Довгозбережне середовище для кріоконсервації сперми бугаїв та способи його виготовлення

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА УААН

ПАВЛЕНКО Людмила Миколаївна

УДК 57.08:636.22/.28.453.5

ДОВГОЗБЕРЕЖНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ КРІОКОНСЕРВАЦІЇ СПЕРМИ БУГАЇВ-ПЛІДНИКІВ ТА СПОСОБИ ЙОГО ВИГОТОВЛЕННЯ

3.00.20 - біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Харків - 1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в інституті тваринництва УААН.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, академік УААН Осташко Федір Іванович.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Бугров Олексій Дмитрович, головний науковий співробітник відділу біотехнології та генної інженерії Інституту тваринництва УААН;

кандидат біологічних наук Крамар Марія Йосипівна, науковий співробітник Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Провідна установа: Державний науково-дослідний інститут ветеринарних препаратів і кормових добавок. Львів

Захист дисертації відбудеться “23” березня 1999 року о 10-00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.65.356.02 при інституті тваринництва УААН.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці інституту тваринництва УААН. Просимо прийняти участь в засіданні Ради, або вислати відгук в двох примірниках, затверджених печаткою.

Адреса інституту: 312120, м. Харків, п/в Кулиничі

Автореферат розіслано “ 16 ” лютого 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат с.-г. наук Ф. М. Снегур

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В реалізації крупномасштабної селекції тварин одне з провідних місць займає штучне осіменіння.

Основою докорінної перебудови організації штучного осіменіння став метод глибокого заморожування і тривалого зберігання сперми плідників сільськогосподарських тварин, на основі фундаментальних досліджень вітчизняних та зарубіжних вчених: (І.І.Іванов, 1910; В.К.Мілованов, 1962; І.В.Смірнов, 1949; Ф.І.Осташко, 1968; Е.П.Платов, 1961; О.Д.Бугров, 1964; C.Polge, A.U.Smith, A.S.Parkes, 1948, 1949; H.Nagase, T.Niwa, 1964; R.Cassou, 1964; L.Simmet, 1972). Завдяки виключній ефективності він став основним елементом національних програм по розмноженню і покращенню тварин всіх цивілізованих країн світу. Однак, деякі вирішальні аспекти технології кріоконсервації сперми вивчені недостатньо, що не дає змоги використовувати його з максимальною ефективністю. Реалізація потенційних можливостей методу кріоконсервації сперми всіляко залежить від складу штучних середовищ та їх санітарних властивостей.

Обов'язковим антишоковим компонентом відомих середовищ є жовток курячих яєць, що обмежує строки зберігання і не дає можливості централізованного виготовлення та постачання їх племінним підприємствам. Крім того, жовток будучи хорошим живильним середовищем для мікроорганізмів в ряді випадків є носієм патогенної і сапрофітної мікрофлори, яка негативно впливає на сперму, а також на відтворювальну функцію і стан здоров'я самиць. У зв'язку з цим виникла настійна необхідність створення стерильних довгозбережних екологічно чистих середовищ для кріоконсервації сперми плідників.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках науково-технічних комплексних програм ВАСГНІЛ осх. 42.0107.Н3; осх. 77.08.02/№№ держреєстрації 010001316р; 01.8600048.345 та НТР УААН на 1991-1995 рр. “Удосконалити методи кріоконсервації та довгозбереження сперми сільськогосподарських тварин з метою максимального використання генетичних резервів племінного тваринництва”, “Розробити перспективні моделі господарств по виробництву молока, забезпечуючих високу продуктивність тварин, покращуючих якість при зниженні витрат кормів, праці та фінансів”.

Мета досліджень - розробити і впровадити стерильне довгозбережне середовище для кріоконсервації сперми бугаїв, стандартизоване за біохімічними і санітарними показниками та способи його виготовлення і удосконалити на цій основі технологію кріоконсервації сперми плідників.

Завдання досліджень:

1. Розробити спосіб одержання з нативного жовтка компонента з антишоковими властивостями.

2. Вивчити захисні властивості компоненту при охолоджуванні на спермі бугая, барана та кнура.

3. Розробити склад термостабільного довгозбереженого середовища для кріоконсервації сперми бугаїв і термічний спосіб його стерилізації.

4. Розробити спосіб хіміко-термічної стерилізації середовища з нативним жовтком.

5. Розробити асептичний спосіб та пристрій для оцінки сперми в герметичних упаковках.

6. Провести науково-виробничий та широкий виробничий дослід і впровадити розроблене середовище в виробництво.

Наукова новизна та теоретична цінність досліджень. Вперше установлено, що екстракт жовтка в складі кріопротективного середовища після термообробки зберігає свої попередні біологічні властивості і забезпечує захист статевих клітин при кріоконсервуванні, аналогічно нативному жовтку. На цій підставі створено термостабільне стерильне середовище, де нативний жовток замінено термостабільним антишоковим компонентом (а.с. СРСР № 745045).

Вперше установлено ефект збільшення виходу антишокового компоненту після екстрагування його із заморожено-відталого жовтка.

Вперше вивчена дія антисептика - перекису водню в складі середовища для кріоконсервації сперми і виявлена ефективна сінергідна антимікробна дія його спільно з прогрівом 65-75°С, що забезпечує повну стерильність термолабільного середовища і не знижує його захисних властивостей при кріоконсервації сперми. На цій основі створено стерильне, довгозбережне жовтокутримаюче середовище для кріоконсервації сперми і спосіб його виготовлення (патент СРСР № 1828582 і патент України № 13138).

Вперше винайдено спосіб та розроблено пристрій для асептичної оцінки сперми в герметичній упаковці (а.с.CРСР № 1543598).

