Моделювання росту та біосинтезу морських мікроводоростей у квазібезперервній культурі

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Моделювання росту та біосинтезу морських мікроводоростей у квазібезперервній культурі

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Використання мікроводоростей у науково-дослідних і промислових цілях безупинно поширюється. Різноманітні види водоростей слугують джерелами рослинного білка, вітамінів, хлорофіл-каротиноїдних комплексів і тощо. Створення оптимальної технології масового вирощування морських водоростей припускає розробку кількісних методів керування процесом біосинтезу клітин. Однак, до теперішнього часу не існує теорії культивування одноклітинних водоростей, яка дозволяла б складати прогнози росту культур мікроводоростей у заданих умовах навколишнього середовища без використання складних математичних операцій. Моделі росту мікроводоростей, які наводяться в літературних джерелах, базуються на результатах емпіричних досліджень, а також на сучасних досягненнях теорії мінерального обміну морських організмів. Параметрична база таких моделей охоплює широкий набір коефіцієнтів, що характеризують стан природних середовищ. У лабораторних дослідженнях процеси біосинтезу відбуваються в спеціально створюваних фіксованих біотичних й абіотичних умовах. Через те застосування математичних моделей мінерального обміну в природних екосистемах для опису динаміки росту мікроводоростей у культиваторах приводить до необхідності обліку надлишкової кількості факторів і до громіздкості математичних формул розрахунків коефіцієнтів. Таким чином, виникає необхідність побудови простої якісної моделі росту і біосинтезу мікроводоростей, яка б оперувала мінімальною кількістю кінетичних характеристик росту культури і в той же час дозволяла порівнювати експериментальні дані різних авторів, а також складати прогнози росту при зміні умов культивування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі біотехнологій та фіторесурсів ІнБПМ НАНУ в рамках фундаментальних досліджень за держбюджетними темами: «Вивчення функціонування морських біотехнологічних комплексів та їхньої взаємодії з навколишнім середовищем» (ДР 0106U001586, 2006-2010 р.р.), «Систематичний аналіз і комплексна оцінка сучасного стану вивченості біологічних ресурсів Азово-Чорноморського басейну та перспектив розвитку марикультури, ресурсних біо - та нанобіотехнологій» (ДР 0107U008034, 2007-2009 р.р.). У перерахованих темах дисертант брав участь як виконавець під час навчання в аспірантурі.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - побудова кінетичної моделі субстратзалежного росту і біосинтезу, яка дозволила б з'ясувати й прогнозувати ріст квазібезперервної культури мікроводоростей. Для досягнення поставленої мети були виконані такі завдання:

1. На основі відомих уявлень про ріст мікроводоростей в умовах періодичної культури побудувати кінетичну модель, що описує динаміку росту та вмісту основних біохімічних компонентів квазібезперервної культури мікроводоростей;

2. На основі відомих уявлень про дійсний та спостережуваний економічні коефіцієнти та уявлення про темнове дихання культури як розпад біомаси, побудувати кінетичну модель споживання мінеральних компонентів середовища квазібезперервною культурою мікроводоростей;

3. Провести верифікацію моделі на різноманітних видах мікроводоростей різних систематичних груп;

4. Провести експериментальне визначення коефіцієнтів моделі, провести розрахунок кінетичних характеристик росту квазібезперервної культури мікроводоростей.

Об'єкт дослідження - альгологічно чисті культури Dunaliella salina Teod. (штам IBSS-2), Porphyridium purpureum (Bory) (синонім Porphyridium cruentum Nаg.) (штам IBSS-70), Arthrospira platensis (Nordst.) Gomont (синонім Spirulina platensis (Nordst.) Geitl.) (штам IBSS-31) з колекції ІнБПМ НАН України.

Предмет дослідження - ростові та біохімічні показники D. salina, P. cruentum, S. platensis залежно від умов вирощування.

Методи дослідження - у роботі використовували спектрофотометричні методи визначення оптичної щільності культур мікроводоростей, вмісту білка, хлорофілу а, В-фікоеритрину, методи математичного моделювання.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше запропоновано модель росту періодичної культури мікроводоростей, що дозволяє визначити основні характеристики росту (максимальну питому швидкість росту, максимальну продуктивність, питому швидкість дихання, дійсну потребу) та прогнозувати динаміку вмісту біохімічних компонентів клітин культур мікроводоростей при зміні умов культивування.

