Размещено на http://www.allbest.ru/

МIНIСТЕРСТВО ОСВIТИ І НАУКИ, МОЛОДІ ТА СПОРТУ УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені І.І. МЕЧНИКОВА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Біологічно активні речовини у плодах, листi та продуктах переробки перспективних сортiв аличі

03.00.04 - біохімія

Гребеннікова Оксана Анатоліївна

Одеса - 2011

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі фізіолого-біохімічних досліджень, біотехнології та репродуктивної біології рослин Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру НААН України.

Науковий керівник:

доктор технічних наук, професор, академік НААНУ Єжов Валерій Микитович, директор Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру НААН України.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, академік НААНУ Мусіенко Микола Миколайович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри фізіології та екології рослин; доктор біологічних наук

Курчій Богдан Олексійович, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу росту і розвитку рослин

Захист дисертації відбудеться 30 вересня 2011 року о 13⁰⁰ годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06 при Одеському національному університеті імені І.І. Мечникова за адресою: 65058, м. Одеса, пров. Шампанський, 2, (біологічний факультет), ауд.27.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за адресою: м. Одеса, вул. Преображенська, 24.

Автореферат розісланий " " серпня 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вче-ної ради доктор біологічних наук, професор Т.О. Філіпова

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Алича - Prunus cerasifera Ehrh. (родина розоцвітих - Linsacoae Juss) в природних умовах найбільше поширена в Кавказькому регіоні і Середній Азії. Плоди аличі поєднують високі показники смаку та вмісту біологічно активних речовин (БАР). З цього погляду найбільший інтерес становить алича великоплідна (Prunus cerasifera subsp. macrocarpa [Erem. et Garcov]) з її різновидами - аличею типовою, червонолистою та гібридною, плоди яких містять вуглеводи, органічні кислоти, вітаміни, каротиноїди, фенольні та мінеральні речовини (Еремин, 1989). Алича є відносно невибагливою, морозо - та посухостійкою рослиною (Витковский, 2003); її плоди пропонують використовувати для виробництва соків, компотів, варення, конфітюрів, пастили (Горина, Андриевская, 2003; Гребенникова и др., 2007). Народна медицина рекомендує плоди аличі як вітамінний, зміцнюючий та ранозагоюючий засіб (Лойко, 1995). Серед біологічно активних речовин рослин, зокрема аличі, важливу роль відіграють поліфеноли. Рослинні феноли представляють велику групу речовин, віднесених до "вторинних метаболітів", роль яких в рослинах зумовлена їхніми антиоксидантними властивостями. Фенольні сполуки функціонують в рослинах також як антимікробні, протипухлинні і антивірусні агенти (Comparative., 2007). Серед рослин аличі інтродукції та селекції Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру (НБС - ННЦ) відібрано ряд перспективних сортів для подальшого культивування в заданих грунтово-кліматичних умовах. Хоча умови культивування цих рослин досліджені достатньою мірою, проте біохімічна характеристика потенційно корисних для харчування і медичних цілей частин рослини аличі представлена фрагментарно і потребує комплексної оцінки. Зокрема, для рекомендацій щодо виробництва перспективних сортів аличі необхідно визначити вміст біологічно активних речовин та оцінити антиоксидантну активність потенційно корисних частин рослини (листя і плодів), а також продуктів їх переробки.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у відділі біотехнології і біохімії рослин Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру з 2005 по 2008 рр. відповідно до науково-дослідної теми: "Здійснити комплексне біохімічне оцінювання біологічної розмаїтості культивованої і природної флори півдня Україні з метою встановлення закономірностей біосинтезу біологічно активних речовин (БАР), пошуку біохімічних ознак видів, сортів і продуктів підвищеної біологічної цінності" (№ держреєстрації 0101U007189), а також згідно з календарним планом роботи аспіранта.

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було вивчення складу, вмісту та динаміки накопичення біологічно активних речовин у плодах і листі перспективних сортів аличі для біохімічного обґрунтування найбільш ефективних технологій переробки плодів і листя аличі.

Для досягнення мети вирішували такі завдання:

1. визначити склад і вміст біологічно активних речовин у зрілих плодах перспективних сортів аличі інтродукції та селекції Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру;

2. встановити вміст та хімічну природу фенольних сполук в плодах аличі;

3. вивчити динаміку накопичення біологічно активних речовин та характер зміни показника антиоксидантної активності в плодах аличі в процесі дозрівання;

4. проаналізувати зв'язок між антиоксидантною активністю тканин плодів і вмістом в них фенольних речовин і вітамінів;

5. встановити склад біологічно активних речовин листя аличі та дослідити можливості їх використання як біологічно активних добавок у виробництві продуктів переробки;

фенольна речовина алича листя

6. базуючись на біохімічних даних, дати висновок щодо доцільності переробки плодів і листя аличі на харчову і лікувально-профілактичну продукцію.

Об'єкт дослідження. Особливості метаболізму в органах рослин аличі залежно від їхньої сортової приналежності та стадії зрілості плодів.

Предмет дослідження. Біологічно активні речовини та антиоксидантна активність у плодах і листі аличі в період їх зростання і дозрівання.

Методи досліджень. Аналітичні, хроматографічні та спектральні методи визначення складу й вмісту біологічно активних речовин. Прискорено-кінетичний метод оцінювання антиоксидантної активності на моделі термічного автоокиснення олеїнової кислоти. Статистичні методи опрацювання експериментальних даних.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено дослідження біохімічного складу та кількісного вмісту біологічно активних речовин і показника антиоксидантної активності в плодах шести перспективних сортів аличі інтродукції та селекції Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру. Серед сортів, що вивчаються, максимальним вмістом простих вуглеводів, пектинових речовин і каротиноїдів вирізняється сорт Зємлянічная, а за вмістом фенольних сполук і аскорбінової кислоти - сорт Красномясая.

