Роль глікозаміноглікан-зв’язуючих білків у морфогенезі та пластичності мозку
Визначення ролі гепарансульфат- і гіалуронат-зв’язуючих білків на різних етапах морфогенезу головного мозку за нормальних умов. Оцінка внеску глікозаміноглікан-зв’язуючих білків у нейропластичність у разі впливу чинників, що провокують розумові порушення.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 11.08.2014 |
| Размер файла | 73,8 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru
ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ім. В.Н.КАРАЗІНА
Ушакова Галина Олександрівна
УДК 517.112:612.8
РОЛЬ ГЛІКОЗАМІНОГЛІКАН-зв'язуючих білків у МОРФОГЕНЕЗІ та ПЛАСТИЧНОСТІ мозку
03.00.04 - біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Харків - 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті Міністерства освіти і науки України.
Науковий консультант:
доктор біологічних наук, професор Корогод Сергій Михайлович,
Дніпропетровський національний університет, завідувач кафедри експериментальної фізики, керівник Дніпропетровського відділення Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України.
Офіційні опоненти:
- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Малишева Маргарита Костянтинівна,
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу нейрохімії;
- доктор біологічних наук, професор
Шевцова Алла Іванівна,
Дніпропетровська державна медична академія професор кафедри біологічної та загальної хімії;
- доктор біологічних наук, професор
Перський Євген Єфроїмович,
Харківський національний університет ім В.Н. Каразіна, завідувач кафедри біохімії.
Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка (кафедра біохімії), м. Київ.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради Падалко В.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дослідження глікокон'югатів набувають особливої актуальності. Тривалі роки вуглеводи (особливо полісахариди) розглядалися здебільшого як джерело енергії та структурні компоненти клітин. Останнім часом усе більше даних указують на обмеженість таких уявлень. Визначені полісахариди, що спроможні вибірково зв'язуватися з білками й ліпідами, такі взаємодії грають важливу роль у передачі інформації у системах “клітина-клітина” й “клітина-матрикс” (Guimond et al., 2001; Yip et al, 2002; Weigel and Yik, 2002). білок морфогенез головний мозок
Як вважають деякі дослідники, глікозилювання є регуляторний механізм життєдіяльності клітини, й, можливо, більш поширена форма регуляції, ніж фосфорилювання (Flogel, 2001). Зміни взаємодії гліканів із їх лігандами спостерігаються при розвитку багатьох патологічних процесів, наприклад, при запаленні (Ellies et al., 1998), пухлинному рості (Scheidegger et al., 1994), автоімунних захворюваннях (Chui et al., 2001). Навіть патогенні мікроорганізми починають взаємодію із клітиною господарю через взаємодії карбогідрат-лектин (Karlsson, 1998). Глікозаміноглікани беруть участь у багатьох фізіологічних процесах, включаючи контроль клітинного росту, рух клітин та їх адгезію (Martinho et al., 1996). Значна частина процесів, що задіяні у реалізації клітинних функцій, контролюється гепарансульфат-зв'язуючими білками. У цю групу входять фактори росту, молекули клітинної адгезії, різні протеоглікани (Kreis and Vale, 1993).
Найбільш докладно характеризовані глікозаміноглікани й протеоглікани, що присутні у сполучній тканині (Reddy and Dhar, 1991). Однак процеси проліферації, міграції і міжклітинної адгезії не менш актуальні для морфогенезу й функціонування ЦНС. Було показано (Margolis and Margolis, 1979; Yanagishita, 1993; Heufelder, 2000), що кількість глікозаміногліканів і протеогліканів у ЦНС украй мала. Тому протягом тривалого часу дослідники взагалі заперечували наявність даних компонентів у нервовій тканині. Тільки з появою більш чутливих методів імунохімії та молекулярної біології вдалося показати, що глікозаміноглікани, й, зокрема, гепарансульфати та гіалуронова кислота, представляють собою сполуки, котрі характерні для нервової тканини також (Karthikeyan et al., 1994; Hartmann and Maurer, 2001). Однак, природа, механізм й функціональні наслідки взаємодії глікозаміногліканів із специфічними білками у центральній нервовій системі багато в чому залишаються невідомими. На сьогодні є дані лише про структурні особливості окремих протеогліканів, що вже ідентифіковані, функції їх тільки вивчаються (Yanagishita, 1993; Heufelder, 2000; Hartmann and Maurer, 2001). Для визначених глікозаміноглікан-зв'язуючих білків часто встановлюється висока ступінь гомології стосовно структури (особливо вуглевод-зв'язуючих доменів), й можливості компенсаторного перехрестя контролювання однієї й той самої функції (Kreis and Vale, 1993). Частина глікозаміноглікан-зв'язуючих білків у нервовій тканині ще не визначена. У зв'язку з цим особливу актуальність набуває вивчення спочатку рівня загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої властивості білків у мозку. Для цього потребуються відповідні методи, що характеризуються високим ступенем специфічності та чутливості; необхідні дані стосовно оптимальних умов щодо визначення глікозаміноглікан-зв'язуючої властивості білків нервової тканини як в умовах експерименту in vitro та й в умовах in vivo.
Взаємодії глікозаміногліканів із їх лігандами частіше всього забезпечуються за рахунок електростатичних зв'язків, що є високочутливі до зміни навколишнього середовища, особливо до впливу вільних радикалів, рН й осмолярності (Moseley et al., 1995). Зміна властивостей мембрани цілого нейронального компартменту, що містить десятки й сотні синапсів, неодмінно впливає на вихідний сигнал цього нейрону, визначаючи нейрональну пластичність. Логічно припустити, що вплив кислих метаболітів (наприклад у разі гіперфенілаланінемії), зміна осмолярності під час впливу опромінення низької інтенсивності або під час гіпералгезії у післяопераційний термін можуть призводити до змін у взаємодіях між глікозаміногліканами та їх специфічними рецепторами. Яким чином це впливає на нейрональну пластичність раніше не було встановлено. Альтернативні пошуки корегування ментального порушення в наслідок впливу різних чинників є одна із серйозних проблем сучасності.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами науково-дослідних робіт. Робота виконувалася в рамках договору про спільну наукову діяльність Дніпропетровського національного університету та Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України (№1167, 2001-2003 рр) за темою “Дослідження механізмів формування неоднорідних розподілів мембранних макромолекул та їх ролі у морфо- та електрогенезі нейронів”, міжнародного цільового гранта від уряду Саксонії (Німеччина), 1996-1997 рр., (грант AZ 1-6220.3-02/41) за темою “Вплив материнського гіпотиреозу на ембріональний розвиток мозку та щитовидної залози щурів”, держбюджетної теми інституту біології ДДУ № 02-20-97 “Фундаментальні дослідження впливу синергічної дії екопатогенних чинників та наукове обґрунтування нових комплексних методів діагностики, корекції та профілактики порушень стану здоров'я населення” Міністерства освіти України.