Розраховано величини дійсної потреби культур D. salina, P. cruentum, S. platensis в азоті для різних початкових концентрацій нітратного азоту в середовищі. Встановлено, що зі зменшенням концентрації азоту в середовищі величина дійсної потреби також зменшується. Це означає, що величина дійсної потреби є фізіологічною нормою, яка показує кількість субстрату, необхідну для синтезу одиниці біомаси.

Практичне значення одержаних результатів. Запропонована модель дозволяє проектувати установки для культивування мікроводоростей з необхідними параметрами росту. Використовуючи отримані за допомогою пропонованої моделі кінетичні характеристики росту мікроводоростей, можна скласти методичний посібник з аналізу кривих росту культур мікроводоростей для учбових та наукових установ. Отримані результати важливі для оптимізації умов росту мікроводоростей та максимізації виходу біомаси в умовах промислового виробництва. Використовуючи розраховані характеристики росту, модель дозволяє прогнозувати динаміку вмісту біохімічних компонентів біомаси в умовах квазібезперервної культури.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням. Розробка завдань і вибір методів досліджень, основний комплекс експериментальних робіт (постановка експериментів, визначення кінетичних характеристик росту культур мікроводоростей, математичне опрацювання отриманих даних), узагальнення, аналіз й інтерпретація отриманих даних виконані автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на семінарах відділу біотехнологій та фіторесурсів ІнБПМ НАНУ (2005-2009 рр.), Міжнародній конференції молодих учених «Актуальні проблеми ботаніки та екології» (м. Київ, 17 - 20 вересня 2007 р.), IV Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих учених з проблем Чорного та Азовського морів «Понт Евксинський IV» (м. Севастополь, 24 - 27 травня 2005 р.), «5-ій Міжнародній науково-практичній конференції молодих учених із проблем водних екосистем» (м. Севастополь, 24 - 27 вересня 2007 р.), Міжнародній конференції «Сучасні проблеми альгології» (м. Ростов-на-Дону, 15 - 19 червня 2008 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 праць (4 - без співавторів). Наукові результати повною мірою викладені в 7 статтях, опублікованих у наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, 7 - у матеріалах і тезах національних і міжнародних конференцій. У роботах [1 - 7, 12], опублікованих в співавторстві, внесок здобувача полягає в постановці й проведенні експериментів, математичній обробці експериментальних даних, написанні тексту статті. Права співавторів публікацій не порушено.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, 5 розділів, висновків, списку використаних джерел (97 вітчизняних видань та 65 іноземних). Робота викладена на 151 сторінці машинописного тексту, ілюстрована 18 таблицями й 34 рисунками.

Подяки. Автор вважає приємним обов'язком висловити глибоку вдячність науковому керівникові кандидатові біологічних наук, завідувачу відділу біотехнологій та фіторесурсів ІнБПМ НАН України Р.П. Тренкеншу за допомогу в розробці теоретичних основ дисертації, керівництво та визначення стратегії досліджень; подяку к. б. н. І. В. Дробецькій за надані первинні експериментальні дані; вдячність усім співробітникам відділу біотехнологій та фіторесурсів за постійну увагу до роботи й цінні зауваження та допомогу в проведенні експериментів.

Зміст роботи

мікроводорость дихання біомаса

Огляд літератури

У розділі надається аналіз літературних даних з моделювання росту мікроводоростей, наведені основні існуючі моделі світлозалежного та субстратзалежного росту, детально розглянуте поняття потреби мікроводоростей в елементах мінерального живлення. Відображений вплив мінеральних елементів середовища на вміст біохімічних компонентів клітин.

Аналіз та узагальнення літератури показали, що на сьогоднішній день розроблено безліч моделей росту як для періодичної, так і для безперервної культури мікроводоростей. Звичайно такі моделі базуються на результатах емпіричних досліджень або є класичними моделями росту мікроорганізмів. З іншого боку, при моделюванні процесів субстратзалежного росту часто використовуються моделі, які базуються на сучасних досягненнях теорії мінерального обміну морських організмів. Вивчення процесів росту та біосинтезу мікроводоростей в лабораторних дослідженнях припускає створення спеціальних контрольованих умов, через те при вивченні впливу конкретного фактора середовища виникає необхідність використання простої якісної моделі, що дозволить з`ясовувати й описувати ріст мікроводоростей в умовах квазібезперервної культури.

Матеріал і методи

Експериментальні дослідження проводили з трьома культурами нижчих фототрофів: Dunaliella salina, Porphyridium cruentum й Spirulina platensis. Всі культури мікроводоростей отримані з колекції культур ІнБПМ НАН України.

