ДНК-маркери у вивченні взаємовідносин між вірусом ядерного поліедрозу та його хазяїном непарним шовкопрядом

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 578.52 + 575.17

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ДНК-маркери у вивченні взаємовідносин між вірусом ядерного поліедрозу та його хазяїном непарним шовкопрядом

03.00.06 - вірусологія

Оберемок Володимир Володимирович

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі екології та раціонального природокористування Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського Міністерства освіти і науки, молоді та спорту України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Сімчук Андрій Павлович, Таврійський національний університет імені В.І. Вернадського МОНМС України професор кафедри екології та раціонального природокористування.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Бучацький Леонід Петрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка МОНМС України, провідний науковий співробітник НДЛ фізико-хімічної біології Навчально-наукового центру “Інститут біології”;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Матвієнко Наталія Миколаївна, Інститут рибного господарства НААН, зав. лабораторії іхтіопатології.

Захист дисертації відбудеться “29”березня 2011 р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. Глушкова, 2, корпус 12, навчально-науковий центр “Інститут біології”, ауд. 434.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, спеціалізована вчена рада Д 26.001.14.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ім. М. Максимовича Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “29 ” лютого 2011 р.

Вчений секретар cпеціалізованої вченої ради В.В. Джаган.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Використання ДНК-маркерів у вивченні взаємовідносин між вірусом ядерного поліедрозу та його хазяїном непарним шовкопрядом (Lymantria dispar) допомагають дослідити основні процеси, що відбуваються в їхньому життєвому циклі та використати ці знання у вирішенні теоретичних проблем і практичних завдань. Однією з невирішених теоретичних проблем є доказ існування трансоваріальної передачі цього вірусу. Трансоваріальна передача вірусу є важливою адаптацією для паразита, тому що створює можливість не покидати організм хазяїна при зміні поколінь. У деяких з вірусів комах трансоваріальну передачу вже знайдено (Гулий, Рыбина,1988; Cooper et al., 2003; Khurad et al.). У той же час для вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда це питання поки що не знайшло чітких підтверджень (Тарасевич, 1975; Charpentier et al., 2003; Ильиных, Ульянова, 2005). Однією з важливих практичних задач є дослідження впливу окремих фрагментів ДНК вірусу і вірусних препаратів на розвиток гусениць непарного шовкопряда - серйозного шкідника лісу. Такий напрям досліджень може стати корисним для розробки нових ДНК-біопрепаратів і вивчення впливу існуючих вірусних препаратів. ДНК-маркування впливу існуючих вірусних препаратів на комаху і пошук генетичних маркерів стійкості і чутливості до вірусу розширює знання щодо особливостей взаємовідносин в системі паразит-хазяїн та сприяє підвищенню ефективності захисту рослин. Перспективною є й розробка біопрепаратів на основі фрагментів ДНК вірусу. Цьому сприяє та важлива роль, яку ДНК відіграє в клітинах, і значна варіабельність навіть невеликих за розмірами фрагментів молекули, що може забезпечити ефективність і вибірковість дії створених на основі ДНК-фрагментів препаратів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках міжкафедральних науково-дослідних тем Таврійського національного університету: "Екологічні аспекти вивчення тваринного і рослинного світу степового і передгірського Криму" (2001-2005) (номер державної реєстрації 0101U005236) і "Еколого-генетичні аспекти вивчення біоценозів степового і передгірського Криму" (2006-2010) (номер державної реєстрації 0106U003978), а також тем, які фінансувалися Міністерством освіти і науки України: "Взаємодія популяцій непарного шовкопряда з патогенними мікроорганізмами: генетичні маркери вірулентності і стійкості" (2002-2004) (номер державної реєстрації 0102U001403) і "Теоретичні обгрунтовування оптимізації лісозахисних заходів у дібровах Криму: безпестицидний захист" (2005-2007) (номер державної реєстрації 0105U00222).

Мета роботи і завдання дослідження. Основна мета дослідження - знайти генетичні маркери трансоваріальної передачі вірусу, дослідити вплив фрагментів ДНК вірусу ядерного поліедрозу і вірусного препарату на гусениць непарного шовкопряда та виявити ДНК-маркери чутливості та стійкості комахи до вірусу.

Для її досягнення було поставлено такі завдання:

- визначити присутність ДНК вірусу в яйцях комахи і личинках за допомогою RAPD-PCR-аналізу (Random Amplified Polymorphic DNA - випадково ампліфікована ДНК);

- визначити присутність STS-маркерів (Sequence-Tagged Site - сайти з відомою послідовністю) вірусної ДНК у комасі та в імаго паразита яєць непарного шовкопряда Anastatus japonicus за допомогою PCR-аналізу зі специфічними праймерами;

- вивчити вплив двох коротких одноланцюгових фрагментів ДНК вірусу на життєздатність гусениць непарного шовкопряда у порівнянні із личинками Drosophila melanogaster;

- визначити за допомогою RAPD-PCR-аналізу стійкі й чутливі до вірусу генотипи особин непарного шовкопряда;

- розробити генетичний підхід до боротьби з непарним шовкопрядом.

Об'єкти дослідження - вірус ядерного поліедрозу непарного шовкопряда, непарний шовкопряд, личинки D. melanogaster, Bacillus thuringiensis.

Предмет дослідження - трансоваріальна передача вірусу, вплив вірусного препарату і фрагментів ДНК вірусу на розвиток комах.

Методи дослідження. Вірусні поліедри досліджувались за допомогою техніки фазового контрасту. Підрахунок вірусних поліедрів проводився в камері Горяєва. Вивчення ДНК вірусу і непарного шовкопряда здійснювалось за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР, PCR) з використанням методики довільно ампліфікованої поліморфної ДНК (ДАПД, RAPD) і PCR-аналізу із специфічними праймерами. Обробка результатів проводилась методами математичної статистики.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше за допомогою RAPD-PCR-аналізу та PCR-аналізу із специфічними праймерами визначено присутність вірусної ДНК в яйцях комахи, личинках шовкопряда, а також у паразитах яєць шовкопряда, що є доказом трансоваріальної передачі вірусу. В яйцях непарного шовкопряда з Ірану, Росії і України було знайдено RAPD-маркери вірусної ДНК, що є також характерними для вірусних препаратів виготовлених у Киргизії, Китаї, Росії та Україні. Методом PCR-аналізу із специфічними праймерами в імаго внутрішнього паразита яєць непарного шовкопряда A. japonicus та в яйцях шовкопряда двох генерацій однієї лінії було знайдено STS-маркери вірусної ДНК довжиною 317 та 524 п.н. Вони співпадають за довжиною із теоретично розрахованими на основі секвенованої послідовності фрагментів геному вірусу, що міститься в електронній базі ICTVdB (International Committee on Taxonomy of Viruses Database - База даних Міжнародного комітету з таксономії вiрусiв).