У плодах сортів Красномясая та Олєнька ідентифіковано 15 сполук фенольної природи, представлених фенольними кислотами, флавонолами, антоціанами та катехінами. Виявлені сортові відмінності у вмісті даних сполук: у сорту Красномясая переважають антоціани, а у сорту Олєнька - лейкоантоціани.

Вперше вивчено динаміку накопичення БАР у процесі дозрівання плодів аличі. В ході аналізу встановлено, що високі концентрації БАР характерні для стадії фізіологічної зрілості плодів.

Встановлено високу антиоксидантну активність плодів і листя аличі, при цьому її максимальне значення виявлене для сорту Красномясая (з підвищеним вмістом фенольних речовин); в цілому антиоксидантна активність аличі вища у листі, ніж у плодів.

Вперше встановлено кореляційну залежність між показником антиоксидантної активності та вмістом біологічно активних речовин у плодах аличі. Виявлено тісний кореляційний зв'язок показника антиоксидантної активності із вмістом у плодах фенольних речовин і вітамінів.

Практичне значення отриманих результатів. На базі отриманих експериментальних даних рекомендовані нові напрями та обґрунтовані режими переробки плодів і листя аличі; розроблені рецептури нової продукції, збагаченої БАР. Перспективним є отримання: з плодів сортів Зємлянічная та Піссарді Крупноплодная освітлених і неосвітлених соків; з плодів сорту Зємлянічная - пастили; з плодів сорту Красномясая - концентрату поліфенолів. Показано, що для збагачення соків і концентрату біологічно активними сполуками доцільно використовувати як сировину листя аличі. Для цього оптимізовані режими отримання екстракту листя та визначено дози його внесення до цільового продукту.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає в аналізі наукової літератури, розробці методологічних підходів до вирішення поставлених завдань та виконанні експериментальної роботи, а саме: визначенні динаміки накопичення біологічно активних речовин і зміни антиоксидантної активності плодів і листя аличі, одержанні експериментальних зразків харчової та лікувально-профілактичної продукції та встановленні її хімічного складу. Дисертантом узагальнені експериментальні дані з використанням методів статистики. Разом з науковим керівником сформульовані основні положення і висновки дисертації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і обговорювались на Міжнародній конференції молодих вчених Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру УААН та Центрального ботанічного саду НАН Білорусі: "Сучасні проблеми ботаніки, інтродукції, селекції та екології рослин" (Ялта, 2008), I Міжнародній конференції студентів, аспірантів і молодих учених "Фундаментальні і прикладні дослідження в біології" (Донецьк, 2009), Міжнародній науковой конференції: "Актуальні проблеми прикладної генетики, селекції та біотехнології рослин" (Ялта, 2009), IV Міжнародній науковій конференції молодих науковців "Біологія: від молекули до біосфери" (Харків, 2009), VI Міжнародній науково-практичної конференції "Образование и наука 21 век" (София, 2010) та VII Міжнародній науково-практичної конференції "Naukowa przestrzen Europy - 2011" (Перемышль, 2011).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 10 наукових робіт, з них 4 статті у фахових наукових виданнях, 5 тез в матеріалах конференцій, патент.

Структура і зміст дисертації. Дисертаційна робота викладена на 175 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, 5 розділів, узагальнення, висновків, списку літератури (238 найменувань, з них 134 кирилицею, 104 - латиницею), додатку та містить 24 таблиці та 33 рисунків.

Основний зміст роботи

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

У літературному огляді описані характеристика та основні функції БАР кісточкових культур. Наведено дані про вміст та динаміку накопичення БАР у плодах (в процесі дозрівання) і листі кісточкових культур, а також їхню антиоксидантну активність. Розглянуті питання щодо зміни вмісту БАР під час зберігання та переробки плодів і листя кісточкових культур.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для дослідження відібрано 6 сортів аличі інтродукції та селекції НБС - ННЦ: `Нікітская Жолтая' - типова алича; `Олєнька', `Іділлія', `Красномясая', `Зємлянічная' - гібридні форми; `Піссарді Крупноплодная' - алича червонолиста. Досліджувані сорти належать до таких груп дозрівання: середньоранні (кінець першої декади липня) - `Нікітская Жолтая' і `Красномясая'; середні (друга половина липня), - `Іділлія'; середньопізні (кінець липня) - `Олєнька'; пізні (початок серпня) - `Піссарді Крупноплодная' та `Зємлянічная'. Як контроль вибрано сорт Олєнька, занесений з 1995 р. до Реєстру сортів рослин України (Помологія, 1997). Усі досліджувані сорти аличі зростають на одній з дослідних ділянок Нікітського ботанічного саду в однакових грунтово-кліматичних умовах.

Збір і аналіз плодів здійснювали в період дозрівання (з середини червня по серпень, кожні 7 діб), листя - після збирання плодів всіх сортів, що вивчалися (з серпня по листопад, кожні 30 діб).

Вміст сухих речовин визначали гравіметричним методом (Кривенцов, 1982); моно - та дисахаридів - фотометрично у водних витяжках гомогенату за Бертраном (Рихтер, 1999); пектинів - фотометричним методом з використанням тимолу у водних витяжках гомогенату плодів, заздалегідь відмитого етанолом від моно - та дисахаридів (Кривенцов, 1989); аскорбінової кислоти - йодометричним титруванням (Кривенцов, 1982); каротиноїдів - спектрофотометрично в ацетонових витяжках гомогенату плодів (Мусієнко та ін., 1981). Для зв'язування антоціанів плодів до витяжок додавали оксиди алюмінію та кальцію (Плешков, 1985). Вимірювання виконували при довжинах хвиль 440,5, 644 і 662 нм для уникнення впливу на результат хлорофілу.

Концентрацію вільних органічних кислот визначали титруванням водних витяжок гомогенату гідроксидом натрію, сумарний вміст кислот - аналогічно, заздалегідь обробивши водні витяжки гомогенату сильнокислотним катіонітом в Н-формі (Кривенцов, 1982).

Сумарний вміст фенольних сполук визначали колориметричним методом з використанням реактиву Фоліна - Чокальтеу (Методы…, 2002).

