Обмеження вірусних інфекцій в рослинах під дією порфіринів та генетичної трансформації

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 578.85/.86

03.00.06 -- вірусологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ОБМЕЖЕННЯ ВІРУСНИХ ІНФЕКЦІЙ В РОСЛИНАХ ПІД ДІЄЮ ПОРФІРИНІВ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ТРАНСФОРМАЦІЇ

Крулько Інна Валеріївна

КИЇВ - 2009



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Поліщук Валерій Петрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Коваленко Олексій Григорович, Інститут мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України, завідуючий відділом фітопатогенних вірусів

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент УААН Мельничук Максим Дмитрович, Національний університет біоресурсів і природокористування України, Кабінет Міністрів України, проректор з наукової та інноваційної діяльності

Захист дисертації відбудеться «26» січня 2010 р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр. Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 433.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ім. М. Максимовича Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий «21» грудня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О. В. Молчанець



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В умовах сучасного інтенсивного розвитку рослинництва вірусні хвороби рослин є актуальною проблемою, що потребує пошуку нових засобів обмеження їх шкодочинності. В останні роки досить активно проводяться дослідження в галузі хіміотерапії вірусних інфекцій рослин [Коваленко, 1999; Van Damm, 2001; Бабоша, 2002]. Існує велика кількість хімічних сполук - віруліцидних [Citovsky, 1998; Ghoshroy 1998; Song, 2003] та етіотропних антивірусних препаратів [Kirkpatrick, 1961; Ткачук, 1993], а також індукторів стійкості [Zipf, 1995; Culver, 1995; Depsey, 1999], які певною мірою здатні пригнічувати розвиток вірусної інфекції. Проте, незважаючи на велику кількість антивірусних речовин, в практиці використовуються лише поодинокі. Тому, питання хіміотерапії і профілактики вірусних захворювань рослин залишається на сьогодні не вирішеним.

Останнім часом значний інтерес дослідники проявляють до класу сполук з вираженою антибактеріальною та протипухлинною дією - природним та синтетичним порфіринам, а також їх аналогам. Дані сполуки визнані перспективними поліфункціональними агентами, що поряд з антибактеріальною [Зінченко, 2006; Maisch, 2007] та антипухлинною дією [Gelfuso, 2006] мають терапевтичну активність щодо ряду хвороб людини і тварин [Zecasin, 2003; Chen-Collins, 2003]. На сьогодні питання впливу порфіринів на віруси рослин все ще залишається не вивченим, що обґрунтовує необхідність подальших досліджень їх антифітовірусної дії.

Поряд з пошуком ефективних екзогенних факторів впливу на вірусну інфекцію рослин розробляються підходи до звільнення рослин від вірусів за рахунок залучення ендогенних природних захисних механізмів [Guo, 2003; Nomura, 2004; Ilardi, 2006]. Так, створення трансгенних рослин, стійких до вірусних інфекцій, є раціональним підходом, що зазвичай гарантує майже повну несприйнятливість рослини до патогена [Jan, 1999]. Проте, зважаючи на вузьку специфічність трансгенної стійкості [Vance, 1995; Prus, 1997; Goldbach, 2003], перспективним напрямком досліджень є створення трансгенних рослин з високим рівнем вірусостійкості та можливістю протистояти близько спорідненим вірусам.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота пов'язана з науково-дослідною роботою кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка за темою “Вивчення екологічних особливостей та біоіндикаторних властивостей різних організмів та їх угруповань в умовах трансформованого середовища для розв'язання проблем біобезпеки України” (реєстраційний номер № 06БФ036-04) та кафедри патології рослин Національного університету Чонг-Сінг (Тайвань).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було визначення антивірусної активності синтетичних порфіринів та їх металокомплексів в різних модельних системах та створення трансгенних рослин, стійких до вірусної інфекції, а також порівняння даних підходів для обмеження вірусної інфекції в рослинах.

Згідно з поставленою метою, робота передбачала виконання таких завдань: металокомплекс порфірин трансгенний рослина

1) вивчити інгібування синтетичними порфіринами інфекції ВТМ в рослинних тканинах in vitro;

2) дослідити антивірусну активність порфіринів в рослинах тютюну, інфікованих ВТМ;

3) вивчити морфологію вірусних часток та електрофоретичну рухливість білків оболонки вірусів під впливом порфіринів;

4) створити векторну конструкцію на основі консервативної ділянки гена полімерази вірусу мозаїки турнепсу (ВМТ);

5) провести трансформацію рослин ділянкою гена полімерази ВМТ полів та вивчити рівень стійкості трансгенних рослин до цього вірусу;

6) порівняти хіміотерапевтичний та молекулярно-біологічний підходи для лімітування вірусних інфекцій в рослинах.

Об'єктами дослідження були: вірус тютюнової мозаїки (ВТМ), вірус мозаїки турнепсу (ВМТ), бактерія групи кишкових паличок Escherichia coli, фітопатогенна бактерія Agrobacterium tumefaciens штаму EHA4404, що зберігались в колекціях кафедри вірусології біологічного факультету та кафедри патології рослин Національного університету Чонг-Сінг, рослини тютюну Nicotiana tabacum, рослини Nicotiana benthamiana, синтетичні металовмісні та неметаловмісні порфірини.

Предметами дослідження були: антивірусна активність синтетичних металовмісних та неметаловмісних порфіринів, пригнічення фітовірусної інфекції у трансгенних рослин.

Методи дослідження: вірусологічні, імунологічні, молекулярно-біологічні та методи варіаційної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано антифітовірусну дію синтетичних металовмісних та неметаловмісних порфіринів-тритозилатів, тетратозилатів та порфіринів-хлоридів. Виявлено найбільш активні препарати, які проявляють інгібувальну активність щодо ВТМ. Встановлено, що в присутності порфіринів віріони ВТМ агрегують між собою, проте порфірини не впливають на електрофоретичну рухливість білка оболонки вірусу.