Практичне значення отриманих результатів. Методика виявлення вірусної інфекції на стадії яйця комахи за допомогою RAPD-PCR-аналізу і PCR-аналізу із специфічними праймерами може стати корисною у прогнозі епізоотій, оцінці ступеня генетичної різноманітності вірусу, для підвищення ефективності планування лісозахисних заходів у районі досліджень.

Результати, що отримані при вивченні впливу коротких одноланцюгових ДНК-фрагментів на життєздатність гусениць, можуть бути використані у розробці біопрепаратів, ефективних проти листогризучих комах.

Дані щодо генетичних маркерів стійкості та чутливості непарного шовкопряда до вірусу можна використовувати для раціонального вибору біологічних заходів боротьби зі шкідником.

Матеріали даного дослідження було використано при патентуванні 4 винаходів, написанні методичного посібника, а також під час викладання спецкурсів "Генетика популяцій" та "Генетика" на кафедрі екології та раціонального природокористування Таврійського національного університету, зокрема, при викладанні розділів, де йдеться про генетичні методи аналізу організмів.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є завершеною науковою роботою, яка виконувалася особисто автором впродовж 2002-2010 рр. Матеріал для роботи був зібраний автором у Криму, а також люб'язно надісланий із Всеросійського науково-дослідного інституту лісівництва та механізації лісового господарства (м. Пушкіно, Росія), "Укрлiсозахисту" (смт. Покотилівка, Харківська обл.), Дніпропетровського та Київського національних університетів. Дослідження проводились на кафедрі екології та раціонального природокористування Таврійського національного університету. За участю наукового керівника проведено аналіз, інтерпретацію та узагальнення одержаних результатів. Особистий внесок у написанні кожної конкретної наукової роботи зазначено у "Списку наукових праць за темою дисертації".

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертації були представлені на наступних конференціях: XXXVІІI Міжнародній конференції спілки патологів безхребетних (Анкорідж, США, 2005); ІІ, III і IV Міжнародній конференції студентів і аспірантів "Молодь та поступ біології" (Львів, 2006, 2007, 2008), Міжнародній конференції з молекулярної біології і генетики для студентів, аспірантів і молодих вчених, присвяченої 120-річчю з дня народження М.І. Вавілова (Київ, 2007), VI Міжнародній науковій конференції "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Мінськ, 2008), VII Парнасівській конференції з біохімії та молекулярної біології (Ялта, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових робіт, 6 з них - статті в наукових виданнях, які відносяться до переліку ВАК України, 4 - патенти; 7 - тези в матеріалах конференцій, 1 - методичний посібник.

Структура і об'єм дисертації. Матеріали роботи викладено на 121 сторінці друкарського тексту. Дисертація складається зі вступу, 5 розділів, висновків, списку використаних джерел. Текст ілюстровано 15 таблицями та 41 рисунком. Список використаної літератури налічує 100 джерел, з них 52 - закордонних авторів.

Основний зміст роботи

Молекулярно-генетичний підхід у вивченні системи взаємовідносин вірус-хазяїн

Геном вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда було секвеновано 12 років тому (Kuzio et al., 1999) і це відкрило широкі можливості використання ДНК-маркерів у вивченні його життєвого циклу. Продемонстровано можливість використання PCR-аналізу зі специфічними праймерами (сконструйованими на основі секвенованої послідовності) та RAPD-PCR-аналізу для доказу трансоварільної передачі вірусів комах. На основі проаналiзованих даних зроблено висновок, що трансоваріальна передача вірусу є важливою адаптацією паразита і може бути досить широко розповсюдженою серед вірусів. Відмічено, що для доказу трансоваріальної передачі вірусу достатнім є встановлення факту вертикальної передачі вірусної ДНК, а не cформованих вірусних часток, тому що саме вона у разі необхідності запускає і контролює синтез віріонів та поліедрів з хімічних сполук клітин хазяїна.

Проаналізовано питання можливості існування ДНК-інтерференції у взаємовідносинах між вірусом та його хазяїном. Показано можливість використання біопрепаратів на основі ДНК-фрагментів вірусу (ДНК-інсектицидів) для боротьби з листогризучими комахами, зокрема з непарним шовкопрядом. Констатовано відсутність робіт з впливу коротких фрагментів ДНК вірусу ядерного поліедрозу на життєздатність особин непарного шовкопряда та інших комах.

Розглянуто питання впливу бакуловірусів на комах. Відмічено, що вплив вірусу ядерного поліедрозу на популяцію його хазяїна залежить від її генетичного складу. Констатовано відсутність робіт, пов'язаних з пошуком генетичних маркерів стійкості і чутливості непарного шовкопряда до препаратів на основі вірусів та бактерій. Показана можливість практичного застосування такого роду знань у захисті рослин.

Об'єкти, місце і методи проведення дослідження

Об'єктами дослідження були непарний шовкопряд, личинки D. melanogaster, B. thuringiensis і вірус ядерного поліедрозу непарного шовкопряда.

Вірусні препарати, вироблені у Киргизії, Росії і Китаї, а також яйцекладки непарного шовкопряда з Ірану і Росії, були люб'язно надано колегами з лабораторії захисту лісу від інвазійних і карантинних організмів (ВНДІЛМ, м. Пушкіно, Росія). Вірусний препарат "ВІРІН-НШ" було надано співробітниками Державного спеціалізованого лісозахисного об'єднання "Укрлісозахист" (смт. Покотилівка, Харківська обл.). Яйцекладки непарного шовкопряда збирались впродовж 2003-2008 років у Криму. Лінію D. melanogaster (ebony) було надано співробітниками кафедри генетики Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Ізолят B. thuringiensis, B3, був наданий кафедрою мікробіології та екології Дніпропетровського національного університету.

Дослідження проводили в лабораторії екологічної генетики на кафедрі екології та раціонального природокористування Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського та на модельних ділянках лісу "Лаврове" i "Дубки".

Гусениць вирощували в лабораторних умовах на штучному кормі і на свіжому листі Quercus pubescens (дуба пухнастого).

Паразитів визначали на фазі імаго після виходу їх із яєць непарного шовкопряда (Алексеев и др., 1978).

Вірусні поліедри вивчали за допомогою техніки фазового контрасту. Кількість поліедрів підраховували у камері Горяєва.