Вміст лейкоантоціанів визначали фотометричним методом з використанням підкисленого бутанолу; антоціанів - фотометричним методом з використанням підкисленого етанолу (Кривенцов, 1982); флавонолів - спектрофотометрично з використанням хлористого алюмінію (Плешков, 1985).

Ідентифікацію окремих фенольних сполук здійснювали методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) на хроматографі фірми Agilent Technologies (модель 1100). Для виконування аналізу було використано хроматографічну колонку 2,1 х 150 мм, заповнену октадецилсилільним сорбентом зернінням 3,5 мкм "ZORBAX" SB-C18.

Антиоксидантну активність визначали прискорено-кінетичним методом на моделі термічного автоокиснення олеїнової кислоти. Ступінь окиснення олеїнової кислоти оцінювали перекисним числом, яке визначали йодометричним методом. Антиоксидантну активність екстракту розраховували для двох концентрацій за формулою: (в %), де Пч^и, Пч^к, Пч^{о -} відповідно перекисні числа (% I₂) вихідної олеїнової кислоти, контрольного і дослідного зразків олеїнової кислоти після 3 годин її окислення (Поиск…, 1989).

Визначення всіх показників здійснювали не менше ніж з триразовою повторністю.

Аналіз отриманих даних статистично проводили з використанням пакету програм STATISTICA 6.0. Планування експерименту з оптимізації одержання екстрактів з підвищеною біологічною активністю здійснювали з використанням методів планування багатофакторного експерименту (Адлер и др., 1976; Грачев, 1979; Лакин, 1990).

ЗАГАЛЬНА БІОХІМІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ПЛОДІВ І ЛИСТЯ АЛИЧІ НА СТАДІЇ ФІЗІОЛОГІЧНОЇ СТИГЛОСТІ ПЛОДІВ

Сортові особливості вмісту БАР плодів аличі. Хімічний склад плодів досліджуваних сортів аличі оцінювали за такими показниками: вміст сухих речовин, вуглеводів (моно - та дисахаридів, протопектину, водорозчинного пектину), органічних кислот (зв'язаних і вільних форм), аскорбінової кислоти, каротиноїдів і фенольних речовин (антоціанів, лейкоантоціанів, флавонолів). Отримані дані подані у вигляді середнього в перерахунку на сиру речовину, як заведено в науковій літературі, для порівняння біохімічного складу плодів (табл.1).

Таблиця 1

Сортові відмінності основних біохімічних показників зрілих плодів аличі (середнє за 2005-2008 рр. в перерахунку на сиру речовину)

Вміст Сорт	Сухі речовини, %	Моно - та дисахариди, г / 100 г	Пектинові речовини, г / 100 г	Органічні кислоти, г / 100 г	Аскорбінова кислота, мг / 100 г	Каротиноїди, мг / 100 г	Фенольні речовини, мг / 100 г
Нікітская Жолтая	14,90	10,15	0,79	1,14	5,22	1,84	200
Олєнька	17,25	10,95	1,09	1,75	5,76	5,27	350
Іділлія	17,60	12,20	1,18	1,48	8,10	5,58	820
Красномясая	14,65	7,30	1,03	2,13	12,17	5,04	1351
Піссарді Крупноплодная	16,25	7,65	0,93	2,13	7,46	3,19	562
Зємлянічная	25,05	13,35	1,10	1,69	10,49	7,18	1269
НІР0,05 (n=12)	4,15	1,45	0,10	0,30	1,18	1,64	173

Встановлено, що вміст сухих речовин та моно - й дисахаридів вищий у плодах аличі сортів пізнього строку достигання. За цими показниками найбільший інтерес становлять плоди аличі сорту Зємлянічная. Водночас рівень інших показників визначається здебільшого сортовими особливостями. Досить високим є вміст у плодах аличі фенольних сполук, при цьому важливим є їх фракційний склад. Серед фенольних сполук особливий інтерес становлять антоціани, які, з одного боку, забезпечують біологічну цінність плодів (Стуруа та iн., 1971; Wanasundara et al., 1995) та, відповідно, продуктів їх переробки, а з іншого - додають їм привабливого зовнішнього вигляду (Харламов, Кафка, 1979; Tanaka et al., 2008).

З наведених даних випливає, що забарвлені плоди аличі вирізняються високим вмістом антоціанів, причому найвища їх концентрація відмічена у сорту Красномясая (табл. 2).

Таблиця 2

Вміст фенольних речовин у плодах аличі різних сортів

Сорт	Вміст фенольних речовин, мг / 100 г сирої речовини
	Лейкоантоціани	Антоціани	Флавоноли
Нікітская Жолтая	136	-	7,9
Олєнька	138	88	21,3
Іділлія	293	402	19,4
Красномясая	423	791	17,0
Піссарді Крупноплодная	213	238	14,7
Зємлянічная	660	410	43,9
НІР0,05 (n=12)	171	136	4,3

Вивчення хімічного складу плодів аличі загалом свідчить про істотну варіабельність вмісту різних речовин, як у межах різних сортів, що вивчаються, так і в межах певного сорту в різні роки. Проте за вмістом вуглеводів і каротиноїдів вирізняється сорт Зємлянічная, а за концентрацією аскорбінової кислоти та фенольних сполук - сорт Красномясая.

Ідентифікація індивідуальних компонентів фенольних сполук плодів аличі. У сортах Олєнька і Красномясая методом ВЕРХ ідентифіковано 15 компонентів, що належать до чотирьох груп речовин фенольної природи - фенольних кислот, флавонолів, антоціанів і катехінів (табл. 3).

При цьому в зрілих плодах аличі домінують антоціани. Переважаючим компонентом антоціанів в обох сортах є ціанідин-3-О-арабінозид, вміст якого становить 57 % (сорт Красномясая) та 63,5 % (сорт Олєнька) від сумарного вмісту антоціанів.

Вищі значення як сумарного вмісту, так і вмісту окремих фенольних кислот відмічені у сорту Красномясая. Для плодів обох сортів характерне переважання хлорогенової кислоти, частка якої від сумарного вмісту фенолокислот у плодах сортів Олєнька і Красномясая сягає 49 і 50,5 %, відповідно.