Мета та задачі дослідження. Метою роботи стало визначення ролі гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючих білків на різних етапах морфогенезу головного мозку за нормальних умов та оцінка внеску глікозаміноглікан-зв'язуючих білків у нейропластичність у разі впливу чинників, що провокують розумові порушення. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:
1) розробити методичні заходи визначення загальної гепарансульфат або гіалуронат-зв'язуючої здатності білків мозку, визначити оптимальні умови для їх застосування в умовах in vitro та in situ;
2) визначити рівні загальної гепарансультат й гіалуронат-зв'язуючої здатності білків, їх клітинну й субклітинну локалізацію у мозку під час ембріонального розвитку щурів;
3) оцінити ступень схожості глікозаміноглікан-зв'язуючої властивості білків та їх локалізації в ембріональному мозку людини й щурів;
4) вивчити зміни гепарансультат та гіалуронат-зв'язуючої здатності білків та їх розподілу в мозку щурів під час раннього постнатального розвитку щурів;
5) дослідити глікозаміноглікан-зв'язуючу властивість білків у різних відділах дорослого мозку та її залежність від статі;
6) характеризувати наслідки впливу гепарансульфата та гіалуроната на морфогенез нейронів гіпокампу;
7) виділити та очистити гепарансульфат-зв'язуючі та гіалуронат-зв'язуючі білки з мозку щурів та людини, визначити їх головні характеристики;
8) з'ясувати рівень зміни глікозаміноглікан-зв'язуючої здатності білків у мозку щурів, розвиток котрих проходив в умовах гіперфенілаланінемії;
9) дослідити гепарансультат та гіалуронат-зв'язуючу активність білків у мозку щурів на різних етапах морфогенезу та у дорослих особин під впливом іонізуючих чинників різного походження у малих дозах;
10) вияснити можливу участь гепарансульфат-зв'язуючих білків мозку щурів у центральних механізмах болю;
11) визначити динаміку поведінкових реакцій щурів під впливом указаних шкідливих чинників;
12) запропонувати гіпотетичну шкалу залежності морфогенезних подій у мозку від загального рівня гепарансультат та гіалуронат-зв'язуючої здатності білків.
Об'єкт дослідження. Гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуюча властивість білків мозку.
Предмет дослідження. Динаміка гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої властивості білків мозку на різних етапах морфогенезу головного мозку за нормальних умов та при дії чинників, що призводять до ментальних порушень; характеристика нових глікозаміноглікан-зв'язуючих білків мозку.
Методи дослідження. Фізико-хімічні методи очистки й характеристики білків (екстракція, ультрацентрифугування, гель-фільтрація, іонообміна й афіна хроматографії, електрофорез у ПААГ, імуноблотинг, імуноферментний аналіз, твердофазний вуглевод-ферментний аналіз); кількісний аналіз глікозаміногліканів, гісто- та імуноцитохімічні методи; моношарова культура нейронів гіпокампу;експериментальні моделі на щурах; статистичні засоби обробки данних.
Наукова новизна одержаних результатів. Запропоновано концепцію регуляції морфогенезних подій та нейропластичності у головному мозку за рахунок зміни загального рівня гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої властивості білків.
Уперше визначена динаміка загальної гепарансульфат- й гіалуронат-зв'язуючої здатності білків у мозку щурів під час ембріонального та постнатального розвитку. Отримані нові дані про специфічну субклітинну локалізацію центрів зв'язування гепарансульфату та гіалуронату в мозку щурів на різних етапах морфогенезу. Установлена наявність гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючих компонентів у ядрах проліферуючих та мігруючих нервових клітин, і наведені докази зв'язування названих глікозаміногліканів із білками ядерного скелета. Показано схожість субклітинної локалізації гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючих білків в ембріональному мозку людини. Доведено перерозподіл глікозаміноглікан-зв'язуючої властивості між мембранними та екстрацелюлярними/цитоскелетними білками на ранніх стадіях морфогенезу мозку. Установлений рівень співвідношення загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої властивості екстрацелюлярних/цитоскелетних білків (1:10) на ранніх стадіях морфогенезу мозку.
Очищені та охарактеризовані гепарансульфат-зв'язуючі мембраноасоційовані та цитоскелетні білки з неонатального мозку щурів, що представлені двома поліпептидами з молекулярними масами 19 і 28 кДа, та нові мембранні гіалуронат-зв'язуючі білки з ембріонального мозку людини з молекулярними масами 250 і 20 кДа, які не мають імуноперехрестя з відомими білками.
Представлені докази швидкого збільшення загального рівня глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків мозку на стадіях активної проліферації та міграції клітин в умовах гіперфенілаланінемії, яка супроводжувалася зниженням маси мозку та порушеннями локомоторних, емоційних та дослідницьких реакцій щурів.
Уперше наводяться дані про збільшення загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності білків у мозку новонароджених щурів унаслідок впливу 131I у малій дозі, отриманої під час критичних етапів ембріогенезу, при одночасній стабільності цих параметрів у мозку дорослих самиць.
Отримані дані про загальну гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючу активність білків із різних відділів мозку дорослих щурів обох статей за нормальних умов та після одноразового й фракціонованого загального рентгенівського опромінення у малій дозі (0,25 Гр). Установлено, що рівень загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності білків відрізняється в різних відділах мозку та залежить від статі тварин. За нормальних умов максимальний рівень загальної глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків був виявлений у структурах лімбічної системи. Як при одноразовому, так і при фракціонованому опроміненні динаміка змін загальної глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків у корі великих півкуль й гіпокампі відрізнялася від інших досліджених відділів мозку щурів, що вказує на специфічну пластичну перебудову міжклітинних взаємодій та взаємодії клітина-матрикс у цих структурах мозку під впливом малих доз радіації. Проява поведінкової активності тварин у перші дні пострадіаційний термін була пригнічена з найбільшим зменшенням параметрів, які характеризують емоційний та дослідницький стан.
Показана участь гепарансуфат-зв'язуючих білків мозку дорослих щурів у центральних механізмах болю в післяопераційний період.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані експериментальні дані й сформульовані на їх підставі висновки мають загальнотеоретичне та практичне значення для загальної біохімії, й особисто для нейрохімії, глікобіології, клінічної біохімії та радіобіології.
На основі отриманих у роботі даних зроблено припущення про важливу роль гепарансульфат та гіалуронат-зв'язуючих білків у контролі проліферації та міграції окремих популяцій нервових клітин за рахунок регуляції генної експресії під час нормального розвитку мозку та в умовах впливу патогенних чинників (радіації у низьких дозах, гіперфенілаланінемії, материнського гіпотиреозу, післяопераційного болю). Дані про статеві розбіжності в рівні глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків свідчать про існування механізму гормональної регуляції експресії даних білків у мозку статевозрілих щурів, або взаємодії цих білків із глікозаміноглікановим лігандом. Установлені закономірності змін рівню загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності білків у мозку дорослих щурів за умов розвитку біологічних ефектів, спричинених дією одноразового та фракціонованого опромінення у малій дозі. Очищені мембраноасоційовані гепарин-зв'язуючі білки з мозку новонароджених щурів та мембранні гіалуронат-зв'язуючі білки з ембріонального мозку людини за нормальних умов. Запропоновані в даній роботі підходи до кількісного та якісного виявлення гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючих білків можуть бути використані в лабораторній біохімічній практиці.