Вплив ДНК-фрагментів вірусу на життєздатність личинок непарного шовкопряда та D. melanogaster вивчали із застосуванням ділянки гену-інгібітору апоптозу вірусу (GeneID:1488470). Застосовувався водний розчин (100 пмоль/мкл) фрагментів ДНК вірусу (metabion international AG, Німеччина). У якості контролю використовували водний розчин (4,3 OО/мл) з випадковими ДНК-фрагментами olig 11 (GAAGGCACTG) та olig 35 (TGCGCAGCCC) (SibEnzyme, Росія).

Виявлення вірусної ДНК в яйцях і гусеницях непарного шовкопряда I-го личинкового віку проводили за методикою RAPD-PCR-аналізу з праймером OPA-08 (GTGACGTAGG) (Operon Technologіes, США) та PCR-аналізу із специфічними праймерами - 1) ACG TTC TCG TTG AAC GTG CTG, 2) CTG GTG AAC CAC AAA ACC CTG (metabion international AG, Німеччина). Вірусну ДНК в паразитах яєць непарного шовкопряда виявляли за допомогою PCR-аналізу із специфічними праймерами - 1) GCC GGC GGA ACT GGC CCA, 2) CGA CGT GGT GGC ACG GCG (metabion international AG, Німеччина). Дизайн специфічних праймерів було виконано із застосуванням опублікованої в ICTVdB (номер AF081810) послідовності геному вірусу.

Пошук генетичних маркерів чутливості і стійкості гусениць непарного шовкопряда до вірусу ядерного поліедрозу проводили за методикою RAPD-PCR-аналізу, використовуючи при цьому праймер OPA-14 (TCTGTGCTGG) (Operon Technologіes, США).

Екстракцію тотальної ДНК проводили згідно стандартної методики (Sambrook et al., 1989) з використанням комплекту "ДНК-сорб-А" (АмплиСенс, Москва). Для доказу трансоваріальної передачі вірусу ДНК патогену виділяли двічі: з поверхні та з вмісту яйця комахи. Ампліфікацію ДНК виконували на термоциклері "Терцик" (ДНК-Технология, Росія) з використанням реактивів для полімеразної ланцюгової реакції "АмплиСенс-200-1" (АмплиСенс, Москва). У якості маркерів використовували DNA markers M 100 (ИзоГен, Росія) з довжиною фрагментів 100 bp та DNA ladder M 26 (SibEnzyme, Росія) з довжиною фрагментів 100 bp + 2 Kb + 3 Kb.

Доказ трансоваріальної передачі вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда методом pcr-аналізу

RAPD-PCR-аналіз. Трансоваріальна передача допомагає вірусу не залишати хазяїна і, таким чином, бути захищеним його покривами від ультрафіолетового випромінювання, високої температури, різних детергентів. Швидше за все, вона є досить розповсюдженою серед вірусів поліедрозів. Доцільність пошуку трансоваріальної передачі вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда добре узгоджується із законом гомологічних рядів спадкової мінливості М.І. Вавілова. Якщо застосувати даний закон до паралелізму явищ, обумовленого схожістю спадкової мінливості у видів, які належать до близьких таксонів, наприклад, тутовий шовкопряд (Тарасевич, 1975), шовкопряд-монашка (Бахвалов, 2001), то існування трансоваріальної передачі вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда уявляється достатньо реальним процесом.

Проте, разом з роботами, що показують розповсюдженість трансоваріальної передачі вірусної інфекції серед комах (Тарасевич, 1975; Гулий, Рыбина,1988; Cooper et al., 2003; Khurad et al., 2004), є роботи, які ставлять під сумнів такий тип передачі, в тому числі і у непарного шовкопряда (Тарасевич, 1975; Charpentier et al., 2003; Ильиних, Ульянова, 2005). У науковій літературі відсутні роботи, де б вказувався факт трансоваріальної передачі вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда у вигляді поліедрів, віріонів або вірусної ДНК. Для вирішення цього питання вивчали спектри ДНК-фрагментів вірусу непарного шовкопряда.

Спектри фрагментів ДНК препаратів вірусу різного географічного походження, отриманих в ході RAPD-PCR з використанням праймера OPA-08, можна поділити на три зони: 01, 02 і 03. Вони присутні у ДНК спектрах усіх п'яти вірусних препаратів (рис. 1). Таким чином, ці ДНК-зони можна використовувати у якості генетичних маркерів наявності ДНК вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда.

Рис. 1. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда з препаратів різного географічного походження: 1 - з Киргизії; 2 - з Китаю (I); 3 - з Росії; 4 - з Китаю (II); 5 - з України; 6 - маркер молекулярних мас ДНК від 100 до 1000 пар нуклеотидів з кроком в 100 пар нуклеотидів (від низу до верху); 01, 02, 03 - зони продуктів ампліфікації ДНК вірусу з праймером ОРА-08

Для препарату з України отримано детальний набір RAPD-фрагментів, які зустрічаються в зонах 01, 02, 03 (рис. 2).

Рис. 2. Продукти ампліфікації вірусної ДНК, виділеної з вірусного препарату "ВІРІН-НШ" (праймер ОРА-08): 1 - проба з поверхні пробірки; 2-6 - проби між поверхнею і дном пробірки; 7 - проба з дна пробірки; 8 - проба з середини пробірки після струшування; 9 - маркер молекулярних мас ДНК від 200 до 1000 п.н. з кроком у 100 п.н.; 01, 02, 03 - зони продуктів ампліфікації ДНК вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда; 01.1, 01.2, 02.1, 02.2, 02.3, 03.1, 03.2, 03.3 - фрагменти вірусної ДНК довжиною приблизно 380, 350, 290, 260, 240, 210, 190 та 160 п.н.

Таким чином, було знайдено 8 ДНК-фрагментів вірусного геному довжиною приблизно від 160 до 350 п.н., які більш детально відображають зони 01, 02 та 03. Фрагменти ДНК вірусу довжиною приблизно 210, 290 та 350 п.н. були використані для доказу трансоваріальної передачі вірусу.

Із даних, наведених на рис. 3, видно, що на електрофореграмі присутні зони 01, 02, 03, які маркують наявність вірусної ДНК. У деяких випадках вірусну ДНК було знайдено і на поверхні яєць комахи (рис. 3 - 2.1, 5.1 і 6.1).

Рис. 3. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК (праймер ОРА-08), виділеної з поверхні (2.1, 5.1, 6.1) та вмісту (1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2) яєць непарного шовкопряда з Росії; 8 - маркер молекулярних мас ДНК від 100 до 1000 п.н. з кроком в 100 п.н. (від низу до верху); 01, 02, 03 - маркерні зони продуктів ампліфікації ДНК вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда; x, y, z - RAPD-маркери довжиною приблизно 350, 290 та 210 п.н.