За вмістом флавонолів переважає сорт Олєнька (18,4 мг/100г), при цьому на частку рутина припадає 59 % (сорт Красномясая) і 67 % (сорт Олєнька) від сумарної кількості цих сполук.

Концентрація катехінів також вища в плодах аличі сорту Олєнька (18,3 мг/100г). Компонентний склад цієї групи різний: у плодах сорту Олєнька домінує D-катехін, а в плодах сорту Красномясая - (-) - епікатехін.

Таблиця 3

Вміст окремих фенольних сполук у плодах аличі

Фенольна сполука	Вміст, мг / 100 г сирої речовини
	Сорт Олєнька	Сорт Красномясая
Неохлорогенова кислота	3,32 ± 0,15	16,52 ± 0,56
Хлорогенова кислота	5,47 ± 0,23	29,11 ± 1,23
п-кумарова кислота	0,62 ± 0,04	10,23 ± 0,37
Ферулоїлгексоза	1,73 ± 0,07	1,76 ± 0,003
Біозид	2,39 ± 0,09	0,87 ± 0,003
Рутин	12,24 ± 0,43	7,82 ± 0,24
Рамнозид	0,56 ± 0,01	0,67 ± 0,01
Кверцетин-3-О-глікозид	3,16 ± 0,04	3,96 ± 0,01
Ціанідин-3-О-галактозид	6,97 ± 0,12	65,13 ± 4,87
Ціанідин-3-О-гликозид	1,54 ± 0,01	37,20 ± 1,67
Ціанідин - 3-О-арабінозид	16,35 ± 0,34	152,00 ± 9,87
Ціанідин - 3-О-рутинозид	0,83 ± 0,03	8,15 ± 0,44
Ціанідин-3-О-ацетилгалактозид	0,07 ± 0,001	3,74 ± 0,11
(+) - D-катехін	13,42 ± 0,35	1,97 ± 0,003
(-) - епікатехін	4,91 ± 0,22	13,11 ± 0,27

Відомо, що фенольні сполуки відрізняються таксономічною специфічністю через відмінності ферментних систем рослин, що беруть участь у процесі біосинтезу цих речовин (Запрометов, 1993). Тому сорти різного походження мають однаковий склад фенольного комплексу. Сортові особливості проявляються в кількісному вмісті окремих компонентів фенольних сполук: сорт Красномясая перевершує сорт Олєнька за вмістом антоціанів і фенольних кислот, тоді як сорт Оленька відрізняється високим вмістом катехінів і рутину.

Антиоксидантна активність (АОА) плодів аличі та її зв'язок із вмістом фенольних речовин і вітамінів. У плодах аличі досліджуваних сортів величина АОА при концентрації зразка 0,2 г / 100 г становила 21-54 % і при максимальній концентрації (1 г / 100 г) - 51 - 76 % (рис.1). Найбільш високим показником АОА вирізняється сорт Красномясая, що відповідає підвищеним концентраціям в його плодах фенольних речовин, зокрема фенольних кислот і антоціанів.

Для встановлення взаємозв'язку показника АОА із вмістом фенольних речовин та вітамінів у дослідних плодах аличі були розраховані відповідні коефіцієнти кореляції. При порівнянні величини АОА із концентрацією суми фенольних речовин, лейкоантоціанів, антоціанів, флавонолів, аскорбінової кислоти та каротиноїдів у стиглих плодах аличі отримані високі коефіцієнти кореляції, незалежно від концентрації внесеного екстракту, для таких пар показників, як: "АОА - сумарний вміст фенольних речовин, "АОА - вміст антоціанів", "АОА - вміст каротиноїдів".

Рис. 1. Антиоксидантна активність зрілих плодів аличі

Сорти: 1 - Нікітская Жолтая; 2 - Олєнька; 3 - Іділлія; 4 - Красномясая; 5 - Піссарді Крупноплодная; 6 - Зємлянічная.

Одержані коефіцієнти кореляції свідчать про спільний внесок зазначених речовин в антиоксидантні властивості стиглих плодів аличі дослідних сортів.

Міжсортові відмінності вмісту БАР та показника АОА в листі аличі. З метою встановлення додаткового джерела БАР при виробництві продукції з плодів аличі здійснено вивчення складу листя цієї культури (табл. 4).

Таблиця 4

Вміст біологічно активних речовин у листках аличі

Сорт	Вміст БАР, мг / 100 г сухої речовини	Антиокси-дантна активність,%
	Аскорбінова кислота	Каротиноїди	Лейко-антоціани	Фенольні речовини
Нікітская Жолтая	49,08 ± 1,04	4,63 ± 0,44	919 ± 83	1925 ± 88	92,0
Олєнька	39,81 ± 0,92	17,63 ± 0,95	1512 ± 110	3042 ± 116	98,0
Іділлія	62,39 ± 1,12	14,12 ± 0,91	1152 ± 95	2486 ± 182	79,0
Красномясая	53,56 ± 1,08	15,10 ± 0,95	1722 ± 129	2880 ± 176	98,0
Піссарді Крупноплодная	47,14 ± 0,98	10,62 ± 0,81	1560 ± 116	3072 ± 169	96,0
Зємлянічная	80,66 ± 1,23	19,05 ± 0,91	2353 ± 143	3464 ± 171	90,0

Виявлено, що, порівняно з плодами аличі в стані фізіологічної зрілості, в листках міститься більше аскорбінової кислоти і каротиноїдів. Вміст лейкоантоціанів і фенольних речовин у листках і плодах приблизно однаковий, проте антиоксидантна активність листя є вищою. Наведені вище результати дають підставу для збагачення продукції з плодів аличі БАР листя, які запропоновано вносити до продукції у вигляді водно-спиртових екстрактів.

