Грибы симбионты растений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Грибы симбионты растений

Классификация

По своим специфическим характеристикам микоризные грибы традиционно разделяются на три группы:

1. Эктомикориза,

2. Эндомикориза (эндофитные грибы),

3. Везикулярно-арбускулярная микориза (строго облигатная эндомикориза).

Еще одна классификация (согласно Смиту и Риду, изменено, 1997г.) включает в себя 5 партнерских групп:

1. Экто-,

2. Экто-Эндо- (эктэндомикоризы),

3. Арбутоидные,

4. Вересковые

5. Везикулярно-арбускулярные

и две антагонистические группы:

6. Орхидейные,

7. Монотропоидные.

Общим для всех форм является то, что гифы гриба пронизывают почву и поставляют растению минеральные вещества.

1. Эктомикориза

Эктомикориза - наиболее часто встречающийся в лесах средне-европейской полосы корневой симбиоз. Мицелий (совокупность разветвленных гифов) словно чехлом плотным слоем покрывает поверхность корня. Гифы гриба прорастают в корковый слой корня, но, не проникая в корневые клетки, образуют во внеклеточном пространстве сеть, которая способствует оптимизации обмена питательными веществами между грибом и растением (сеть Хартига). Гифы гриба проникают глубоко в почвенный слой, что обеспечивает корню дополнительную поставку многих питательных веществ и влаги.

Помимо этого микоризный гриб защищает корень дерева от инфицирования другими бактериями и почвенными грибами. Подобная форма симбиотических отношений характерна для берез, буков, сосен, ив и розоцветных.

Партнерами-грибами в большинстве случаев выступают представители отряда Boletales и Agaricales (базидиомицеты), а в редких случаях также сумчатые грибы (аскомицеты), такие как трюфель и особый вид ковшевидных - кедровый песчаник.

В благоприятных условиях многие растения могут развиваться также и без партнерства с грибами, однако среди грибов есть такие, которые для своего развития должны обязательно вступать в союз с растением. Считается, что многие виды больших грибов способны к образованию эктомикоризы - в Центральной Европе их более тысячи; к ним относятся сыроежки, подорешники, рядовки, гигрофор, мухоморы, бледная поганка, лисички.

2. Эндомикориза (Эндофитные грибы)

Эндофитные грибы - грибы, живущие внутри растения и не вызывающие видимых симптомов заболевания. Истинные эндофиты - грибы, живущие внутри растения и никогда не вызывающие видимых симптомов заболевания.

2.1 Эндофитные грибы злаков (клавиципитальные эндофиты)

Клавиципитальные грибы (порядок Clavicipitales) входят в класс сумчатых грибов (Ascomycetes). В основном это паразиты (например, спорынья), однако, есть и факультативные сапрофиты [Клавиципитальные грибы СССР / Коваль Э.З. - Киев: Наукова думка, 1984. - 288 с.].

Среди эндофитов злаков в настоящее время активно изучается представители рода Epichloл и их анаморфы - представители рода Neotyphodium. Эти грибы находятся в симбиотической ассоциации с различными злаками, не вызывая никаких внешних признаков заражения. Растение обеспечивает гриб питанием и стабильной средой обитания. Эндофиты выделяют алкалоиды, которые защищают растение от насекомых вредителей и частично от травоядных млекопитающих, а также увеличивают устойчивость растения-хозяина к болезням и неблагоприятным условиям. Распространение эндофита происходит вместе с семенами растения-хозяина. Изучение этой группы эндофитных грибов с прикладной точки зрения в первую очередь связано с кормовой отраслью сельского хозяйства. У скота, который кормят травой с высокой долей заражения эндофитами, появляются симптомы отравления, вплоть до гибели. С другой стороны растения без эндофитов растут хуже. Данная дилемма отсутствует в другой прикладной отрасли - селекции газонных трав. В настоящий момент направление, связанное с использованием эндофитов для улучшения качества газонных трав, считается перспективным [Благовещенская Е.Ю. Эндофитные грибы злаков. Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. Москва, 2006. - 26 с.].

Особенности роста эндофитных клавиципитальных грибов: мицелий идет по межклетникам хозяина, не образуя гаусторий (боковые ответвления гиф паразитических грибов, проникающие внутрь клетки-хозяина). Обычно они приурочены к надземным частям растений, к стеблям и влагалищам листьев. Иногда мицелий может заходить и в листовую пластинку. Иногда мицелий эндофитов обнаруживают также и в корнях молодых проростков при культивировании растений in vitro. При развитии генеративных побегов мицелий заходит в стебель и далее в развивающееся семя. Клетки растения-хозяина, соседствующие с мицелием неотифодиев (Neotyphodium uncinatum), выглядят нормально и не отличаются от других по ультратонкому строению. Обычно поверхностный мицелий развивается только при инкубации растения или его частей на питательной среде.

2.2 Эндофиты корней (ТС- эндофиты, DSE)

Так называемые Dark Septate Endophytes (DSE) - Темные септированные эндофиты (ТС-эндофиты). Особенности DSE: Заселяют только корни, имеют меланизированную септу, не имеют специфичности по хозяевам или по месту обитания хозяев, встречаются в ризосфере, предполагается горизонтальная передача.