Вірусна ДНК достовірно частіше зустрічається усередині яєць шовкопряда, ніж на їх поверхні (ч² = 4,68; d. f. = 1; P < 0,05). Цей факт можна пояснити тим, що вірогідність потрапляння вірусу до великої за об'ємом внутрішньої частини яйця комахи вища, ніж до його поверхні.

Вірусну ДНК знайшли в яйцях непарного шовкопряда з Ірану, Росії і України. Усередині яєць непарного шовкопряда вірусну ДНК знаходили у 76 % випадків, а на поверхні - у 56 %. Таким чином, результати вказують на значну загальну зараженість яєць непарного шовкопряда вірусом ядерного поліедрозу у природі.

Після вилуплення з яєць гусениць I-го личинкового віку у них також були знайдені маркерні зони 01, 02, 03 вірусної ДНК (рис. 4).

Рис. 4. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК вірусу, виділеної з гусениць I-го личинкового віку: 3, 5, 7 - продукти ампліфікації ДНК вірусу; 1, 2, 4, 6 - відсутність продуктів ампліфікації ДНК вірусу; 8 - маркер молекулярних мас ДНК від 100 до 1000 п.н. з кроком в 100 п.н. (від низу до верху); 9, 10 - продукти ампліфікації вірусної ДНК, виділеної із залишків хоріонів 7 яєць комахи; 01, 02, 03 - маркерні зони продуктів ампліфікації ДНК вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда; x, y, z - RAPD-маркери довжиною приблизно 350, 290 та 210 п.н.

Але серед них маркери вірусної ДНК зустрічалися з помітно меншою частотою (у 43% особин), що свідчить про зниження серед особин вірусоносійства, яке відбувалось упродовж розвитку яйця комахи (ч² = 4,68; d. f. = 1; P < 0,05). Достовірно знизилась частота RAPD-алелів довжиною приблизно 350 (ч² = 27,5; d. f. = 1; P < 0,01), 290 (ч² = 4,68; d. f. = 1; P < 0,05) та 210 (ч² = 10,2; d. f. = 1; P < 0,01) п.н., що свідчить про переважне виживання певних генотипів вірусу залежно від захисних сил окремої особини.

Для сукупності яєць шовкопряда з Ірану, Росії і України було показано, що генотипи вірусу з RAPD-алелем довжиною приблизно 350 п.н. (зона 01) передаються переважно через внутрішній вміст яйця комахи (ч² = 8,1*; d. f. = 1; P < 0,01) (табл. 1).

Таблиця 1 Частота зуcтрічаємості зон продуктів ампліфікації вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда всередині (a) та на поверхні яєць шовкопряда (b)

	Частота зуcтрічаємості зон 01, 02, 03; F
	F01-350	F02-290	F03-210
	а	b	а	b	a	b
Яйцекладка з Ірану	0,4	0	0,8	0,6	0,8	0,8
Яйцекладка з Росії	1	0,29	1	0,43	1	0,43
Яйцекладка з України	0,2	0	0,2	0,6	0,4	0,8
N	17	17	17
Критерій ч2	8,1*	0,5	0,14

^*P < 0,01

PCR-аналіз із специфічними праймерами

Вивчення ампліфікації STS-маркера вірусної ДНК в двох генераціях однієї лінії непарного шовкопряда. Специфічні праймери були підібрані і сконструйовані на основі опублікованої у ICTVdB геномної послідовності вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда (AF081810). Послідовності двох специфічних праймерів були наступними:

ACG TTC TCG TTG AAC GTG CTG;

CTG GTG AAC CAC AAA ACC CTG.

Ці два специфічні праймери в ході реакції ампліфікації за наявності вірусної ДНК ініціюють формування одного амплікона довжиною 524 п.н. У якості маркера вірусної ДНК вибрали ділянку гену, який кодує білок капсиду вірусу (GeneID: 1488517).

Вірусну ДНК виявили в личинках і яйцях непарного шовкопряда двох генерацій однієї лінії, що походили з Ірану.

Як видно з рис. 5 та 6, STS-маркер вірусної ДНК було знайдено у двох поколіннях однієї лінії непарного шовкопряда. Такі результати вказують на те, що вірус не залишав організму комахи упродовж двох поколінь. Як видно з рис. 7, вірусна ДНК трансоваріально передається як через зовнішню, так і через внутрішню частину яйця комахи. Отримані результати підтверджують наявність трансоваріальної передачі вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда.

Рис. 5. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда, що знаходиться в гусеницях I-го личинкового віку (I покоління): 2, 4 - присутність продуктів ампліфікації ДНК вірусу; 1, 3 - відсутність продуктів ампліфікації ДНК вірусу; 5 - продукти ампліфікації ДНК вірусу, виділеної з вірусного препарату з Китаю; 6 - маркер молекулярних мас ДНК від 200 до 1000 п.н. з кроком в 100 п.н. (від низу до верху); 7 - контроль; F (STS-маркер) - фрагмент вірусної ДНК довжиною 524 п.н.

Рис. 6. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК вірусу ядерного поліедрозу з поверхні (3.1) та вмісту (1.2) яєць непарного шовкопряда з Ірану (ІI покоління); 6 - маркер молекулярних мас ДНК від 300 до 1000 п.н. з кроком в 100 п.н. і від 1000 до 3000 п.н. з кроком в 1000 п.н. (від низу до верху); F (STS-маркер)- фрагмент вірусної ДНК довжиною 524 п.н.

Виявлення STS-маркера вірусної ДНК у паразитах непарного шовкопряда A. japonicus. Вивчали наявність вірусної ДНК у імаго A. japonicus - яйцевого паразита шовкопряда. Личинки Anastatus - внутрішні паразити комах (Алексеев и др., 1978), тому вірус, який знаходиться у імаго, мав потрапити в них з внутрішньої частини яйця комахи. Тому в якості другої робочої гіпотези щодо трансоваріальної передачі вірусу слугувало встановлення наявності ДНК вірусу у паразитів.

Для її доказу було підібрано і сконструйовано специфічні праймери на основі опублікованої в ICTVdB геномної послідовності вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда (AF081810). Маркером вірусної ДНК слугував ДНК фрагмент ідентичний до ділянки гену-інгібітору апоптозу клітин хазяїна (GeneID:1488470). Послідовності двох специфічних праймерів були наступними:

5'- GCC GGC GGA ACT GGC CCA -3';

5'- CGA CGT GGT GGC ACG GCG -3'.

Ці праймери в ході реакції ампліфікації за наявності вірусної ДНК ініціюють формування ДНК-фрагменту довжиною 317 п.н. (рис. 8).

