Функціональний стан гемоглобіну й еритроцитів морських риб, стійких до зовнішньої гіпоксії

Размещено на http://allbest.ru

ТАВРIЙСЬКИЙ НАЦIОНАЛЬНИЙ УНIВЕРСИТЕТ IМ. В.I. ВЕРНАДСЬКОГО

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Спеціальність 03.00.13 - Фізіологія людини i тварин

ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ГЕМОГЛОБІНУ Й ЕРИТРОЦИТІВ МОРСЬКИХ РИБ, СТІЙКИХ ДО ЗОВНІШНЬОЇ ГІПОКСІЇ

ВИКОНАЛА ПАРФЬОНОВА ІРИНА ОЛЕКСАНДРIВНА

Сімферополь - 2006



АНОТАЦІЯ

Парфьонова І.О. Функціональний стан гемоглобіну й еритроцитів морських риб, стійких до зовнішньої гіпоксії. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.13 - фізіологія людини та тварин. - Таврійський національний університет імені В.І. Вернадського, Сімферополь, 2006.

В умовах експериментальної гіпоксії вивчено киснезв'язуючі властивості гемоглобіну та морфометричні характеристики циркулюючої еритроцитарної маси чорноморських риб, що живуть у гіпоксичних акваторіях Чорного моря.

Показано, що кров стійких до гіпоксії видів (бичка-кругляка, скорпени) має водночас високу спорідненість до кисню та підвищену чутливістю до рН (ефект Бора). Ця властивість стає ще більш вираженою в умовах експериментальної гіпоксії. Вона визначається показниками гемоглобіну і не залежить від умов внутрішньоеритроцитарного мікрооточення (концентрацій NTP, Mg²⁺).

Методом диск-електрофорезу в ПААГі досліджено гетерогенну систему гемоглобіну риб, стійких до гіпоксії. Вперше виявлено компонент, що має водночас високу спорідненістю до кисню й виражені ефекти Бора та Рута. Показано, що його вміст у крові істотно підвищується в умовах зовнішнього дефіциту кисню, що призводить до змін киснезв'язучих характеристик крові в цілому.

Відзначено, що гемоглобін риб може легко переходити в окислений стан (мет-форма) і в умовах природного процесу оксигенації крові, і в умовах гіпотермії. На разі відбувається зниження стійкості еритроцитів до осмотичного шоку. Таке явище визначається присутністю малоефективної NADH₂-діафорази в клітинах червоної крові риб, чутливих до умов навколишнього середовища.

Показано, що в умовах довготривалої експериментальної гіпоксії (більш 10-ти діб) у особин скорпени та бичка-кругляка відбувається зростання значень гематокриту. Названа реакція обумовлена свелінгом циркулюючих еритроцитів внаслідок гідратації їхньої цитоплазми. Про це свідчить характер змін еритроцитарних індексів. Зазначеній реакції передує зморщення еритроцитів, що розвивається в умовах короткочасної адаптації особин до гіпоксії (90 годин). У крові при цьому відбувається підвищення вмісту поліхроматофільних нормобластів та поява менш диференційованих форм - базофильних нормобластів.

Вперше описано феномен росту обсягу ядер та ядерно-плазмових відношень у зрілих еритроцитів риб в умовах зовнішнього дефіциту кисню.

риба гемоглобін еритроцит гіпоксія



1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Кисень разом із температурою та солоністю є одним із найважливіших чинників, що впливають на поширення організмів у водному середовищі [Романенко, 2004]. Обмеження водообміну, евтрофікація, пов'язана з антропогенним навантаженням на водойми, є основними причинами, що призводять до виникнення зон стійкого дефіциту кисню [Бордовський, Іваненков, 1979; Романенко, 2004]. Останнім часом це явище вельми часто охоплює високопродуктивні шельфові зони Світового океану, призводячи до якісної трансформації існуючих екосистем [Виноградов, 1968; McEnroe et al., 1998; Kuharev, 1998; Duncombe-Rue et al., 2000; Shulman et al., 2002]. Чорне море в такому контексті не є виключенням. Зони стійкої придонної гіпоксії були порівняно нещодавно виявлені на його північно-західному шельфі [Фесюнов, Назаренко,1991; Берлінський, Диханов, 1991; Фащук та ін.,1991; Виноградов та ін., 1992; Зуєв, 2000].

Спостереження, зроблені в Аденській затоці, в акваторіях Каліфорнійського узбережжя та Західної Африки, дозволили багато в чому переглянути попередні уявлення про необхідність присутності кисню у водному середовищі для існування гідробіонтів [Виноградов, 1968; McEnroe et al., 1998; Kuharev, 1998]. Виявлено, що значна кількість організмів, у тому числі й оксифільні, здатні тривалий час знаходитись у середовищі із залишковим вмістом кисню (менше 0.4 мл л^-1).