ТС-эндофиты известны для 600 видов растений (320 родов, 114 семейств), среди которых есть хвощи, плауны и папоротники. Встречаются повсеместно от Арктики до Антарктики.

DSE содержат разные группы грибов обитающих в корнях. DSE можно определить как конидиальные или стерильные сумчатые грибы, которые колонизируют живые корни растений, не вызывая видимых негативных последствий, таких как дезорганизация тканей. [Jumpponen, A. and Trappe, J.M. Dark-septate root endophytes: a review with special reference to facultative biotrophic symbiosis. New Phytologist. 1998. 140: 295-310]. Такое определение включает множество грибов, чьи функции и таксономическое родство остаются неизвестными. В эту группу также могут быть включены грибы обычно образующие эктэндомикоризы хвойных. Эктэндомикоризы имеют структурные сходства с эктомикоризами: они формируют мантию или сеть Хартига (см. эктомикориза). Тем не менее, эти два типа микоризы отличаются тем, что эктэндомикориза проникает в внутриклеточное пространство в большей степени, чем эктомикориза.

DSE часто не в состоянии сформировать полную сеть Хартига при колонизации восприимчивого к эктомикоризе хозяина, но колонизируют внутриклеточные пространства, образуя микросклероции. Тем не менее, некоторые исследования морфологии корней колонизированных DSE описали такие ассоциации, как эктэндомикориза. Таким образом, DSE, вероятно, включает грибы, которые можно рассматривать как эктэндомикоризные симбионты, способные колонизировать великое множество хозяев [Jumpponen A. Dark septate endophytes - are they mycorrhizal? // Mycorrhiza (2001) 11:207-211].

Развитие мицелия в корнях растения хозяина наиболее хорошо изучено у Phialocephala fortinii:

1. Формируется поверхностный мицелий. Т.н. «runner hyphae».

2. Гифы проникают в коровые клетки, реже проникновение происходит через корневые волоски.

3. Гифы растут вдоль длинной оси корня, от клетки к клетке, не вызывая при этом патологических изменений в корне. Через клеточную стенку растения гифа проникает формируя очень узкую проникающую трубочку (penetrate tube).

4. Время от времени гифы формируют микросклероции.

2.3 Прочие эндофиты

Эндомикоризу образует большинство почвенных микромицетов, особенно грибы родов Fusarium, Trichoderma, Mucor, Altemaria, Aspergillus и Penicillium. Характер взаимоотношений гриба и растения-хозяина, как правило, трудно предсказать. Диапазон - от явного паразитизма до трофического симбиоза. Например, исследование эндомикоризы, образуемой грибами р. Fusarium показало, что некоторые виды фузария, проникая в корень, ведут себя как типичные паразиты, другие ограничиваются в своем развитии корой корня. При этом в паренхимных клетках коры гриб образует хламидоспоры вдоль клеточных оболочек. Гифы сворачиваются в более или менее плотные клубки.

Один и тот же вид фузария может оказывать неодинаковое влияние на различные сельскохозяйственные культуры. Например, Fusarium moniliforme, проявляющий стимулирующие свойства по отношению к проросткам кукурузы, одновременно угнетает рост яровой пшеницы. Микоризация зерна ячменя и яровой пшеницы Fus. somifectum, Fus. avenaceum, т.е. видами фузария, часто выделяемыми с поверхности зерна этих культур, привела к более чем 2 кратному увеличению урожая.

Интересно, что один и тот же вид фузария может оказывать стимулирующее или ингибирующее воздействие на определенную сельскохозяйственную культуру в зависимости от состояния последней. Гриб может перейти от симбиотрофии к паразитизму в случае ослабления растения какими-либо внешними факторами.

3. Везикулярно-арбускулярная микориза (ВАМ-грибы, АМ-грибы)

ВАМ-грибы - облигатные симбионты и потому не способны развиваться без растения-хозяина. ВАМ-грибы имеют следующее морфологическое строение. Вокруг корня формируется сеть наружного экстраматрикального мицелия, гифы которого резко увеличивают площадь поглощения корневой системы, что особенно важно в случае отсутствия корневых волосков у растений. Внутренний мицелий распространяется внутри и между клетками коры корня. Ткани в эндодерме не колонизируются.

Арбускулы (древовидно-разветвленные гифы) развиваются, когда верхушечная или боковая ветвь гифы проникает в клетку хозяина и там начинает дихотомически ветвиться. В результате этого обеспечивается предельно большая площадь контакта между грибом и цитоплазмой клетки. Цитоплазма арбускул, как и цитоплазма внутренних и внешних гиф, содержит много сферических гранул диаметром 0,1-0,2 мм. Заключенные в них полифосфаты связаны с вакуолями в транспорте фосфатов током цитоплазмы по гифам из почвы к арбускулам.