Як бачимо, дані, наведені на рис. 7, свідчать про те, що в особинах А. japonicus методом PCR було знайдено вірусну ДНК. В одній особині вірусну ДНК не виявляли, тоді як у тотальній ДНК, виділеної з семи особин паразита ДНК патогена знаходили (ч² = 6,44; d. f. = 1; P < 0,01). Відсутність продуктів ампліфікації ДНК, виділеної з однієї особини А. japonicus, говорить або про відсутність вірусної ДНК в деяких паразитах, або про її недостатню кількість для виявлення методом PCR. Таким чином, виявлення у яйцевого паразита шовкопряда вірусної ДНК ще раз підтвердило трансоваріальну передачу вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда. Наявність вірусної ДНК у паразита свідчить про горизонтальну передачу вірусу за участю А. japonicus і не виключає можливості розмноження вірусу в його тканинах.

Рис. 7. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда з використанням специфічних праймерів: 1 - продукти ампліфікації ДНК вірусу, виділеної з вірусного препарату з Китаю; 2 - маркер молекулярних мас ДНК довжиною від 100 до 1000 п.н. з кроком в 100 п.н. (від низу до верху); 3 - відсутність продуктів ампліфікації ДНК вірусу, виділеної з однієї особини імаго А. japonicus; 4 - продукти ампліфікації ДНК вірусу, виділеної з семи особин імаго А. japonicus; F - фрагмент вірусної ДНК довжиною 317 п.н.

Таким чином, симбіотичні відносини між вірусом ядерного поліедрозу та його хазяїном непарним шовкопрядом включають трансоваріальну передачу патогену. Можна стверджувати, що при зміні поколінь комахи між вірусом ядерного поліедрозу та його хазяїном непарним шовкопрядом зв`язок не втрачається.

Вплив одноланцюгових днк-фрагментів вірусу на життєздатність гусениць непарного шовкопряда у порівнянні з d. Melanogaster. Виявлення впливу одноланцюгових ДНК-фрагментів вірусу на життєздатність гусениць непарного шовкопряда. Підвищення ефективності захисту лісів від такого серйозного шкідника, яким є непарний шовкопряд, має велике значення. Альтернативним використанню вірусних препаратів та пестицидів засобом боротьби з листогризучими комахами, у тому числі з непарним шовкопрядом, може стати використання біопрепаратів на основі ДНК-фрагментів вірусу (ДНК-інсектицидів).

Одним з можливих шляхів проникнення ДНК-фрагментів у тіло гусениці є зовнішній. Відомо, що наявність розвиненої епікутикули певною мірою обмежує проникність покровів для більшості інсектицидів, але хлорорганічні та інші контактні інсектициди можуть розчинятися у кутикулярному воску. Розчинений у воску інсектицид легко потрапляє в організм комахи крізь найпроникніші ділянки покровів (Тыщенко, 1986).

Для вивчення впливу одноланцюгових фрагментів вірусної ДНК використовувалиcь гусениці I-II личинкових віків з іранських яйцекладок шовкопряда. На поверхню гусениць було нанесено водний розчин двох одноланцюгових фрагментів гену-інгібітору апоптозу клітин хазяїна (GeneID:1488470), що раніше використовували у якості праймерів (стор. 10). Якщо антиапоптозні гени вірусу є гомологічними антиапоптозним генам хазяїна, то їх застосування повинно викликати апоптоз клітин комахи через блокування синтезу антиапоптозних білків, як це буває при РНК-інтерференції (Fire et al., 1998) та ДНК-інтерференції (Kawai-Toyooka et al., 2004). Для пошуку ділянок геному непарного шовкопряда гомологічних антиапоптозному гену iap-3 вірусу ядерного поліедрозу використовувались яйця комахи. Продукти ампліфікації ДНК непарного шовкопряда були отримані при застосуванні специфічних праймерів (рис. 8).

Рис. 8. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК непарного шовкопряда із специфічними праймерами: 1 - маркер молекулярних мас ДНК довжиною від 100 до 1000 п.н. з кроком в 100 п.н. і від 1000 до 3000 п.н. з кроком в 1000 п.н. (від низу до верху); 2-6 - індивідуальні електрофоретичні спектри ДНК особин непарного шовкопряда; 2* - індивідуальний набір фрагментів ДНК; 7 - контроль

В продуктах ампліфікації ДНК, виділеної з яєць непарного шовкопряда (рис. 9), було знайдено від 7 до 8 фрагментів геному комахи для кожного індивідуального спектру. Отримані результати свідчать про наявність в яйцях непарного шовкопряда фрагментів геному, які певною мірою співпадають з фрагментами гену-інгібітору апоптозу iap-3. Таким чином, отримані дані вказують на можливість впливу ДНК-фрагментів антиапоптозного гену iap-3 вірусу на клітини непарного шовкопряда. В середньому за 11-добовий період в експериментальних групах загинуло 53 % особин, що на 30 % більше, ніж у контрольних групах (ч² = 23,72; d. f. = 1; P < 0,01). Лише 5,6 % особин загинуло за цей період у групі, де гусениці I-II личинкового віку були зібрані у природі та оброблені розчином (0,2 мкл/гусениця) з випадковим ДНК-фрагментом olig 11. Слід зазначити, що за використання ДНК-фрагментів вірусу смертність гусениць спостерігалася через короткий проміжок часу (2-3 доби), тоді як при експериментальному зараженні личинок комах вірусами-збудниками ядерних поліедрозів інкубаційний період хвороби триває від 5 до 10-12 діб і більше (Гулий, Рыбина, 1988). Таким чином, отримані результати вказують на більш швидку дію ДНК-фрагментів вірусу на клітини хазяїна порівняно з вірусними біопрепаратами. Динаміка смертності гусениць в різних експериментальних групах була в значній мірі схожою (рис. 9). Також показано, що на різні особини непарного шовкопряда по-різному впливають фрагменти ДНК.

Рис. 9. Динаміка смертності гусениць непарного шовкопряда I-II личинкових віків після зовнішнього застосування одноланцюгових фрагментів ДНК вірусу: ряд 1 - гусениці з яйцекладки 1, ряд 2 - гусениці з яйцекладки 2, ряд 3 - гусениці з яйцекладки 3

Достовірність коефіцієнтів кореляції смертності личинок шовкопряда з різних яйцекладок (0,91, 0,95, 0,96; P < 0,01) вказує на те, що в організмі гусениць запускаються однакові механізми реакції на одноланцюгові фрагменти вірусної ДНК (табл. 2). Іншими словами, у клітинах хазяїна існує єдиний неактивний механізм, який ДНК-фрагменти вірусу здатні тригерувати.