Фізіологічним та біохімічним чинникам існування гідробіонтів в умовах гострої гіпоксії приділяється пильна увага протягом останніх 30-ти років [Waversveld et al., 1989 a,b; Савина, 1992; Shulman et al., 1998; 2002; Shulman, Love, 1999; Lushchak et al., 2005; Lushchak, Bagnyukova, 2006 та ін.]. Особливу зацікавленість викликає вивчення стану систем кисневого забезпечення організму, зокрема крові, функціональна реалізованість яких в умовах гострої гіпоксії суттєво знижена. Дослідження, проведені в означеному напрямку, дозволили виявити в крові риб, стійких до зовнішньої гіпоксії, наявність гемоглобінів, які не чутливі до рН [D'Avino et al., 1994; Pellegrini et al., 1995; Taiwo, 1995], а також володіють зворотним ефектом Бора в лужному діапазоні рН [Fago et al., 1995; Feuerlein, Weber, 1996]. Досить несподівані реакції були відзначені і на рівні циркулюючих ядерних еритроцитів: свелінг клітин [Perry, Thomas, 1991], активізація трансмембранного Na⁺/H⁺-обміну [Nikinmaa, 1991; Perry, Reid, 1992; Reid, Perry, 1994], збільшення випадків амітотичного розподілу [Houston, Murad, 1995; Soldatov, 1996] тощо. Однак загальна функціональна значущість виявлених змін залишається до кінця не проясненою. Вивченню впливу водної гіпоксії на респіраторні системи гідробіонтів й присвячена дійсна робота.

Мета i завдання дослiдження. Мета дисертаційної роботи - дослідження функціонального статусу компонентів гемоглобінової системи, гематологічних характеристик та еритрограми циркулюючої крові в донних риб, толерантних до гострого дефіциту кисню.

Для реалізації поставленої мети потрібно вирішити такі завдання:

Визначити в умовах експерименту критичні та межові концентрації кисню для донних риб, стійких (бичок-кругляк, скорпена) та чутливих (камбала-глосса; бички: мартовик, трав'яник) до дефіциту кисню.

Порівняти гематологічні, морфометричні та киснезв'язуючі властивості циркулюючої крові риб різної толерантності до зовнішньої гіпоксії.

Дослідити в умовах експерименту вплив гіпоксії на гематологічні, морфометричні та киснезв'язуючі властивості циркулюючої крові риб, стійких до дефіциту кисню.

Вивчити гетерогенну систему гемоглобіну толерантних до гіпоксії риб та визначити функціональні характеристики її окремих компонентів.

Оцінити окисну стійкість гемоглобінів риб (перехід у феррi-форму), активність NADH₂-дiафорази еритроцитів та стійкість кліток червоної крові до осмотичного шоку в умовах нормоксії.

Об'єкт дослідження: представники донної іхтіофауни Чорного моря: скорпена (Scorpaena porcus L.), камбала-глосса (Platichthys flesus luscus P.), бички: кругляк (Neogobius melanostomus P.), мартовик (Gobius batrachocephalus P.), трав'яник (Gobius ophiocephalus P.).

Предметом дослідження є вивчення морфо-функціональних підстав адаптації червоної крові низки донних риб Чорного моря до існування в умовах гострого дефіциту кисню.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених завдань було використано комплекс фізіологічних (гематологічні дослідження, спектрофотометричні методи побудови кривих оксигенації крові та гемоглобіну), біохімічних (електорофорез білків у ПААГі, активність ферментів, значення метаболітів та окисних модифікацій гемоглобіну), цитологічних (світлооптична мікроскопія та цитометрія клітин крові) та статистичних методів, а також методи моделювання гiпоксiї в умовах лабораторiї.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в умовах експериментальної гіпоксії вивчено киснезв'язуючі властивості гемоглобіну та морфометричні характеристики циркулюючої еритроцитарної маси чорноморських риб, що живуть у гіпоксичних акваторіях Чорного моря.

Показано, що кров стійких до гіпоксії видів (бичка-кругляка, скорпени) має водночас високу спорідненість до кисню та підвищену чутливістю до рН (ефект Бора). Цi ознаки ставали ще яскравіше виражени в умовах експериментальної гіпоксії. Вони визначалися властивостями гемоглобіну і не залежали від умов внутрішньоеритроцитарного мікрооточення (концентрацій NTP, Mg²⁺).

Методом диск-електрофорезу в ПААГі досліджено гетерогенну систему гемоглобіну риб, стійких до гіпоксії. Вперше виявлено компонент, якому притаманні водночас висока спорідненістю до кисню та вираженість ефектів Бора й Рута. Показано, що його вміст у крові істотно підвищується в умовах зовнішнього дефіциту кисню, що призводить до змін киснезв'язуючих характеристик крові в цілому.

Вперше відзначено, що гемоглобін риб може легко переходити в окислений стан (мет-форма) і за умов природного процесу оксигенації крові, і за умов гіпотермії. На разі відбувається зниження стійкості еритроцитів до осмотичного шоку. Таке явище визначається присутністю малоефективної NADH₂-діафорази в клітинах червоної крові риб, чутливих до умов навколишнього середовища.

Вперше описано феномен росту обсягу ядер та збільшення ядерно-плазмових відносин у зрілих еритроцитах риб за умов зовнішнього дефіциту кисню.

Практичне значення одержаних результатів. Морфологічні та цитометричні реакції еритроцитарної маси на гіпоксію, одержані в дисертаційному дослідженні, можуть бути використані при діагностиці гіпоксичних станів риб у сучасному рибництві.