Результати досліджень входять до програм курсів лекцій та лабораторних робіт із біохімії, клінічної біохімії для студентів біолого-екологічного факультету та медичного факультету ДНУ. Отримані дані оптимальних умов для проведення твердофазного вуглевод-ферментного мікроаналізу впроваджені до ЦНДЛ Дніпропетровської державної медичної академії.
Особистий внесок здобувача. Основні ідеї роботи висунуті автором самостійно. Дисертантом було самостійно проведений аналіз літературних даних, проведені експериментальні дослідження та статистична обробка результатів, частина експерименту проведена сумісно з аспіранткою Білоусовою Т.В. (гл. 5, 6.2 та 6.3). Обговорення методології та отриманих результатів проведені сумісно з науковим консультантом. У роботах, що опубліковані у співавторстві, відображені результати, що отриманні при особистій участі автора у проведенні експерименту та обговоренні результатів. У дисертації не використовувалися ідеї або розробки, які належать співавторам публікацій.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були подані особисто на щорічних наукових підсумкових конференціях Дніпропетровського національного університету (Дніпропетровськ, 1994-2003), 15th Meeting of the International Society for Neurochemistry (Кіото, Японія, 1995), 23rd and 24th Meetings of FEBS (Базель, Швеція, 1995, Барселона, Іспанія, 1996), Second Biennial Research Conference on “Molecular biology of cellular interactions” (Ленгрис, Німеччина, 1995), 8th Sardinian Conference on Neuroscience (Кагліарі, Італія, 1995), 11th and 14th Biennial Meetings of the International Society for Developmental Neuroscience (Тампере, Фінляндія, 1996 та Сідней, Австралія, 2002), IV та V Міжнародних конференціях “Франція й Україна, науково-практичний досвід у контексті діалогу національних культур” (Дніпропетровськ, 1997, 1998), 16th ISN/28th ASN Meeting (Бостон, США, 1997), YII та VIII Українських біохімічних з'їздах (Київ, 1997 та Чернівці, 2002), III та IV з'їздах по радіаційним дослідженням (Москва, Росія, 1997 та 2001), II та III з'їздах Українського біофізичного товариства (Харків, 1998 та Львів, 2002), IV European Research Conference: Neural Mechanisms of Learning and Memory (Аквафреда ді Маратеа, Італія, 1998), Forum of European Neuroscience (Берлін, Німеччина, 1998), Twelfth General Meeting of the European Society for Neurochemistry (Санкт-Петербург, Росія, 1998), Annual Meeting of the Canadian Pain Society (Саскачеван, Канада, 1998), 10th European Congress of Anaesthesiology (Франкфурт на Майні, Німеччина, 1998), 4th International Congress In The Decade of the Brain (Гданськ, Польща, 1999), 15th National Meeting of British Neuroscience (Лондон, Англія, 1999), Fifth IBRO World Congress of Neuroscience (Єрусалим, Ізраїль, 1999), 17th ISN/13th ESN Meeting (Берлін, Німеччина, 1999), Forums of European Neuroscience (Брайтон, Англія, 2000 та Париж, Франція, 2002), Joint Meeting of the ISN/ASN (Буенос Айрес, Аргентина, 2001), International Symposium Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems (Київ, 2001), III з'їзді з радіаційних досліджень (Київ, 2003).
Публікації. Результати досліджень подані у 25 статтях (7 із них одноособові) та 35 тезах, які опубліковані у профільних вітчизняних та закордонних журналах та матеріалах з'їздів та конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 294 сторінках друкованого тексту і складається з вступу, основної частини, що містить огляд літератури, розділ матеріалів та методів досліджень, розділів результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення результатів дослідження, висновки, 2 додатки. Робота ілюстрована 12 таблицями та 87 рисунками. Перелік використаної літератури включає 447 найменувань цитованої літератури.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури
Огляд літератури присвячений опису факторів, що забезпечують міжклітинні взаємодії, наведена характеристика сімейства глікозаміногліканів, систематизовані глікозаміноглікан-зв'язуючі білки, що були ідентифіковані у нервовій тканині, представлені докази забезпечення важливих функцій у нервовій системі за рахунок глікозаміноглікан-зв'язуючих білків та можливих порушень за умов впливу шкідливих чинників.
Матеріали та методи дослідження
Біологічні об'єкти. Модельні експерименти проводились на лабораторних щурах лінії Вістар та білих нелінійних щурах, всього 342 тварини. Тварини знаходилися у стандартних умовах. Головним об'єктом дослідження був головний мозок щурів та людини різного віку. Також для досліджень використовувалися сироватка крові, селезінка, печінка, тканини скелетних та серцевих м'язів щурів та людини. Декапітацію тварин проводили під легким наркозом. Для імунізації та отримання специфічних поліклональних антитіл використовували 4 дорослих кроля Шиншила. Тканини людини (аутопсийний матеріал) від 24 жертв дорожньо-транспортних катастроф були надані обласною лікарнею ім. Мечнікова м. Дніпропетровська. Головний мозок з абортивного матеріалу був наданий міською лікарнею №9 м. Дніпропетровська. Надання та використання біологічного матеріалу людини проводилось згідно Хельсінкської декларації прав людини. Об'єктом дослідження морфогенезу нейронів була моношарова культура нейронів гіпокампу щура.
Хімічні реагенти. В роботі використовувалися особливо чисті реагенти фірм Sigma (USA), Fluka (Switzerland), Serva (Germany), Medix Biochemica (Finland), Boehringer Mannheim Biochemica (Germany), Medac (Germany), Serotec (Germany), DAKOPATS (Denmark), Affaniti (Nottingham, UK), Реагент (Дніпропетровськ, Україна). Лабораторний пластик та концентруючи патрони були придбані у фірм “Amicon” (USA) та “Nunc” (USA).
Для визначення загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності білків, що різняться за місцем локалізації були отримані різні фракції, що містили водорозчинні, мембраноасоційовані, мембранні та екстрацелюлярні/цитоскелетні білки за допомогою диференціального центрифугування та застосування солюбілізації білків за участю NaCl, тритона Х-100 та сечовини, відповідно (Березін, 1989). Вихідний буфер містив трис - 0,25 мМ (рН7,4), ЕДТО - 1 мМ, дитіотрейтол - 2 мМ, ФМСФ - 0,2 мМ, NaN3 - 3 мМ.
Загальна кількість глікозаміногліканів оцінювалася за методом Gold (1981).
Кон'югати гепарансульфату та гіалуронової кислоти з ферментом пероксидазою хрону готували за методикою перйодатного окислення (Dolzhenko, 1994). Для визначення загальної гепарин- або гіалуронат-зв'язуючої активності білків у різних біологічних фракціях був використаний твердофазний вуглевод-ферментний аналіз (Dolzhenko, 1994; Ushakova, 1995). Його особливість полягає у використанні кон'югату, що складається з глікозаміноглікану з нашитою на нього ферментною міткою. Аналіз проводили у плоскодонних 96-лункових планшетах. Дані калібрувальних вимірювань використовували для перерахунку екстинції у кількість (нг) зв'язаного з білками відповідного глікозаміноглікана у співвідношенні до 1 мг загальної кількості білка (ЗБ) у пробі. Вимірювання екстинції проводили на спектрофотометрі “Anthos 2010”.