Вперше отримано трансгенні рослини тютюну з високим рівнем стійкості до потівірусу, трансформовані векторною конструкцією, що містить консервативну ділянку гена реплікази ВМТ.

Практичне значення одержаних результатів. Синтетичні три- та тетратозилати є аналогами природних рослинних пігментів, відтак їхня антивірусна активність та відсутність токсичності на рослинний організм відкриває перспективу використання цих речовин як засобів оздоровлення і захисту рослин від вірусних інфекцій. Отримані результати передбачають використання порфіринів як інгредієнтів поживного середовища для регенерації і оздоровлення рослин від вірусної інфекції, а також для захисту оздоровленого матеріалу від повторного ураження.

Підхід до створення конструкції для трансформації рослин, який полягає у використанні як джерела вірусної нуклеотидної послідовності консервативної ділянки гена вірусної полімерази, може бути використаний в трансгенезі рослин, стійких до вірусних захворювань.

Розроблені векторні конструкції можуть бути використані для трансформації рослин, стійких до ряду потівірусів.

Дані про стійкість трансгенних рослин до потівірусів, зумовлених консервативною ділянкою вірусної реплікази, можуть бути використані при розробці засобів захисту рослин від фітовірусних інфекцій.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем зібрана та проаналізована наукова література з теми дисертації, одержані основні експериментальні дані, узагальнено отримані результати, проведено їх статистичну обробку.

Формування основних положень і висновків дисертаційної роботи, а також підготовку публікацій за отриманими результатами проведено за участю наукового керівника д.б.н., проф. В. П. Поліщука.

Частину досліджень виконано на базі лабораторії молекулярної вірусології кафедри патології рослин Національного університету Чонг-Сінг (Тайчунг, Тайвань) спільно з д-р, проф. Ш. Д. Йе.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації апробовані на VІ Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів (Київ 2006), конференції «Пошук та розробка нових профілактичних і лікувальних протимікробних засобів, антисептиків, дезінфектантів та пробіотиків» (Харків, 2006), конференції молодих вчених “Молодь і поступ біології” (Львів, 2007), V Міжнародній конференції «Біоресурси і віруси» (Київ, 2007), ІІІ Європейському конгресі з вірусології (Нюрнберг, Німеччина, 2007), конференції молодих вчених «Молодь і поступ біології» (Львів, 2008), конференції молодих вчених «Шевченківська весна» (Київ 2008), IX міжнародній конференції «Биология растительных клеток in vitro и биотехнология» (Звенигород, Росія, 2008), І Міжнародної конференції студентів, аспірантів та молодих учених «Фундаментальні та прикладні дослідження в біології» (Донецьк, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових робіт (5 статей у фахових журналах, 7- тези доповідей).

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 127 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, основної частини (включає матеріали і методи досліджень, результати досліджень і їх обговорення, узагальнення отриманих результатів), висновків, списку використаних джерел, що містить 252 назви, з них 211 - закордонних авторів. Робота ілюстрована 34 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Огляд літератури складається з п'яти підрозділів, в яких наведено сучасні дані про різні методи пригнічення розвитку вірусної інфекції в рослинному організмі, зокрема хіміотерапії та генетичної трансформації як методу конструювання вірусостійкості рослин.

Огляд літератури обґрунтовує доцільність виконання роботи.

Матеріали та методи досліджень. Матеріалом при дослідженні були ВТМ та ВМТ, бактерії Escherichia coli та Agrobacterium tumefaciens, Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana та синтетичні порфірини, що згідно з будовою, були розділені на тритозилати (№1, №2, №3, №4), тетратозилати (№6, №7), та порфірини-хлориди (№5, №8, НХ).

Для вивчення дії синтетичних металовмісних та неметаловмісних порфіринів на розвиток інфекції ВТМ в культурі рослинних тканин використовували метод регенерації рослин N.tabacum з калусної тканини [Мусієнко, 2001]. Для цього на гормонвмісне середовище з досліджуваними порфіринами у концентраціях 10, 20 та 40 мкМ поміщали експланти з рослин, інфікованих ВТМ. Через 30-40 днів з утвореного калусу відбирали зразки для дослідження вмісту ВТМ в калусі за допомогою непрямого ІФА [Crowther, 1995]. Для дослідження токсичного ефекту порфіринів на рослинні тканини використовували експланти зі здорового тютюну, поміщені на середовище із порфіринами (40 мкМ). За результатами ІФА вираховували зниження вмісту ВТМ в дослідних зразках з калусу, порівняно з вірусвмісним контролем. Для дослідження накопичення білка оболонки ВТМ в дослідних та контрольних зразках з калусу, останні також піддавали електрофорезу білків з використанням ДСН [Laemmli, 1970].

З метою вивчення профілактичної дії синтетичних порфіринів щодо вірусного захворювання, викликаного ВТМ на рослинах Nicotiana tabacum, здорові нестерильні рослини N. tabacum попередньо обробляли досліджуваними речовинами у концентраціях 10 мкМ, 20 мкМ або 40 мкМ та на наступну добу інфікували ВТМ. Через 20 днів після інфікування з рослин відбирали зразки для дослідження в них вмісту ВТМ методом ІФА.

З метою дослідження терапевтичного ефекту порфіринів в системі ВТМ - N. tabacum рослини уражували сумішшю ВТМ та досліджуваних сполук у концентраціях 10 мкМ, 20 мкМ та 40 мкМ. Через 20 діб після інфікування з рослин відбирали зразки для дослідження вмісту в них антигену ВТМ методом ІФА.