Одержані результати дозволяють скорегувати уявлення про причини, що викликають розвиток метгемоглобінемії в риб при риборозведенні. Показано, що в основі означеного стану може лежати не лише інтоксикація організму нітритами та нітратами, але й чинники водного середовища, що виходять за межі толерантності виду (гіпотермія).

Камбала-глосса є одним iз перспективних об'єктів сучасного рибництва. Результати, отримані в дійсній роботі з респіраторних характеристик крові даного виду, можуть бути використані при визначенні й уточненні меж фізіологічних норм, які варто дотримувати в умовах штучного риборозведення.

Теоретичні положення та практичні розробки дисертації можуть бути використані при читанні курсів лекцій з фізіології та біохімії адаптаційних процесів, екологічної фізіології та біохімії риб студентам факультетів біологічного та рибогосподарського профілю.

Особистий внесок дисертанта. Дисертантом самостійно зібрано й проаналізовано спеціальну літературу за темою роботи. Виконано всі експериментальні дослідження, лабораторна обробка фізіологічних, біохімічних проб та цитологічних препаратів. Проведено статистичний аналіз отриманих результатів. Постановка мети та задач дослідження, а також інтерпретація отриманих даних виконані при участі наукового керівника і співавторів опублікованих робіт.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. У розділі охарактеризовано гіпоксичні акваторії Світового океану та Чорного моря. Розглянуто причини виникнення цих зон, їхнє поширення, описано стан екосистем та стійкість гідробіонтів до дефіциту кисню. Подано розгорнуту морфологічну, ультраструктурну та функціональну характеристики еритроїдної популяції клітин крові риб. Описано структурно-функціональні особливості гемоглобінів означеної систематичної групи організмів. Розглянуто особливості функціонування системи червоної крові риб в умовах дефіциту кисню.

Матеріали і методи досліджень. Матеріалом для досліджень стала кров 5-ти видів донних риб, що живуть біля узбережжя Кримського півострова: бичка-кругляка (Neogobius melanostomus P.), бичка-мартовика (Gobius batrachocephalus P.), бичка-трав'яника (Gobius ophiocephalus P.), камбали-глосси (Platichthys flesus luscus P.) та скорпени (Scorpaena porcus L.). Всього використано 317 особин. Рибу відловлювали в Севастопольській бухті (ІнБЮМ НАН України) та в районі Кара-Дагу (Карадагський природний заповідник). Під час проведення експериментальної частини роботи використовували спеціально виготовлений стенд. Він дозволяв підтримувати задану температуру та концентрацію кисню у воді протягом необмеженого часу і застосовувався при визначенні критичних та межових концентрацій кисню, а також у експериментах з вивчення впливу гіпоксії та гіпотермії на організм риб. У момент вилучення особин із камери для запобігання розвитку маніпуляційного стресу застосовували уретановий наркоз [Солдатов, 2003].

Концентрацію гемоглобіну в крові та розчинах контролювали за допомогою геміглобінцианідного методу. Застосовували стандартний набір реактивів ТОВ “Агат-мед” (Росія). Кількість еритроцитів у крові підраховували в камері Горяєва [Золотницька, 1987]. Гематокрит визначали шляхом центрифугування зразків крові в гепаринізованих капілярах (750 g; 30 хвилин). На підставі одержаних значень розраховували еритроцитарні індекси (MCV, MCH, MCHC) [Золотницька, 1987]. Водночас визначали осмотичну резистентність у циркулюючих еритроцитів за мікроскопічним методом Яновського [Стенко, 1975]. Мазки крові забарвлювали за комбінованим методом Паппенгейма [Золотницька, 1987]. На мазках підраховували процентний вміст незрілих еритроїдних форм: пронормобластів (ПрН), базофільних (БН) та поліхроматофільних нормобластів (ПН); за допомогою окуляр-мікрометра вимірювали великий та малий діаметри в зрілих еритроцитах (L_c; B_c) та їхніх ядрах (L_n; B_n). На підставі значень L_n та B_n за формулою еліпсоїда обертання розраховували обсяг ядра еритроцита (V_n) [Ташке, 1980]. Для порівняльної оцінки змін MCV та V_n визначали індекс: V_n / MCV (ядерно-плазмові відношення).

Криві кисневого насичення для цільних гемолізатів та розчинів окремих фракцій гемоглобіну будували за допомогою спектрофотометричного методу з використанням кювет-десатураторів [Крикливий та ін., 1979]. Величину рН крові та гемолізатів оцінювали на рН-метрі ELWRO N 5123 (Польща). Величину напівнасичення гемоглобіну киснем (P₅₀) та коефіцієнт Хілла (n) розраховували з кривих кисневого насичення. Ефект Бора (r) оцінювали за рівнянням Ділла. Водночас визначали сумарний вміст нуклеотидтрифосфатів (NTP) в еритроцитах за допомогою неферментативного методу Сейца (гідроліз лабільного фосфату) [Терехов, Петров, 1983] та внутрішньоклітинний вміст Mg²⁺ - спектрофотометрично за допомогою стандартного набору реактивів фірми “Lacheme” (Чехія). Фракціонування гемолізатів проводили за допомогою диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі. Концентрація акриламіду - 7.5 % [Маурер, 1971]. Розподіл оптичних щільностей між фракціями оцінювали за допомогою денситометра “Carl Zeiss” (Німеччина). Стійкість гемоглобіну до окислювання контролювали за вмістом його феррі-форми (метгемоглобін) у крові. Контроль здійснювали спектрофотометрично з використанням реагента ацетон-циангідрину [Кушаковський, 1970]. Водночас визначали активність НАДН₂-діафорази в циркулюючих еритроцитах за швидкістю відновлення метгемоглобіну [Кушаковський, 1970]. Цифровий матеріал оброблено статистично за допомогою t-критерію Стьюдента, а також методів кореляційного аналізу [Лакін, 1980]. Результати представлені як .

