Ветеринарно-санитарная экспертиза ВСЭ и санитарная оценка продуктов убоя животных при ящуре

2.1. Серологический метод

Сущность метода заключается в обнаружении специфического антигена того или иного типа и варианта вируса ящура непосредственно в материале, полученном от животных с клиническими признаками заболевания, с помощью реакции связывания комплемента (РСК).

2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы

2.1.1.1. Для проведения исследования применяют:

центрифугу настольную с угловым ротором и частотой вращения до 5000 об/мин;

центрифугу рефрижераторную;

холодильник с температурой минус 20 °С;

холодильник с температурой от 0 до 8 °С;

гомогенизатор;

баню водяную или термостат;

шкаф сушильный с регулируемой температурой в диапазоне от 100 до 200 °С;

электрофотоколориметр или спектрофотометр;

пробирки стеклянные по ГОСТ 10515-75;

пластинки (панели) для микросерологических реакций типа Такачи;

наборы разбавителей и капельниц для микросерологических реакций типа Такачи;

пипетки вместимостью до 10 см с ценой деления 0,01 и 0,1 см по ГОСТ 20292-74*;

________________

* На территории Российской Федерации действуютГОСТ 29169-91,ГОСТ 29227-91-ГОСТ 29229-91,ГОСТ 29251-91-ГОСТ 29253-91, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

колбы мерные вместимостью 50, 100 и 200 см по ГОСТ 1770-74;

комплемент морской свинки с титром не более 2,8% по ГОСТ 16446-78;

гемолизин кроличий к эритроцитам барана с титром 1:8000 по ГОСТ 16446-78;

эритроциты барана в виде дефибринированной крови, смешанной с равным объемом консерванта;

сыворотки морских свинок семи типов и актуальных для стран-членов СЭВ вариантов вируса ящура с титром в РСК не ниже 1:20;

антигены ящурные эталонные семи типов и актуальных для стран-членов СЭВ вариантов вируса с титром в РСК не ниже 1:4;

сыворотки и антигены для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний свиней;

кислоту борную дважды перекристаллизованную;

веронал;

мединал;

глюкозу поГОСТ 975-75*;

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 975-88. - Примечание изготовителя базы данных.

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;

магний хлористый по ГОСТ 4209-77, х.ч.;

кальций хлористый по ГОСТ 4460-77, х.ч.;

среду питательную для культивирования клеток с 0,5% гидролизата лактальбумина (рН 7,4-7,6);

хлороформ по ГОСТ 20015-74* или флюорокарбон-113;

________________

* На территории Российской Федерации действуетГОСТ 20015-88. - Примечание изготовителя базы данных.

консервант для эритроцитов; приготовленный следующим образом: последовательно растворяют в 100 см дистиллированной воды 6 г глюкозы, 4,5 г борной кислоты, дважды перекристаллизованной, и 0,85 г хлористого натрия. Полученный раствор стерилизуют кипячением в течение 3 дней по 30 мин;

раствор буферный веронал-мединаловый концентрированный, приготовленный следующим образом: растворяют в 1000 см кипящей дистиллированной воды 83 г хлористого натрия, 18,4 г веронала, 1,15 г хлористого магния и 0,22 г хлористого кальция. Раствор охлаждают, затем растворяют 0,22 г мединала, стерилизуют автоклавированием и хранят при температуре 4 °С. Рабочий раствор готовят непосредственно перед постановкой РСК разбавлением концентрированного раствора четырьмя объемами дистиллированной воды.

2.1.2. Подготовка к исследованию

2.1.2.1. Суспензии стенок и содержимого афт, полученные в соответствии с пп.1.5, 1.6 и 1.8, разводят с 1:2 до 1:32 0,15 М раствором хлористого натрия, вероналовым буфером или средой для культивирования клеток и разливают в серологические пробирки по 0,1 см или в лунки панелей для микросерологических реакций по 0,025 см. Число пробирок (лунок), заполняемых каждым разведением исследуемой суспензии, должно быть равно числу штаммоспецифических сывороток и контролей на антикомплементарность и гемолитические свойства.