Везикулы - сферические или овальные пузырчатые вздутия в середине и на концах гиф, главным образом, между клетками первичной коры. Везикулы функционируют как запасающие структуры и как выживающие пропагулы, когда микоризные корни отмирают и разлагаются (рисунок).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Практически все члены класса формируют арбускулы в корковых ячейках корней покрытосемянных растений. Таксон Geosiphon формирует интересный симбиоз даже с морскими водорослями.

За исключением разновидностей Gigaspora и Scutellospora, грибы формируют заполненные липидами пузырьки в пределах корней. То, что члены двух родов не формируют пузырьки, привело к дебатам относительно того, является ли название арбускулярная микориза более соответствующим, чем везикулярно-арбускулярная микориза для этих отношений, или должны быть использованы более соответствующие термины, в зависимости от разновидностей микоризы.

Споры образуются АМ-грибами в почве, прямо на гифах или внутри спорокарпов, последние имеют размеры от нескольких мм до 2-3 см. Внутри спорокарпов могут находиться спорангии, зигоспоры или хламидоспоры. Зиготы образуются в результате слияния двух одноядерных или многоядерных клеток, отделившихся перегородками от гиф мицелия. Бывают гомо- и гетероталлические виды. Зрелые споры эндомикоризных грибов имеют характерные прикрепления к несущим их гифам, что является важным диагностическим признаком.

Таксономия этой группы грибов претерпевает постоянные изменения. Ранее их относили в отдел Zigomycota к семейству Endogonaceae (эндогоновые грибы) состоящим из родов: Acaulospora, Gigaspora, Glomus и Sclerocystis. В настоящее время АМ-грибы выделили в самостоятельный отдел Glomeromycota, состоящий из 5 семейств.

Современная классификация отдела гломеромицетов

Однако это и теперь подвергается сомнению. Недавняя информация о последовательности их 18S рибосомальных РНК указывает, что они формируют древнюю группу, ветвящуюся перед аскомицетами и базидиомицетами. Все виды грибов этого отдела репродуцируются асексуально с помощью бластоспор.

Эндомикоризные грибы - облигатные симбионты, не растущие в культуре in vitro. В связи с этим изучение жизненного цикла грибов было всегда затруднено.

Цикл развития большинства эндофитов можно разделить на две фазы: биотрофную и сапротрофную. Биотрофная фаза связана с живым растением-хозяином, преимущественно, с его корневой системой. Сапротрофная фаза протекает в почве или на растительных остатках, где происходит формирование зигоспор, хламидоспор, спорокарпов, являющихся органами перенесения неблагоприятных условий внешней среды в отсутствие растений.

У многолетних растений в зимних условиях гриб сохраняется в тканях корня в форме гиф и многочисленных везикул (рис.4). С возобновлением вегетации высшего растения сразу же возобновляется и рост эндофитного гриба в корнях. Гифы из перезимовавших участков корня постепенно внедряются во вновь формирующиеся ответвления корней. Но возможно также заражение микоризными грибами из почвы, где они сохраняются в виде хламидоспор и спорокарпов.

Наличие или отсутствие микориз, а также особенности их строения, зависят, преимущественно, от систематического положения растения-хозяина. Большинство папоротников и мохообразных микотрофны. У высших споровых растений не имеют микориз спорофиты плаунов и хвощей. Голосеменные все микотрофны. Среди покрытосеменных не имеют микориз осоковые, ситниковые, крестоцветные, маковые, гвоздичные, большинство гречишных и маревые. Более того, вытяжки из их корней действуют угнетающе на процесс прорастания спор ВАМ. Согласно данным Ротамстедской опытной станции сильной степенью микоризации отличаются цитрусовые, лук-порей, репчатый лук, спаржа и клевер. Средняя степень микоризации характерна для сои, кукурузы. сорго и паспалума. Микоризации плохо поддаются пшеница, ячмень, картофель, люпин и рис. ВАМ-грибы также инфицируют деревья и кустарники: дуб, ясень, яблоню, лещину, жимолость и даже морские водоросли.

микоризный гриб эндофитный злак

4. Выделение эндофитных грибов

Корни растений отделяют, многократно отмывают водопроводной водой, затем обрабатывают 33% пероксидом водорода и затем корни отмывают 96% этанолом. Полученные образцы корней промывают стерильной водой, измельчают стерильными ножницами, помещают на плотную и жидкую питательную среду Гельцер с добавлением антибиотика стрептомицина (200 мкг/мл) и инкубируют в течение 2 недель.

Чистые культуры выделяют методом последовательных пересевов на агаризованную среду Гельцер с антибиотиком [Гельцер Ф. Ю. Симбиоз с микроорганизмами - основа жизни растении. - М.: Изд-во МСХА, 1990, с. 134.].

Питательная среда Гельцер:

рН 6,5±0,2.

* Основная особенность симбионтных грибов растений - их потребность в ростовых веществах в короткий период прорастания из растительной ткани в питательную среду. Без наличия гормонального воздействия извне эти грибы не прорастают. В качестве гормональных препаратов могут быть взяты спиртовые вытяжки из различных гименомицетов, таких, как белые грибы, мухоморы, скрипица, различные сыроежки, фитобактериомицин, изготовляемый из актиномицета Actinomeces lavendulae, гиббереллин, препарат Симбионт 1.