ЗМІНА ВМІСТУ БАР І АОА ПЛОДІВ (У ПРОЦЕСІ ДОСТИГАННЯ) І ЛИСТЯ АЛИЧІ

Для об'єктивного оцінювання даних концентрації речовин, що вивчались, у плодах аличі досліджено динаміку їх накопичення в процесі дозрівання плодів, яка показана на прикладі сорту Зємлянічная (рис.2, табл. 5).

Динаміка вмісту сухих речовин при достиганні плодів аличі. Вміст сухих речовин у процесі достигання плодів аличі постійно зростає, що властиве всім кісточковим культурам. Інформація про значення цього показника є важливою для об'єктивної оцінки динаміки накопичення всіх БАР у процесі достигання плодів аличі, позаяк усі отримані нами експериментальні дані були перераховані на суху речовину.

Рис. 2. Динаміка накопичення БАР у процесі дозрівання плодів аличі сорту Зємлянічная.

Вміст вуглеводів на різних стадіях достигання плодів аличі. У міру достигання в плодах відбувається постійне накопичення простих вуглеводів. На початкових етапах достигання, до набуття плодами характерного забарвлення, концентрація простих вуглеводів зростає передусім за рахунок синтезу моносахаридів, який відбувається як у листках, так і частково у хлоропластах зелених плодів. На останніх стадіях достигання плодів збільшення вмісту простих вуглеводів відбувалося за рахунок біосинтезу сахарози. Зміна вмісту пектинових речовин у процесі достигання плодів аличі відбувалася нелінійно та неоднозначно. Це пов'язане зі значним впливом сортових особливостей на процеси синтезу й гідролізу пектинових речовин через різну активність і субстратну специфічність ферментів. Зміна частки протопектину також відбувається неоднозначно. Для більшості сортів за дослідний період було відмічено по два максимуми збільшення цього показника, що може свідчити про врівноважений перебіг процесів гідролізу та синтезу нерозчинної фракції пектину.

Зміна концентрації вітамінів та органічних кислот у процесі достигання плодів аличі. В плодах аличі сорту Красномясая вміст аскорбінової кислоти у міру достигання плодів безперервно зростає. Для інших досліджуваних сортів аличі зміна цього показника в процесі достигання плодів у різні роки відбувалася неоднозначно й нелінійно. Такі відмінності пов'язані з різною активністю ферментів, що каталізують окисно-відновні процеси за метаболізму аскорбінової, щавлевої і винної кислот на різних стадіях достигання плодів та в різні сезони вегетації. Вміст каротиноїдів у плодах аличі в міру достигання зростає, що пов'язане з їхніми захисними функціями та участю у формуванні характерного забарвлення плодів. Концентрація органічних кислот у процесі достигання плодів аличі постійно зменшується, що віддзеркалює участь кислот у процесах енергетичного й пластичного обміну, які відбуваються за інтенсивного наростання м'якуша плода. Частка вільних органічних кислот у плодах аличі змінювалася неоднозначно, але протягом усього процесу достигання залишалася високою - понад 70 %. Співвідношення вільних та зв'язаних форм органічних кислот зумовлює потрібну іонну рівновагу та визначає рН клітинного соку, беручи участь у регулюванні активності ферментів.

Таблиця 5

Динаміка накопичення БАР у процесі дозрівання плодів аличі сорту Зємлянічная

БАР	Вміст БАР, мг / 100 г сухої речовини
	Стадія дозрівання	I	II	III	IV	V	VI
Фенольні речовини	2008	9618	9045	7471	7990	6037	5422
	2007	8133	7099	6432	6406	5905	5385
	2006	4661	3753	6211	5080	5883	4606
	2005	5377	5033	4946	6104	5481	4789
	НІР0,05	111	126	95	91	69	68
Пектиновi речовини	2008	5330	6920	5870	5470	5350	4460
	2007	6460	6080	5400	4990	4950	4340
	2006	7110	8480	6970	5900	5940	4460
	2005	5480	6500	5000	5040	5500	4390
	НІР0,05	213	146	116	133	192	95
Аскорбінова кислота	2008	65,7	58,1	42,1	34,2	36,7	40,7
	2007	25,0	23,4	32,0	37,5	40,3	39,6
	2006	32,1	27,2	31,9	37,9	40,9	45,3
	2005	34,0	36,3	38,4	46,1	43,8	42,5
	НІР0,05	1,7	1,4	1,6	1,2	1,2	1,2

Динаміка вмісту фенольних речовин у процесі достигання плодів аличі. Вміст фенольних речовин у міру достигання плодів аличі змінюється неоднозначно й нелінійно. Для більшості сортів кількість фенольних речовин на початку достигання перевершувала їх вміст у стиглих плодах, тобто спостерігалася тенденція щодо їх зменшення. Це можливо пояснити тим, що впродовж достигання плодів, поряд із синтезом фенольних сполук, відбувається їх окиснення. Фенольні сполуки накопичуються в плодах аличі для участі в процесі поділу й росту клітин та виконання функції резервних речовин, слугуючи своєрідною формою запасання БАР. Разом з тим відбувається окиснення фенольних речовин як аутокаталітично, так і за рахунок присутності поліфенолоксидази, активність якої в плодах кісточкових культур, як описано в літературі, є доволі високою. Зміна вмісту лейкоантоціанів при достиганні плодів аличі відбувається аналогічно і пояснюється значною часткою цих сполук у сумарному вмісті фенольних речовин. Крім того, саме лейкоантоціани беруть участь у процесі поділу й росту клітин, що спричинює їх біосинтез на певних стадіях достигання. Вміст антоціанів у процесі достигання плодів аличі постійно зростає, що пов'язане з потребою виконання ними основних функцій в рослині, наприклад захисту від ультрафіолетового випромінення.

Динаміка накопичення індивідуальних компонентів фенольної природи визначається їхньою роллю в процесах, що відбуваються в рослині на різних стадіях достигання плодів.