Критичні та межові концентрації кисню. Порівняльна оцінка чутливості та стійкості до гіпоксії була виконана на 5-ти видах донних риб (табл. 1). Вибір цієї групи був обумовлений розходженнями в їхній толерантності до дефіциту кисню. Як критерії чутливості та стійкості до гіпоксії обрані показники критичної (Р_кр.О₂) та межової напруги кисню (Р_пор.О₂) у воді.

За результатами визначення показників цих величин встановлено, що найменш чутливими до зміни концентрації кисню в середовищі виявилися кругляк та скорпена (табл. 1). Перехід на залежний тип дихання в них відбувався при найбільш низьких Р_кр.О₂ у середовищі (p<0.01). Аналіз Р_пор.О₂ показав, що найбільш стійким до гіпоксії видом є кругляк. Загибель його особин спостерігалася при найбільш низьких значеннях даного показника - 4.9 гПа. Під час експерименту в двох особин кругляка відзначали здатність переносити повну аноксію. В інших риб межові напруги кисню були в 2-3 рази вищими (p<0.001). Це означає, що організм скорпени та кругляка має функціональні можливості, які дозволяють цим видам існувати в умовах гострого дефіциту кисню. За цим повинні стояти і відповідні молекулярні комплекси.

Таблиця 1. Р_кр.О₂ та Р_пор.О₂ у деяких видів донних риб (температура води 15-17^оС)

Види риб	n	Ркр., гПа	Рпор., гПа
Кругляк	10	35.6+2.2	4.9+1.1
Мартовик	9	41.2+1.8	10.5+0.8
Трав'яник	7	54.3+1.7	14.6+0.8
Глосса	8	49.9+1.6	14.7+0.9
Скорпена	10	33.1+0.9	10.6+0.7

Гемоглобінова система. Порівняльний аналіз кривих оксигенації цільних гемолізатів показав, що для гемоглобіну стійких до гіпоксії риб (кругляка та скорпени) характерне поєднання двох ознак: високої спорідненості до кисню та підвищеної чутливості до рН. Величини напівнасичення гемоглобіну киснем (Р₅₀) у кругляка та скорпени мали мінімальні значення (p<0.01), що відбивало високу сполучну здатність цього білка. Про підвищену чутливість до рН свідчили високі значення ефекту Бора (p<0.001) (табл. 2). Величини коефіцієнта Хілла були низькими і збігалися у всіх риб, що відбивало низький ступінь кооперативної взаємодії субодиниць у молекулі гемоглобіну.

Таблиця 2. Характеристики кривих оксигенації цільних гемолізатів

Види риб	P50, гПа	Коефіцієнт Хілла	Ефект Бора (r)
	n		n		n
Кругляк	27	16.8+0.6	27	1.36+0.02	7	-0.31+0.02
Мартовик	30	19.3+0.6	30	1.41+0.02	9	-0.19+0.01
Трав'яник	26	19.4+0.6	26	1.49+0.02	6	-0.17+0.01
Глосса	20	24.9+0.9	20	1.18+0.02	10	-0.15+0.01
Скорпена	21	15.7+0.6	21	1.27+0.03	10	-0.28+0.02



Розглянуті вище особливості функціональних властивостей гемоглобіну риб, стійких до зовнішньої гіпоксії, мають яскраво виражений адаптивний характер, що призводять до певних суттєвих наслідків:

· зростання спорідненості гемоглобіну до кисню полегшує його насичення в умовах низького РО₂ у середовищі;

· підвищення чутливості гемолгобіну до рН сприяє розвантаженню оксигенованої молекули на тканинному рівні, особливо в умовах тканинного ацидозу, що супроводжує розвиток тканинної гіпоксії.

Розходження в спорідненості до кисню та чутливості до рН можуть бути пов'язані і з особливостями самого пігменту, і з умовами мікрооточення молекули. Для встановлення причин розходжень були вивчені особливості складу внутрішньоеритроцитарного середовища (табл. 3). Основними алостеричними регуляторами спорідненості гемоглобіну до кисню в риб є ATP і GTP. Тому в еритроцитах риб визначалася сумарна фракція NTP. Показники, наведені в таблиці, дають змогу контатувати, що принципових розходжень у вмісті цього з'єднання між досліджуваними видами риб немає. Природним конкурентом за NTP в еритроцитах риб виступає Mg²⁺. У перерахуванні на NTP (індекс Mg²⁺/NTP) розходження також не були встановлені.