Практичне значення роботи. Отримані результати дали можливість виділити з нативного жовтка термостабільний антишоковий компонент і використати його в науково-дослідній роботі при розробці термостабільного довгозбережного середовища для кріоконсервації сперми бугаїв.

Виявлення антимікробної дії перекису водню в жовтокутримаючих середовищах дозволило створити довгозбережене середовище для кріоконсервації сперми і технологію його виробництва, яка схвалена і рекомендована для впровадження Міжвідомчою комісією Мінагропрому України (протокол № 7 від 10 квітня 1992 р.). На цій підставі організовано централізоване виробництво середовищ і постачання їх племінним підприємствам України і Російській Федарації (акт впровадження МНВА “Ембріон” від 3 січня 1998 р.), що виключило можливість забруднення сперми і статевих шляхів самиць при штучному осіменінні мікрофлорою, яка може передаватись нестерильними розбавлювачами.

З метою підвищення санітарно-гігієнічного рівня роботи пунктів штучного осіменіння і раціонального використання сперми, створено і впроваджено в виробництво асептичний спосіб та пристрій для оцінки сперми в герметизованих спермодозах.

Особистий внесок дисертанта в розробку наукових результатів, що виносяться на захист. Дисертаційна робота виконана особисто автором, самостійно проведені всі експериментальні та теоретичні дослідження, науково-виробничі досліди проведені з особистою участю автора на базі експериментально-методичної станції штучного осіменіння дослідного господарства “Українка”, Харківського племоб'єднання та Міжнародної науково-виробничої асоціації “Ембріон”.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень і основні положення дисертації викладені і обговорені в доповідях Всесоюзної конференції “Кріобіологія і кріомедицина”, 1984, Харків; 10 th International Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination (10-14 June, 1984 - Illinois, U.S.A.); науково-виробничій конференції “Новые методы и биотехнология в животноводстве”, 1991, Киев; Міжнародній конференції “Успехи в современной криобиологии” (21-25 апреля 1992, Харьков). В повному об'ємі результати досліджень обговорювались на об'єднаному засіданні відділів біології розмноження та штучного осіменіння сільськогосподарських тварин, біотехнології відтворення тварин та фізіології сільськогосподарських тварин.

Основні результати дисертації викладені у 3 наукових працях, 5 матеріалах наукових конференцій і конгресу, 2 авторських свідоцтвах, 2 патентах України та Росії.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, основної частини, висновків, рекомендацій виробництву, доповнення і списку використаних джерел. Робота викладена на 132 сторінках машинописного друку, містить 24 таблиці, 3 ілюстрації, 9 додатків. Список літератури включає 212 джерел, в тому числі 62 іноземних авторів.

Матеріали і методи досліджень

Об'єктом досліджень були: сперма бугаїв, баранів і кнурів, жовток курячих яєць і його компоненти, самиці великої рогатої худоби. Термостабільний антишоковий компонент вилучали з жовтка екстрагуванням на сконструйованому нами пристрої. Відмивання сперміїв від захисних компонентів здійснювали центрифужним методом, пробу на температурний шок проводили за ДЕСТ 20909.4-75. Підбір компонентів середовища проводили методом зустрічних рядів за В.К.Міловановим, 1962. Осмотичний тиск середовища вимірювали кріоскопічним методом. Концентрацію водневих йонів (рН) визначали на іонометрі ЕВ-74 (за ДЕСТ 20909.5-75). Заморожували сперму за Харківською технологією. Рухливість, виживаність в годинах, показник абсолютної виживаності сперміїв визначали, згідно з чинними ДЕСТами на нативну і заморожену сперму (ДЕСТ 23745-79, ДЕСТ 26030-83, ДЕСТ 27777-88). Дослідження експериментальних зразків середовищ на бактеріологічну забрудненість проводили за методикою, затвердженою ГУВ МСГ СРСР, 1969. Всі дослідження виконували на розділених еякулятах.

В усіх дослідах при вивченні запліднюючої здатності порівняльні групи тварин при осіменінні підбирали за принципом пар-аналогів. Самиць осіменяли двократно в одну охоту мано- або візоцервікальним способом. Отримані дані піддавали статистичній обробці загальноприйнятими методами. Оцінку результатів проводили за критерієм Стьюдента. Різниця вважалась вірогідною при Р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Як свідчать отримані результати компоненти курячого жовтка екстраговані органічними розчинниками (спирт, ефір) і введені в середовище для розбавлення сперми в концентрації 3% запобігають температурному шоку статевих клітин бугая, барана та кнура на одному рівні з 30%-ною концентрацією нативного жовтка, про що свідчать дані таблиці 1.

З таблиці 1 видно, що рухливість сперміїв бугая в середовищі з нативним жовтком до шоку становила 7,1 балів, а після шоку 3,9 балів, різниця між показниками рухливості статевих клітин була високовірогідною (Р < 0,001), при цьому коефіціент кріорезистентності (R) становив 0,55. В досліді рухливість сперми, розбавленої розріджувачем з вмістом антишокового компоненту становила 6,8 балів, а після шоку 3,95 балів, при цьому коефіціент кріорезистентності становив 0,58, що було на рівні контролю.

При вивченні зв'язку антишокового компоненту з цитоплазматичними мембранами статевих клітин проводили багаторазове центрифужне відмивання його від сперміїв ізотонічним цукрово-сольовим буфером з послідуючим визначенням стійкості їх до температурного шоку. При цьому на спермі бугая коефіціент кріорезистентності (R) становив після першого відмивання 0,58, після п'ятого 0,58. В контролі ці показники були відповідно 0,55 і 0,61. Різниця між дослідом і контролем була статистично невірогідна (Р > 0,5). Аналогічна залежність виявлена і в дослідах на статевих клітинах барана і кнура. Показник рухливості сперміїв бугая після розбавлення і послідуючих відмивань в дослідних і контрольних зразках вірогідно знижувався (Р < 0,01), а коефіцієнт кріорезистентності лишався на одному рівні (Р > 0,5). З даних дсліджень витікає, що антишоковий компонент (3%) і нативний жовток (30%) захищають спермії бугая, барана і кнура від температурного шоку на одному рівні.