Експериментальні роботи виконували на базі відділу біотехнологій та фіторесурсів ІнБПМ НАНУ. В роботі використовували поживне середовище Тренкеншу (Тренкеншу, 1979), модифікована поживне середовище Тренкеншу (до стандартного середовища додавали 120 г./л сухої морської солі) і середовище Заррук (Пиневич, 1970). Залежно від поставлених завдань вирощування водоростей здійснювали методами періодичної або квазібезперервної культури. Водорості вирощували в фотобіореакторі плоскопаралельного типу. Кожен фотобіореактор являв собою скляну місткість розміром 5Ч25Ч50 см із робочою товщиною 5 см. Об'єм реактора - 5 л. Нижня грань зроблена під кутом 25 градусів з метою поліпшення перемішування суспензії. Зверху фотобіореактор закривався скляною кришкою, у якій є 2 отвори для подачі повітря та поживного середовища. Всі скляні елементи фотобіореактора склеєні акваріумним силіконом. Як джерело світла використовували лампу ДРЛ-750. Середня освітленість на поверхні фотобіореактора становила 21 кЛк. Освітлення реєстрували за допомогою люксметра Ю-116. Культура барботувалась газо-повітряною сумішшю зі швидкістю 5 л/хв із доданням 3% вуглекислоти.

Кожен фотобіореактор оснащений системою охолодження (водяною сорочкою). Щоб уникнути повітряних пробок та пузирів усередині сорочки водяний струм спрямовували знизу вгору. Збільшення або зменшення швидкості протоку води через водяну сорочку дозволяло стабілізувати температуру в фотобіореакторі на заданому рівні. Температура підтримувалася в діапазоні від 26 до 28 C. Випаровування води з поверхні компенсували доданням дистильованої води. Концентрацію нітратів у середовищі вимірювали за допомогою іонометра И-160М. Визначення концентрації у середовищі фосфатів за допомогою методу Морфі-Райлі (Методи…, 1988). рН середовища вимірювали рН-метром И-150.

Ріст культур реєстрували фотометричним методом за оптичною щільністю суспензії мікроводоростей в області 750 нм (), вимірюваної на фотоелектроколориметрі ФЕК-2 у кюветах з робочою довжиною 0,5 см. Максимальний проміжок часу між відбором проби та виміром не перевищував 10 хв.

Вміст білка визначали методом Лоурі (Lowry, 1951), вміст хлорофілу а - спектрофотометричним методом (Wettstein, 1957): пігмент екстрагували із клітин 100% ацетоном, спектри екстрактів пігментів вимірювали на спектрофотометрі СФ-2000. Для виділення В-фікоеритрину проводили шестиразове заморожування біомаси для руйнування клітинних стінок. Концентрацію пігменту визначали спектрофотометричним методом. Водні екстракти B-фікоеритрину проміряли на довжинах хвиль, що відповідають його максимумам поглинання на спектрофотометрі СФ-2000. Концентрацію у відсотках на АСР розраховували по формулі, наведеній в роботі (Стадничук, 1990).

Моделювання росту мікроводоростей у квазібесперервній культурі

Модель періодичної культури мікроводоростей. З літературних джерел відомо, що періодичну криву можна розподілити на такі фази росту: лаг-фаза, експоненціальна, лінійна фаза, фаза сповільнення росту, стаціонарна фаза та фаза відмирання. У роботі (Тренкеншу, 2005) ця ідея одержала розвиток. Автор пропонує описувати динаміку росту накопичувальної культури мікроводоростей на кожній з фаз окремим рівнянням, де коефіцієнтами є кінетичні характеристики росту. Подібний підхід ми взяли за основу для виконання дисертаційної роботи. Це дозволило нам записати комплексну модель періодичної кривої. Модель обґрунтовує наявність експоненціальної та лінійної фази росту. Також показано, що накопичувальна крива є характеристикою росту мікроводоростей у даних умовах, і по її формі можна визначити фактори, що обмежують ріст культури.

Експоненціальна фаза. За визначенням, на експоненціальній фазі спостерігається необмежений ріст клітин. Питома швидкість росту культури мікроводоростей максимальна, постійна і дорівнює .

B=B_ln*exp(-µ_m* t_ln) (1)

де µ_m - максимальна питома швидкість росту, B_ln - біомаса в момент початку експоненціальної фази t_ln.

Відмітимо такий момент: всі фактори, що обмежують ріст культури мікроводоростей, можна розподілити на 3 групи. По-перше, це енергетичний субстрат, до якого відносимо світлові умови. По-друге, це газова складова: забезпеченість вуглекислим газом, винос кисню і тощо. І, по-третє, це мінеральні компоненти поживного середовища. Загальний вплив зазначених факторів визначає форму накопичувальної кривої. Вірно й зворотне твердження - по формі накопичувальної кривої можна судити про лімітуючї ріст фактори, послідовність їхньої дії.