5. Выделение ВАМ-грибов

Л. В. Крюгер, И. А. Селиванов. Грибы, образующие везикулярно-арбускулярные эндомикоризы, и методы их изучения // Значение консортивных связей в организации биогеоценозов Источник: http://www.activestudy.info/griby-obrazuyushhie-vezikulyarno-arbuskulyarnye-endomikorizy-i-metody-ix-izucheniya/ © Зооинженерный факультет МСХА

Простейшим является метод прямого отбора спор и спорокарпов из почвы и лесной подстилки под лупой или бинокуляром. Но этот способ мало продуктивен из-за больших затрат времени на поиски нужных объектов.

Второй метод - метод влажного просеивания - заимствован Гердеманом (Gerdemann, 1955) из практики изучения фитопатогенных нематод. Сущность метода состоит в следующем. Пробу почвы объемом 250 см3 взбалтывают в 1 литре воды. Через несколько секунд взмученная жидкость процеживается через почвенное сито с крупными отверстиями. Полученная почвенная суспензия вновь, взмучивается и процеживается через сито с меньшими отверстиями и т. д. Большинство спор АМ грибов имеют диаметр от 150-250 до 400-450 микрон, поэтому на такие фракции обращают основное внимание.

Дебрис с сита переносят в чашки Петри с тонким слоем воды и просматривают его под бинокулярным микроскопом, выбирая споры препаровальной иглой с плоским кончиком. Подобная процедура довольно трудоемка: чтобы найти 100 спор, приходится затратить рабочий день.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Существенные изменения в методику влажного просеивания и фильтрования внес Оме (Ohms, 1957), предложивший так называемый флотационный способ - расслаивания и центрифугирования. Первые этапы работы -- приготовление почвенной суспензии и ее процеживание -- ведутся по Гердерману (1955), но затем фракция частиц, остающихся на сите с отверстиями 0,177 мм, суспензируется в воде, взмучивается, а после осаждения тяжелых частиц центрифугируется. После этого на дно другой -- 50-миллиметровой центрифужной пробирки наливается 10 мл 50%-ного раствора сахарозы, а затем осторожно по вертикальной стенке шприцем с изогнутой стеклянной трубкой добавляется 15 мл 25%-ного раствора сахарозы, а сверху--10 мл воды. В эту же пробирку добавляется 15 мл суспензия с наиболее легкими почвенными частицами и дебрисом. После центрифугирования, проводимого в течение б минут при 3100 оборотах в минуту, споры осядут в среднем слое, а почвенные частицы -- на дно. Споры из среднего слоя пипеткой переносят в чистую пробирку или мензурку, добавляют воды, чтобы уменьшить удельный вес раствора. Осевшие споры промываются водой. За день этим способом можно отобрать примерно более 2000 спор.

Большая трудность исследования АМ грибов заключается, во-первых, в том, что находимые в почве споры и спорокарпы в лабораторных условиях обычно не прорастают, а во-вторых, в том, что находящиеся в фикомицетных микоризах эндофитные грибы вне живого растения-хозяина не растут.

Одним из важных условий культуры эндогонов является отбор спелых спорокарпов, максимальное количество которых, судя по литературным данным (Mosse, 1954, 1956, 1959; Godfrey, 1957; Gerdemann, 1955, 1968; и др.), созревает в сентябре-октябре. Признаком зрелых спорокарпов является легкое выделение из них покоящихся спор, характеризующихся ясно выраженной двуслойной оболочкой: бесцветной наружной и желтоокрашенной внутренней.

Вторым условием успешной культуры АМ является отбор здоровых спорокарпов, не зараженных паразитическими грибами, которые нередко поражают споры грибов из семейства Endogonaceae (Thaxter, 1922; Mosse, 1954, 1959; Godfrey, 1956, 1957в; и др.).

Третьим важным условием является поверхностная дезинфекция спор, проводимая обычно» хлорамиром -- Т (в концентрации 200 частей на миллион) в течение 15 минут (с добавлением стрептомицина и детергента).

Для стимуляции прорастания спор исследователями применялось много различных приемов и способов, описанных в работах Gerdemann (1955, 1968), Gilmore (1968), Godfrey (1957) и др., но наибольшего успеха в этом отношении добилась Mosse (1959). По ее мнению, лучше всего прорастание спор стимулировать следующим образом. В стерильную чашку Петри помещается металлическое или стеклянное кольцо. В пространство между стенками чашки Петри и кольцом вливается 0,75%-ный водный агар, а в центр -- почво-агаровая среда (0,2 г просеянной почвы и 0,5 мл 0,75%-ного водного агара). После затвердения агара кольцо удаляется, а на агар кладется большой стерильный целлофановый диск, на который помещаются маленькие также дезинфицированные целлофановые квадратики со спорами. Споры, расположенные на целлофане, диффузно получают из почвы необходимые для прорастания стимулирующие вещества, вместе с тем до мйнимума сводится их заражение патогенными микроорганизмами. При инкубации (20° С) через 2--4 дня прорастает 80--100% спор эндогоновых грибов.