2.1.2.2. Для приготовления гемолитической системы эритроциты барана трехкратно отмывают от консерванта 0,15 М раствором хлористого натрия, каждый раз осаждая их центрифугированием с частотой вращения 600 об/мин в течение 5-7 мин и готовят рабочую суспензию смешиванием 2 смосадка с 98 смразбавителя. К полученной суспензии эритроцитов при постоянном перемешивании приливают постепенно равный объем гемолизина, разведенного 0,15 М раствором хлористого натрия с таким расчетом, чтобы его конечное разведение было в 4 раза концентрированнее предельного гемолитического титра, указанного на этикетке. Затем суспензию выдерживают в течение 15-20 мин в водяной бане при температуре 37 °С или при комнатной температуре.

При постановке РСК на панелях для микрореакций концентрацию эритроцитов в гемсистеме увеличивают в 2 раза.

2.1.2.3. Для приготовления рабочего разведения комплемента содержимое нескольких ампул с сухим препаратом растворяют в первоначальном объеме дистиллированной воды, определяют предельный титр, обусловливающий гемолиз 50% эритроцитов гемсистемы, приготовленной согласно п.2.1.2.2, и разводят 0,15 М раствором хлористого натрия или вероналовым буфером из расчета 5 CH в 0,1 см(если РСК ставят в пробирках) или в 0,025 см(при постановке РСК на панелях для микрореакций).

2.1.2.4. Рабочие разведения типоспецифических ящурных сывороток готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или вероналовом буфере из расчета получения раствора в 2 раза более концентрированного, чем их предельный титр, т.е. они должны содержать 2 сывороточных единицы (СЕ). Вариантноспецифические сыворотки разводят до предельного титра. Вместо типоспецифических сывороток могут быть использованы вариантноспецифические в предельном, двух- и четырехкратном титрах (1, 2 и 4 СЕ).

2.1.2.5. Рабочие разведения эталонных (контрольных) яшурных антигенов готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или вероналовом буфере. Они должны быть в 2 раза концентрированнее, чем их предельный титр, т.е. должны содержать 2 антигенных единицы (АЕ).

2.1.2.6. Рабочие разведения сывороток и антигенов для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний сельскохозяйственных животных готовят по пп.2.1.2.4 и 2.1.2.5.

2.1.3. Проведение исследования

2.1.3.1. В пробирки (лунки), заполненные в соответствии с п.2.1.2.1, вносят равные объемы штаммоспецифических сывороток, взятых в рабочем титре, и рабочего разведения комплемента, содержащие 5 CH. В контролях исследуемого патологического материала на антикомплементарность заменяют сыворотки равным объемом разбавителя, а в контроле на гемолитические свойства - разбавителем заменяют и комплемент. Все полученные смеси тщательно встряхивают и помещают в водяную баню пли термостат при 37 °С на 30 мин, после чего к ним добавляют суспензию эритроцитов, сенсибилизированных гемолизином, в объеме 0,2 см(пробирки) или 0,05 см (лунки), энергично встряхивают и выдерживают при 37 °С в течение 20 мин.

Пробирки или панели извлекают из термостата или водяной бани и осаждают эритроциты центрифугированием в течение 5 мин с частотой вращения 600 об/мин или отстаиванием в течение 2-3 ч при комнатной температуре.

При исследовании недоброкачественных афтозных материалов, а также при исследовании сердечной мышцы объем исследуемых суспензий увеличивают в 4 раза при сохранении объема и концентрации остальных компонентов реакции в обычных пределах.

Для повышения чувствительности РСК применяют реакцию длительного связывания комплемента (РДСК), при которой первая фаза протекает при 4 °С в течение 16-20 ч.

2.1.4. Обработка результатов

Оценку результатов проводят визуально.

Реакцию считают положительной, если в ряду пробирок (лунок) с какой-либо штаммоспецифической сывороткой отмечается задержка гемолиза не менее 50% эритроцитов при полном гемолизе в параллельных рядах с другими штаммоспецифическими сыворотками и в контроле с пробами патологического материала на антикомплементарность. Возбудитель относится к тому варианту вирусов ящура, с сывороткой которого титр исследуемой суспензии окажется выше.

Отрицательная реакция не исключает ящура или иного сходного с ним заболевания, поскольку концентрация вирусоспецифического антигена в исследуемом материале может оказаться слишком низкой для обнаружения в РСК.

2.2. Методы выявления вируса

Сущность методов заключается в выявлении биологического действия вируса на восприимчивые и чувствительные биологические системы и его последующей идентификации серологическим методом.