На лог-фазі єдиним обмежуючим ріст чинником може бути лише величина зовнішнього світлового потоку. При збільшенні освітленості (якщо мінерального та газового субстрату достатньо) питома швидкість росту культури µ_m буде зростати. В результаті ми отримаємо той самий експоненціальний ріст, тільки з більшим кутом нахилу прямої до осі абсцис у логарифмічних координатах. В межі, при деякій граничній освітленості Iпор, ми будемо спостерігати максимально можливу, генетично закладену питому швидкість росту культури. З іншого боку, зменшення світлового потоку приведе до зменшення швидкості росту культури.

Лінійна фаза. Далі культура мікроводоростей переходить у наступну фазу росту, що не описується експоненціальним законом. У більшості випадків ми спостерігаємо фазу лінійного росту, що характеризується сталістю продуктивності культури. Це стає можливим лише в випадку сталості потоку лімітуючого субстрату в систему.

Розглянемо випадок лімітування росту на лінійній фазі світловим потоком, прийнявши за константу зовнішню освітленість. Тоді зі збільшенням щільності культури збільшиться темнове дихання, що приведе до розпаду частини біомаси. Це означає, що енергетичний субстрат, задіяний при її синтезі, безповоротно губиться. Зі збільшенням щільності культури втрати збільшуються, а повернення субстрату з біомаси, що розпалася, не відбувається. У зв'язку з цим, лінійний ріст у цьому випадку буде неможливий.

У випадку лімітування мінеральним субстратом потік визначається початковою концентрацією елементів у поживному середовищі. З ростом культури відбувається споживання мінеральних компонентів середовища. Темнове дихання буде викликати розпад біомаси, але на відміну від енергетичного субстрату, можливе повернення мінеральних речовин в середовище. За рахунок того, що біомаса, що розпалася, повинна бути мінералізована, час повернення такого субстрату буде більшим у порівнянні з часом оберту ферментної системи, і, виходить, швидкості росту будуть визначатися лише зовнішнім потоком.

Якщо розглянути газову складову, то можна припустити, що повернення вуглекислоти із біомаси, що розпалася, відбувається з часом, порівняним з часом оберту ферментної системи. Отже, газовий субстрат, який виділився з біомаси, що розпалася, може бути повторно задіяний у біосинтезі. Таким чином, не буде втрат, і швидкість росту культури буде визначатиметься лише величиною зовнішнього потоку субстрату, а при його сталості ми одержимо лінійний закон росту для біомаси:

P_m = k* V_CO2* Y_S⁰ (2)

B= B_l+ P_m(t - t_l) (3)

де P_m - максимальна продуктивність; k - коефіцієнт поглинання вуглекислоти культурою; Y_S⁰ - дійсна потреба у вуглеці; V_CO2 - швидкість надходження вуглекислого газу; B_l - біомаса в момент початку лінійної фази t_l.

Отже, підкреслимо, що наявність лінійної фази свідчить про лімітування росту вуглекислим газом, причому швидкість росту культури визначається швидкістю подачі вуглекислоти. Подібний висновок підтверджується експериментальними даними, наведеними у роботі (Ладыгина, 2007). При культивуванні мікроводоростей Dunaliella viridis та Isochrysis galbana з продувкою повітрям (без додання вуглекислоти) і з продувкою газоповітряною сумішшю, яка містить 2% вуглекислого газу, продуктивність на лінійній фазі росту змінювалася, відповідно, в 5 і 3 рази.

Фаза сповільнення росту. Закінчення лінійної фази свідчить про зміну фактора, що лімітує ріст водоростей. Культура переходить у фазу сповільнення росту. Тут обмежувати ріст можуть і світлові, і мінеральні умови середовища. Треба відзначити, що при відсутності лінійної фази на накопичувальній кривій, лімітування по вуглекислоті не відбувається, і на ріст, у першу чергу, впливають інші чинники.

Фаза сповільнення росту характеризується сталістю питомої швидкості дихання µ_r. Для фази сповільнення залежність біомаси від часу записується у такому вигляді:

B= B_m - (B_m - B^l)*exp(-µ_{r *}(t - t^l) (4)

де µ_r - питома швидкість подиху; B_m - концентрація біомаси на стаціонарній фазі; B^l - концентрація біомаси наприкінці лінійної фази t^l.