В культуре у АМ грибов наблюдается тенденция к образованию мицелия двух типов: воздушного на целлофане и погруженного в почво-агаровую среду. Это явление, видимо, отражает условия естественного роста АМ грибов, живущих частично в почве, частично в корнях высших растений.

Для успешного культивирования эндогоновых грибов важно знать потребности роста и условия синтеза везикулярно-арбускулярных микориз. Mosse (1959), основываясь на предположении, что везикулярно-арбускулярный эндофит является облигатным симбионтом, который не может быть выращен в отсутствии корней растения-хозяина, провела серию опытов, чтобы установить, насколько рост эндогоновых грибов может быть стимулирован либо путем асептического выращивания сеянцев на агаре с помещенными около корней спорами, либо прибавлением в среду корневых вытяжек. Ею выяснено, что в асептических условиях непосредственный контакт с корнями не ускоряет роста гиф или ускоряет его кратковременно. Если срезанные корешки на 5--8 минут поместить в звуковой дезинтегратор, то полученная суспензия увеличивает рост гиф на водном агаре. Дезинтегрированная таким же способом культура хлореллы оказала большее положительное воздействие, чем корни высших растений. По-видимому, концентрация ростактивирующих веществ в хлорелле выше, чем в корнях. Органические кислоты (яблочная, уксусная, лимонная, пировиноградная, виннокаменная) увеличивают прирост мицелия. Вероятно, они могут использоваться грибом как источник углерода.

Культивирование ВАМ-грибов in vitro

[Tahir Abdoulaye DIOP. In vitro culture of arbuscular mycorrhizal fungi: advances and future prospects // African Journal of Biotechnology Vol. 2 (12), pp. 692-697, December 2003] Мини-обзор

Эта статья описывает методы позволяющие культивировать органы корня, и позволяющие выбрать и очистить AM грибковый инокулюм (интрарадикальные и экстрарадикальные формы). Обобщены аксеничные (т.е. чистые) и моноксеничные (т.е. совместно с корнем растения) культуры AM грибов, и предложена методология извлечения и обеспечения непрерывной культуры AM без грибов потери инфекционности.

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУР ОРГАНОВ КОРНЯ

Использование удаленных корней в качестве хозяина партнера в симбиозе с AM было сначала предложено Mosse и Hepper (1975). Изолированный корень может размножаться непрерывно на различных твердых и жидких средах с высокой воспроизводимостью. Были получены клоновые корни около 15 растений (Butcher, 1980), и в течение прошлых десятилетий этот список был расширен. Инициирование изолированных корней требует, чтобы перед прорастанием семян проводилась стерилизация классическими дезинфицирующими средствами (натрия гипохлорит, перекись водорода), затем тщательное отмывание в стерильной дистиллированной воде. Прорастание семян происходит после 48 ч в 28°C в темноте на водном агаре или увлажненной фильтровальной бумаге. Появившиеся проростки (2 см) могут быть пересажены на богатую среду, такую как модифицированная Белая среда (Bйcard и Fortin, 1988) или среда Strullu и Romand (Strullu и Romand, 1987). рH среды устанавливают 5.5 перед автоклавированием. Быстрорастущие корни клонируют повторными субкультурами.

Трансформация корней почвенным микроорганизмом Agrobacterium rhizogenes обеспечила новый способ массового получения корней за очень короткое время. 2-суточная бактериальная суспензия используется для прививки органов корня. Корни моркови (Daucus carrota L.) генетически модифицированные культурой A. rhizogenes показывают обильное накопление корней спустя две-четыре недели. Затем проростки стерильным образом выращивают на богатой среде (Bйcard и Fortin, 1988). Чтобы получить свободноживущие корни без бактерий необходимы несколько (3-4) субкультур на этой же среде, обогащенной антибиотиками, такими как карбенициллин или ампициллин. После этого устанавливается клоновая культура, полученная из единственного корня.

A. rhizogenes вставляет в трансформируемые корни копии Т-ДНК, которые возникают в большой плазмиде A. rhizogenes (Чилтон и др., 1982). Поэтому трансформированные корни быстро, энергично и однороднно растут в относительно плохих средах без добавок гормональных веществ. Отрицательный геотропизм трансформированные корней облегчает контакты с гифами AM грибов (Bйcard и Fortin, 1988; Mugnier и Mosse, 1987). Тэпфер (Tepfer, 1984) указал, что они могут выживать в течение долгого времени без субкультивирования, и из-за их отрицательного геотропизма наблюдается меньше загрязнений в культуре трансформированных корней моркови (Diop, 1990).

ГРИБНОЙ ИНОКУЛЯТ

Все типы AM ростков (изолированные споры или везикулы, мицелий, кусочки микоризированных корней) практически в состоянии начать AM симбиоз (рисунок). Хламидоспоры Glomus sp. (Mosse и Hepper, 1975; Mugnier и Mosse, 1987) и не-спорокарповые азигоспоры Gigaspora margarita (Bйcard и Fortin, 1988; Bйcard и Pichй, 1989a; Diop и др., 1992) очевидно является предпочтительным посевным стартером, даже если в тепличных условиях могут произойти переход в состояние покоя и мутация штамма. Предпочтение отдается благодаря доступности средств восстановления, стерилизации и проращивании я этих ростков.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Прорастающие образцы AM ростков на водном агаре: везикула Glomus fasciculatum (A), спора Gigaspora margarita (B), кусочек корня микоризированного Glomus intraradices (C).