Загальну кількість білку визначали за методом Бредфорд (1985).
Очистку гіалуронат-зв'язуючих білків проводили за допомогою афінної хроматографії на кількох типах носіїв (залежно від активації сефарози та засобу приєднання гіалуроната до неї). Оптимальні умови для зв'язування гіалуронату до специфічних білків були підібрані за допомогою твердофазного вуглевод-ферментного методу. Контроль за ходом хроматографії проводили спектрофотометрично.
Гепарин-зв'язуючі білки з мозку виділяли за допомогою афінної хроматографії, що проводили на гепарин-сефарозі (Sigma).
Для подальших етапів очистки білків використовували також іонообміну хроматографію на ДЕАЕ-сефадексі А-50 (Pharmacia) та гель-фільтрацію на сефакрилі S-300 (Pharmacia).
Дослідження поліпептидного складу гепарин- та гіалуронат-зв'язуючих білків проводили за методом електрофорезу в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію за Леммлі (1970).
Серед білків, що були розділені під час електрофорезу, специфічні білки визначали методом імуноблотингу (Stott, 1989) з використанням моноспецифічних антисироваток до N-CAM, фібронектину, вітронектину, тенасцину, антитромбіну III, CD44. Паралельно, гель після електрофорезу фіксували у розчині ТХО - 10% та фарбували іонами срібла (Merril, 1986).
Поліклональна антисироватка проти N-CAM була отримана шляхом імунізації кролів чистим білком, що був люб'язно наданий Елізабет Бок (лабораторія білка Копенгагенського університету). Антисироватка детально охарактеризована (Ushakova, 1995). Інші антисироватки були придбані у Sigma (USA), Serva (Germany), Boehringer (Germany), DAKOPATS (Denmark), Affaniti (Nottingham, UK),
Непрямий та конкурентний варіанти імуноферментного аналізу використовували для визначення кількості специфічних білків (Фримель, 1987). Кількість гормонів Т-4, ТСГ у сироватці крові визначали з використанням імуноферментних тест-наборів Medix Biochemica (Фінляндія).
Локалізацію гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючих білків у мозку ссавців визначали гістохімічними засобами (Bullock and Petrusz, 1985) із використанням напівтонких парафінових зрізів мозку та специфічних кон'югатів (Ushakova, 1997). На паралельних зрізах проводили забарвлення за допомогою антитіл до ЯАКП (ядерного антигену клітинної проліферації) (Sigma), місця специфічного зв'язування антигену на зрізах виявляли за допомогою біотин-стрептовідин-пероксидазного комплексу. Візуальну оцінку гістологічних зрізів проводили при застосуванні світлового мікроскопа Axioplan (Zeiss). Морфометрію проводили при збільшенні х400 за допомогою вставленого калібрувального окуляра, сполученого зі стандартним мікрометром.
Дослідження морфогенезу нейронів проводили з використанням культури нейронів гіпокампу (Wilcox et al., 1994) та імуноцитохімічних засобів із використанням антитіл проти N-CAM та протеїну А, кон'югованого з частками колоїдного золота розміром 20 нм (Sigma). Оцінку проводили за допомогою електронного мікроскопа JEM-100CX (JEOL). Електронні мікрофотографії обробляли за допомогою програми UTHSCSA ImageTool (США). Розподіл молекул на плазматичній мембрані нейронів розраховували за допомогою комп'ютерної моделі Ніконенко (2000).
Для статистичної обробки даних використовували t-тест Ст'юдента, U-тест Манн-Уітні, та тест Колмогорова-Смірнова (Лакин, 1990).
Для дослідження впливу шкідливих чинників різного походження на глікозаміноглікан-зв'язуючу властивість білків мозку були відтворенні декілька експериментальних моделей.
Модель впливу інкорпорованого I-131 на розвиток щурів була відтворена згідно рекомендації Рейллі (Reilly, 1986). Самицям вводився I-131 (Київ) внутрішньом'язово у дозі 5,5 МБк (150 мкКі) в 0,05 мл фізіологічного розчину, що відповідає дозі поглиненої радіації в 0,5 Гр. Самицям контрольної групи вводився фізіологічний розчин 0,05 мл, в аналогічних умовах Терміни введення обирали відповідно до критичних періодів ембріогенезу.
З метою дослідження впливу тотального іонізуючого опромінення низької інтенсивності на мозок дорослих тварин були створені моделі одноразового й фракціонованого опромінення. Тварини опромінювали рентгенівськими променями в дозі 0,25 Гр. за допомогою установки РУМ-17 одноразово (напруга 150 кВ, струм 6 мА, фільтри Cu 2,0 мм, фокусна відстань 168 см, потужність дози 0,26 сГр/хв) та фракціоновано по 0,01 Гр/добу протягом 25 діб на установці РУМ-17 (фокусна відстань 181 см, решта параметрів - такі самі).
Експериментальна модель гіперфенілаланінемії створювалася за схемою Matsuo та Hommes (1988). Стан гіперфенілаланінемії отримували за рахунок ін'єкцій (двічі на добу з інтервалом 12 год.) фізіологічного розчину, що містив L-фенілаланін - 0,13 М та DL--метилфенілаланін - 0,06 М (Research Organics, Cleveland, Ohio, USA) по 0,2 мл/10 г ваги тіла у перші чотири ін'єкції, та по 0,4 мл/10 г ваги тіла у решті ін'єкцій. Тваринам контрольної групи вводився еквівалентний об'єм фізіологічного розчину.
Експериментальна модель післяопераційного болю була відтворена згідно Brennan (1996). Поведінкові реакції тварин визначалися за тестом у “відкритому полі” (Буреш, 1991).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Визначення оптимальних умов зв'язування глікозаміногліканів специфічними білками мозку in vitro
Синтезовані специфічні кон'югати, гепарансульфату (або гіалуронату), зв'язаних із пероксидазою хрону. Установлені оптимальні умови використання цих кон'югатів для кількісного та якісного аналізу загальної гепарансульфат та гіалуронат-зв'язуючої активність компонентів мозку. Для дослідження рівня загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої властивості білків мозку за допомогою твердофазного вуглевод-ферментного та гістохімічного аналізу насамперед був визначений характер впливу основних чинників, які застосовуються під час екстракції білків та їх аналізу. А саме, був визначений вплив рН середовища, іонної сили та детергентів, що можуть змінювати афінність білків до глікозаміногліканів in vitro.
Було визначено, що оптимальним показником рН буфера для сорбції гіалуронат-зв'язуючих білків до полістиролу мікротитрувальних планшетів, є 5,6. Для гепарансульфат-зв'язуючих білків оптимальним є діапазон рН 5,6-6,8.