Таким чином, встановлено, що вміст сухих речовин, сумарний вміст моно - та дисахаридів, сахарози, каротиноїдів і антоціанів в процесі дозрівання плодів аличі збільшується, тоді як концентрація органічних кислот - зменшується. Для пектинових речовин і фенольних сполук зміна концентрації в процесі дозрівання має хвилеподібний характер, що може відображати складні фізіологічні і біохімічні процеси синтезу і гідролізу цих сполук у плодах. Однак, у зрілих плодах аличі вміст пектинових речовин залежно від сорту складає 63-100% від максимального значення, що досягається в період дозрівання; для фенольних сполук цей показник сягає 72 - 100 %. Таким чином, у зрілих плодах аличі досліджуваних сортів зберігається високий вміст БАР, що дає підстави для їх використання як у свіжому вигляді, так і для переробки.

Зміна антиоксидантної активності плодів аличі в процесі достигання. Зміна АОА при дозріванні плодів аличі відбувається нерівномірно (рис.3). Це можливо пояснити нерівномірним накопиченням основних антиоксидантів плодів аличі, як-от: фенольні сполуки та аскорбінова кислота. Крім того, активність основних антиокисних ферментів - супероксиддисмутази та каталази також змінюється нелінійно, проходячи через максимуми. Проте в зрілих плодах аличі АОА є досить високою і складає, залежно від сорту 71 - 100 % від максимального значення, що досягається в період дозрівання.

Для оцінювання вкладу фенольних речовин і вітамінів в антиоксидантні властивості плодів були розраховані коефіцієнти кореляції АОА із вмістом цих речовин у плодах аличі на кожній стадії дозрівання (табл.6).

Рис. 3. Зміна антиоксидантної активності плодів аличі в процесі дозрівання

Таблиця 6

Коефіцієнти кореляції антиоксидантної активності із вмістом фенольних речовин і вітамінів у плодах аличі

Стадія дозрівання	Коефіцієнт кореляції АОА із вмістом:
	Фенольних речовин	Лейкоанто-ціанів	Антоціанів	Флавонолів	Аскорбіно-вої кислоти	Каротиної-дів
Незабарвлені тверді плоди (n=16)	0,40	0,30	-0,57*	0,07	-0,07	0,18
Плоди з частковим забарвленням (n=24)	0,66**	0,47*	-0,09	0,55**	0,02	0,71**
Напівзабарвлені тверді плоди (n=24)	0,71**	0,49*	0,29	0,39	0, 19	0,49*
Повністю забарвлені тверді плоди (n=24)	0,76**	0,66**	0,44*	0,60**	-0,02	0,21
Плоди початкової зрілості (технічна зрілість) (n=24)	0,57**	0,30	0,52**	-0,01	0,18	0,38
Зрілі плоди (фізіологічна зрілість) (n=24)	0,77**	0,52**	0,77**	0,48*	0,70**	0,72**
Перезрілі плоди (n=8)	0,97**	0,98**	0,94**	0,95**	0,95**	0,87**

Примітка: * - р ? 0,05; ** - р ? 0,01

Таким чином, на початку дозрівання, коли на поверхні плоду ще відсутнє кольорове забарвлення, достовірного зв'язку між вмістом будь-якого з перерахованих БАР та антиоксидантною активністю плодів не встановлено. В подальшому встановлено значне зростання внеску лейконтоціанів і флавонолів в антиоксидантні властивості плодів аличі.

Істотна роль антоціанів виявляється від моменту повного забарвлення плодів, тоді як аскорбінової кислоти і каротиноїдів стає значимою при їх повному дозріванні.

Отже, суттєва роль у забезпеченні антиоксидантних властивостей плодів аличі може визначатися фенольними сполуками.

Зміна вмісту біологічно активних речовин та показника антиоксидантної активності в листі аличі. Оцінка вмісту БАР у листі становила інтерес після збирання врожаю та виконання ними своїх фізіологічних функцій, тому їх збір та аналіз здійснювали з серпня по листопад (рис. 4,5).

Рис. 4. Зміна вмісту аскорбінової кислоти та каротиноїдів в листі аличі сорту Красномясая

Рис. 5. Зміна вмісту фенольних сполук та лейкоантоціанів в листі аличі сорту Красномясая

Концентрація аскорбінової кислоти в листі аличі всіх виучуваних сортів сягала максимуму безпосередньо перед опаданням, що, ймовірно, пов'язане з припиненням відтоку з листя до плодів аскорбінової кислоти та простих вуглеводів. Вміст каротиноїдів у листі аличі зменшувався, що, враховуючи їхні функції, може бути пов'язане з підготовкою рослини до стану зимового спокою.

Концентрація фенольних сполук у листі аличі всіх досліджуваних сортів поступово знижувалась з серпня по жовтень та різко збільшувалась перед початком листопаду, сягаючи максимальних значень. Зменшення концентрації фенольних сполук у листі в осінній період пов'язане, вочевидь, зі зниженням їх синтезу внаслідок уповільнення поділу клітин рослини, тоді як збільшення - з підготовкою рослини до стану зимового спокою. Вміст лейкоантоціанів у листі аличі всіх виучуваних сортів поступово зростав упродовж усього досліджуваного періоду, сягаючи максимального значення перед листопадом. Безперервне накопичення цих сполук, імовірно, пов'язане з процесами осіннього росту рослини. АОА листя аличі всіх виучуваних сортів за досліджуваний період поступово зростала, що спричинене зростанням вмісту в них основних антиоксидантів. При проведенні кореляційного аналізу вірогідного зв'язку між зміною АОА та динамікою накопичення аскорбінової кислоти, каротиноїдів і фенольних речовин у листі аличі не виявлено. Це, очевидно, зумовлене значною роллю ферментів антиоксидантного захисту у формуванні АОА листя аличі.

Загалом, за рівнем досліджуваних показників, збирання листя доцільно здійснювати в листопаді, тобто безпосередньо перед падолистом.

Біохімічне обґрунтування використання плодів та листків аличі в харчовій промисловості

Біохімічні аспекти одержання продукції з плодів аличi. Враховуючи високий вміст таких БАР, як вуглеводи, органічні кислоти, вітаміни і фенольні сполуки в плодах досліджуваних сортів аличі та з метою конкретизації напрямів їх подальшого використання з плодів аличі було одержано таку консервну продукцію: соки з м'якоттю, освітлені соки, нектари, пастилу.