Из-за неспособности некоторых AM грибов образовывать споры, использование интрарадикальных форм AM грибов считается хорошим способом получения AM симбиоза (Джонсон, 1977; Макги, 1989). Интравезикулы в микоризных корнях являясь резервом и ростком, имеют более высокий посевной потенциал, чем другие АМ ростки такие как споры и гифы (Magrou, 1946; Bierman and Linderman, 1983; Strullu and Romand, 1986; Mosse, 1988). Ряд авторов использовали интрарадикальные формы грибов AM для достижения массового получения биомассы Glomus sp. (Diop, 1995; Diop et al., 1994, Strullu et al., 1996; Declerk et al., 1996a; 1998).

Ключом успеха при получении аксеничных или моноксеничных культур AM грибов являются правильный выбор и эффективность процесса стерилизации всех видов AM ростков. Изолированные споры чаще всего поверхностно стерилизуют по двух ступенчатому способу Меца (Metz et al., 1979) в модификации Бекарда и Фортина (Bйcard and Fortin, 1988). Инокулят из кусочков AM грибов поверхностно стерилизуется по методу Диопа (Diop et al., 1994). Обычно, поверхностная стерилизация включает обработку раствором хлорамина-T (2%) со следовым содержанием ПАВ (Tween 20/80) и антибиотиками, такими как стрептомицин или гентамицин. Стерилизованные ростки AM грибов должны храниться при 4 ° С до использования.

АКСЕНИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ (чистые культуры)

Получение чистой культура AM грибов по-прежнему является сложной задачей для микробиологов. Пресимбиотический рост AM грибов характеризуется формированием так называемого управляющей (запускающей) гифы. После нескольких недель без дополнительного партнера хозяина проросшие ростки AM прекращают септирование гиф и цитоплазма втягивается. Для объяснения отсутствия роста AM грибов в чистой экстрарадикальной фазе были изучены несколько факторов, таких как питание (Hepper, 1983), химические обработки (Gianinazzi-Pearson et al., 1989; Bйcard и Pichй, 1989a) и генетические факторы (Burggraaf и Beringer, 1989; Bйcard и Pfeffer, 1993; Bianciotto и Bonfante, 1993). Низкие количества натуральных или синтезированных флавоноидов стимулируют рост грибков (Morandi, 1989, Chabot et al, 1992b). В другом случае, некоторые аминокислоты (Hepper и Jacobsen, 1983), летучие соединения, в частности двуокись углерода и экссудаты корней способствовали удлинению гиф (Carr и др., 1985;. Elias и Safir, 1987; Bйcard и Pichй, 1989b).

Хилдебрант обнаружил присутствие на поверхности стерилизованных спор Glomus intraradices слизеобразующих бактерий идентифицированных как Paenibacillus validus (Hildebrant et al., 2002). Эти бактерии при отсутствии какой-либо растительной ткани стимулировали рост G. intraradices до стадии споробразования. Аналогичные результаты по пресимбиотической споруляции были получены с другим грибом Glomus sp. (Diop, неопубликованные данные). Авторы объясняют эту необычную споруляцию возможностью использования грибами химического компонента (или компонентов) секретируемого бактериями. Buee и др. (2000) выделил полуочищенную фракцию, названную «Branched factor» (Ветвившийся фактор) от 8 видов микотрофных растений, которые очень активно стимулировали прорастание и деление ядер Gigaspora sp.

G. versiforme и G. intraradices из корней без добавления живого растения хозяина в течение трех месяцев развивает на водной агаровой среде обширные экстрарадикальные структуры до стадии споруляции (Диоп и соавт., 1994b). Это происходит благодаря большому содержанию липидов в интрарадикальных формах АМ гриба. Результаты подтверждают, что качество, а не количество корневых экссудатов является более важным в стимуляции роста гиф (Карр и др., 1985;. Элиас и Сафир, 1987).

МОНОКСЕНИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ (АМ грибы + корни)

В работах Bйcard и Pichй (1992), Fortin и др. (2002) описывается развитие AM грибов в моноксеничных культурах с использованием трансформированных или или нетрансформированных корней. Самой подходящей средой для стандартизации in-vitro культур AM грибов является модифицированная Белая среда (Минимальная среда M) (Bйcard и Fortin, 1988) и модифицированная среда Strullu и Romand (среда MSR) (Diop, 1995) Долгосрочное изучение G. margarita на трансформированных Ri-TDNA корнях моркови показало, что 80% грибковых единиц образуется во время периода старения корня (Bйcard Fortin, 1988; Diop и др., 1992).