асептичний жовток стерилізація сперма

Таблиця 1 Вплив антишокового компоненту і нативного жовтка в середовищі на кріорезістентність сперміїв бугая, барана і кнура

Етапи обробки	Рухливість сперміїв, бали	R-коефіціент кріорезістентності
сперми	середовище з жовтком	середовище з антишоковим компонентом	середовище з жовтком	середовище з антишоковим
	до шоку	після шоку	до шоку	після шоку		компонентом
Сперма бугаїв (12)
Розбавлення	7,1±0,18	3,95±0,22	6,8±0,25	3,95±0,14	0,55±0,1*	0,58±0,24*
Відми-вання	5,9±0,18	3,4±0,29	5,8±0,20	3,1±0,28	0,57±0,04*	0,55±0,04*
Сперма баранів (10)
Розбав-лення	6,3±0,11	2,4±0,15	6,4±0,13	2,3±0,13	0,38±0,02*	0,35±0,02*
Відми-вання	6,2±0,08	2,3±0,15	6,2±0,08	2,2±0,11	0,37±0,03*	0,35±0,03*
Сперма кнурів (15)
Розбав-лення	6,5±0,34	2,6±0,3	6,6±0,34	2,7±0,3	0,40±0,05*	0,40±0,03*
Відми-вання	6,2±0,4	2,6±0,4	6,1±0,6	2,8±0,4	0,41±0,04*	0,45±0,03*

* Вірогідність різниці (Р > 0,5).

Захисна дія екстракту пояснюється утворенням на поверхні мембрани спермія ліпопротеїнового прошарку, запобігаючого пошкоджуючій дії холоду. Збереження цього прошарку після багаторазового відмивання свідчить про міцний хімічний зв'язок антишокового компоненту з мембранами клітини, що узгоджується з дослідженнями Ф.І.Осташко, М.П.Павленко, 1976; М.П.Павленко, 1981 і експериментально підтверджено J.Fulkes, 1978, який також спостерігав міцний зв'язок ліпідів жовтка, мічених радіоактивним вуглецем С17 з плазматичними мембранами сперміїв, назвавши цей зв'язок хімічним.

Таким чином, нашими дослідженнями вперше визначено рівень захисту статевих клітин компонентами жовтка від температурного шоку і підтверджена модель (Ф.І.Осташко, 1963) захисної дії жовтка на живі клітини. Отримані результати відкривали перспективу створення штучних середовищ для різних видів тварин з кращими санітарними, біологічними, екологічними і технічними показниками.

Значний інтерес представляє питання вивчення можливості заміни нативного жовтка в штучних середовищах його компонентами при глибокому заморожуванні сперми бугаїв.

Для проведення дослідів нами були отримані і використані для досліджень спиртовий, ефірний, спирт-ефірний і ацетоновий екстракти жовтка. В результаті проведених досліджень установлено, що найбільш високу антишокову дію при кріоконсервації сперми проявляють ефірний і спиртовий екстракти. Рухливість сперми в ефірному екстракті після розморожування становили 4,3 балів і виживаність (Sa) 22,4 одиниці, в спиртовому екстракті ці показники становили 4,2 і 21,2, відповідно. Високовірогідне зниження рухливості сперміїв в порівнянні з контролем (Р < 0,001) після кріоконсервації відмічено в ацетоновому екстракті. При визначенні оптимальної концентрації екстракту жовтка в штучному середовищі сперму, розбавлену розбавлювачами випробували на стійкість до температурного шоку і на виживаність її при температурі 0...+5°С. Одержані результати свідчать, що в даних умовах оптимальна концентрація екстракту в середовищі становила 3%. При цьому коефіціент резистентності статевих клітин до температурного шоку був на одному рівні з контролем R = 0,76.

З метою удосконалення способу отримання антишокового компоненту вивчали вплив руйнівної дії низької температури на кількісні та якісні показники екстракту, вилученного з жовтка після обробки його рідким азотом. Ступінь руйнівної дії на структуру жовткових кульок нативного жовтка встановлювали мікрофотографуванням суспензії жовтка до і після кріообробки. Встановлено, що після глибокого заморожування і послідуючого відтанення дослідних зразків жовтка спостерігаються деструктивні зміни жовткових кульок і вихід з них ліпопротеїнів у вигляді окремих острівків.

Отриманий ефект базується на внутриклітинній кристалізації води і механічному пошкодженні кристалами плазматичних мембран.

Результати вивчення компоненту показані в таблиці 2, які свідчать про те, що вихід антишокового компоненту в досліді становив 16,4%, проти 11% в контролі. При порівнянні кількісних показників дослідних і контрольних проб, різниця між ними на користь досліду була високовірогідною (Р < 0,001) і була вищою за массою в 1,5 рази, при повному збереженні якісних властивостей.

Таким чином, встановлено, що попередня кріообробка нативного жовтка заморожуванням до -196°С призводить до деструкції жовткових кульок і виходу з них ліпопротеїнових сполук, що дало змогу розробити спосіб збільшення виходу антишокового компоненту при екстрагуванні з жовтка.

Таблиця 2.