В освітлених соках з плодів аличі збереглася значна частина біологічно активних речовин, що містяться у свіжих плодах, зокрема 62 - 77 % аскорбінової кислоти (47,3 - 94,0 мг / дм³) та 60 - 81 % антоціанів (116 - 6166 мг / дм³). Соки з м'якоттю також вирізняються високою концентрацією аскорбінової кислоти (40,9 мг / дм³) і підвищеним вмістом антоціанів (110 - 7920 мг / дм³). Хімічний склад нектарів за вмістом БАР значно поступається сокам, проте нектари становлять певний інтерес як освіжаючий напій, збагачений Р-активними речовинами за рахунок вмісту антоціанів (27 - 2636 мг / дм³) та лейкоантоціанів (348 - 1296 мг / дм³).

Пастила з аличі має привабливий зовнішній вигляд завдяки високому вмісту антоціанів (88 - 451 мг / 100 г сирої маси). Визначення хімічного складу пастили з плодів п'яти сортів аличі показало, що її особливістю є високий вміст пектинових речовин (3,62 - 5,87 г / 100 г сирої маси). За співвідношенням простих вуглеводів і кислот (сахаро-кислотний коефіцієнт дорівнює 10) та вмістом антоціанів (451 мг / 100 г сирої маси) вирізняється пастила сорту Зємлянічная, що отримала найвищу дегустаційну оцінку.

Таким чином, експериментально підтверджено ефективність отримання з плодів аличі таких продуктів, як неосвітлені та освітлені соки, нектар, пастила. Найбільш придатними для цього виявилися такі сорти, як Зємлянічная та Красномясая.

Динаміка вмісту БАР у соках під час їх зберігання. Для оцінювання втрат БАР у процесі зберігання освітлених соків було проведено їх біохімічний аналіз після 3, 6, 12 і 24 місяців зберігання при температурі 12 - 20°С (рис. 6,7).

Встановлено, що протягом досліджуваного періоду в соках відбувається значне зменшення вмісту аскорбінової кислоти та антоціанів, особливо в перші місяці зберігання. Додавання до соків сахарози на втрати БАР істотного впливу не має.

Рис. 6. Зміна вмісту фенольних речовин у процесі зберігання освітленого соку з плодів аличі сорту Зємлянічная.

Рис. 7. Зміна вмісту аскорбінової кислоти в процесі зберігання освітленого соку з плодів аличі сорту Зємлянічная.

Отже, для підтримання високого рівня БАР в освітлених соках, особливо при їх тривалому зберіганні, необхідним є додаткове джерело цих сполук.

Біохімічне обґрунтування доцільності додавання екстрактів з листків аличі до продукції з плодів. Аналіз даних біохімічного складу продуктів переробки плодів аличі свідчить, що для отримання високоякісної продукції, яка поєднує приємний смак і високий вміст БАР, необхідно додатково вносити екстракти з листя аличі.

На прикладі освітленого соку показано, що додавання спиртових екстрактів з листя сприяє збільшенню в продукті аскорбінової кислоти, фенольних та пектинових речовин.

З урахуванням отриманих даних, а також підвищеного вмісту фенольних речовин, аскорбінової кислоти і високого значення АОА в плодах аличі сорту Красномясая, вивчено перспективи його використання для отримання збагаченого поліфенолами концентрату. За контроль було взято промислово освоєний харчовий концентрат поліфенолів з винограду "Еноант" (Огай и др., 2000; Бабанин, Богданов, 2003; Брезицкая и др., 2003; Мизин, 2001; Мизин и др., 2003). Під час експерименту з отримання концентрату визначали оптимальні режими екстрагування БАР, що містяться в сировині, та дозу внесення водно-спиртового екстракту листя.

За результатами біохімічного оцінювання та робочої дегустації вирізнявся концентрований екстракт з внесенням 2 % екстракту листя, до якого для поліпшення органолептичних і стабілізуючих властивостей додавали 20 % сахарози. Зразок отримав робочу назву "Героант". З даних, поданих у таблиці 7, видно, що вміст сухої речовини, аскорбінової кислоти, каротиноїдів і фенольних сполук, зокрема антоціанів, у концентраті "Героант" вищий, ніж у контрольному зразку - "Еноант".

Таблиця 7

Хімічний склад концентрату поліфенолів аличі

Показник	Вміст БАР, г / дм3
	Концентрат поліфенолів аличі (робоча назва - "Героант")	Контроль - концентрат поліфенолів винограду ("Еноант")
Сухі речовини	540,2 ± 20,6	360,0 ± 10,4
Фенольні речовини	19,0 ± 0,6	16,3 ± 0,6
Антоциани	10,0 ± 0,4	1,9 ± 0,08
Лейкоантоціани	6,5 ± 0,3	10,2 ± 0,4
Аскорбінова кислота	0,089 ± 0,004	0,053 ± 0,002
Каротиноїди	0,037 ± 0,001	0,022 ± 0,001
Моно - й дисахариди	420,2 ± 18,6	240,0 ± 7,2
Органічні кислоти	12,95 ± 0,39	8,62 ± 0,26

Зроблено висновок, що отриманий експериментальний зразок "Героант" може бути базовим для розроблення відповідного лікувально-профілактичного продукту після його клінічних випробувань.

Висновки

Вперше досліджено вміст біологічно активних речовин та виявлені сортові ознаки у плодах і листі шести перспективних сортів аличі інтродукції та селекції Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру.

1. За вмістом простих вуглеводів (13,35 г / 100 г), пектинових речовин (1,10 г / 100 г) і каротиноїдів (7,18 мг / 100 г) серед сортів, що вивчаються, виділяється сорт Зємлянічная; за максимальним вмістом фенольних сполук (1351 мг / 100 г), зокрема антоціанів (791 мг / 100 г) - сорт Красномясая.