Для вивчення терапевтичної дії порфіринів на розвиток інфекції ВТМ в N. tabacum здорові нестерильні рослини N.tabacum обробляли різними концентраціями порфіринів (10 мкМ, 20 мкМ та 40 мкМ) після інфікування ВТМ (через 15 діб) та появи на рослинах симптомів хвороби. Через 5 діб після обробки порфіринами з рослин відбирали зразки для дослідження вмісту антигену ВТМ в дослідних рослинах методом ІФА.

З метою дослідження впливу порфіринів на білки оболонки ВТМ та ВМТ, виділені препарати вірусів змішували з неметаловмісним порфірином №3 та його цинк-вмісним аналогом №4 в концентрації 10 мкМ, 20 мкМ та 40 мкМ, інкубували протягом 8 год., а відтак оброблені зразки піддавали електрофорезу в поліакриламідному гелі.

Вплив порфіринів на морфологію вірусних часток вивчали за допомогою електронної мікроскопії [Миронов, 1994]. Виділений ВТМ обробляли речовиною №3 (10 мкМ) та досліджували в електронному мікроскопі JEM-100В при інструментальному збільшенні 20000 - 40000.

Щоб створити конструкції для трансформації рослин з метою надання останнім стійкості до ряду потівірусів на основі РНК-залежного «мовчання» генів, ми проводили відбір найбільш консервативного гена ВМТ шляхом порівняння нуклеотидних послідовностей чотирьох генів серед 32 представників роду Potyvirus. За допомогою комп'ютерних програм Віоеdit [http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html] та DNAStar [http://www.dnastar.com/] було обрано ген з найвищим відсотком гомології серед вище зазначених вірусів, а саме ген РНК-залежної РНК полімерази. По відсотку ідентичності та наявності функціональних нуклеотидних послідовностей, важливих для цього фермента, в гені було відібрано найбільш консервативний фрагмент.

Консервативна ділянка NIb (580 п.н.) була амліфікована з кДНК ВМТ та вбудована у висококопійний ТОРО-вектор, після чого проведена трансформація компетентних клітини E.coli [Маниатис, 1984]. Відтак бактеріальна суспензія була висіяна на селективне середовище LА, що містило індуктор транскрипції векторного гену галактозидази ІРТG та Х-gа1. Фрагмент кДНК послідовності NIb був вирізаний з ТОРО-вектора шляхом рестрикції відповідними рестриктазами ХbаІ та Хho1 і вбудований у низкокопійний вектор для трансформації рослин на основі Ті-плазміди А. tumefaciens pBI121 [Alvekens, 1988]. Спочатку проводили хімічну трансформацію вектором компетентних клітин Е.coli, а потім клітин А. tumefaciens. Скринінг наявності фрагмента гена NIb в трансформованих клітинах Е.coli та А.tumefaciens проводили за допомогою ПЛР та рестрикційного аналізу з використанням комерційних наборів для ПЛР та рестрикції (Genmark, Тайвань).

Трансформацію рослин N.benthamiana фрагментом гена полімерази ВМТ, вбудованим в A.tumefaciens, проводили, інокулюючи листкові диски трансформованою бактерією [May, 1995; Gustavo, 1998]. Для визначення наявності послідовностей ділянки гена NIb та гена nptII у РНК рослин використовували ЗТ-ПЛР (Genmark, Тайвань). Стійкість рослин до ВМТ визначали завдяки інокуляції цим вірусом ліній регенерованих трансгенних рослин з наступним тестуванням вмісту вірусу порівняно з таким у нетрансформованих рослин.

Антивірусна активність порфіринів в модельній системі ВТМ-культура тканин Nicotiana tabacum. Дослідження антивірусної активності порфіринів in vitro проводили в модельній системі ВТМ- культура тканин N. tabacum шляхом регенерації рослин з калусної тканини на середовищі, що містило досліджувані речовини у концентраціях 10 мкМ, 20 мкМ та 40 мкМ. Візуальні спостереження показали, що процес калусоутворення та регенерації рослин з експлантів, отриманих з інфікованих рослин тютюну, в присутності різних концентрацій три- та тетратозилатів проходив значно швидше, ніж у контролі, тобто експлантів з інфікованих рослин на середовищі без порфіринів. Речовини №5, №8 та НХ стимулювали утворення калусу в нижчій концентрації (10 мкМ) на відміну від вищих концентрацій (20мкМ, 40 мкМ) цих сполук, які майже зовсім не індукували калусоутворення та регенерації рослин.

Речовини не мали помітного токсичного впливу на рослинний матеріал, оскільки почорніння та відмирання калусної тканини або регенерантів, культивованих на середовищі з ними, не відмічено.

Результати ІФА зразків калусу, отриманому на середовищі з порфіринами, показали, що неметаловмісні тритозилати (сполуки №1, 3) діяли активніше, ніж їхні цинквмісні аналоги (№2, 4) (рис. 1), викликаючи пригнічення репродукції ВТМ приблизно на 83-95% (порфірин №1) та 40-70% (порфірин №3). Речовини №2 та №4 знижували вміст антигену ВТМ в калусі на 68-73% та 33-45%, відповідно. Металовмісні порфірини №6 та №7 у цих умовах зменшували концентрацію вірусу на 18-43%. Таким чином, наявність атому металу у складі порфірину дещо знижувала антивірусну активність порфіринів у системі вірус-культура рослинних тканин.

Порфірини НХ та №5, що представляють собою ноніл-хлорид та його марганецьвмісний аналог, а також дигідрохлорид порфірин №8, не проявили значної активності в даній модельній системі та призводили до зниження вмісту антигену ВТМ в калусі лише на 15-25% (сполука №5), 13-29% (сполука №8), 15-23% (сполука НХ).