Вплив умов кріообробки жовтка на вихід антишокового компоненту

Види обробок жовтка перед екстрагуванням	Вихід екстракту, % Номери дослідів 1 2 3 4 5 6 7	В середн.,%
Нативний жовток (контроль)	8,8	12	12,2	12,2	13,2	8,8	10,2	11,0
Замороженний жовток	13,2	18,2	15,0	19,8	19,8	14,6	15,0	16,4
Різниці, Р	+	+	+	+	+	+		0,001

Важливим етапом досліджень був пошук оптимальних режимів стерилізації середовища, яке містить антишоковий компонент і вивчення його ефективності після довгострокового зберігання. Досліджували можливість термічної стерилізації середовищ шляхом кип'ятіння та автоклавування.

В дослідні зразки вносили модельну мікрофлору (Bac.Subtilis). Простерилізовані середовища перевіряли на бактеріальну забрудненість та її вплив на біологічні показники сперми після кріоконсервації - відтанення. Результати досліду представлені в таблиці 3.

Встановлено, що стерилізація кип'ятінням (10...30 хв.), автоклавуванням при 0,5 атм. 20 хв. забезпечують повну стерильність середовища, а його кріозахисні властивості після термічної обробки в порівнянні з контролем не знизились відносно статевих клітин.

Вперше доведено, що при дії на антишоковий компонент середовища температурами, перевищуючими +100°С, він проявляє термостабільність і повністю зберігає свої попередні кріозахисні властивості, що дало змогу використати ефективні термічні способи стерилізації середовищ без погіршення їх фізико-хімічних і санітарно-біологічних характеристик. Дослідну партію проавтоклавованого середовища залишали при кімнатній температурі і випробували вплив строків зберігання середовища на його санітарні і кріозахисні властивості при заморожуванні сперми бугаїв. Результати досліджень свідчать про те, що зберігання простерилізованого середовища на протязі 2 років, забезпечило надійну його стерильність і збереження кріопротективних властивостей - рухливість сперми після розморожування становила 4,1 бали, виживаність в годинах - 9,3; показник абсолютної виживаності - 18,3, що не відрізнялось від використання жовтокутримаючого середовища, виготовленого ex tempore.

Таблиця 3 Вплив режимів стерилізації середовища на заморожено-відтанені спермії (n=14)

		Режим стерилізації (хв.)
Показники якості сперми	Контроль	Кип'ятіння	Автоклаву-вання 0,5 атм.
		10	20	30	20
Рухливість після отримання (бали), М±m	7,8±0,17	7,8±0,17	7,8±0,17	7,8±0,17	7,8±0,17
Рухливість при деконсервації, (бали), M±m	4,1±0,14	4,0±0,13	4,1±0,15	4,1±0,12	4,1±0,14
Виживаність в годинах при +38°С, M±m	8,5±0,5	8,1±0,6	8,4±0,8	8,6±0,8	8,6±0,7
Показник абсолютної виживаності при +38°С, ±m	22,1±1,4	21,7±1,8	22,1±2,1	23,5±1,7	23,5±1,6
Достовірність різниці, Р		>0,5	>0,5	>0,5	>0,5
Бактеріологічні дослідження	Суцільний ріст	стер.	стер.	стер.	стер.

Наступним етапом досліджень було визначення запліднюючої здатності сперми, законсервованої в довгозбережному штучному середовищі. Науковий дослід проведено в колгоспі ХХУ Партз'їзду Велико-Бурлукського району на 140 головах великої рогатої худоби. За даними ректальних досліджень і за розтеленнями встановлено, що заплідненість після першого осіменіння в досліді становила 71,2%, а в контролі 69,2, що було вище на користь досліду на 2%. Ці результати свідчать про те, що використання збереженого при кімнатній температурі протягом 2 років середовища для кріоконсервації сперми забезпечило запліднюючу здатність самиць на одному рівні зі спермою, законсервованою в стандартному середовищі, виробленому перед розбавленням сперми. Науково-виробничий дослід проведено в колгоспах “Росія” Ново-Миколаївського району Запоріжської області; “Ленінська Іскра” Охтирського району Сумської області і дослідному господарстві “Українка” інституту тваринництва УААН, де було осіменено 3299 корів і телиць спермою розділених еякулятів. З осіменених 1816 самиць дослідною спермою процент заплідненості після першого осіменіння складав в середньому 62,2%, що було вище в порівнянні з контролем на 2% і не відрізнялось від відповідних показників, отриманих в порівняльному науковому досліді.

Одержані позитивні результати ефективності використання термостабільного довгозбережного середовища дають підставу для організації централізованого його виробництва на підприємствах фармакологічної і біологічної промисловості. Однак, це пов'язано з додатковими капіталовкладеннями. Тому, на період вирішення цього питання виникла необхідність пошуку і практичного застосування простих, ефективних і дешевих способів стерилізації жовтокутримаючих середовищ. На нашу думку, за своїми фізико-хімічними властивостями для стерилізації середовищ, найбільш ефективним антисептиком може бути перекис водню.

Для вивчення дії антисептика провели дослідження по визначенню ступеня токсичності різних концентрацій 33%-ного перекису водню до сперми бугаїв і рівня його бактерицидної дії в складі середовища з жовтком. Установлено, що перекис водню в концентрації 0,02...0,03% не впливає токсично на статеві клітини. При концентрації 0,02% відмічено стимулюючу дію продуктів розпаду Н2О2 на спермії. При цьому середня виживаність статевих клітин була вища в порівнянні з контролем на 2 години, показник абсолютної виживаності на 4,6 одиниць (59,7 в досліді проти 55,1 в контролі), а бактерицидна дія дослідного антисептика в середовищі проявлялась вже при 0,03%.

Установлено, що при замороженні сперми в середовищі з вмістом антисептика в концентрації 0,02...0,03% рухливість сперміїв після деконсервації склала 4,8 проти 4,4 балів, в контролі. Така ж залежність була відмічена і за показником її абсолютної виживаності 22,3 проти 20,3%. Що-до бактерицидного впливу Н2О2 на мікрофлору очевидно, що при її концентрації 0,02% в середовищі зафіксована наявність (8-10 мікроорганізмів в 1 мл), а починаючи з 0,03% концентрації і вище всі зразки були стерильними, а в контролі спостерігався суцільний ріст мікрофлори.