Использование моноксеничной системы AM симбиоза дешевле, чем парниковые культуры (Диоп и др.., 1994a). Предлагается следующая методологию для извлечения, очистки и выращивания тропических AM грибов: AM грибы могут быть выделены из поверхностных слоев почвы (1, см. рисунок) (Диоп, 1995). Их размножают в сочетании с микотрофными растеними в тепличных условиях (2). Изолированные споры или везикулы могут быть моноксенично прокультивированы в присутствии изолированных корней (3, 4) или на растении-хозяине (5).

Интрарадикальные формы AM грибов (6, 7) используются в качестве инокулята моноксеничных культур (8) на среде М или MSR. Регулярное субкультивирование (каждые 4 месяца) позволяет получить различные грибковые поколения в непрерывных культурах (9). Возможную потерю инфекционности можно избежать путем введения растения в систему in vitro (10).

Аксенические AM ростки сохраняется при 4 ° С в темноте в течение нескольких месяцев или используются для фундаментальных исследований. Возможность непрерывного культивирования и криоконсервации привели к созданию международной коллекции in vitro AM грибов (веб-сайты: http://www.mbla.uclac.be/ginco-bel и http://res2.agr.ca/ecorc/ginco.can/ ).

Фундаментальные и практические исследования

Хотя культура in vitro является искусственной системой, она может быть ценным инструментом для изучения фундаментальных и практический аспект AM симбиозе, дополняя экспериментальные подходы. Развитие экстрарадикального мицелия в асептических условиях часто сопровождается образованием, так называемых арбускуло-подобных структур (ALS) (Пегу и др.., 1998a) или разветвленных поглощающих структур (BAS) (Пегу и др.., 1998b).

Диоп (1995) создал банк гермплазмы АМ моноксеничных культур в ассоциации с изолированными томатными или трансформированных морковными корнями. Полученные ростки (споры, гифы, инфицированных корни) смогли прорасти и эффективно заразить новые растения. Инкапсуляция стабилизирует биологические свойства микоризных корней и изолированных везикул или спор (Strullu и др., 1991;.. Declerk и др., 1996b). Это иммобилизация также сохраняет инфекционность AM ростков в условиях in vitro или in vivo.

8. Биопрепараты

Мицефит - препарат регулятор роста сельскохозяйственных растений на основе синтеза БАВ ТС-эндофита Phialocephala fortinii F-833, выделенным из корней багульника болотного (Ledum palustre L.) [Разработка биотехнологии препарата регулятора роста сельскохозяйственных растений на основе синтеза биологтчески активных веществ микромицетом Phialocephala fortinii].

Мицефит предназначен для обработки семян и вегетирующих растений. Использование данного препарата позволяет сократить сроки прорастания семян на 5-12 дней, увеличить корневую систему, увеличить зеленую биомассу и урожайность различных культур, позволяет снизить нормы расхода удобрений, а в ряде случаев отменить их применение. Повышает урожай на 20-30% для томатов, моркови, тыквы и петунии. Представляет собой лиофильно высушенную форму белого цвета в пенициллиновых флаконах, в которых содержится 0,04 г активного начала.

Производитель: ОАО «Биохиммаш» (Москва); тел.: 159-31-70; E-mail: info@bioplaneta.ru; http://bioplaneta.ru.

Симбионта, Ж (д.в. грибов-эндофитов женьшеня продукт метаболизма). Норма расхода препарата 1 мл/т при замачивании семян перед посевом и 1 мл/га при опрыскивании посевов. Стимуляция роста и развития, повышение устойчивости к заболеваниям. Культуры: зерновые (озимые и яровые), перцы, баклажаны, капуста, арбузы, астры.

Производитель: ЗАО «Сельхозполимер». Номер государственной регистрации № 09-511-0134-0.

Эмистим, ВР (д.в. продукты метаболизма симбионтного гриба Acremonium lichenicola, выделенного из корней женьшеня). Содержит ростовые вещества цитокининовой и гиббереллиновой природы, бета-лактамные антибиотики, циклоспорин С, алкалоиды с фитоалексиновой активностью, гидроксилированные изопреноиды. Препарат воспринимается растением при очень низкой концентрации, путем межклеточных сигналов в клетках листьев, которые включают комплекс защитных механизмов, приводящих к синтезу лигнина, суберина, каллозы, в результате чего укрепляются клеточные стенки растения. При этом клеточные стенки растений укрепляются настолько, что некоторые насекомые-вредители не могут их прокусить или съесть. Тли и нематоды резко теряют интерес к обработанным растениям и ищут себе жертв послабее на соседних участках.

«Эмистим» в первую очередь увеличивает мощность корневой системы, обеспечивая растению преимущество в развитии по сравнению с его конкурентами - сорняками. Обработка растений «Эмистимом» в сочетании с микроэлементами и гуматами («Гумат+7», «Лигногумат», «Плодородие») усиливает их способность сопротивляться неблагопритным факторам, таким как весенние заморозки, высокие летние температуры, засуха. Норма расхода препарата 0,01-0,3 мл/т при обработке семян и клубней. Повышение полевой всхожести и урожайности, содержания сахаров и витаминов, снижение содержания нитратов. Культуры: картофель, свекла сахарная и кормовая, хлопчатник.

Экост 1ГФ - полный аналог эмистима, но в сухой форме в виде порошка

Производитель: ПБОЮЛ «Янина». Номер государственной регистрации № 09-0642-0559-1.