Таблиця 3. Особливості складу внутрішньоеритроцитарного середовища в донних риб

Види риб	NTP ммоль л-1	Mg2+ммоль л-1	Mg2+/NTP	рН
	n		n		n		n
Кругляк	7	8.04+0.39	12	9.8+0.7	7	24.6+1.8	7	7.71+0.03
Мартовик	8	7.25+0.50	10	11.3+0.8	8	30.2+2.2	8	7.72+0.02
Трав'яник	6	7.82+0.42	-	-	-	-	-	-
Глосса	10	7.49+0.48	-	-	-	-	10	7.79+0.03
Скорпена	11	8.39+0.45	15	12.8+0.7	11	28.4+2.4	11	7.74+0.03



Мал. 1. Криві оксигенації для цільних гемолізатів кругляка в нормі (А) та в умовах експериментальної гіпоксії (Б)

Результати, представлені в цій таблиці, дозволяють зробити висновок про те, що внутрішньоеритроцитарне середовище не могло вплинути на відзначені раніше розходження в киснезв'язуючих властивостях гемоглобінів риб, чутливих та стійких до дії зовнішньої гіпоксії.

Відзначені вище властивості гемоглобінів риб, стійких до гіпоксії (висока спорідненість до О₂ та підвищена чутливість до рН), ще більш посилювалися в умовах експериментальної гіпоксії (мал. 1). Перебування особин кругляка протягом 10-ти діб у воді з концентрацією кисню 1.7-1.8 мг л^-1 (20 % насичення) супроводжувалося зсувом кривих оксигенації гемоглобіну вліво (Р₅₀ знижувалося на 21.8 %, p<0.01), що свідчить про збільшення спорідненості гемоглобіну до кисню. Водночас підвищувалась чутливість пігменту до рН. При зміні рН інкубаційного середовища в діапазоні 8.3>7.8 зсув кривих оксигенації вправо був більше вираженим у риб, що знаходяться в умовах гіпоксії. Ефект Бора підвищувався в 3.2 рази (p<0.001). Водночас проявлявся й ефект Рута. Про це свідчило зниження ступеня насичення гемоглобіну киснем при високих значеннях РО₂ в інкубаційному середовищі (100 гПа). У риб, що знаходяться в умовах нормоксії, цього не спостерігалося.

Таблиця 4. Влив експериментальної гіпоксії на киснезв'язуючі характеристики гемолiзатов кругляка

Показники	n	Умови експерименту
		Нормоксiя	Гiпоксiя
P50, гПа (рН 8.3)	8	15.6+0.8	12.2+0.7
Коефiцiєнт Хiлла (рН 8.3)	8	2.49+0.06	1.73+0.07
Ефект Бора (рН 8.3>7.5)	8	-0.22+0.06	-0.70+0.04
Ефект Рута (при 100 гПа)	8	-	4.63+1.21

Відзначені вище закономірності демонструють розрахунки середньостатистичних параметрів: показника Р₅₀, ефектів Бора та Рута (табл. 4).

Поєднання високої спорідненості до кисню з підвищеною чутливістю гемоглобіну до рН, що було відзначено в порівняльних дослідженнях, та посилення цієї властивості в умовах експериментального навантаження означає, що така адаптаційна стратегія, мабуть, має певне функціональне значення.

Гемоглобін бичка-кругляка було розділено за допомогою вертикального диск-електорофорезу в поліакриламідному гелі на чотири компоненти: два головних (F₁ та F₂) та два мінорних (M₁ та M₂) (мал. 2). Відносна електрофоретична рухливість F₁ та F₂ склала відповідно 0.224+0.004 та 0.254+0.003, а M₁ та M₂ - 0.198+0.004 та 0.272+0.003.

Денситометрування одержаних електрофореграм дозволило визначити процентне співвідношення основних компонентів у системі . В особин, що знаходяться в умовах гіпоксії, вміст F₂ збільшувалося на 41.8 % (p<0.001), а рівень F₁ знижувався на 26.8 % (p<0.001).

Мал. 2. Денситограми гемоглобінової системи кругляка в нормі (А) та в умовах експериментальної гіпоксії (Б)

Для уточнення функціональної значущості розглянутих перебудов гемоглобінової системи компоненти F₁ та F₂ були елюйовані з гелевих стовпчиків. Одержані зразки гемоглобінів потім були використані для вивчення їхній киснезв'язуючих властивостей. Криві оксигенації F₂ розташовувалися лівіше, ніж F₁, тобто даний компонент гемоглобіну мав більш високу спорідненість до кисню (мал. 3). Водночас він мав підвищену чутливість до рН. При зміні рН інкубаційного середовища в діапазоні 8.3>7.8 його криві оксигенації зміщувалися вправо значніше, ніж у F₁. Форма кривої оксигенації у F₂ була більш близькою до гіперболи, ніж у F₁. Розходження були статистично вагомі (табл. 5). Наявність F₂ у гемоглобіновій системі кругляка пояснювала особливості газотранспортних властивостей крові в цілому, а також стійкість цього виду до зовнішньої гіпоксії.