З метою дослідження впливу порфіринів на наявність капсидного білка ВТМ (17.5 кДа) у калусі було проведено електрофорез тканевого гомогенату [Харіна, 2002]. Для дослідження було обрано калус з інфікованих ВТМ рослин тютюну, що утворився на середовищі з порфіринами №1 та №3, оскільки дані сполуки проявили себе як одні з найбільш ефективних проти ВТМ в культурі тканин. Електрофореграми білків свідчать, що вміст специфічного для ВТМ білка в зразках з порфіринами виявився значно меншим порівняно із контрольними зразками без додавання речовин (рис. 2).

Профілактична дія порфіринів в системі ВТМ - N. tabacum. З метою оцінки профілактичної дії порфіринів в системі ВТМ - Nicotiana tabacum здорові нестерильні рослини N. tabacum попередньо обробляли досліджуваними речовинами у концентраціях 10 мкМ, 20 мкМ або 40 мкМ та через 1 добу інфікували ВТМ. В результаті проведених досліджень було показано, що сполуки №1, №2, №3, №4 (рис. 3), №6, №7 зумовлювали затримку розвитку симптомів системної інфекції, викликаної ВТМ.

Обробка рослин речовинами №5, №8, НХ не впливала на розвиток симптомів вірусного ураження, які були подібні до тих, що мали необроблені інфіковані ВТМ рослини тютюну.

Результати ІФА зразків з дослідних рослин показали, що найвираженішу антивірусну дію при обробці рослин до інфікування мали неметаловмісні (№1 та №3) та цинквмісні тритозилати (№2 та №4) (рис. 4). Порфірини-хлориди №5, №8, НХ в даному випадку мали незначну антивірусну активність. Металовмісні порфірини-тетратозилати (№6, №7), у цілих рослинах, як і в калусі, не призводили до значного зниження вмісту вірусу в тютюні - приблизно до 24-32% (речовина №6) та 42-45% (речовина №7).

Противірусний ефект порфіринів в системі ВТМ - N. tabacum при інфікуванні рослин сумішшю порфірину та вірусу. Для вивчення противірусної дії досліджуваних порфіринів в системі ВТМ - N. tabacum рослини інфікували сумішшю вірусу та досліджуваних сполук у концентраціях 10 мкМ, 20 мкМ та 40 мкМ. Через 20 днів спостерігали утворення мозаїки та деформації листкових пластинок тютюну, викликаних ВТМ на контрольних інфікованих та дослідних рослинах. В противагу цьому, рослини, інфіковані сумішшю вірусу та порфіринів містили незначну кількість симптомів (приблизно 1/5 рослини містила симптоми вірусного захворювання). З рослин відбирали зразки для дослідження вмісту ВТМ в дослідних рослинах за допомогою ІФА. Майже всі речовини виявились активними інгібіторами накопичення антигену ВТМ в рослинах.

Порфірин №1 мав дещо нижчі показники антивірусної дії, ніж його цинк-вмісний аналог №2. Високі показники зниження вмісту ВТМ в рослинах мали речовини №3 (77-83%) та №4 (84-87%). Порфірини №6 та №7, що являють собою металовмісні тетратозилати, призводили до зменшення вмісту ВТМ в тютюні приблизно на 54.5-84%. Порфірини-хлориди №8 та НХ знижували вміст антигену ВТМ більше, ніж на 60%.

Вплив порфіринів на розвиток інфекції ВТМ в N. tabacum при обробці рослин після інфікування. Для вивчення терапевтичної дії порфіринів на розвиток вірусної інфекції in vivo рослини N. tabacum спочатку інфікували ВТМ, а після появи симптомів вірусного захворювання (через 15 діб) їх обробляли досліджуваними порфіринами у концентраціях 10 мкМ, 20 мкМ або 40 мкМ. Виявилось, що всі речовини були нездатними пригнічувати інфекцію ВТМ. Вони призводили до зниження вмісту антигену ВТМ в рослинах лише на 8-10%. Тобто, на стадії, коли вірусна інфекція вже розповсюдилась по всій рослині [Shukla, 1994], порфірини вже не можуть блокувати розвиток вірусної інфекції.

Взаємодія порфіринів з білками оболонки ВТМ та ВМТ. З метою дослідження впливу порфіринів на білки оболонки ВТМ та ВМТ інтактні вірусні частки змішували з неметаловмісним порфірином №3 та його цинк-вмісним аналогом №4 в концентраціях 10 мкМ, 20 мкМ та 40 мкМ, інкубували протягом 8 год та піддавали електрофорезу у поліакриламідному гелі.

Результати дослідів свідчать, що порфірини в різних концентраціях не впливали на електрофоретичну рухливість білків оболонки вірусів та не порушували вторинної структури білка.

Вплив порфіринів на морфологію віріонів ВТМ. Як зразок для електронної мікроскопії використовували препарат очищеного ВТМ, оброблений сполукою №3 в концентрації 10 мкМ. Контролем служив вірус, не оброблений сполукою. На електронній мікрофотографії у контрольних зразках віріони були рівномірно розподілені. У дослідних зразках видно скупчення, що складаються з паралельно розташованих вірусних часток (рис. 5). Під дією сполуки структура вірусних часток не змінюється, і їх модальні величини залишаються в межах норми, яка для ВТМ становить 300±10 х 18±2 нм.

Відомо, що утворення конгломератів вірусів під впливом віруліцидних сполук є одним із можливих механізмів антивірусної дії [Maillard, 2001]. Літературні дані свідчать, що агрегація вірусних часток під впливом порфіринів зумовлена електростатичною та стеричною взаємодією між молекулами цих речовини та білком оболонки вірусу [Casteel, 2004; Costa, 2008].