Мембраноасоційовані та сечовинорозчинні білки мозку мають найбільшу активність зв'язування гепарану за умов кислого значення рН 3. Із зростанням водневого показника від 5 до 10 гепарансульфат-зв'язуюча активність мембраноасоційованих білків поступово знижується (рис. 2.А). У фракції сечовинорозчинних білків спостерігається додатковий пік гепаран-зв'язуючої активності в області фізіологічних значень рН (рис. 2.Б).
Оптимальним значенням рН середовища для зв'язування гіалуронату специфічними білками з різних білкових фракцій мозку як новонароджених, так і дорослих щурів є область 5,0 (рис. 3). Така сама тенденція спостерігається і для білків виділених із мозку людини.
Для дослідження глікозаміноглікан-зв'язуючої активності мембранних білків in vitro не можна застосовувати непрямий метод твердофазного вуглевод-ферментного аналізу (ВФА), оскільки присутність тритону Х-100 в концентрації більш ніж 0,05% гальмує сорбцію білків полістиролом більш ніж на 50%. У таких випадках необхідно застосовувати конкурентний спосіб ВФА. Присутність тритона Х-100 у діапазоні концентрації 0-1% у буфері під час інкубації сорбованих білків із гіалуронат-ферментним кон'югатом не змінює істотно спорідненість цих білків до вуглеводу. Тільки за умов збільшення вмісту детергенту до 2 % гіалуронат-зв'язуюча активність білків починає вірогідно знижуватися.
Для дослідження вуглевод специфічної спорідненості сечовинорозчинних білків можна застосовували непрямий метод ВФА, у разі розведення проб в 20-40 разів. У випадках низької концентрації загального білка у цих зразках необхідно застосовувати також конкурентний варіант ВФА.
Використання додецилсульфата натрію для екстракції мембранних білків із подальшим визначенням глікозаміноглікан-зв'язуючої активності не можливо, тому що даний аніонний детергент навіть у концентрації 0,03% повністю блокує спорідненість білків до відповідних вуглеводів.
Зв'язування специфічного кон'югату з дослідними компонентами необхідно проводити в умовах низької іонної сили (концентрація як Са2+, так й Mg2+ не повинна перевищувати 4 мМ, оптимальна концентрація Na+ чи К+ 60 мМ становлять для гепарансульфата та 20 мМ - для гіалуроната).
Указані вище умови, найсприятливіші й для проведення гістохімічного забарвлення зрізів мозку за допомогою визначених кон'югатів.
Розподіл глікозаміноглікан-зв'язуючих білків у мозку під час ембріогенезу. На 6-13 добу ембріонального розвитку щура гепарансульфат-, й гіалуронат-зв'язуючі білки зосереджені у вентрикулярному шарі нервової трубки. При збільшенні мікроскопічного зображення в області вентрикулярного шару клітин видно, що глікозаміноглікан-зв'язуючі центри в найбільшій кількості присутні в області навколо плазматичної мембрани проліферуючих та мігруючих клітин. Дослідження гістохімічних зрізів голови ембріонів людини 6 - 7 тижнів розвитку показали, що розподіл ГАГ-зв'язуючих компонентів у мозкових міхурах співпадає за характером із таким у мозку щурів під час ембріогенезу (рис. 4).
Найбільша кількість центрів зв'язування гепарансульфату та гіалуронату також виявлена у вентрикулярному та субвентрикулярному шарах нервової трубки, де клітини інтенсивно діляться й мігрують.
Кількісний аналіз підтвердив вуглеводгістохімічні дані про найвищий рівень глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків мозку на самих перших етапах морфогенезу, під час активної проліферації й міграції клітин. Глікозаміноглікан-зв'язуюча здібність білків мозку під час ембріогенезу на три порядки вище за таку у дорослої людини. Оскільки на гістохімічних зрізах було чітко видно зосередження глікозаміноглікан-зв'язуючих компонентів саме в областях плазматичної мембрани нервових клітин, був проведений диференційований аналіз гепарансульфат та гіалуронат-зв'язуючої здібності білків у мембраноасоційованій, мембранній та екстрацеллюлярній фракціях із мозку ембріонів людини. Як для гепарансульфату, так і для гіалуронату найбільша кількість рецепторів виявлена у мембранній фракції (рис. 5).
Розподіл глікозаміноглікан-зв'язуючих білків у мозку під час постнатального розвитку. На момент народження щурів у мозку визначається значне зменшення кількості центрів зв'язування для гепарансульфату та гіалуронату. Найбільше ГАГ-зв'язуюча активність виявляється тільки в областях де продовжується проліферація й міграція нервових клітин. Характер локалізації цих сайтів схожий з таким на 21 добу ембріогенезу щурів .
Найбільша щільність пофарбованих клітин спостерігається в гермінативних зонах, навколо IV шлуночку мозку (вентрикулярний та субвентрикулярний шари). Також висока гепарин/гепарансульфат-зв'язуюча активність білків була виявлена в субвентрикулярній зоні латерального шлуночку мозку й у прилеглих областях кори великих півкуль і гіпокампу.
Головною субклітинною структурою, що мала високу гепарансульфат-зв'язуючу активність, було клітинне ядро, що, можливо, вказує на присутність гепарансульфат- зв'язуючих білків у ядрі й участі у регуляції біосинтезу білків. У молекулярному шарі кори мозочка, що формується, крім клітинних ядер, незначно офарбовувався міжклітинний матрикс (рис. 6).
Протягом перших 4 діб спостерігається різке зниження інтенсивності фарбування гепарансульфат-зв'язуючих центрів. У мозку новонароджених щурів область найвищої гіалуронат-зв'язуючої активності білків співпадає з областями високої гепарансульфат-зв'язуючої активності й характерна для періплазматичного та міжклітинного простору та значна менша для ядерних компонентів гранулярних клітин (рис. 7). Зниження гіалуронат-зв'язуючої активності у мозку щура у перші дні постнатального розвитку також відбувається дуже швидко. На 5 добу після народження високий вміст гіалуронат-зв'язуючих центрів визначається тільки в апікальному конусі росту клітин Пуркін'є під час перших етапів формування дендритного дерева, а також у навколоклітинному просторі.
На 10 добу постнатального розвитку в мозку щура вдається визначити слабке забарвлення місць зв'язування гіалуроната тільки у міжклітинного просторі.
Дані кількісного аналізу свідчать про специфічність субклітинного розподілу гепарансульфат-зв'язуючих білків у мозку ссавців під час постнатального розвитку.
Твердофазний вуглеводферментний аналіз за чутливістю перевищує на два порядки вуглеводгістохімічний аналіз. Тому можна визначити ступінь зв'язування вуглеводів у фракції білків із мозку щурів на пізніх етапах постнатального розвитку, тоді як на зрізах мозку тварин цього віку не можна чітко візуалізувати цей параметр. Згідно отриманим результатам у новонароджених щурів загальна гепарансульфат-зв'язуюча активність білків мозочка у середньому на 25% вища ніж у великих півкулях.