Разом з цим відмічено, що перекис водню в дозах, перевищуючих 0,03% поряд з бактерицидною дією проявляє токсичну дію на спермії. Ймовірно це поянюється тим, що при підвищенних концентраціях перекису водню не всі атоми кисню встигають об'єднатись в молекули і вони діють на статеві клітини в такій же мірі згубно, як і на мікроорганізми за рахунок атомарного кисню.

Для вивчення сінергідної дії Н2О2 спільно з термообробкою, а також визначення мінімальної концентрації бактерицидної хімічної речовини провели спеціальні дослідження,результати яких показані в таблиці 4. Дані таблиці вказують на те, що використаний сінергідний спосіб стерилізації забезпечив стерильність середовища при дозах антисептика 0,1...0,01% на 100 мл. Такий режим стерилізації дозволив знизити стерилізуючу дозу Н2О2 в 10 разів і уникнути токсичності антисептика.

Таблиця 4 Визначення мінімальної стерилізуючої дози Н2О2 спільно з нагрівом при +65° С/40 хв.

Показники	Контроль	Кількість Н2О2 (мл) в середовищі
		0,1	1,09	0,08	0,07	0,06	0,05	0,04	0,03	0,02	0,01
Рівень бактеріальної забрудне-ності	106	106	106	106	106	106	106	106	106	106	106
Результати бактеріологічних досліджень	++++ суц. ріст	стер	стер	стер	стер	стер	стер	стер	стер	стер	стер

З метою отримання максимального сануючого ефекту від сінергідного способу стерилізації визначали допустиму верхню межу нагріву середовища з жовтком.

В результаті досліджень установлено, що оптимальним режимом прогріву середовища з жовтком були температури +65...75°С при експозиції 40 - 20 хвилин. Ескпозиція дослідних зразків при температурі + 60°С не гарантувала санації середовища, а підвищення температури до + 80°С призводило до денатурації жовтка.

Аналізуючи результати дослідів по розробці хіміко-термічного способу стерилізації на основі використання перекису водню з дозованим нагрівом дійшли висновку, що він забезпечує стерилізацію і може бути застосований для санації біологічних середовищ з вмістом термолабільних компонентів. Далі вивчали вплив довгозбережного середовища після хіміко-термічної стерилізації на якісні показники сперми при кріоконсервуванні. За контроль брали середовище СДС-1 (стерильне довгозбережне середовище) стерилізоване радіаційним методом. Порівняльні результати досліджень представлені в таблиці 5

Дані таблиці свідчать, що хіміко-термічний спосіб стерилізації середовищ не впливає негативно на статеві клітини в процесі їх заморожування. Установлено з вірогідністю (Р < 0,001), що запропонований спосіб виготовлення середовища сприяє покращанню біологічної активності сперміїв при консервуванні в порівнянні з середовищем простерилізованим прискореними електронами, про що свідчить показник абсолютної виживаності сперми - 23,9 одиниць в досліді, проти 15,5 одиниць в контролі.

Таблиця 5 Вплив способу стерилізації на заморожено-відтаяні спермії (n=10)

Показники сперміїв	Радіаційний (контроль)	Хіміко-термічний	Вірогідність, Р
Рухливість після розбавлення, бали	7,6±0,01	7,6±0,01	>0,5
Рухливість після заморожування-відтанення,бали	4,0±0,01	4,2±0,02	>0,5
Виживаність сперміїв, години	7,0±0,05	9,0±0,05	<0,05
Показник абсолютної виживаності, Sa	15,5±0,02	23,9±0,15	<0,001

Отримані дані дали підставу для вивчення впливу строків зберігання середовища з жовтком після хіміко-термічної стерилізації на його бактеріологічні і біологічні показники. Перевірку середовищ досліджували зразу після їх виготовлення, а потім через 1, 6, 12 і 36 місяців зберігання в умовах кімнати. Контролем було середовище, виготовлене ex tempore.

Результати досліджень представлені в таблиці 6.

З таблиці видно, що всі дослідні зразки середовища, які зберігались в умовах кімнати на протязі експерименту були стерильні, що підтверджено Харківською науково-виробничою лабораторією, експертизи №№ 2805, 1807. Запропонований склад середовища і спосіб його виготовлення забезпечує кріозахист сперміїїв протягом всіх випробуваних строків зберігання (36 місяців). Отримано вірогідне покращення якості сперми після замороження в порівнянні з контролем за всіма показниками досліду.

З метою визначення остаточної біологічної повноцінності статевих клітин, законсервованих в досліджуваних довгозбережних середовищах була вивчена їх запліднююча здатність.

Осіменіння проводили в радгоспах “Мартівський” Чугуєвського району і “Чапаєва” Харківського району. Результати досліду свідчать, що використання сперми, законсервованої в середовищі після хіміко-термічної стерилізації дало позитивний ефект. Заплідненість після першого осіменіння в досліді склала 74,0%, проти 70,0% в контролі. Це свідчить про високий рівень запліднюючої здатності сперми, законсервованої в довгозбережному середовищі, яке містить жовток.