Модель споживання елементів мінерального харчування мікроводоростями. Наведені кінетичні характеристики дозволяють описати динаміку росту культури мікроводоростей як на кожній фазі росту окремо, так і всю накопичувальну криву в цілому. Однак, часто виникає необхідність кількісної оцінки впливу того або іншого елемента живлення на ріст культури. Подібне завдання приводить до поняття «потреби» мікроводоростей у субстраті. Потребу Y_S⁰ визначимо як відношення кількості спожитого субстрату dS до синтезованої за рахунок цього субстрату біомаси dBs:

Y_S⁰=-dS/dBs (5)

На відміну від клітинної квоти Друпа, потреба культури мікроводоростей у субстраті не є вмістом цього елемента в клітинах, а є певною фізіологічною нормою, яка показує кількість субстрату, необхідну для синтезу одиниці біомаси. Залежно від умов середовища потреба змінюється, тоді як мінімальна квота Друпа є величиною постійною.

Використовуючи наведені кінетичні характеристики росту, отримаємо рівняння динаміки субстрату для різних фаз росту накопичувальної культури, де параметром вмісту мінерального елемента в біомасі є величина потреби. У загальному випадку, ріст і біосинтез компонентів клітини є результатом двох процесів: властиво фотосинтезу та дихання, пов'язаного з підтримкою структури (темнове дихання). Спостережувана швидкість росту буде дорівнювати різниці швидкостей «чистого» фотосинтезу і темнового дихання. Таким чином, ми одержали дві величини, що характеризують потребу культури в субстраті: спостережувана Y_S і дійсна Y_S⁰. Очевидно, що в процесі росту культури мікроводоростей величина синтезованої біомаси dBs залишається постійною (ми говоримо про лімітований ріст). В той же час величина приросту щільності dB зменшується за рахунок процесів дихання. Таким чином, значення дійсної потреби залишається константою, а спостережуваної - буде збільшуватися з часом.

Біомаса, яка розпалася внаслідок її мінералізації, слугує джерелом мінерального живлення. Мінеральні елементи можуть або повторно використовуватись у біосинтезі, або безповоротно губитися, переходячи в нерозчинні сполуки, які не можуть бути задіяні біосинтетичним апаратом клітини. Також можливий варіант, коли тільки частина мінералізованого субстрату повторно втягується в біосинтез. Оцінимо швидкість повернення субстрату dSr/dt. Очевидно, що ця величина буде прямопропорційна кількості біомаси, що розпалася за рахунок дихання dBr/dt. Отже, для швидкостей справедлива рівність:

dSr/dt=б* Y_S⁰* dBr/dt (6)

де б - безрозмірний коефіцієнт повернення субстрату в біосинтетичні процеси.

Балансове рівняння для динаміки субстрату в середовищі має вигляд:

dSr/dt= - Y_S⁰* dBs/dt+ dSr/dt (7)

Рівняння показує, що концентрація субстрату знижується за рахунок витрати на синтез біомаси й одночасно відбувається повернення субстрату із біомаси, що розпалася.

Експоненціальна фаза характеризується сталістю питомої швидкості росту µ_m. Інтегруючи балансове рівняння (7) з урахуванням (1), одержимо залежність асиміляції субстрату від часу (для випадку ):

S=S₀ - Y_S⁰*1/ µ_m*(µ_m+ µ_r)*B_0*(1+exp(µ_m*t)₎ (8)

де - початкова концентрація субстрату.

Отримане рівняння відображає зміну концентрації субстрату в середовищі за умови експоненціального росту культури мікроводоростей. При відомих кінетичних характеристиках росту (максимальній питомій швидкості росту і питомій швидкості дихання) і початкових умовах (Bo та So) можна прогнозувати динаміку концентрації субстрату в середовищі. На рис. 2A представлено сім'ю кривих, розрахованих за рівнянням (8) при різних значеннях дійсної потреби (значення коефіцієнтів - So = 440 мг/л, µ_m = 0,5 доб ^-1, µ_r = 0,1 доб ^-1). Очевидно, що форма кривих обумовлюється ростовими характеристиками культури. Таким чином, апроксимація реальних експериментальних даних рівнянням (8) дозволить визначити величину дійсної потреби.