Зважаючи на літературні дані, а також враховуючи те, що поверхня капсидного білка ВТМ є негативно зарядженою [Kegel, 2006], а досліджувані нами порфірини є катіонними сполуками, можна зробити припущення, що досліджувані нами синтетичні металовмісні порфірини здатні в розчині приєднуватись до структурних білків ВТМ, таким чином призводячи до утворення вірусних конгломератів.

Клонування консервативної ділянки гена полімерази ВМТ у ТОРО-вектор. Альтернативою пошуку хіміотерапевтичних препаратів для боротьби з вірусними інфекціями рослин є створення стійкості рослин до вірусів з використанням молекулярно-біологічних підходів.

В нашій роботі були зроблені спроби отримати трансгенні рослини зі стійкістю до ВМТ за допомогою механізму РНК-залежного «мовчання» генів. За літературними даними відомо, що для інактивації вірусної РНК за допомогою «мовчання» генів кількість комплементарних основ має перевищувати 50% [Timmons, 2006].

Потівірусні гени Р1, Р2, NIа, 5' та 3' кінці геному мають рівень гомології, який є меншим за 50% [Shukla, 1994]. За допомогою комп'ютерних програм Віоеdit та DNAStar нами було проведено порівняння нуклеотидної послідовності генів HC-Pro (гена допоміжного компоненту протеази), CIP (гена хелікази), NІb (гена реплікази) та CP (гена білка оболонки) у 32 вірусів роду Potyvirus.

В результаті проведених досліджень було встановлено, що дані гени мають вищий рівень гомології, який проявлявся у більше, ніж 50% послідовностей. Найвищий рівень гомології (71%) проявлявся у гена вірусної полімерази NIb. Відтак, для створення вектора, необхідного для трансформації рослин було обрано саме цей ген.

Враховуючи невеликі розміри вектора для трансформації рослин, було необхідно обрати найбільш консервативну ділянку гена NIb, яка б не перевищувала 1000 н. Вибір консервативного фрагмента значною мірою залежав від наявності ділянок, що відповідають за важливі для вірусу функції. У фрагменті NIb присутні три (Motifs І, II та III) з восьми ділянок, консервативних серед усіх РНК-полімераз вірусів з позитивним РНК-геномом [Koonin, 1991].

До послідовностей праймерів до ділянки NIb додавали послідовності стоп-кодонів TAA для формування конструкцій, які б не призводили до синтезу трансгенного білка. Ампліфікацію консервативної ділянки гена NIb (580 п.н.) з кДНК ВМТ проводили шляхом ПЛР. Результат ПЛР свідчить про наявність фрагмента, що відповідає розміру консервативної ділянки (рис. 6).

Для ампліфікації та переносу досліджуваного фрагмента в ДНК рослини використовували вектори на основі плазмід бактеріального походження. З цією метою використовували ТОРО-вектор з високою ефективністю реплікації в клітинах E.coli [Маниатис, 1984].

Продукти ПЛР були вбудовані у ТОРО-вектор та трансформовані у компетентні клітини E.coli. Бактерія-носій була висіяна на середовище LА з індуктором транскрипції векторного гена галактозидази IPTG та продуктом для розщеплення даним ферментом - Х-gа1.

Для перевірки наявності вбудованого фрагмента NІb в клітинах з чашки Петрі було відібрано по 7 окремих білих колоній E.coli. З даних колоній виділяли плазмідну ДНК, яка використовувалась для проведення ПЛР. За результатами ПЛР фрагменти були присутні у ТОРО-векторі та мали розмір, який відповідав розміру консервативної ділянки (рис. 7).

Створення вектора для трансформації рослин з ділянкою гена NIb. Для переносу досліджуваного фрагмента в геном рослини використовували вектор на основі Ti-плазміди Agrobacterium tumefaciens [Alvekens, 1988; Hannon, 2002]. З метою створення даної конструкції фрагмент кДНК послідовності NIb був вирізаний з ТОРО-вектора шляхом рестрикції відповідними рестриктазами, ген GUS в такий же спосіб був вирізаний з рВІ121. Відтак було проведено електрофорез продуктів рестрикції у 1.2% агарозному гелі. Фрагмент, який відповідав розміру ділянки NIb, а також рВІ121 вектор були вирізані з гелю та елюйовані. Продукти елюції були перевірені на наявність фрагмента ДНК за допомогою електрофорезу в 0.8% агарозному гелі. Ділянка кДНК послідовності NIb була вбудована у низькокопійний комерційний вектор для трансформації рослин рВІ121 за допомогою реакції лігації. Компетентні клітини Е.coli були трансформовані продуктом лігації у кількості 15 мкл шляхом хімічної трансформації та висіяні на середовище LА з канаміцином. З метою скринінгу виділеної плазмідної ДНК з E.coli на наявність досліджуваного фрагмента проводили рестрикційний аналіз. В результаті в гелі були отримані треки, що відповідають розмірам вектора pBI121 та фрагмента NІb (рис. 8).

Клітини А. tumefaciens піддавали хімічній трансформації вектором рВI121 з ділянокю NIb. Шляхом ПЛР проводили скринінг наявності досліджуваного фрагмента у плазмідній ДНК. Завдяки ПЛР були отримані фрагменти NІb, що відповідають послідовності гена NІb з плазміди, вбудованої в E. coli.

Отримання трансгенних рослин N.benthamiana, стійких до інфекції ВМТ. Щоб перенести ДНК-фрагмент потівірусного гена в рослини N.benthamiana листкові диски культивували in vitro та інокулювали трансформованими бактеріями A. tumefaciens, а відтак з листової тканини отримували рослини-регенеранти (рис. 9) [May 1995; Gustavo, 1998]. Регенеровані рослини N. benthamiana за морфологією не відрізнялись від контрольних здорових нетрансформованих рослин.