Таблиця 6 Вплив строків зберігання середовища в умовах кімнати на санітарні та біологічні показники сперми (n=17)

	М і с я ц і
Показники	0	1	6	12	36
сперми	Контроль	Дослід	Контроль	Дослід	Контроль	Дослід	Контроль	Дослід	Контроль	Дослід
Рухливість при отриманні, бали	7,9 ±0,2	7,9 ±0,2	7,9 ±0,2	7,9 ±0,2	7,9 ±0,2	7,9 ±0,2	7,7 ±0,2	7,7 ±0,2	7,8 ±0,2	7,8 ±0,2
Рухливість після заморожування-відтанення, бали	4,4 ±0,1	4,8 ±0,1	4,0 ±0,1	4,2 ±0,1	4,0 ±0,1	4,4 ±0,1	4,1 ±0,1	4,8 ±0,1	4,2 ±0,1	4,3 ±0,1
Показник абсолютної виживаності, Sa	20,3 ±1,5	21,7 ±1,3	17,5 ±1,3	19,1 ±1,2	22,9 ±1,5	23,9 ±1,5	23,7 ±1,0	24,4 ±1,1	22,9 ±1,2	23,4 ±1,2
Виживаність в годинах	9,0 ±0,5	9,4 ±0,9	7,3 ±0,2	7,7 ±0,3	8,5 ±0,4	9,0 ±0,5	9,0 ±0,5	9,0 ±0,5	8,7 ±0,4	9,0 ±0,5
Результати бактеріолог. досліджень	- стер.	- стер	- стер.	- стер.	- стер.	- стер.	- стер.	- стер.	- стер.	- стер.

Розробка довгозбережних середовищ для кріоконсервації сперми дала змогу усунути серйозніше джерело забруднення сперми мікроорганізмами, що дало можливість завершити комплекс асептичних засобів при кріоконсервації сперми за Харківською технологією.

В процесі вивчення довгозбережних середовищ було виявлено ще одну з їх переваг - прозорість. В першому варіанті це досягається за рахунок повного видалення жовткових кульок при екстрагуванні антишокового компоненту, в другому - за рахунок їх спонтанної седиментації при зберіганні середовища в ампулах.

Завдяки прозорості з'явилась можливість розробки асептичного способу та пристрою для оцінки якості сперми, безпосередньо в герметизованій спермодозі, що передбачається вимогами Харківської технології штучного осіменіння корів і телиць.

Розроблений спосіб підготовки доз для мікроскопії за рахунок іммерсійної системи і пристрій для мікроскопії сперми в еластичних упаковках забезпечує досягнення вірогідних результатів контролю якості сперми в порівнянні з загальноприйнятим способом мікроскопії роздавленої краплі сперми.

На завершення проведено широке виробниче дослідження по застосуванню довгозбережного середовища, стерилізованого хіміко-термічним способом і вивчена ефективність його використання при кріоконсервації сперми на племпідприємствах України і Росії.

На основі проведених дослідів нами розроблені технічні умови і регламент виготовлення довгозбережного середовища, а також організовано експериментальний біоцех по виготовленню середовищ.

Протягом досліду виготовлено і реалізовано племінним підприємствам 1137 літрів стерильного довгозбережного середовища. Законсервовано в дослідному середовищі 14,4 млн. спермодоз і осіменено 3,505 млн. корів і телиць. Заплідненість після першого осіменіння склала 61,8%. За результатами міжвідомчих випробувань середовище і спосіб його виготовлення рекомендовані для промислового виробництва.

Застосування довгозбережних середовищ в порівнянні с аналогами має слідуючі переваги: можливість промислого виготовлення середовищ і централізованого постачання їх племінним підприємствам; виключається можливість забруднення сперми і статевих шляхів самиць при їх осіменінні мікрофлорою середовищ; забезпечується раціональне використання хімреактивів і жовтка; досягається прозорість середовища, що забезпечує об'єктивну оцінку рухливості сперміїв, і дало змогу розробити асептичний спосіб мікроскопії сперми в герметизованих спермодозах.

ВИСНОВКИ

1. Компоненти жовтка курячих яєць екстраговані органічними розчинниками і введені в сперму в концентрації 3% запобігають температурному шоку статевих клітин бугая, барана і кнура на одному рівні з 30%-ною концентрацією нативного жовтка.

2. Встановлено міцний зв'язок антишокового компоненту жовтка з цитоплазматичними мембранами сперміїв. Багаторазове центрифужне його відмивання від сперміїв ізотонічним вуглеводно-сольовим буфером не позбавляє резистентності статевих клітин до температурного шоку.

3. Встановлено, що попередня кріообробка нативного жовтка заморожуванням до -196°С призводить до деструкції жовткових кульок і виходу з них ліпопротеїнових сполук, що дало змогу розробити спосіб збільшення виходу антишокового компоненту при екстрагуванні з жовтка в 1,5 рази.

4. Прогрівання розчинів антишокового компоненту при +100...110°С не впливає негативно на його термостійкі властивості і не порушує захисні якості відносно сперми, що дає змогу застосувати ефективні способи його стерилізації.

5. Розроблено середовище для кріоконсервування сперми бугаїв (а.с. № 745045), яке відрязняється тим, що з метою збереження високої санітарної і біологічної якості сперми, середовище містить замість жовтка термостабільний антишоковий компонент в такому співвідношенні інгрідієнтів: 11% розчин лактози 93,0, гліцерін мл 4,0, термостабільний антишоковий компонент 3.0.

6. Розроблено спосіб виготовлення середовища з антишоковим компонентом, який відрізняється тим, що з метою довгозбереження і уникнення мікробного фактору, середовище герметизують в ампули і прогрівають при 100...110°С протягом 20 хвилин, потім зберігають в умовах кімнати до моменту використання.

7. Встановлено, що 33%-ний перекис водню, внесений в термолабільне середовище в концентрації 0,02% стимулює рухливість і виживаність сперміїв при +38°С, а токсична його дія наступає з 0,07%-ної концентрації, що дозволило вперше застосувати цей антисептик для санації термолабільних середовищ.