У фракціях мембранних білків із мозочка новонароджених щурів середній рівень загальної гепарансульфат-зв'язуючої активності складає 8 нг зв'язаного гепарансульфату на 1 мг загальної кількості білка, а у гіпокампі - 6 нг зв'яз. ГП/мг ЗБ. У фракціях сечовинорозчинних білків рівень досліджуваного параметра складає десь 500 та 370 нг зв'язаного гепарансульфату/мг загального білка у мозочку та великих півкулях, відповідно (рис. 8). Таким чином, рівень загальної гепарансульфат-зв'язуючої активності сечовинорозчинних білків у мозку новонароджених щурів більш ніж у 60 разів перевищує рівень загальної гепарансульфат-зв'язуючої активності мембранних білків.
Термін активної проліферації клітин та міграції у досліджуваних структурах мозку відрізняється. У великих півкулях активна фаза цих процесів відбувається під час ембріогенезу, на відміну від мозочка, котрий у щурів активно розвивається протягом 2 тижнів після народження.
Кількісний аналіз указує на різке зниження гепарансульфат-зв'язуючої активності у мозку щурів протягом перших 5 діб до досягнення на 20 добу найнижчого рівня цього параметра, який підтримується постійним у дорослих тварин за нормальних умов. Порівняльний аналіз указує на вагомий внесок у загальну гепарансульфат-зв'язуючу активність сечовиннорозчинних білків з екстрацелюлярної/цитоскелетної фракції. За наявністю значного зниження загальної здатності до зв'язування гепарансульфата у мозку щура на 30 добу постнатального розвитку у порівнянні з новонародженими найбільший внесок у загальний показник надають все одно сечовиннорозчинні білки та білки мембранної фракції (рис. 9).
Оскільки вагомий внесок у рівень загальної гепарансульфат-зв'язуючої активності білків мозку дорослих щурів належить сечовинорозчинним компонентам було досліджено данний параметр у різних відділах мозку самців та самиць окремо. У всіх відібраних відділах мозку загальна гепарансульфат-зв'язуюча активність сечовинорозчинних білків не перевищувала 25 нг зв'яз. ГП/мг ЗБ (рис. 10).
Тобто була більш ніж у 40 разів меншою за даний рівень активності сечовинорозчинних білків із мозку новонароджених щурів.
Як у самців, так і у самиць найбільша активність зв'язування гепарансульфату специфічними білками була виявлена в стріатумі, а найменша - у середньому мозку. У самиць значний рівень даної активності був визначений у гіпокампі, тоді як у самців у гіпокампі, корі великих півкуль, мозочку й у варолієвому мості рівні активності практично збігалися. У всіх відібраних відділах мозку дорослих щурів, за винятком гіпокампу, загальна гепарансульфат-зв'язуюча активність білків була у середньому на 22% вища у самців, ніж у самиць.
Дослідження загальної гіалуронат-зв'язуючої активності білків в отриманих фракціях із мозочка та великих півкуль мозку щурів показали схожу динаміку здатності білків мозку щодо специфічного зв'язування гіалуронату під час розвитку (рис. 11).
Найвищий рівень гіалуронат-зв'язуючої активності зареєстрований у фракції сечовинорозчинних білків із мозочка новонароджених щурів, що складав у середньому
4 мкг зв'яз. гіалуроната (ГК) / мг ЗБ. Аналіз субклітинного розподілу гіалуронат-зв'язуючої активності у фракціях, отриманих із мозочка та великих півкуль, вказує на вагомий внесок мембранних та мембраноасоційованих білків у загальний показних афінності до гіалуронату на відміну від гепарансульфатспецифічних білків. Ці данні підтверджуються попередньо отриманими гістохімічними даними стосовно розподілу гіалуронат-зв'язуючих сайтів саме у періплазматичних областях мігруючих нервових клітин. Порівняльний аналіз загальної гіалуронат-зв'язуючої активності білків на 0 та 30 добу постнатального розвитку вказує на перерозподіл даної властивості між мембранними та мембраноасоційованими компонентами (рис. 12).
Одночасні, незалежні дослідження кількісного субклітинного розподілу гепарансульфат- та гіалуронат специфічних білків у мозочку та великих півкулях мозку щурів й їх гістохімічне підтвердження надають можливість сформувати уявлення про специфіку розподілу цих білків під час раннього постнатального розвитку мозку та визначити їх незмінний рівень у мозку дорослих осіб за нормальних умов. Отримані дані вказують на те, що в процесах постнатального розвитку мозку у першу чергу значну роль відіграють мембранні й екстрацелюлярні макромолекули, що мають ГАГ-зв'язуючі домени. Накопичення гіалуронату в міжклітинному матриксі збігається зі стадіями клітинної міграції, коли гіалуронат обумовлює високу гідратованість й проникливість матриксу, що сприяє руху клітин. Мігруючі клітини використовують різні специфічні рецептори (наприклад, ламінін/еластинові рецептори, інтегрини і т.д.) для забезпечення свого руху. На додаток до цього експресія незайнятих рецепторів гіалуронової кислоти може дозволяти клітинам взаємодіяти з вільним гіалуронатом і транспортувати сигнал крізь гіалуронат-збагачений екстрацелюлярний матрикс. Іншим важливим аспектом взаємодії гіалуронату з гіаладгеринами, цілком ймовірно, є формування міжклітинного матрикса шляхом іммобілізації гіалуроната специфічними білками. Відношення зв'язаного гіалуроната до його вільної форми збільшується в міру розвитку мозку. Отже, у процесі розвитку під час клітинної міграції у легко проникному матриксі може активуватися мобілізація гіалуроната, що створює стерічні перешкоди для міграційних сигналів до клітини. Крім самого гіалуроната в утворенні конденсованого матрикса беруть участь як мембрані рецептори цього глікозаміноглікана, так і молекули міжклітинного матриксу.
Вплив глікозаміногліканів на морфогенез нейронів у культурі. Дослідження біохімічних механізмів морфогенезу нервових клітин мають велике значення не тільки в плані розуміння розвитку нервової системи, але й для розробки ефективних заходів терапії нейродегенеративних випадків, як успадкованих (наприклад, хвороба Альцгеймера), так й вторинне придбаних (травми, пухлини, інфекції). Техніка культури нейронів надає можливість в умовах in vitro змінювати хімічні складові системи, де нервові клітини проходять головні етапи морфогенезу: диференціацію, ріст аксонів й дендритів, синаптогенез. З метою дослідження впливу гіалуронату та гепарансульфату на морфогенез окремих нейронів була застосована первинна дисоційована культура нейронів гіпокампу низької щільності.
Згідно попередніх результатів найвища кількість гіалуронат-зв'язуючих білків знаходиться у навколомембранній області та у міжклітинному матриксі. Тому подалі ми визначили вплив вільного гіалуроната, присутнього в субстраті, на морфогенез нейронів гіпокампу (рис. 13).
Нейрони вирощувалися на субстраті з полі-L-лізином, куди додавали різну кількість гіалуроната (діапазон концентрації від 0 до 20 мкг гіалуроната на 1 мл субстрату). Культури нейронів досліджували за допомогою інвертованого мікроскопа та імуногістохімічного забарвлення фіксованих культур нейронів із використанням антитіл проти нейрофіламенту Н (Affinity Inc., Great Britain). Наявність вільного гіалуроната в міжклітинному матриксі призводило до збільшення спорідненості нейронів до субстрату, що підтверджується збільшенням кількості нейронів, що прикріпилися.