Таблиця 2 Значення коефіцієнтів кореляції між динаміками смертності гусениць I-II личинкового віку з трьох яйцекладок за 11-добовий період

Яйцекладки	Значення коефіцієнта кореляції в групах експерименту	Значення коефіцієнта кореляції в контрольних групах
Яйцекладки 2,3	0,97*	0,42
Яйцекладки 1,3	0,95*	0,94*
Яйцекладки 1,2	0,92*	0,45

*(P < 0,01)

На підставі отриманих даних було висунуто гіпотезу щодо можливої ролі ДНК-інтерференції (Kawai-Toyooka et al., 2004) у цьому явищі, але із застосуванням одноланцюгових фрагментів ДНК замість дволанцюгових.

Виявлення впливу одноланцюгових ДНК-фрагментів вірусу на життєздатність D. melanogaster.

Вивчали вплив розчинів двох одноланцюгових фрагментів іap-гену та одного випадкового ДНК-фрагменту olig 35 на життєздатність 1-2-добових личинок D. melanogaster (рис. 10). Після 20-хвилинного витримування у розчинах з фрагментами iap-гену, рахували кількість особин, які дійшли до стадії імаго.

Рис. 10. Кількість загиблих особин (%) у контрольних (1 - вода) та дослідних (2 - розчин з iap) групах

Дані, наведені на рис. 10, вказують на істотну різницю між смертністю у досліді і контролі (ч² = 4,87; d. f. = 1; P < 0,05). Використання випадкового ДНК-фрагменту olig 35 не призвело до достовірної різниці.

В результаті пошуку фрагментів геному D. melanogaster гомологічних частинам iap-гену вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда була отримана електрофореграма (рис. 11).

Наявність 6-10 ДНК-фрагментів у кожному індивідуальному спектрі свідчать про наявність у D. melanogaster фрагментів геному, які певною мірою співпадають з послідовністю гену-інгібітору апоптозу iap-3 і це може пояснювати вплив одноланцюгових фрагментів вірусу на комах за механізмом ДНК-інтерференції.

Рис. 11. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК D. melanogaster із специфічними праймерами: 1-5 - індивідуальні електрофоретичні спектри ДНК особин D. melanogaster; M - маркер молекулярних мас ДНК довжиною від 100 до 1000 п.н. з кроком в 100 п.н. і від 1000 до 3000 п.н. з кроком в 1000 п.н. (від низу до верху); 6 - контроль; 7 - індивідуальний набір ампліконів

Більшість загиблих у дослідній групі личинок відрізнялись від загиблих у групі контролю морфологічно (рис. 12). Загиблі личинки комахи з дослідної групи мали чорний колір, а загиблі личинки з контрольної групи були звичайного білого кольору.

Рис. 12. Загиблі личинки D. melanogaster з контрольної (а) та дослідної (б) груп

Після виділення ДНК з тканин загиблих особин дослідної групи отримали фрагментовану ДНК (рис. 13).

Рис. 13. ДНК виділена із загиблих особин дослідної (1) та контрольної (2) груп; М - маркер молекулярних мас ДНК довжиною від 100 до 1000 п.н. з кроком в 100 п.н. і від 1000 до 3000 п.н. з кроком в 1000 п.н. (від низу до верху); S - фрагментована ДНК

Як показано на рис. 13, для дослідної групи було отримано фрагментовану ДНК, яка складається з 5 фрагментів ДНК довжиной приблизно від 50 до 180 п.н. Відомо, що для апоптозу характерні фрагменти ДНК більшої довжини, кратні 180 п.н. Відсутність ДНК-фрагментів більшої довжини може пояснюватися, на нашу думку, тим, що фрагментована ДНК є частинами нуклеосом, глибоко деградованими нуклеазами під час апоптозу (Ванюшин, 2001). Отримані результати дають можливість припустити, що саме апоптоз спричинив загибель клітин в особинах дослідної групи під впливом одноланцюгових фрагментів антиапоптозного гену iap-3. Не виключена і роль некрозу у цьому явищі.

Відомо, що існують білки, якi сприяють і які перешкоджають розвитку апоптозу, і результат цього впливу дуже часто залежить від їхньої відносної концентрації (Агол, 1996). Цей процес може бути представлено у вигляді "терезів" апоптозу-антиапоптозу. Різні чинники впливають на цей бінарний процес, внаслідок чого "терези" схиляються у той чи інший бік. Це триває до певної критичної відмітки, після якої сигнал до апоптозу або антиапоптозу (на деякий час) стає незмінним. ДНК-фрагменти вірусу зміщують біохімічні реакції клітини у бік апоптозу, і основну роль в цьому, ймовірно, грає явище ДНК-інтерференції або схожий на неї процес. ДНК-інтерференція блокує синтез антиапоптозних білків, що призводить до апоптозу окремих клітин, а у певних випадках - до загибелі організму. Така властивість ДНК-фрагментів вірусу може бути використана для створення ДНК-інсектицидів, лікарських препаратів (фармакогеноміка) або біостимуляторів.

Генетичні маркери впливу вірусного препарату "вірін-НШ" на непарного шовкопряда

Вивчення генетичного поліморфізму особин непарного шовкопряда, пов'язаного з відмінностями у стійкості до вірусу ядерного поліедрозу. Практично всі зареєстровані вірусні препарати, які використовуються у захисті рослин, створені на основі бакуловірусів (Бахвалов, 2001). Без знання не лише екології, але й генетики шкідників та їхніх патогенів, біологічні заходи боротьби зі шкідниками не можуть бути успішними (Гулий, Голосова, 1975; Гулий, Штерншис, 1976). У системі паразит-хазяїн жоден її член не може розглядатися ізольовано, незалежно один від одного, бо як паразит впливає на свого хазяїна, так і хазяїн впливає на свого паразита, прагнучи знешкодити його (Радкевич, 1980). Саме з огляду на це, й планували експерименти.

Кожна гусениця в експерименті на II-III добу III-го личинкового віку перорально отримала дозу вірусу у 10⁴ поліедрів промислового препарату "ВІРІН-НШ" ("Укрлісозахист"). Генетичний поліморфізм личинок непарного шовкопряда, пов'язаний з відмінностями у стійкості до вірусу ядерного поліедрозу, оцінювали за допомогою методики виявлення випадково ампліфікованої поліморфної ДНК (RAPD). Застосування стандартного праймера ОРА-14 (TCTGTGCTGG) (Operon Technologіes, США) дозволило отримати 6 RAPD-фрагментів, що виявляються у вигляді окремих смуг при електрофорезі і маркують чутливість та стійкість комахи до вірусу (рис. 14).