Мал. 3. Криві оксигенації окремих компонентів гемоглобінової системи кругляка

Стійкість гемоглобіну до окислювання. Гемоглобіни риб відрізняються низькою стійкістю до окислювання. Рівень феррі-форми в крові може досягати 27 % без ознак токсичної метгемоглобінемії. При утриманні особин скорпени в умовах експериментальної гіпоксії (15 і 30 % насичення води киснем) нами був зареєстрований факт зниження концентрації метгемоглобіну в крові (табл. 6). Це відбувалося на тлі підвищення стійкості еритроцитів до осмотичного шоку (мал. 4).

Одержані результати дозволяють говорити про те, що процес природної оксигенації крові трансформував частину гемоглобіну скорпени в окислений стан. Подібна ситуація можлива лише у випадку низької ефективності антиоксидантних систем еритроцита та, зокрема, NADH₂-діафорази, що перешкоджає утворенню феррі-форми. Про те, що це дійсно має місце, свідчить зміна осмотичної стійкості еритроцитів, мембрани яких чутливі до рівня окисних процесів у клітині.

Таблиця 5. Киснезв'язуючі характеристики компонентів гемоглобінової системи кругляка

Показники	n	Фракції гемоглобіну
		F1	F2
P50, гПа (рН 8.3)	5	21.5+1.9	7.74+0.98
Коефiцiєнт Хiлла (рН 8.3))	5	2.60+0.09	1.65+0.08
Ефект Бора (рН 8.3>7.5)	5	-0.17+0.03	-0.81+0.09
Ефект Рута, % (при 100 гПа)	5	-	12.8+1.4

Таблиця 6. Концентрація метгемоглобіну в крові скорпени в умовах експериментальної гіпоксії

Умови експерименту	n	Концентрація метгемоглобіну
		г л-1	% Hb
100% О2 (контроль)	9	9,46+0,76	5,17+0,57
30% О2 (дослiд 1)	7	3,97+0,53	2,16+0,23
15% О2 (дослiд 2)	4	5,50+0,72	2,46+0,27

При проведенні досліджень було виявлено, що окисна стійкість гемоглобінів риб знижується в умовах низьких температур. Для уточнення цих аспектів були проведені додаткові експерименти.

При інкубації in vitro гепаринізованих зразків крові скорпени при 5, 10 і 15^о С значний ріст феррі-форми (до 7 % Hb, p<0.01) був відзначений при 5^оС. Аналогічні дані були одержані in vivo і при адаптації особин кругляка до низьких температур (20>10^о С). При цьому ріст концентрації метгемоглобіну відбувався на тлі зниження активності NADH₂-діафорази еритроцитів. В умовах довготривалої адаптації (15 діб) було показано, що організм бичка міг компенсувати підвищення рівня метгемоглобіну в крові, відновлюючи активність NADH₂-діафорази.



Мал. 4. Осмотична резистентність циркулируючих еритроцитів скорпени в умовах експериментальної гіпоксії (1 - мінімальна; 2 - максимальна резистентність)

Гематологічні дослідження. Порівняльна оцінка гематологічних характеристик та еритроцитарних індексів у риб різної толерантності до гіпоксії не дозволила виявити статистично вагомих розходжень.

В умовах експериментальної гіпоксії відзначалось істотне зростання показників гематокриту (30-40 %, p< 0.05) при збереженні концентрації гемоглобіну та кількості еритроцитів у крові. Це реєструвалося і щодо кругляка, і щодо скорпени (табл. 7, 8). Розрахунки еритроцитарних індексів показали збільшення середньоклітинного обсягу (20-25 %, p<0.05), що відбувалося на тлі зменшення середньоклітинної концентрації (15-20 %, p<0.001) та збереженні середньоклітинного вмісту гемоглобіну. Таке співвідношення процесів вказує на набрякання (свелінг) циркулюючих еритроцитів.

Випадки свелінга клітин червоної крові в умовах зовнішньої гіпоксії були описані раніше для багатьох риб [Tetens, Christensen, 1987; Perry, Thomas, 1991; Plante et al., 1998]. В основі такого явища лежить трансмембранний обмін Na⁺/H⁺, що індукуєтсья підвищенням концентрації катехоламінів у крові [Perry, Thomas, 1991].



Таблиця 7. Гематологічні характеристики крові кругляка в умовах нормоксії та гіпоксії

Показники	n	Умови експерименту
		Нормоксія	Гіпоксія
Гемоглобін, г л-1	8	45.5+3.2	51.1+2.9
Еритроцити, (1012) л-1	8	1.04+0.13	1.16+0.04
Гематокрит, %	8	20.6+1.6	28.5+1.1
MCH, пг	8	45.7+3.1	44.1+2.6
MCHC, %	8	22.4+0.6	17.9+0.9
MCV, мкм3	8	204.6+14.0	245.4+4.6

Таблиця 8. Гематологічні характеристики крові скорпени в умовах нормоксії та гіпоксії

Показники	n	Умови експерименту
		Нормоксія	Гіпоксія
Гемоглобін, г л-1	8	33.8+1.6	36.1+2.2
Еритроцити, (1012) л-1	8	0.58+0.03	0.63+0.03
Гематокрит, %	8	14.4+0.8	19.2+1.6
MCH, пг	8	58.9+2.3	57.5+1.7
MCHC, %	8	23.6+0.4	19.2+0.7
MCV, мкм3	8	250.7+12.7	307.4+17.5

Вихід H⁺ із клітини запобігає значним змінам рН еритроциту в умовах плазмового ацидозу, що сприяє нормальному функціонуванню його молекулярних систем, насамперед гемоглобіну. Водночас відбувається надходження Na⁺ у клітину, що підвищує осмотичний тиск і супроводжується оводненням еритроциту. Очевидно, ці процеси і визначали збільшення обсягу клітин червоної крові у скорпени в умовах експериментальної гіпоксії. Для уточнення деталей нами були досліджені морфометричні характеристики циркулюючих еритроцитів.