Згідно отриманим даним адгезивність нейронів гіпокампу до субстрату знаходиться не в прямій залежності від кількості гіалуроната, а має куполоподібний характер. Проблема полягає у багатоскладовому комплексі, що визначає ступінь адгезії однієї клітини до другої in vivo. Зараз накопичуються експериментальні дані про вплив окремих складових цього комплексу, що модулюють поведінку клітини під час морфогенезу. Отримані нами дані з експерименту на культурі нейронів гіпокампу дали можливість припустити модуляторну адгезивну властивість гіалуронату, за рахунок чого можна контролювати перші етапи морфогенезу. Пізніше, у 2002 році, експерименти Zimmerman та співавторів підтвердили наші припущення. Авторами був продемонстрований вплив гіалуроната на процеси адгезії А6 клітин до кальцій-(R,R) та (S,S)-тартрат тетрагідратних кристалів. Вони показали, що обробка гіалуронідазою епітеліальних клітин нирок із Xenopus luevis перед посадкою їх на субстрат значно знижує ступень адгезії. Знижену адгезію клітин, що були оброблені гіалуронадазою, можна частково або повністю поновити додаванням екзогенного гіалуроната. Але, надмірне збільшення екзогенного гіалуроната у вільній від сироватки рідині (10-1000 мкг/мл), що використовувалася для попередньої обробки клітин перед посадкою, призводить до гальмування адгезії клітин.
Гіалуронат є довгий лінейний глікозаміноглікан, який складається тільки з повторів дисахариду, що містить глюкуронову кислоту та N-ацетилглюкозамін. Молекула такої довжини є добрий кандидат для забезпечення взаємодії клітин із поверхнею. Кожна молекула гіалуронату може мати масу до декілька мільйонів дальтон та довжину десь 10 мкм, але це не характерне для фізіологічних умов у біологічних тканинах. Однак, Laurent (1992) указував на те, що одна молекула гіалуроната може простиратися на декілька мікронів від поверхні, до якої клітина торкається чи сорбується.
Отримані нами дані свідчать про те, що гіалуронат впливає не тільки на ступінь адгезії нейронів до субстрату, але й на термін морфогенезних подій. Нейрони, що були сорбовані на субстрат в умовах присутності гіалуроната, залишалися значно довгий час в округлій формі (указані стрілками, рис. 14), ріст аксонів та дендритів починався пізніше ніж у нейронів контрольних культур. Затримка початку диференціації спричинила збільшення терміну життя нейронів у культурі. У контрольній культурі на 30 году культивування нейрони вже диференційовані гинули в умовах низької щільності. За умов присутності у субстраті гіалуроната спостерігалося збільшення кількості недиференційованих нейронів, які були диференційовані пізніше, на 30 годину культури. Детальне дослідження нейронів офарбованих проти нейрофіламенту Н указує на те, що нейрони, котрі сорбовані на субстрат у присутності гіалуроната, мають більш інтенсивне забарвлення на нейрофіламент Н, ніж контрольні нейрони. На основі цих даних можна припустити, що гіалуронат впливає не тільки на адгезивність нейронів за рахунок взаємодії з мембранними рецепторами, але й може передавати сигнал про модифікацію цитоскелету, що також важливо під час морфогенезу нейронів.
Субстрат-зв'язані та вільні екстрацелюлярні молекули впливають на різні складові регуляторного ланцюга під час контролю розміру та полярності нейронів (Lochter et al., 1991).
Накопичено багато даних стосовно особливостей структури протеогліканів та глікопротеїнів, які мають у своїй структурі ГАГ-зв'язуючий домен (чи декілька). Найбільше всього характеризовані в цьому плані глікопротеїни міжклітинного матриксу ламінин (Calof et al., 1994; Denzer et al., 1997), колаген (Tillet et al., 2002) та фібронектин (Reichardt et al., 1991), які приймають активну участь у міжклітинних взаємодіях, міграції та диференціюванні периферичних та центральних нейронів. Останні роки більший інтерес привертають молекули, які секретуються у міжклітинний простір й можуть модулювати поведінку нейронів як за рахунок індукції трансмембранних чи мембраноасоційованих складових, так й за рахунок інтерналізації. У попередніх дослідженнях вважалось, що ключову роль у структурі протеогліканів та й глюкопротеїдів відіграє серцевинна, білкова частина. Зараз уже встановлено, що здатність більшості протеогліканів та й глікозаміногліканів зв'язувати, концентрувати та частково інтерналізувати деякі фактори росту тісно пов'язана як з особливістю конформації карбогідратних ланцюгів, так й з великою кількістю негативних зарядів на цих ланцюгах. Однак досі не вистачає інформації для того, щоб цілком зрозуміти механізм регуляції морфогенезу нейронів за участю окремих глікозаміногліканів, і особливо за їх сумісною дією in vivo. На сьогодні головна частина експериментів у цьому напрямку проводиться in vitro. Раніше було показано, що ріст аксонів та дендритів може бути під різним контролем за рахунок молекул міжклітинного матриксу, що присутні у культуральній рідині (Chamak and Prochiantz, 1989). Більш того, показано, що вплив різних молекул міжклітинного матриксу на розмір, форму та полярність нейронів значно залежить не тільки від кількості цих молекул, але й від того, де саме вони презентовані у клітині. У роботах Chamak (1989), Rousselet (1990), Prochiantz (1990) висловлюється припущення, що ріст аксонів краще відбувається в умовах низької адгезивності клітин, тоді як ріст дендритів можливий тільки в умовах високої адгезії.
З метою дослідження впливу гепарансульфату на адгезивні властивості нейронів під час морфогенезу ми вирощували нейрони гіпокампу на субстраті з додатком гепарансульфату. У присутності вільного гепарансульфату більшість нейронів протягом 2 годин мали округлу форму й не утворювали агрегатів. Ми дослідили, яким саме чином гепарансульфат впливає на адгезивні властивості нейронів гіпокампу. Для цього певні культури нейронів гіпокампу були префіксовані та оброблені антитілами проти нейрональної молекули клітинної адгезії, N-CAM, що є один із добре характеризованих представників родини молекул клітинної адгезії (Martini, 1994; Bock, 2002; Berezin et al., 2003; Schachner, 2003). Взаємодія N-CAM із гепарансульфат-протеогліканом відіграє також важливу роль у регуляції адгезії (Kiselyov et al., 1997). Наші попередні дослідження in vivo показали, що характер загальної гепарансульфат-зв'язуючої активності білків у мозку щурів значно змінюється під час ембріогенезу та раннього постнатального розвитку. Одночасні дослідження вмісту мембранної форми N-CAM у мозку щурів показали дуже схожу тенденцію. Найвищій рівень N-CAM був визначений у новонароджених щурів, котрий значно знижувався протягом перших двадцяти діб постнатального розвитку. Звертає увагу різниця темпу зниження кількості N-CAM у великих півкулях та мозочку, що також характерна для загальної гепарин-зв'язуючої активності білків мозку під час раннього постнатального розвитку.