Щоб перевірити регенеровані рослини на наявність вбудованого фрагмента гена NIb та гена nptII проводили ЗТ-ПЛР тотальної рослинної РНК. В результаті проведеної реакції, з 5 ліній трансгенних рослин були отримані електрофоретичні фрагменти продуктів ампліфікації, що відповідали розмірам ділянки NІb та гена nptII (рис. 10).

Через 20 діб після ураження вірусом лінії регенерантів N. benthamiana NIb1, NIb2, NIb3, NIb4, інфіковані ВМТ, містили незначні ознаки ураження або майже не містили симптомів, характерних для цієї вірусної інфекції, порівняно із інфікованими контрольними нетрансформованими рослинами. Контрольні рослини мали виражені симптоми мозаїки та скручування листків, характерні для ВМТ (рис.11.).

В результаті проведеного ІФА було виявлено зниження вмісту ВМТ в трансгенних рослинах N. benthamiana, що складало від 88% до 92% відносно вірусного контролю (рис.12).

Можна припустити, що пригнічення розвитку вірусної інфекції в рослинах тютюну обумовлено наявністю в геномі рослини трансгена, який являє собою послідовність консервативної ділянки гена реплікази ВМТ.

З огляду на це, механізм дії трансгена в трансформованій рослині може полягати в наступному: вірусна РНК, потрапляючи до рослинної клітини, починає реплікуватись та створює комплекси дволанцюгових РНК з РНК трансгена, який несе послідовність, гомологічну послідовності вірусної РНК [Baulcombe 2004; Zamore, 2005]. Дані комплекси дволанцюгових РНК є ініціаторами процесу РНК-інтерференції або «мовчання» генів, що призводить до косупресії вищезазначених нуклеотидних послідовностей [Baulcombe, 2004].

Порівняння хіміотерапевтичного та молекулярно-біологічного підходів, спрямованих на обмеження фітовірусної інфекції. В результаті проведених нами досліджень було показано, що при використанні порфіринів для пригнічення розвитку інфекції ВТМ в культурі рослинних тканин та в рослинах тютюну відсоток зниження інфекції становив 40-90%. Синтетичні порфірини виявились ефективними інгібіторами вірусної інфекції в культурі рослинних тканин, мають антивірусну дію в рослинах. Найбільш ефективними виявились три- та тетратозилати, які можуть бути рекомендовані для додавання до поживного середовища для оздоровлення рослин in vitro, а також для обробки рослин з метою попередження розвитку вірусної інфекції. З огляду на те, що сполуки даного класу раніше проявили себе як ефективні антибактеріальні [Maisch, 2007] та протигрибні [Cormick, 2009] речовини, їхні антифітовірусні властивості можуть бути корисними для розробки універсальних засобів захисту рослин від патогенів різної етіології.

Отримання рослин, стійких до вірусної інфекції, методами генетичної трансформації також є ефективним, оскільки зниження вмісту ВМТ в трансформованих рослинах в наших дослідах сягав 92%. Даний підхід, що полягає в залученні ендогенних природних захисних механізмів для захисту рослини від вірусу, вже продемонстровано багатьма дослідниками. На відміну від хіміотерапевтичних засобів, що зазвичай мають неспецифічний характер дії [Hansen, 1989], внесення трансгена з визначеною вірусною послідовністю у геном рослини супроводжується, як правило, утворенням вузькоспецифічної стійкості до певного виду вірусу [Xie, 2004]. Саме тому біотехнологічні методи отримання рослин, стійких до вірусних інфекцій, мають бути спрямовані на розширення спектра резистентності трансгенних рослин. Перевага векторних конструкцій для трансформації рослин, запропонованих нами, полягає в тому, що вони містять ділянку найбільш консервативного гена - гена РНК-полімерази ВМТ. Це забезпечує конструювання рослин, стійких і до інших вірусів - представників роду Potyvirus. Зважаючи на отримані нами результати, можна зробити висновок, що обидва підходи є раціональними і можуть бути рекомендовані для розробки засобів боротьби з вірусними інфекціями рослин.



ВИСНОВКИ

Встановлена гальмівна дія синтетичних металовмісних та неметаловмісних порфіринів на розвиток вірусної інфекції в модельних системах ВТМ - культура тканин N. tabacum та ВТМ - N. tabacum. Отримані трансгенні рослини N. benthamiana, стійкі до ВМТ, а також дана порівняльна характеристика хіміотерапевтичного та молекулярно-біологічного підходів до обмеження вірусної інфекції в рослинному матеріалі.

В системі ВТМ - культура тканин N. tabacum найбільш виражений антивірусний ефект мали неметаловмісні тритозилати №1, №3 (42-95%). Для більшості сполук ефективнішою виявилась концентрація в 40мкМ. Порфірини №5, №8, НХ призводили до незначного антивірусного ефекту та затримували розвиток калусу, що може бути зумовлено наявністю іонів хлору в структурі молекул.

В модельній системі ВТМ - рослини N. tabacum високий рівень профілактичної активності щодо ВТМ проявили метало- та неметаловмісні тритозилати №1, №2, №3 та №4 (35-87%). При інфікуванні рослин тютюну сумішшю ВТМ та порфірину спостерігається підвищення терапевтичної дії у металовмісних речовин №2, №4, №5, №6, №7 (54-84%). Всі речовини виявились нездатними пригнічувати інфекцію ВТМ, якщо їх наносили на рослини після формування симптомів захворювання.