Морфометричні характеристики еритроцитів. В умовах експериментальної гіпоксії в еритроцитах скорпени візуально не відзначалися зміни забарвлення цитоплазми чи наявність будь-яких деформацій. Однак клітини при цьому ставали більшими та набували більш округлої форми. Значно збільшувався обсяг їхніх ядер. Подібні зміни були найкраще виражені в особин, що знаходяться в умовах гострого дефіциту кисню протягом 45 діб. Це видно і на прикладі середньостатистичних величин (ріст малого діаметра еритроцитів та обсягу ядра), і на прикладі зсуву максимумів розподілів (табл. 9; мал. 5). Слід зазначити, що ріст обсягу ядра перевершував збільшення обсягу клітини, про що свідчать більш високі значення ядерно-плазмових відношень у піддослідної групи риб.

Таблиця 9. Цитометричні характеристики циркулючої еритроцитарної маси скорпени в умовах експериментальної гіпоксії

Показники	n	Умови експерименту
		Нормоксія	Гіпоксія
Lc, мкм	8	13.90+0.17	14.20+0.21
Bc, мкм	8	8.63+0.20	9.62+0.22
Lc-Bc, мкм	8	5.27+0.16	4.58+0.21
Ln, мкм	8	5.31+0.13	5.89+0.09
Bn, мкм	8	3.72+0.13	4.15+0.09
Vn, мкм3	8	39.3+3.9	53.4+2.83
Vn/MCV	8	0.160+0.019	0.178+0.014

Збільшення обсягу ядра клітини зазвичай спостерігається у випадках: функціональної активізації структури, поліплоїдії, токсичної дії. У нашому випадку більш ймовірна перша причина, якщо враховувати перебудову гемоглобінової системи в умовах гіпоксії, розглянуту вище, що вимагає активізації певних локусів генома.

Гіпоксія викликала також підвищення вмісту незрілих еритроїдних форм у крові більш, ніж у 2 рази (p<0.001). Ріст був обумовлений переважно підвищенням вмісту поліхроматофільних нормобластів. На ранніх етапах адаптації до гіпоксії була відзначена також поява в крові кліток більш ранніх стадій диференціювання - базофільних нормобластів.



Мал. 5. Гістограми розподілу обсягів ядер еритроцитів скорпени в умовах нормо- та гіпоксії (n - 800 клітин)



ВИСНОВКИ

Кров стійких до гіпоксії риб (бичка-кругляка, скорпени) має водночас високу спорідненість до кисню та підвищену чутливість до рН (ефект Бора). Ця властивість стає ще більш вираженою в умовах експериментальної гіпоксії. Вона визначається показниками гемоглобіну і не залежить від умов внутрішньоеритроцитарного мікрооточення (концентрацій NTP, Mg²⁺).

У гемоглобіновій системі бичка-кругляка виявлено компонент, що має водночас високу спорідненість до кисню та виражені ефекти Бора й Рута. Показано, що його вміст у крові істотно підвищується в умовах зовнішнього дефіциту кисню, а сам він цілеспрямовано змінює киснезв'язуючі характеристики крові в цілому.

Газотранспортні властивості крові риб, що існують в умовах екстремальної гіпоксії, дозволяють їм зберігати кисневі потреби в широкому діапазоні PO₂. Про це свідчать мінімальні значення критичних та межових концентрацій кисню - 33-36 та 5-10 гПа відповідно.

Гіпоксія викликає зменшення концентрації метгемоглобіну в крові скорпени та збільшення стійкості циркулюючих еритроцитів до осмотичного шоку. Це відбиває нестійкий окислювально-відновлюючий статус клітин, на який впливає природний процес оксигенації гемоглобіну.

Зниження температури в діапазоні 5-10^о С в умовах in vitrо та in vivo призводить до трансформації частини гемоглобіну скорпени в окислений стан (мет-форма). Це корелює зі зниженням активності NADH₂-діафорази еритроцитів. Тривала адаптація до температури 5^о С (15 діб) супроводжується компенсацією таких змін.

В умовах довготривалої експериментальної гіпоксії (більш 10-ти діб) у особин скорпени та бичка-кругляка відбувається зростання значень гематокрита. Концентрації гемоглобіну та кількості еритроцитів у крові не притаманні істотні зміни. Зазначена реакція обумовлена свелінгом циркулюючих клітин червоної крові внаслідок гідратації їхньої цитоплазми, про що свідчить характер зміни еритроцитарних індексів. Їй передує реакція зморщення еритроцитів, що розвивається в умовах короткочасної адаптації особин до гіпоксії (90 годин).