Вирощування нейронів гіпокампу на субстраті з полі-L-лізину з додатком гепарансульфату призводило до зміни кількості молекул N-CAM на плазматичні мембрані нейронів (рис.15).
Збільшення кількості гепарану в субстраті до 40 мкг/мл призводило до статистично вірогідного збільшення відстані між міченими молекулами клітинної адгезії на плазматичній мембрані нейронів. У своїй роботі ми додатково застосували комп'ютерну модель, що запропонована Nikonenko (2000). Ця модель була застосована з метою отримання параметрів двомірного розташування мічених молекул клітинної адгезії на поверхні соми нейронів шляхом аналізу електронних мікрограм паралельних зрізів нейронів. Індивідуальні модельні відстані між мітками для контрольних нейронів, коливалися в діапазоні 0-1455,0 нм, але середнє значення добре збігалося з експериментальними даними й складало 175,47,9 нм.
...Подобные документы
Будова, фізичні та хімічні властивості білків. Для виявлення білків у різних матеріалах застосовують кольорові реакції, найважливішими з яких є ксантопротеїнова і біуретова. Елементарний склад, молекулярна маса білків. Застосування білків у промисловості.
реферат [296,8 K], добавлен 09.11.2010Накопичення продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків. Ефективність функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту. Вільнорадикальні процеси в мозку при експериментальному гіпотиреозі в щурів при фізичному навантаженні.
автореферат [84,7 K], добавлен 20.02.2009Визначення терміну життя білків в організмі. Будова протеасоми як спеціального білкового утворення. Роль убіквіну в процесі утилізації білків. Методи виявлення злоякісних утворень або ослаблення імунної системи клітин. Функціональне призначення лізосоми.
презентация [111,1 K], добавлен 24.09.2014Аналіз сутності, складу, будови, особливостей структури білків - складних високомолекулярних природних органічних речовин, що складаються з амінокислот, сполучених пептидними зв'язками. Порівняльні розміри білків та пептидів. Функції білків в організмі.
презентация [357,5 K], добавлен 10.11.2010Синтез мітохондріальних білків і особливості формування мітохондрій. Система синтезу білка в мітохондріях. Продукти мітохондріального білкового синтезу. Синтез мітохондріальних білків у цитоплазмі. Формування окремих компонентів мембран.
реферат [32,1 K], добавлен 07.08.2007Функціонально-структурна характеристика спинного мозку. Значення нейронних елементів спинного мозку. Розподіл аферентних та еферентних волокон на периферії. Функції спинного мозку. Механізми розвитку міотатичних рефлексів. Складові частини стовбура мозку.
презентация [559,8 K], добавлен 17.12.2014Характеристика компонентів адгезивної міжклітинної комунікації олігодендроцитів та нейронів. Класифікація неоплазій, що виникають у головному мозку ссавців. Патологія міжклітинних контактів гліоцитів і нейронів при дисембріогенетичних новоутвореннях.
курсовая работа [2,3 M], добавлен 31.01.2015Характеристика білків позаклітинного матриксу печінки. Порушення структури еластину. Будова та синтез молекули колагену. Стелатні клітини печінки як основні продуценти компонентів позаклітинного матриксу печінки. Накопичення та зберігання вітаміну А.
курсовая работа [1,1 M], добавлен 25.03.2013Головний мозок як складний біологічне пристрій, принципи передачі даних по нервах та від одного нейрона до іншого. Можливості мозку щодо сприйняття і зберігання необмеженої кількості інформації. Мнемоніка як сукупність різних прийомів запам'ятовування.
презентация [1005,6 K], добавлен 23.09.2015Речовини, які використовуються організмом для енергетичних і пластичних цілей. Насичені жирні кислоти. Прості та складні вуглеводи. Основні джерела вуглеводів у харчуванні людини. Значення вітамінів та їх активну участь в обмінних процесах організму.
презентация [841,0 K], добавлен 16.10.2013Роль білків (білкових речовин) в живій природі, їх структура та біологічні функції. Трансляція і загальні вимоги до синтезу білка в безклітинній системі: рібосоми, аміноацил-тРНК-синтетази, транспортні РНК. Природа генетичної коди. Етапи синтезу білка.
реферат [31,7 K], добавлен 05.10.2009Харчування як фізична потреба людини. Якісний склад харчового раціону людини, основні вимоги до нього. Зниження харчової цінності продукції під час зберігання і перероблення, оцінка та значення, нормування даних змін. Зміни білків, ліпідів та вітамінів.
реферат [17,9 K], добавлен 08.12.2010Біотехнологія мікроорганізмів та їх різноманітний світ. Створення мікроорганізмів-продуцентів та отримання генетичних рекомбінантів. Застосування рекомбінантних ДНК для переносу природних генів. Виробництво харчових білків, амінокислот та вітамінів.
реферат [21,8 K], добавлен 16.01.2013Обмін речовин як основна функція життя. Роль білків у обміні речовин. Значення жирів та вуглеводів у організмі. Водний і мінеральний обмін. Значення води в процесі росту і розвитку дитини. Класифікація та призначення витамінів. Норми та режим харчування.
реферат [34,8 K], добавлен 29.11.2009Класифікація антигенів, поняття антигенності, імуногенності. Роботи по антигенній структурі глобулярних білків. Послідовні та переривчасті антигенні детермінанти, їх властивості. Блокування зв'язування специфічних антитіл із білком в природному епітопі.
реферат [23,6 K], добавлен 14.09.2010Класифікація біотехнологічних виробництв, їх різновиди, відмінні ознаки та функціональні особливості. Сутність конформації та класифікація білків в залежності від даного параметру. Поняття та зміст генної інженерії, її значення на сьогодні, принципи.
контрольная работа [14,5 K], добавлен 24.11.2011Віруси настільки малі, що лише в кілька разів перевищують розміри великих молекул білків. Віруси — збудники багатьох хвороб рослин і тварин. У 1917 р. французький вчений Ф. д'Ерелл відкрив віруси бактерій — бактеріофаги (або фаги).
реферат [7,0 K], добавлен 13.05.2007Механізми дії та функції цитокінів у нервовій системі, їх взаємодії на рівні головного мозку. Рецептори цитокінів в межах центральної нервової системи (ЦНС). Стимуляція гіпоталамо-гіпофізарно-адреналової системи як доказ прямого впливу цитокінів на ЦНС.
реферат [5,7 M], добавлен 13.11.2013Процеси, які підтримують постійний зв'язок організму з навколишнім середовищем. Основні процеси біосинтезу. Властивості генетичного коду. Синтез поліпептидних ланцюгів білків по матриці іРНК. Найважливіші органічні речовини в організмі рослин і тварин.
презентация [1,1 M], добавлен 14.03.2013Загальний біоморфологічний опис Gіnkgo bіloba. Поширення рослини в Україні. Орфографічні та кліматичні умови міста Львова. Фармакологічні властивості, будова і функції білків в рослинному організмі. Аналіз методів дослідження і характеристика обладнання.
дипломная работа [3,9 M], добавлен 09.06.2014