Встановлено, що при дії порфіринів на вірусні частки ВТМ in vitro сполуки не змінювали структуру віріонів, проте зумовлювали агрегацію віріонів та утворення вірусних конгломератів. Антивірусні речовини не впливали на електрофоретичну рухливість білків оболонки ВТМ та ВМТ.

В результаті аналізу нуклеотидної послідовності гена вірусної РНК-залежної РНК-полімерази серед 32 потівірусів обрано найбільш консервативну ділянку, яка містить важливі функціональні послідовності ферменту. На основі консервативної ділянки гена полімерази створено векторну конструкцію для генетичної трансформації рослин.

Трансформація рослин за допомогою бінарної векторної системи Agrobacterium tumefaciens виявилась ефективною і дозволила перенести консервативний фрагмент гена реплікази ВМТ у геном рослини. Трансгенні рослини N. benthamiana проявили високу стійкість до ВМТ (88-92%), що базується на явищі посттранскрипційного «мовчання» РНК.

Як підсумок, обидва підходи до обмеження вірусних інфекцій у рослин виявились ефективними, позаяк призводили до значного зниження вмісту вірусу в рослинному матеріалі, а саме до 95% - при хіміотерапевтичному підході, 92% - за допомогою генетичної трансформації рослин. Ці підходи можуть бути рекомендовані для розробки засобів захисту рослин від вірусних інфекцій.



ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Корнійчук І. В. Вплив гетерополіядерних координаційних сполук металів та солей важких металів на розвиток вірусної інфекції у рослин Nicotiana tabacum / І. В. Корнійчук, Д. О. Устьяненко, Т. Г. Кот, А. В. Харіна, В. П.Поліщук // Анали Мечниковського інституту. - 2007. - №3.- С.20-23. (Дисертантом визначено ідею роботи, проведено пошук та узагальнено літературні дані, проведена обробка одержаних результатів, підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено за участі всіх авторів.)

2. Корнійчук І.В. Створення векторів трансформації рослин для отримання стійкості до потівірусів / І.В. Корнійчук, В.П. Поліщук, Ш. Д. Йе // Біополімери і клітина. - 2007. - Т.23. - №6.- С. 489-494. (Дисертантом проведена обробка одержаних результатів, підготовлено статтю до друку. Результати досліджень обговорені з д.б.н. проф. Йе Ш.Д. Висновки та обговорення зроблено за участі наукового керівника д.б.н. проф. Поліщука В.П.)

3. Krulko I. Study of antiviral activity of metal containing and non-metal containing porphyrins / T. Kalachova, I. Krulko, A. Kharina // Visnyk of Taras Shevchenko Kyiv National University. Series Biology. - 2008. - №51. - P. 38-40. (Дисертантом проведена обробка одержаних результатів. Підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено за участі всіх авторів.)

4. Крулько І. В. Антифітовірусна активність синтетичних порфіринів у системі in vivo / І. В. Крулько, А. В.Харіна, Н. С.Водзинська, Т. О.Філіппова, В. П. Поліщук // Агроекологічний журнал. - 2008. - спеціальний випуск, С. 138-139. (Розділи «Вступ, матеріали та методи» підготовлені групою авторів з Одеського національного університету імені І.І. Мечникова (Водзинська Н.С., Філіппова Т.О.), дисертантом розроблено розділ «Результати досліджень та обговорення». Висновки зроблено за участі всіх авторів.)

5. Krulko I. Role of siRNAs and miRNAs in the processes of RNA-mediated gene silencing during viral infections / I. Krulko, D. Ustyanenko, V. Polischuk // Cytology and Genetics. - 2009. - Vol.43. - №1. - P.63-72. (Дисертантом проведений аналіз літературних даних та підготовлено статтю до друку. Структуру роботи та зміст огляду обговорено з науковим керівником д.б.н. проф. Поліщуком В.П.)

6. Корнійчук І.В. Антивірусні властивості синтетичних порфіринів та їх металопохідних / І. В. Корнійчук, Т.А. Калачова, Н.С. Водзинська, Т. О. Філіппова, Т. Г. Кот, А. В. Харіна // Біоресурси та віруси: V міжнар. конф., 10-13 вересня 2007 р.: зб. тез. - К.: Фітосоціоцентр, 2007. - С. 177.

7. V. Korniichuk Construction of vectors for plant transformation in order to confer broad spectrum resistance to potyviruses / I. V. Korniichuk, V. P. Polischuk, S.D.Yeh // The III -rd European Virology Congress, 1-5 September 2007, Nurnberg, Germany, 2007- P. 106.

8. Корнійчук І. В. Конструювання векторів для трансформації рослин з метою отримання стійкості до потівірусів на основі РНК-залежного мовчання генів / І. В. Корнійчук, В. П Поліщук., Ш. Д. Йе // Молодь і поступ біології: конф. молодих вчених, 23-27 квітня 2007 р.: зб. тез. - Львів, 2007. - С. 350.

9. Крулько І. В. Антивірусні властивості синтетичних порфіринів та їх металопохідних/ І. В. Крулько, Т. А. Калачова, Т. Г. Кот, А. В. Харіна, В. П. Поліщук // Молодь і поступ біології: конф. молодих вчених, 7-10 квітня 2008 р.: зб. тез. - Львів, 2008. - С. 350.

10. Крулько І. В. Антифітовірусна дія синтетичних порфіринів / І. В. Крулько, Т. А. Калачова, Н. С. Водзинська, Т. О. Філіппова, Т. Г. Кот, А. В. Харіна // Шевченківська весна: конф. молодих вчених, 20-23 березня, 2008 р.: зб. тез. - К., 2008. - С. 61.