Лінійна фаза росту характеризується сталістю продуктивності культури P_m = const. Інтегруючи балансове рівняння (7) у рамках лінійної фази росту з урахуванням (3), можна одержати, що спостережувана потреба лінійно залежить від часу культивування, а залежність асиміляції субстрату від часу записується у вигляді:

S=S₀ - Y_S⁰*(Pm +(1 - б) µ_r B_l)*(t-t_l) - Ѕ Y_S⁰(1 - б) µ_r P_m)*(t-t_l) ² (9)

Розглянемо крайні випадки:

1. Відбувається повне повернення субстрату в середовище, б = 1. Одержуємо лінійну залежність для динаміки субстрату від часу:

S=S₀ - Y_S⁰*Pm (t-t_l) (10)

2. Субстрат не повертається в середовище, = 0:

S=S₀ - Y_S⁰*(Pm + µ_r B_l)*(t-t_l) - Ѕ Y_S⁰ µ_r P_m)*(t-t_l) ² (11)

На рис. 2B представлена сім'я кривих, побудованих за рівнянням (11) для різних значень дійсної потреби (значення коефіцієнтів - So = 440 мг/л, P_m = 0,5 г л^-1 доб ^-1, µ_r = 0,1 доб ^-1, B_l = 0,2 г АСР/л). Як і в попередньому випадку, форма кривої обумовлюється характеристиками росту, отже, ми можемо розрахувати величину потреби, апроксимуючи рівнянням (11) експериментальні дані.

Розрахунок величини потреби для безперервної культури. Ґрунтуючись на наведеному балансовому рівнянні (7), для безперервного процесу з питомою швидкістю протоку можна отримати, що залежність динаміки концентрації субстрату в середовищі від часу записується у вигляді:

(12)

де а і b - узагальнені коефіцієнти:

, .

Апроксимація експериментальних даних рівнянням (12) дозволяє розрахувати потребу в умовах хемостату (квазібезперервного процесу), і, навпаки, знаючи величину дійсної потреби та кінетичні характеристики культури, можна записати прогностичну залежність динаміки субстрату від часу для безперервної культури.

Модель вмісту біохімічних складових в клітинах мікроводоростей. Синтезована у процесі росту біомаса В може бути представлена як сума її біохімічних складових (Тренкеншу, 2005):

(13)

де - маса k-ого компонента; k - номер складової.

Відносний вміст будь-якого біохімічного компонента клітини записується наступним рівнянням (на прикладі білка):

(14)

де - функція відносного вмісту білка; - функція, що описує динаміку вмісту білка в процесі росту культури.

Якщо вважати, що культура не виходить за межі лінійної фази росту, тоді динаміка біомаси буде підпорядковуватись рівнянню:

(15)

де - питома швидкість протоку, - щільність культури в момент включення протоку .

Відповідно, динаміка концентрації білка в розчині буде підпорядковуватись рівнянню:

(16)

де - максимальна продуктивність по білку, - концентрація білка в момент включення протоку .

Підставляючи в чисельник і знаменник рівняння (14) вираз для біомаси та білка, отримаємо теоретичну криву динаміки відносного вмісту білка у біомасі:

(17)

Отримана залежність дозволяє прогнозувати вміст білка в біомасі у довільний момент часу на етапі квазібезперервної культури (розрахунок кінетичних характеристик білка і біомаси здійснується на лінійній фазі росту періодичної культури). Також рівняння (17) дозволяє вирішувати й зворотне завдання - апроксимація експериментальних даних дозволить визначити питому швидкість протоки або ростові характеристики культури.

Моделювання росту Dunaliella Salina і Porphyridium Cruentum при різних умовах мінерального живлення

Моделювання росту культури Dunaliella salina. У гіперсолоних водоймах Криму D. salina є домінуючим видом завдяки властивій їй евритермності, евригалінності, геліофільністі, здатності давати високі темпи розмноження за сприятливих умов (Масюк, 1961). Це дозволяє нам вибрати цей вид як модельний об'єкт при дослідженні процесів біосинтезу в умовах квазібезперервної культури. Нами проведено експеримент з дослідження динаміки росту культури D. salina, вмісту хлорофілу а і білка, а також споживання мінеральних компонентів середовища (нітратів і фосфатів). Поживним середовищєм слугувало модифіковане середовище Тренкеншу. Експеримент проводився в п'ятьох паралельних варіантах (далі варіанти А, В, С, D, E). Для визначення абсолютно сухої ваги (АСР) величину оптичної щільності помножували на коефіцієнт 0,78 (Геворгиз, 2005). Для визначення органічної речовини (ОР) величину АСР помножували на , де k - зольність, що становила 27%.

На початковому етапі експерименту культуру вирощували накопичувальним методом. На тринадцяту добу експерименту культура досягла стаціонарної фази росту, після чого була переведена у квазібезперервний режим культивування. Для кожного культиватора встановили питому швидкість протоку : для варіанта А - = 0,12 доб^-1, для варіанта B - = 0,14 доб^-1, для варіанта С - = 0,32 доб^-1, для варіанта D - = 0,42 доб^-1, у варіанта Е розведення не проводили.