2.2.1. Аппаратура, материалы и растворы

2.2.1.1. Для проведения исследования применяют:

термостат с температурой нагрева 37 °С;

пипетки вместимостью до 10 см с ценой деления 0,01 см по ГОСТ 20292-74;

культуры монослойные первичных клеток почки свиней (СП), телят, взрослого крупного рогатого скота (ВП) и ягнят (ПЯ) и перевиваемых линий ВНК-21 и IB-RS-2 в пробирках и флаконах вместимостью 50, 100, 500 и 1000 см;

среду питательную для культивирования клеток с 0,5% гидролизата лактабумина (рН 7,4-7,6);

среду питательную Игла для культивирования клеток перевиваемых линий;

раствор Хенкса солевой, рН 7,2-7,4.

2.2.2. Подготовка к исследованию

2.2.2.1. Суспензии стенок и содержимого афт, полученные в соответствии с пп.1.5, 1.6 и 1.8, и оказавшиеся неактивными в РСК, а также суспензии лимфатических узлов, сердечной мышцы, поджелудочной железы, свернувшейся крови и пищеводно-глоточную слизь, полученные в соответствии с пп.1.7 и 1.9, используют для заражения монослойных культур первичнотрипсинизированных клеток (СП, ВП, ПЯ, щитовидной железы крупного рогатого скота), перевиваемых линий (ВНК-21 и IB-RS-2), десять мышат 3-6-дневного возраста и пять морских свинок. Допускается заражение двух голов крупного рогатого скота в 18-месячном возрасте и четырех поросят 3-месячного возраста, не содержащих в крови специфических антител.

2.2.3. Проведение исследования

2.2.3.1. Проведение биопробы на культурах клеток

Отбирают пробирки (флаконы) с хорошо сформированным монослоем без признаков старения и неспецифической дегенерации. На каждую пробу исследуемого материала берут по 10 пробирок или по 2-3 флакона с перечисленными клеточными культурами. Непосредственно перед инокуляцией культуры дважды отмывают от ростовой питательной среды раствором Хенкса. Затем в пробирочные культуры вносят по 0,1-0,2 см, а во флаконы от 0,5 до 10 см (в зависимости от площади монослоя) исследуемых суспензий. Инокулированные культуры выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 60 мин, затем освобождают от исследуемой суспензии и заливают поддерживающей питательной средой. Одновременно ставят контроль на цитотоксичность раствора Хенкса. Инокулированные контрольные культуры помещают в термостат при температуре 37 °С и в течение 7 дней проводят микроскопию для выявления дегенерации клеток. В случае обнаружения дегенерации только в инокулированных культурах проводят дополнительный пассаж культуральной суспензии, полученной после однократного промораживания культур с дегенерацией монослоя при температуре минус 20 °С. Полученную при этом суспензию осветляют центрифугированием в течение 15 мин с частотой вращения 3000 об/мин и затем заражают исходные культуры в том же порядке, который предусмотрен для исследуемых суспензий проб патологического материала.

Специфичность дегенерации клеток проверяют в РСК.

2.2.3.2. Постановка биопробы на животных

Биопробу ставят на морских свинках, мышатах 3-6-суточного возраста и естественно-восприимчивых к ящуру животных.

Используют клинически здоровых особей, в анамнезе которых полностью исключены предварительные контакты с вирусом ящура. Мышатам исследуемую суспензию инокулируют подкожно в дозе 0,1 см, морским свинкам - в кожу подушечек обеих задних конечностей методом тунелирования в дозе 0,2-0,5 см. Крупному рогатому скоту материал вводят в толщу эпителия языка и в мякиш всех конечностей в дозе 2-3 см. За инокулированными животными наблюдают в течение 7 дней. В случае гибели подопытных мышат проводят дополнительный пассаж материала, приготовленного из тушек павших мышат, и исследование в РСК в соответствии с п.2.1.

При появлении у остальных видов животных везикулярных поражений кожи в местах инокуляции исследуемого материала отбирают пробы содержимого афт в соответствии с п.1.2, готовят из них суспензии в соответствии с пп.1.5 и 1.6 и исследуют в РСК в соответствии с п.2.1.

2.2.4. Обработка результатов

2.2.4.1. Пробу исследуемого патологического материала считают отрицательной, если во втором и последующем пассажах не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышат, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.

Заключение