2. У плодах сортів Красномясая та Олєнька ідентифіковано 15 сполук фенольної природи, представлених фенольними кислотами, флавонолами, антоціанами та катехінами. Виявлені сортові відмінності у вмісті даних сполук: у сорту Красномясая переважають антоціани, а у сорту Олєнька - лейкоантоціани.

3. У процесі дозрівання плодів аличі динаміка накопичення пектинових і фенольних речовин має хвилеподібний характер при збільшенні вмісту сухих речовин, простих вуглеводів, каротиноїдів і зменшенні концентрації органічних кислот. При цьому відмічені високі концентрації БАР у плодах аличі на стадії фізіологічної зрілості.

4. Виявлено високу АОА (51 - 76 %) плодів досліджуваних сортів аличі з максимальним значенням у сорту Красномясая. Зміна величини цього показника при дозріванні плодів аличі відбувається нерівномірно, проте АОА зрілих плодів аличі є досить високою та складає, залежно від сорту, 71 - 100 % від визначених максимальних значень. Встановлено достовірний кореляційний зв'язок цього показника із вмістом у плодах каротиноїдів (r = 0,72**) та фенольних сполук (r = 0,77**), зокрема антоціанів (r = 0,77**).

5. В листі аличі міститься більше аскорбінової кислоти і каротиноїдів порівняно з плодами аличі в стані фізіологічної зрілості. Вміст лейкоантоціанів і фенольних речовин у листі і плодах приблизно однаковий, проте антиоксидантна активність вища. Доцільно збагачення продукції з плодів аличі БАР листя, зібраних безпосередньо перед падолистом. Листя запропоновано вносити до продукції у вигляді водно-спиртових екстрактів.

6. Біохімічно обґрунтовані перспективні напрями переробки плодів аличі на продукцію, збагачену БАР. Запропоновано отримувати освітлені і неосвітлені соки з плодів сортів Зємлянічная і Піссарді Крупноплодная, пастили з плодів сорту Зємлянічная та нового виду продукції - концентрату поліфенолів з плодів сорту Красномясая.

7. Отриманий експериментальний зразок лікувально-профілактичного продукту "Героант" може бути базовим для промислового виробництва після його клінічних випробувань.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Гребенникова О.А. Биохимическое обоснование перспективных направлений использования плодов алычи / О.А. Гребенникова, А.К. Полонская, В.М. Горина, В.Н. Ежов // Бюлл. Гос. Никит. ботан. сада. - 2007. - Вып.95. - С.69-74. (Здобувачем здійснено збір та аналіз отриманих даних, написання статті, формулювання висновків).

2. Полонская А.К. Биологически активные вещества листьев некоторых плодовых культур в связи с перспективой их использования в пищевых продуктах / А.К. Полонская, В.Н. Ежов, Г.В. Корнильев, О.А. Гребенникова // Ученые записки ТНУ им.В.И. Вернадского. Серия "Биология, химия". - 2007. - Т.20 (59). - № 3. - С.122-127. (Здобувачем здійснено збір та аналіз частини даних, взято участь у написанні статті, формулюванні висновків).

3. Гребенникова О.А. Особенности состава и содержания фенольных соединений в плодах алычи // Бюлл. Гос. Никит. ботан. сада. - 2008. - Вып.97. - С.66-68.

4. Гребеннiкова О.А. Біохімічна характеристика соків і пастили з плодів аличі / О.А. Гребеннікова, В.М. Горіна, О.О. Ріхтер // Науковий вісник Нац. університету біоресурсів і природокористування України. - 2009. - Вип.133. - С.227-236. (Здобувачем здійснено збір та аналіз отриманих даних, написання статті).

5. Пат.60897 Україна, МПК C09B 61/00 Спосіб отримання харчового концентрату поліфенолів / О.А. Гребеннікова, В.М. Єжов; власник: Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр. - u 2011 00646; заявл. 20.01.2011; опубл.25.06.2011, Бюл. № 12.

6. Гребенникова О.А. Динамика накопления и компонентный состав антоцианов в плодах алычи в процессе созревания // Фундаментальні та прикладні дослідження в біології: І міжнар. наук. конф. студентів, аспірантів та молодих учених. Донецьк, 23-26 лютого 2009 р. - Донецьк: Вебер, 2009. - С.223-224.

7. Гребенникова О.А. Перспективы использования плодов и листьев алычи в связи с их биологическими особенностями / О.А. Гребенникова, В.Н. Ежов, В.М. Горина // Актуальні проблеми прикладної генетики, селекції та біотехнології рослин: міжнар. наук. конф. Ялта, 3-6 листопада 2009 р. - Ялта, 2009. - С.21. (Здобувачем здійснено збір та аналіз отриманих даних, написання тез).

8. Гребенникова О.А. Изменение содержания биологически активных веществ в плодах алычи в процессе созревания // Біологія: від молекули до біосфери: міжнар. конф. молодих науковців. Харків, 17-21 листопада 2009 р. - Харків, 2009. - С. 202-203.

9. Гребенникова О.А. Антиоксидантная активность плодов алычи и её взаимосвязь с содержанием фенольных веществ и витаминов // Образование и наука 21 век - 2010: VI междунар. научно-практическая конф. София, 17-25 октября 2010 г. - София: Бял ГРАД-БГ, 2010. - С.18-20.

10. Гребенникова О.А. Изменение содержания пектиновых веществ в процессе созревания плодов алычи // Naukowa przestrzen Europy - 2011: VII Miedzynarodowа naukowо-praktycznа konferencjа. Przemysl, 7-15 kwietnia 2011. - Przemysl: Nauka i studia, 2011. - C.10.

Анотація

Гребеннiкова О.А. Біологічно активні речовини у плодах, листi та продуктах переробки перспективних сортiв аличі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Одеський національний університет імені I.I. Мечникова. - Одеса, 2011.

Дисертація присвячена вивченню біологічно активних речовин Prunus cerasifera subsp. macrocarpa [Erem. et Garcov]. Встановлено, що висок...