8. Застосування нетоксичної дози Н2О2 (перекису водню) в середовищі спільно з прогрівом його при +70°С на протязі 20 хвилин, забезпечило стерильність попередньо забрудненого мікроорганізмами середовища і не знизило його захисних якостей в процесі кріоконсервування сперміїв. Рухливість сперміїв після деконсервації складала 4,8 бала проти 4,0 балів в контролі, а по показнику абсолютної виживаності 23,9 проти 15,5 одиниць, відповідно.

9. Запропонований нами склад і спосіб виготовлення середовища, яке містить жовток (патент Росії № 1828582 і Патент України № 13138) забезпечує збереження початкових кріопротективних і санітарних якостей його протягом 36 місяців зберігання в умовах кімнати, що дозволило організувати виробництво і централізоване постачання кріопротективного середовища племінним підприємствам.

10. На основі використання прозорих довгозбережних середовищ розроблено асептичний спосіб і пристрій (а.с. № 1543598) для оцінки сперми перед осіменінням самиць, безпосередньо в герметизованій спермодозі, що забезпечує чітку видимість сперміїв під мікроскопом, більш точну оцінку їх рухливості.

11. Проведено науковий і широкий виробничий дослід впровадження довгозбереженого середовища на 14 підприємствах України і Росії, в якому виготовлено 1137 літрів середовища, заготовлено 15,3 млн.спермодоз і осіменено 3 млн.500 тис.корів і телиць. Заплідненість від першого осіменіння складає 61,8%. При цьому вилучається джерело поширення збудників хвороб, які можуть передаватись з жовтком при штучному осіменінні і скорочуються витрати дорогокоштовних компонентів і реактивів.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Для підвищення санітарно-гігієничного рівня роботи племінних підприємств і запобігання збудників захворювань, які розповсюджуються з жовтком і іншими компонентами, а також для раціонального використання всіх компонентів середовища для кріоконсервації сперми бугаїв пропонується фармзаводам, біофабрикам і племоб'єднанням два варіанти довгозбережних середовищ:

- середовище, яке містить термостабільний антишоковий компонент замість нативного жовтка і його термічну стерилізацію при 110°С протягом 20 хвилин (а.с. СРСР № 745045);

- середовище, яке містить жовток і хіміко-термічний спосіб стерилізації, включаючий в середовище фармакопейний перекис водню (Н2О2) в концентрації 0,02...0,03% і прогрів його при +70°С протягом 20 хвилин (патент СРСР № 1828582, патент України № 13138).

2. З метою підвищення санітарно-гігієничного рівня та раціональної праці пунктів штучного осіменіння тварин пропонується неушкоджуючий асептичний спосіб та пристрій для оцінки рухливості сперміїв при мікроскопії в герметичних упаковках (а.с.СРСР № 1543598).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ АВТОРОМ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. А.с. №745045. Среда для криоконсервации спермы / Ф.И. Осташко, М.П.Павленко, Л.Н.Павленко (СССР).- № 2623106/30-15; Заявлено 1.06.78; Зарег. в ГРИ СССР 7.03.80.гриф:”Не подлежит опубликованию в открытой печати”.

2. Ostashko F.I., Pavlenko M.P., Pavlenko L.N. Antishock effect of yolk and components in cooling spermatozoids of bull, ram and boar/10th International Congress on Animal Reproduction and A.I.- Illinois (USA).- 1984.- V.1.- P. 209-211.

3. Павленко Л.Н. Криоконсервация спермы быков в долгохранящейся термостабильной среде //Всесоюзная конференция криобиологии и криомедицины.- Харьков, 1984.- Т.2.- С. 245.

4. Павленко М.П., Павленко Л.Н. Изучение защитных свойств антишокового компонента желтка на сперме быков, баранов и хряков при криовоздействии //Всесоюзная конференция криобиологии и криомедицины.- Харьков, 1984.- Т.2.- С. 246.

5. А.с. 1543598 СССР. Устройство для микроскопии спермы и эмбрионов в эластичных капсулах /Ф.И.Осташко, М.П.Павленко, Л.Н.Павленко, Г.Н.Кузнецов.- № 44528131/30-15; Завлено 14.04.88; Зарег. в ГРИ СССР 15.10.89.

6. Осташко Ф.И., Павленко М.П., Павленко Л.Н. Долгохранящаяся среда для спермы и ее влияние на выживаемость и оплодотворяющую способность спермиев быков при криоконсервации //Научно-производственная конференция “Новые методы и биотехнология в животноводстве”.- К.: Госагропром УССР, 1991.- С.38-39.

7. Осташко Ф.И., Павленко М.П., Павленко Л.Н. Жидкие долгохранящиеся среды для криоконсервации спермы быков //Тезисы 11 международной конференции 21-25 апреля 1992 “Успехи в современной биологии” / Институт криобиологии и криомедицины АН Украины.- Харьков, 1992.- С.134-135.

8. Осташко Ф.І., Павленко М.П., Павленко Л.М. Методика визначення антишокових властивостей захисних компонентів в розбавлювачах при дії низьких температур на спермії // Нове в методах зоотехнічних досліджень Інститут тваринництва УААН.- Харків, 1992.- С.138-142.

9. Пат. 1828582 СССР. Среда для криоконсервации спермы и способ ее приготовления / Ф.И.Осташко, М.П.Павленко, Л.Н.Павленко (СССР).- № 4948632; Заявлено 8.04.91; Зарег. в ГРИ СССР 13.10.92. гриф. “Не подлежит опубликованию в открытой печати”.

10. Осташко Ф.І., Павленко М.П., Павленко Л.М. Рідкий довгозбережений розбавлювач для кріоконсервації сперми плідників // Основні наукові розробки інституту для впровадження у виробництво / Інститут тваринництва УААН.- Харків, 1992.- С.13-14.

11. Павленко М.П., Павленко Л.М. Довгозбережене середовище для кріоконсервації сперми бугаїв-плідників // Молочно-м'ясне скотарство: Міжв.темат.наук.збірник.- К.:Урожай, 1994.- Вип.85.- С.70-72.