Рис. 14. Індивідуальні електрофоретичні спектри ампліфікованих фрагментів ДНК особин непарного шовкопряда (19-23) з праймером OPA-14; а, b, с, d, e, f - генетичні маркери довжиною приблизно 150, 330, 430, 560, 850 і 1000 п.н.; М - маркер молекулярних мас ДНК довжиною від 100 до 1000 п.н. з кроком в 100 п.н. (від низу до верху)

Наявність фрагменту довжиною приблизно 850 п.н. у спектрі ампліфікованої ДНК співпадало з низькою швидкістю накопичення вірусу в тілі личинки непарного шовкопряда - в середньому 0,4*10⁶ поліедрів/мг за наявності проти 5,1*10⁶ пол./мг за відсутності цього фрагменту (F = 652,08; d. f. = 18; P < 0,05). Тобто була на порядок вище. Аналогічна картина характерна і для маркера довжиною приблизно 430 п.н. - 1,6*10⁶ пол./мг в середньому за наявності та 6,2*10⁶ пол./мг за відсутності цього фрагменту в RAPD-спектрі личинки комахи (F = 462,88; d. f. = 15; P < 0,05).

У якості маркерів стійкості непарного шовкопряда до вірусу було також виділено RAPD-фрагменти довжиною приблизно 150 і 1000 п.н. Фрагменти довжиною 330 і 560 п.н., навпаки, були асоційовані із чутливістю непарного шовкопряда до вірусу (табл. 3).

Таблиця 3 Порівняльний аналіз вмісту поліедрів вірусу ядерного поліедрозу на одиницю ваги личинок непарного шовкопряда, що генетично розрізняються за деякими RAPD-маркерами (праймер ОРА-14)

RAPD-маркер	1000 п.н.	850 п.н.	560 п.н.	430 п.н.	330 п.н.	150 п.н.
Показник	пол./мг	пол./мг	пол./мг	пол./мг	пол./мг	пол./мг
Генотип	-	-	-	-	-	-
Середнє значення	8,9*106	5,1*106	1,6*106	6,2*106	2,8*106	5,5*106
Дисперсія вибірки	2,26*1014	1,1*1014	9,07*1012	1,35*1014	2,08*1013	1,22*1014
N	6	19	9	16	18	19
Генотип	+	+	+	+	+	+
Середнє значення	1,8*106	0,4*106	6*106	0,5*106	9,4*106	0,8*106
Дисперсія вибірки	1,57*1013	1,69*1011	1,45*1014	2,91*1011	3,84*1014	1,21*1012
N	17	4	14	7	5	4
F-критерій (дисперсії)	14,33	652,08	15,96	462,88	18,43	100,94
P	2,11*10-5	8,63*10-5	2,64*10-4	5,56*10-9	5,21*10-6	3,53*10-5

"-" - відсутність RAPD-маркера; "+" - наявність RAPD-маркера; (в таблиці приведені тільки достовірні значення критерію Фішера; P < 0,05); N - кількість особин з даним генотипом

Вплив бактерії B. thuringiensis на генетичний склад (за естеразним локусом) природної популяції непарного шовкопряда. Разом із вірусними препаратами для контролю чисельності непарного шовкопряда використовують препарати на основі B. thuringiensis. Успіх їх використання також генетично обумовлений. Для вивчення диференційного впливу бактерійного ізоляту B3 B. thuringiensis на генетичний склад природної популяції шовкопряда використали метод ензим-електрофорезу. За допомогою ензим-електрофорезу аналізували естеразний локус Est-5 комахи (рис. 15).

Як можна побачити з данних рис. 15, у досліджуваній популяції непарного шовкопряда локус Est-5, що кодує неспецифічну естеразу, представлено двома алелями (F та S).

В експерименті було використано суспензію бактерії у концентрації 10⁸ спор/мл. Точну ж кількість суспензії, яка потрапила в личинки у природному експерименті, визначити було практично неможливо. Однак, це не заважало отримати інформацію щодо впливу мікропатогену на мікропопуляцію шкідника у природних умовах. поліедроз шовкопряд трансоваріальний

Рис. 15. Алелі естеразного локусу Est-5: F, S; 1-4 - електрофоретичні спектри особин

У табл. 4 наведено результати експерименту щодо виявлення впливу інфекції, яку викликала B. thuringiensis, на генетичний склад популяції непарного шовкопряда за локусом Est-5.

Таблиця 4 Частоти генотипних класів (локус Est-5) непарного шовкопряда у контролі та досліді (після обробки суспензією B. thuringiensis)

Генотип	Контроль	Дослід	ч2
SS	0,52	0,13	2,86
FS	0,32	0,88	6,56*
FF	0,16	0	0,42
N	44	8

Після обробки суспензією B. thuringiensis певною мірою знизилась частота гомозигот FF та SS у дослідній групі. Разом з тим зросла частота гетерозигот FS. Отримані результати вказують на те, що особини непарного шовкопряда, гетерозиготні за локусом Est-5, були достовірно більш стійкими до бактерійної інфекції (ч² = 6,56; d. f. = 1; P < 0,05), ніж гомозиготи. Такий факт можна пояснити тим, що одночасна присутність двох алелів локусу Est-5 у геномі особини створює можливість більш повно каталізувати специфічну реакцію, яка, з огляду на отримані результати, має негативний вплив на розвиток бактерійної інфекції.

Отже, розвиток інфекції залежить від генотипу комахи. Можна стверджувати, що у геномі непарного шовкопряда є фрагменти, що маркують як чутливість, так і стійкість комахи до паразита і методи ензим-електрофорезу та RAPD-PCR-аналізу створюють можливість їх детектувати. Дані щодо генетичних маркерів стійкості і чутливості непарного шовкопряда до вірусу ядерного поліедрозу та B. thuringiensis можна використовувати для боротьби зі шкідником. Принцип використання генетичних маркерів базується на застосуванні такого препарату, до якого більшість особин популяції комахи будуть чутливими. При високій частоті особин комахи RAPD-алелей довжиною приблизно 330 і 560 п.н. та одночасно низькій частоті RAPD-алелей довжиною приблизно 150, 430, 850 та 1000 п.н. можна рекомендувати використання вірусного препарату "ВІРІН-НШ". У той же час зараження препаратом на основі B. thuringiensis (B3) непарного шовкопряда викликає переважне виживання гетерозигот за локусом Est-5 і його можна рекомендувати при високій частоті гомозигот у популяції шкідника. Такий підхід до біологічного контролю шкідника, що враховує генетичні маркери стійкості та чутливості комахи до паразита, може мати достатньо істотний економічний ефект при його впровадженні у лісовому господарстві.