Никфан. Биологический стимулятор роста и развития растений препарат «Никфан» разработан Московской сельскохозяйственной академией имени К.А.Тимирязева. Он представляет собой спиртовую вытяжку из микроорганизмов, обитающих на корнях облепихи. Действие препарата основано на усилении корнеобразования и фотосинтеза, благодаря чему обеспечиваются лучшие условия развития растений, повышается сопротивляемость к болезням, засухо- и морозоустойчивость, урожайность культур. Применение «Никфана» на бобовых культурах способствует улучшению их симбиоза с азотфиксирующими бактериями. Известно положительное влияние биопрепаратов-симбионтов на следующие показатели: урожайность, корнеобразование и фотосинтез, сопротивляемость к засухе, морозам, болезням; сокращение сроков созревания, всхожести семян и клубней; эффективность использования растениями минеральных удобрений; снижение содержания в растениях тяжелых металлов, нитратов, радионуклидов, симбиоз с азотфиксирующими растениями. Препарат использовали для обработки семян 0,0001- 0,1%-ным раствором. Средний расход препарата достигал 1-3 мл/га при обработке вегетатирующих растений и семян перед посевом. На всех испытанных культурах наблюдается эффект увеличения урожайности. Это относится как к зерновым, так и к овощным культурам. Эффект значителен и в среднем колеблется в пределах от 20 до 60%. В отдельных случаях он очень велик и составляет, например, для льна 100%, свеклы кормовой - 338%, капусты - 70%. Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать заключение о перспективности практического применения биоудобрения НИКФАН. Его использование обеспечивает: повышение всхожести семян до 56%, активизирует нарастание корешка и семядолей на 8%, снижает содержание нитратов более чем в 4 раза, активизирует корнеобразование на 17% и повышает продуктивность семян в 1,6 раза.

Производитель и владелец технологии ООО «БИОИН - НОВО», г. Москва, т/факс: 8 - (499) 159-63-54, 8-903-185-06-30, E-mail: bioin@yandex.ru, www.nikfan.ru.

Рибав-Экстра, Р (д.в. 0,00152 г/л L-аланина+0,00196 г/л L-глутаминовая кислота) - близкий аналог регулятора роста растений "Симбионта", идентичен медицинскому и ветеринарному лекарству "Биотон-1". Новый корнеобразователь Рибав-Экстра представляет собой продукт метаболизма микоризных грибов, выделенных из корней женьшеня, и содержит уникальный комплекс природных аминокислот, обладающий высокой биологической активностью в ничтожно малых дозах. Препарат стимулирует развитие мицелия полезных грибов, находящихся в симбиозе с корнями растений, и синтез фитогормонов, что приводит не только к усилению роста и развития корневой системы, но и к повышению устойчивости к заболеваниям и неблагоприятным факторам внешней среды. Рибав-Экстра обладает широким спектром действия: его применяют для укоренения, стимуляции роста и развития практически всех видов культур, в том числе декоративных, цветочных, плодово-ягодных, хвойных и трудно приживаемых. Препарат обеспечивает высокую укореняемость (до 100%) зеленых и одревесневших черенков, при этом черенки не подвергаются загниванию. Рибав-Экстра обладает выраженным антистрессовым действием: его используют для восстановления ослабленных и омолаживания старых растений, а также улучшения декоративных качеств различных культур в период вегетации. Эффективность препарата во многих случаях превышает индолил-3-масляную кислоту. Препарат малотоксичен (4-й класс опасности). Препаративная форма - 65%-ный спиртовой экстракт.

Рибав-Экстра имеет гибкие сроки применения и может быть использован практически на всех культурах без нарушения сложившихся технологий выращивания. Наилучшим является двукратное использование препарата: при обработке посадочного материала и в начале активного роста. В дальнейшем Рибав-Экстра применяют по необходимости исходя из конкретных почвенно-климатических условий (заморозки, засуха, повреждения и т. д.) и состояния растения. Препарат применяют в виде 0,01 %-ного раствора (1 мл на 10 л воды) путем замачивания черенков и корневой системы декоративных, хвойных, плодово-ягодных, цветочных культур (рассады, сеянцев, саженцев) в течение 1-12 часов, луковиц и клубнелуковиц декоративных культур - 0,5-2 часов, полива субстрата или почвы перед высадкой черенков и пикировкой сеянцев, при посадках и пересадках всех видов культур в т.ч. крупномеров; в виде 0,001 %-ного (1 мл на 100 л воды) раствора путем опрыскивания вегетирующих растений.

Опыт показывает, что Рибав-Экстра совместим с любыми средствами защиты растений. Микроэлементы усиливают действие Рибав-Экстра. При совместном использовании с индолил-3-масляной кислотой (Корневин) наблюдается синергетический эффект.

Производитель: ООО Биотехнологический центр «РИБАВ».

Эксклюзивный дистрибьютер: ЗАО «Сельхозэкосервис». Номер государственной регистрации № 0415-06-111-131(132)-0-1-3-1

Размещено на Allbest.ru