12. Пат. 13138 Україна, МКИ А 61 D 19/02. Середовище для консервування сперми та спосіб його приготування / Ф.І.Осташко, М.П.Павленко, Л.М.Павленко (Україна).- Опубл. 28.02.97.- Бюл.№ 1.

АНОТАЦІЇ

Павленко Л.М. Довгозбережне середовище для кріоконсервації сперми бугаїв та способи його виготовлення.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія.- Інститут тваринництва УААН.- Харків, 1998 р.

З використанням сучасних методів досліджень встановлено захисний ефект термостабільного антишокового компоненту жовтка при дії низьких температур на спермії. В модельних дослідженнях доведено ідентичність його біологічної дії при кріоконсервації статевих клітин в порівнянні з нативним жовтком. Установлена можливість хіміко-термічної стерилізації середовища з жовтком. На цій основі розроблено і випробувано в виробничих умовах з позитивними результатами довгозбережне середовище і способи його виготовлення. Воно підвищує санітарно-гігієничний рівень роботи племінних підприємств, запобігає поширенню заразних і незаразних захворювань, які розповсюджуються з жовтком, а також забезпечує раціональне використання жовтка і всіх компонентів при виготовленні середовища для кріоконсервації сперми бугаїв. Розроблено асептичний спосіб та пристрій для оцінки рухливості сперміїв в еластичних упаковках з метою підвищення санітарно-гігієничного рівня роботи пунктів штучного осіменіння.

Ключові слова: сперма, жовток, антишоковий компонент, кріорезістентність, кріоконсервування, термостійкість, стерилізація, перекис водню, імерсія, запліднення.

Павленко Л.Н. Долгохранящаяся среда для криоконсервации спермы быков и способы ее изготовления. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Институт животноводства УААН. - Харьков, 1998 г.

Диссертация посвящена вопросам изучения влияния желтка и его компонентов на спермии при их гипотермии и создания на этой основе стерильной долгохранящейся среды для криоконсервации спермы быков-производителей.

С использованием современных методов исследований установлено, что компоненты желтка куриных яиц, экстрагированные органическими растворителями и введенные в среду в концентрации 3%, предохраняют от температурного шока половые клетки быка, барана и хряка на одном уровне с 30%-ной концентрацией нативного желтка. Установлена прочная связь антишокового компонента с цитоплазматическими мембранами спермиев, проявляющаяся сохранением криорезистентности половых клеток после их многократного центрифужного отмывания изотоническими растворами.

Выявлено, что при воздействии на антишоковый компонент в растворе температур, превышающих + 100°С, он проявляет термостойкость и сохранность своих первоначальных защитных свойств. В модельных экспериментах доказана идентичность его биологического воздействия в сравнении с нативным желтком при криоконсервации спермы быков-производителей. На этой основе разработана среда, отличающаяся тем, что с целью создания высокого санитарного и биологического качества спермы, онасодержит термостабильный антишоковый компонент, вместо желтка, что позволило применить эффективный термический способ стерилизации и продлить срок хранения среды в ампуле до 2-х лет вместо одних суток.

Предложен способ увеличения выхода антишокового компонента из желтка в 1,5 раза за счет предварительной его криообработки.

Установлена возможность химико-термической стерилизации желтоксодержащей среды. Введение нетоксичной дозы перекиси водорода в термолабильную среду, в сочетании с ее прогревом при + 70°С в течение 20 минут, обеспечивает стерильность заведомо обсемененной микроорганизмами среды на протяжении 36 месяцев хранения и не снижает ее защитных свойств в процессе криоконсервации спермиев.

На основании использования прозрачных долгохранящихся сред разработан асептический способ и устройство для оценки спермы непосредственно в герметизированной спермодозе, позволяющий улучшить оценку спермы, снизить ее потери, повысить санитарно-гигиенический уровень искусственного осеменения.

Основные результаты работы нашли широкое применение в практике племенных предприятий при создании банков глубокозамороженной спермы быков-производителей.

Предложенные варианты стерильных долгохранящихся сред обеспечивают повышение санитарно-гигиенического уровня работы племенных предприятий, предупреждение заболеваний, распространяю-щихся с желтком и другими компонентами, а также рациональное использование всех компонентов за счет централизованного ее производства.

Ключевые слова: сперма, желток, антишоковый компонент, криорезистентность, криоконсервация, термоустойчивость, стерилизация, перекись водорода, иммерсия, оплодотворяемость.

Pavlenko L. N. Long-term storage medium for bull semen cryopreservation and methods of its production. - Manuscript.

The dissertation for the scientific degree of the Candidate of Sciences (Agriculture) in speciality 03.00.20 - Biotechnology. - The Institute of Animal Science of the UAAS. - Kharkov, 1998.

Using modern research techniques, the protective effect of the heat- stable antishock component of egg yolk at exposure of semen to low temperatures has been established. In simulation experiments the identity of its biological effect at cryopreservation of reproductive cells as compared with native egg yolk has been proved. Feasibility of chemical-thermal sterilization of yolk-containing medium has been established. On the above basis a long-term storage medium and methods of its production have been developed and tested in production conditions with positive results. It increases sanitary-hygienic level of breeding units, prevents spreading contagious and non-contagious diseases transmitted with egg yolk, as well as provides for efficient use of yolk and all the components at producing the medium for bull semen cryopreservation. An aseptic method and device for spermatozoa motility evaluation in elastic packages to increase sanitary-hygienic level and efficient operation of AI units has been developed.

Key words: semen, yolk, antishock component, cryoresistance, cryopreservation, heat stability, sterilization, peroxide, immersion, pregnancy rate.

Размещено на Allbest.ur

...