Висновки

ДНК-фрагменти маркують взаємовідносини між вірусом ядерного поліедрозу та його хазяїном непарним шовкопрядом. Вперше за допомогою ДНК-маркерів доведено трансоваріальну передачу вірусу, встановлено інсектицидну дію його коротких ДНК-фрагментів, отримано 4 маркери стійкості та 2 маркера чутливості комахи до паразита.

1. Використання методу RAPD-PCR з праймером OPA-08 дозволило отримати RAPD-маркери (зони 01, 02, 03 RAPD-спектру) наявності ДНК вірусу ядерного поліедрозу в непарному шовкопряді.

2. Під час розвитку комахи на стадії яйця знижується рівень вірусоносійства серед особин непарного шовкопряда: встановлено достовірне зниження частот генотипів вірусу з RAPD-алелями довжиною приблизно 350, 290 та 210 п.н. (P < 0,05). Це свідчить про виживання в яйцях непарного шовкопряда певних генотипів вірусу залежно від захисних сил організму окремої комахи.

3. Генотипи вірусів з RAPD-алелем довжиною приблизно 350 п.н. (зона 01 RAPD-спектру) переважно передаються через внутрішній вміст яйця комахи (P < 0,01).

4. Методом PCR-аналізу зі специфічними праймерами в імаго внутрішнього паразита яєць непарного шовкопряда Anastatus japonicus та в яйцях шовкопряда двох генерацій однієї лінії були знайдені STS-маркери вірусної ДНК довжиною 317 та 524 п.н. Вони співпадають за довжиною із теоретично розрахованими на основі секвенованої послідовності фрагментів геному вірусу і свідчать про трансоваріальну передачу вірусу.

5. Наявність у яєць непарного шовкопряда маркерів ДНК вірусу ядерного поліедрозу свідчить про трансоваріальну передачу патогена. Методом PCR усередині яєць непарного шовкопряда ДНК вірусу знаходили у 76 % випадків, а на поверхні - у 56 %.

6. Зовнішнє нанесення розчину двох коротких одноланцюгових фрагментів ДНК вірусу ядерного поліедрозу (фрагмент iap-3 гену-інгібітору апоптозу клітин хазяїна) викликає підвищення смертності гусениць непарного шовкопряда (P < 0,01).

7. Обробка личинок Drosophila melanogaster розчином двох коротких одноланцюгових фрагментів ДНК вірусу ядерного поліедрозу (фрагмент гену-інгібітору апоптозу клітин хазяїна, GeneID:1488470) також викликає підвищення смертності мушки (P < 0,05). Таким чином, ДНК-фрагменти вірусу призводять до загибелі клітини комахи, і певну роль у цьому відіграє апоптоз.

8. RAPD-PCR аналіз із праймером OPA-14 дозволив виявити генетичну відмінність особин непарного шовкопряда, пов'язану з інтенсивністю розвитку вірусної інфекції в організмі хазяїна. У особин із RAPD-фрагментами довжиною приблизно 150, 430, 850 і 1000 п.н. достовірно знижується відтворення і накопичення вірусу у тілі хазяїна, тобто вони визначають стійкість до вірусу (P < 0,05), а RAPD-фрагменти довжиною приблизно 330 і 560 п.н. - навпаки маркують чутливість комахи до вірусу (P < 0,05).

9. Використання RAPD-фрагментів (довжиною приблизно 150, 430, 850 і 1000 п.н.) та алелів естеразного локусу (F і S) непарного шовкопряда, асоційованих з чутливістю та стійкістю комахи до вірусного препарату „ВІРІН-НШ” та препарату на основі Bacillus thuringiensis дозволяє використовувати генетичний підхід у регуляції чисельності шкідливих комах. Він базується на визначенні генетичними методами біопрепарату, до якого більшість генотипів особин у популяції комахи найбільш чутливі.

Список наукових праць за темою дисертації

1. Оберемок В. В. Методические рекомендации к применению ПЦР-метода / Оберемок В. В. - Симферополь: Таврический национальный университет шимени В. И. Вернадского, - 2008. - 35 с. - (Методичний посібник).

2. Оберемок В. В. Доказательство трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus (fam. Baculoviridae) методом RAPD-PCR / В. В. Оберемок // Журнал общей биологии. - 2008. - Т. 69, № 5. - С. 397 - 400.

3. Симчук А. П. Изоформы белков, эстераз и щелочной фосфатазы на личиночной стадии развития непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.) / А. П. Симчук, И. Г. Пелецкая, В. В. Оберемок // Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана: тематич. сб. науч. тр. - 2003. - Вып. 13. - С. 172-177. (автор брав участь у проведенні експерименту).

4. Оберемок В. В. Обнаружение методом RAPD-PCR ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда в гусеницах непарного шелкопряда I-го личиночного возраста / В. В. Оберемок // Ученые записки ТНУ. Сер. Биология, химия. - 2008. - Т. 21(60), № 2. - С. 97-101.

5. Сизых Л. М. К вопросу обнаружения трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus) / Л. М. Сизых, В. В. Оберемок, С. И. Красильщикова // Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана: тематич. сб. науч. тр. - Симферополь, 2008. - Вып. 18. - С. 126-130. (автор брав участь в проведенні експерименту і написанні статті).

6. Оберемок В. В. Вплив одноланцюгових ДНК-фрагментів вірусу ядерного поліедрозу (Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus) на життєздатність гусениць його хазяїна непарного шовкопряда (Lymantria dispar) / В. В. Оберемок // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. - Львів, 2009. - Вип. 10. - № 1-2. - С. 275-283.

7. Оберемок В. В. Використання генетичних маркерів у стратегії прийняття рішень з біологічного контролю чисельності непарного шовкопряда / В. В. Оберемок // Біологія тварин. - 2009. - Т. 11, № 1-2. - С. 71-82.

8. Пат. 35987 Україна, МПК (2006) А01М 1/20, Засіб діагностики ДНК-містячих вірусів, Оберемок В. В.; заявник та власник патенту Таврійський національний університет імені В. І. Вернадського. -№ u 2008 05942; заявл. 05.05.2008; опубл. 10.10.2008. Бюл. № 19.

9. Пат. 36445 Україна, МПК (2006) А01М 1/20, Засіб знищення листогризучих комах з ряду лускокрилих, Оберемок В. В.; заявник та власник патенту Таврійський національний університет імені В. І. Вернадського. - № u 2008 0674; заявл. 19.05.2008; опубл. 27.10.2008. Бюл. № 20.

...