Експериментальна гіпоксія викликає ріст обсягу ядер та ядерно-плазмових відношень у зрілих еритроцитів скорпени. Ці зміни стосуюються більше 50 % циркулюючих клітин.

В умовах гіпоксії відбувається підвищення вмісту в крові скорпени поліхроматофільних нормобластів та поява менш диференційованих форм - базофільних нормобластів. Реакція розвивається на ранніх етапах експерименту (90 годин) і утримується потім протягом 45 діб.



СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ З ТЕМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Солдатов А.А., Парфенова И.А.Влияние температуры на устойчивость гемоглобинов морских рыб к окислению // Экология моря. -2000. -Вып.53. -С.49-53 (внесок автора - проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

2. Солдатов А.А., Парфенова И.А. Уровень метгемоглобина в крови и устойчивость циркулирующих эритроцитов скорпены Scorpaena porcus P. к осмотическому шоку в условиях экспериментальной гипоксии // Ж. эволюц. биохим. физиол. -2001. -Т.37, №6. -С.477-479 (внесок автора - проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

3. Солдатов А.А., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Гемоглобиновая система черноморского бычка - кругляка в условиях экспериментальной гипоксии // Укр. биохим. ж. -2004. -Т.76, №3. -С.85-90 (внесок автора - проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

4. Парфенова И.А., Солдатов А.А., Коношенко С.В. Кислородосвязующие свойства гемоглобинов рыб, устойчивых к внешней гипоксии // Доп. НАН України. -2005. -№5. -С.160-164 (внесок автора - проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб, статистичний аналіз одержаних результатів, участь у підготовці тексту рукопису статті).

5. Парфенова И.А., Солдатов А.А. Эритрограмма циркулирующей крови скорпены в условиях экспериментальной гипоксии // Морск. экол. ж.- 2005. -Т.4, №2. -С.59-67 (внесок автора - проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб, статистичний аналіз одержаних результатів, участь у підготовці тексту рукопису статті).

6. Парфенова И.А. Морфометрические характеристики циркулирующих эритроцитов Scorpaena porcus L. в условиях экспериментальной гипоксии // Наук. зап. Терноп. нац. пед. ун-та. Серiя: бiологiя. -2005. -Т.4, №27. -С.170.

7. Парфенова И.А. Влияние гипоксии и гипотермии на устойчивость гемоглобинов морских рыб к окислению / Конференция молодых ученых “Понт Эвксинский 2; Проблемы экологии Азово-Черноморского бассейна: современное состояние и прогноз, Севастополь, 18-20 сентября 2001: Тез. докл. - Севастополь, 2001. -С.14-15.

8. Солдатов А.А., Коношенко С.В., Парфенова И.А. Сравнительная оценка устойчивости к гипоксии черноморских рыб // Ecological Studies, Hazards, Solutions. -2004. -V. 7. -P. 91 (внесок автора - проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

9. Солдатов А.А., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Цитохромная и гемоглобиновая системы бычка-кругляка Neogobius melanostomus (P.) в условиях внешней гипоксии / Мат. Межд. конф. “Совр. пробл. физиол. и биох. водных организмов”, Петрозаводск, 6-9 сентября 2004: Тез. докл. -Петрозаводск, 2004. -С.131-132 (внесок автора - проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

10. Soldatov A.A., Parfyonova I.A., Konoshenko S.V. Nuclear erythrocytes of marine fishes under experimental hypoxia conditions: morphological and biochemical investigations / First (Inaugurel) Ukr. Congr. Cell Biol., Lviv, 25-28 April 2004: Abstr. -Lviv, 2004. -P.229 (внесок автора - проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

11. Парфенова И.А. Критические и пороговые напряжения кислорода у морских рыб различной толерантности к внешней гипоксии / VІІ Міжн. науково-практ. конф. студентів, аспірантів та молодих вчених “Экологiя. Людина. Суспiльство.”, Київ, 13-15 травня 2004: Тез. доп. - Київ, 2004.

12. Солдатов А.А., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Молекулярные системы транспорта и утилизация кислорода у морских рыб в условиях экстремальной гипоксии / XIX Съезд физиол. об-ва им. И.П. Павлова (мат. съезда), Екатеринбург, 19-24 сентября 2005: Тез. докл. -Екатеринбург, 2004. -С.204-205 (внесок автора - проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

13. Солдатов А.А., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Молекулярные основы устойчивости организма некоторых морских рыб к условиям экстремальной гипоксии / Науч. тр. I Съезда физиологов СНГ. Т. 1. Сочи (Дагомыс), 19-23 сентября 2005: Тез. докл. -М.: Медицина-Здоровье, 2005. - С.168 (внесок автора - проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

14. Солдатов А.А., Головина И.В., Гостюхина О.Л., Андреенко Т.И., Столбов А.Я., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Молекулярные и функциональные основы адаптации черноморских гидробиотов к гипоксии, аноксии и различным видам окислительных нагрузок / Межд. научн. конф. “Проблемы биологической океанографии XXI века”, Севастополь, 19-21 сент. 2006: - Севастополь: Экоси-гидрофизика, 2006. - С. 166. (внесок автора - проведення частини експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

Размещено на Allbest.ru

...