Апроксімація фаз росту накопичувальної культури D. salina (рис. 3) дозволила розрахувати значення кінетичних характеристик росту (наведені середні значення п'яти варіантів): максимальна питома швидкість росту - доб^-1; максимальна продуктивність - г ОР/лдоб; питома швидкість дихання - доб^-1.

Отримані значення кінетичних параметрів культури D. salina були використані для розрахунку дійсної потреби в азоті та фосфорі, а також при моделюванні динаміки вмісту білка і хлорофілу а. Апроксимація експериментальних даних динаміки концентрації азоту в накопичувальній культурі рівнянням (11) (рис. 4) дозволила розрахувати величину дійсної потреби дуналієли в азоті, середнє значення якої в усіх варіантах становило 60 мг N/г ОР. Аналогічні розрахунки дозволили визначити величину дійсної потреби за фосфором - 6 мг Р/г ОР. Отримані значення дійсної потреби у азоті та фосфорі, а також величини максимальної продуктивності, максимальної питомої швидкості росту і питомої швидкості дихання були підставлені в рівняння динаміки субстрату в квазібезперервній культурі (12). Відповідність теоретичних кривих та експериментальних даних показано на прикладі варіанта D на рис. 4.

Динаміка хлорофілу а і загального білка в культурі D. salina. Паралельно з виміром біомаси та мінеральних компонентів середовища в експерименті проводилися виміри вмісту хлорофілу а і білка. Апроксимація лінійної фази динаміки вмісту хлорофілу а і білка на етапі накопичувальної культури D. salina дозволила визначити величини максимальної продуктивності за хлорофілом та білком .

Отримані значення продуктивностей за хлорофілом, білком і біомасою були підставлені в рівняння (17). В результаті отримані теоретичні криві динаміки вмісту хлорофілу а і білка на етапі квазібезперервної культури.

Моделювання росту культури Porphyridium cruentum і вмісту В-фікоеритрину у квазібезперервному режимі. Серед досліджень Rhodophyta значна кількість праць присвячена порфіридіуму Porphyridium cruentum. P. cruentum має широкий спектр пігментів (хлорофіл а, В-фікоеритрин, b-фікоеритрин, R-фікоціанін, -каротин (Gantt, 1974), тому P. cruentum становить інтерес як об'єкт керованого біосинтезу, продукти якого можуть бути легко витягнуті із клітин.

Нами проведено експеримент з дослідження динаміки росту, споживання нітратного азоту та вмісту В-фікоеритрину культури P. cruentum при різних початкових концентраціях азоту в поживному середовищі і при різних швидкостях протоку. Експеримент проводився у чотирьох паралельних варіантах (варіанти А, В, С и D). Для визначення біомаси величину оптичної щільності помножували на коефіцієнт 0,68. На початковому етапі експерименту порфіридіум культивували в накопичувальному режимі. У чотирьох дослідних культиваторах, які знаходились в однакових умовах щодо температури, поверхневої освітленості, були задані різні початкові концентрації нітратного азоту: варіант А - 42,9 мг N/л, варіант B - 65,5,9 мг N/л, варіант C - 22,6 мг N/л, варіант D - 42,9 мг N/л (варіант D відрізнявся від варіанта А половинним вмістом фосфору в середовищі). На шосту добу експерименту культуру перевели у квазібезперервний режим з різними питомими швидкостями протоку.

Для визначення кінетичних характеристик росту були проаналізовані експоненціальна та лінійна фази росту культури. Експоненціальна фаза тривала з початку експерименту до другої доби включно. Апроксимація експоненціальної фази накопичувальних кривих рівнянням (1) дозволила визначити величину . Лінійна фаза тривала від другої до п'ятої доби включно. Апроксимація лінійної фази накопичувальних кривих рівнянням (3) дозволила визначити величину . Отримані результати представлені в табл. 1 і на рис. 6.

Отримані кінетичні характеристики були використані для розрахунку дійсної потреби культури P. cruentum в азоті.

Таблиця 1. Максимальна питома швидкість росту µm, максимальна продуктивність Pm, дійсна потреба в азоті YS0, питома швидкість дихання µ для накопичувальної культури P. cruentum при різних початкових концентраціях азоту в середовищі So

	So, мг/л	µm	Pm	YS0	µr
Варіант А	42,9	0,35	0,74	60	0,16
Варіант В	65,5	0,42	0,84	81	0,17
Варіант С	22,6	0,45	0,43	30	0,17
Варіант D	42,9	0,41	0,71	60	0,16

Застосовуване раніше рівняння (11), що описує поглинання лімітуючого субстрату із середовища на лінійній фазі росту, в даному випадку використовувати не можна, оскільки концентрація азоту знизилася до нуля на другу добу експерименту, що відповідає закінченню експоненціальної фази росту. Через те в цьому випадку будемо використовувати рівняння (8). Апроксимація експериментальних даних на експоненціальній фазі росту даним рівнянням дозволила розрахувати значення дійсної потреби (табл. 1).