11. Крулько И.В. Использование порфиринов и их металлокомплексов для регенерации безвирусніх растений in vitro / И. В. Крулько, Т. А. Калачева, Н. С. Водзинская, Т. О. Филиппова, А. В. Харина, В. П. Полищук // Биология растительных клеток in vitro и биотехнология: IX международная конференция, 8-12 сентября 2008г.: сб. тезисов. - М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. - С.206.

12. Калачова Т.А. Порфірини як інгібітори вірусної інфекції на модельній системі бактеріофаг-бактерія / Т. А. Калачова, І. В. Крулько, В. П. Поліщук // Фундаментальні та прикладні дослідження в біології: міжнародна наукова конференція студентів, аспірантів та молодих учених, 23-26 лютого 2009 р.: зб.тез. - ВЕБЕР, 2009. - С. 256.



АНОТАЦІЯ

Крулько І.В. Обмеження вірусних інфекцій в рослинах під дією порфіринів та генетичної трансформації. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Дисертація присвячена пошуку ефективних методів пригнічення розвитку вірусної інфекції в рослинному матеріалі. Вперше показано антифітовірусну дію синтетичних металовмісних та неметаловмісних порфіринів-тритозилатів, тетратозилатів та порфіринів-хлоридів. Виявлено найбільш активні препарати, які проявляють антивірусну активність щодо ВТМ. Встановлено, що при дії на віріони порфірини зумовлюють агрегацію віріонів між собою, не впливають на електрофоретичну рухливість білка оболонки вірусу.

В результаті аналізу нуклеотидної послідовності гена вірусної РНК-залежної РНК-полімерази серед 32 потівірусів обрано найбільш консервативну ділянку, яка містить важливі функціональні послідовності ферменту. На основі консервативної ділянки гена полімерази створено векторну конструкцію для генетичної трансформації рослин. Вперше отримано трансгенні рослини тютюну з високим рівнем стійкості до потівірусу, трансформовані векторною конструкцією, що містить консервативну ділянку гена реплікази ВМТ.

Ключові слова: порфірини, культура рослинних тканин, клонування, вектор, трансформація.



АННОТАЦИЯ

Крулько И.В. Ограничение вирусных инфекций в растениях под действием порфиринов и генетической трансформации. -- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченка, Киев, 2009.

Диссертация посвящена поиску эффективных методов угнетения вирусной инфекции в растительном материале. Впервые показано антифитовирусное действие синтетических металлосодержащих и неметаллосодержащих порфиринов-тритозилатов, тетратозилатов и порфиринов-хлоридов. Антивирусная активность веществ относительно вируса табачной мозаики (ВТМ) исследовалась в системах вирус-растение и вирус- культура растительных тканей. Показано, что почти все вещества проявляли себя как эффективные противирусные агенты, ограничивая развитие фитовирусной инфекции. Выявлены наиболее активные препараты, которые проявляли антивирусную активность по отношению к ВТМ. Определено, что порфирины не изменяли структуру вирусных частиц ВТМ, но приводили к агрегации вирионов между собой. Вещества не влияли на электрофоретичную подвижность белка оболочки вирусов ВТМ и ВМТ.

Нами были проведены работы по получению трансгенных растений табака, устойчивых к потивирусной инфекции на основе феномена РНК-зависимого «молчания» генов.

Был проведен анализ нуклеотидной последовательности гена вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы среди 32 потивирусов, и, как результат, выбрана наиболее консервативная область, содержащая важные функциональные последовательности фермента. Выбранный фрагмент ДНК был амплифицирован из кДНК вируса мозаики турнепса (ВМТ) и клонирован в бактериальном векторе. На основании консервативного фрагмента построена векторная конструкция для трансформации растений на основе Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens.

С помощью A. tumefaciens, содержащей вектор для трансформации растений с встроенным фрагментом последовательности вирусного гена репликазы, проведена трансформация растений N. benthamiana.

Показано, что линии трансформированных растений-регенерантов, инфицированные ВМТ, имели незначительные симптомы, или не содержали их вовсе, в то время, как контрольные нетрансформированные растения имели выраженные симптомы мозаики и скручивания листовых пластинок. Содержание вируса в трансгенных растениях по сравнению с контролем было меньше на 88-92%.

Таким образом, оба подхода к ограничению вирусных инфекций в растениях оказались эффективными, так как приводили к значительному снижению содержания вируса в растительных тканях, а именно до 95% - при химиотерапевтическом и до 92% - с помощью генетической трансформации растений. Эти подходы могут быть рекомендованы для разработки средств и способов защиты растений от вирусных инфекций.

Ключевые слова: порфирины, культура растительных тканей, клонирование, вектор, трансформация.



SUMMARY

I. V. Krulko Limitation of viral infections in plants by porphyrins and genetic transformation. -- Manuscript.

The thesis for obtaining PhD degree in specialty 03.00.06 - virology. Taras Shevchenko' Kyiv National University, Kyiv, 2009.

The thesis is dedicated to the search of efficient methods of decreasing of level of viral infection in plant material. For the first time antiphytoviral activity of synthetic metal containing and non- metal containing porphyrins-tritozilates, tetratozilates and porphyrins-chlorides is shown. The most active substances, which show antiviral activity as for TMV are determined. It was detected that while affecting the virions the porphyrins cause their aggregation, do not influence electrophoretic movement ability of viral coat protein.

In the result of analysis of nucleotide sequence of viral RNA-polymerase gene among 32 potyviruses the most conservative region was selected, which includes important functional sequences of the enzyme. On the basis of this conservative region of the polymerase gene a vector construction for genetic transformation of plants was formed. For the first time transgenic plants with high level resistance to potyvirus transformed with vector construction with conservative gene fragment of replicase of TMV, were obtained.

Key words: porphyrins, plant tissue culture, cloning, vector, transformation.

Размещено на Allbest.ru

...