Отримані значення дійсної потреби корелюють із величиною початкової концентрації азоту в середовищі So: при зменшенні початкової концентрації азоту в середовищі відбувається зменшення величини істинної потреби, отже, змінюється фізіологічний стан культури (Kathiresan, 2006). Подібний висновок підтверджується нашими даними щодо вмісту В-фікоеритрину в режимі накопичувальної культури. У варіанті В ми спостерігали стійкий ріст відносного вмісту B-фікоеритрину (на 100%) при відсутності ліміту по біогенах (у перші чотири доби) з наступною стабілізацією вмісту пігменту при падінні концентрації азоту в середовищі до нуля. В інших трьох культиваторах вміст пігменту знижувався, причому мінімальний вміст B-фікоеритрину в клітинах порфіридіума (0,29% АСР) спостерігався в умовах найбільш жорсткого лімітування по неорганічному азоту (варіант С).

На шосту добу експерименту культуру перевели в квазібезперервний режим культивування, причому у всіх варіантах обмін вироблявся подвоєним середовищем Тренкеншу. Були встановлені наступні питомі швидкості протоку: для варіанта А - 0,2 доб^-1, для варіанта B - 0,3 доб^-1, для варіанта C - 0,1 доб^-1, для варіанта D - 0,4 доб ^-1. Апроксимація динаміки вмісту В-фікоеритрину на етапі квазібезперервної культури рівнянням (17) дозволила визначити величини максимальної продуктивності за В-фікоеритрином.

Для всіх варіантів ця величина склала 30 мг/лдоб. Отримані величини максимальних продуктивностей по біомасі (табл. 1) і В-фікоеритрину були використані для визначення оптимального режиму культивування. Проведені розрахунки показали, що оптимальним для отримання максимального виходу по біомасі і В-фікоеритрину є режим з питомою швидкістю протоку 0,3 доб^-1.

Моделювання росту Spirulina Platensis при різних умовах мінерального забезпечення

При культивуванні мікроводоростей спостерігаються невідповідності між кількістю спожитого мінерального субстрату і його вмістом у біомасі. Розглянемо експериментальні дані роботи (Дробецкая и др., 2001) з дослідження росту накопичувальної культури S. platensis при різних початкових концентраціях нітратного азоту в середовищі. Автори наводять накопичувальні криві щільності культури, а також динаміку споживання азоту. Використовуючи отримані теоретичні рівняння, розрахуємо величину дійсної потреби S. platensis в азоті і порівняємо її зі значеннями, отриманими авторами.

Для розрахунку величини дійсної потреби спіруліни в азоті необхідно визначити значення максимальної продуктивності P_m. Для цього апроксимуємо рівнянням (3) лінійну ділянку накопичувальної кривої. Результати представлені на рис. 8, а значення отриманих коефіцієнтів у табл. 2. Припустимо, що весь субстрат, виділений у середовище з біомаси, що розпалася за рахунок дихання, повторно буде задіяний в біосинтезі. Тоді динаміка концентрації азоту в середовищі повинна описуватися рівнянням лінійним рівнянням (10).

Таблиця 2. Характеристики росту накопичувальної культури S. platensis

Розведення середовища	Pm	µr	YS0, мг N/г АСР
Повне середовище	0,13	0,47	140,47
1:1	0,10	0,46	138,63
1:3	0,09	0,43	110,23

Однак, результати розрахунків дійсної потреби спіруліни в азоті, представлені в табл. 2, показують, що асиміляція азоту не відповідає лінійному закону: при перерахуванні кількості асимільованого азоту на клітинний вміст білка (Тренкеншу, 2005), ми одержуємо завищений вміст білка у біомасі (наприклад, для повного середовища 140,47 мг N / г АСР * 6,25 = 878 мг білка / г АСР = 88%), що не відповідає експериментально визначеним значенням (для повного середовища - 53,39% (Дробецкая и др., 2001). Таким чином, припущення про повне повернення субстрату з біомаси, що розпалася, невірне, тому при розрахунку величини потреби не можна використовувати лінійне рівняння динаміки субстрату у середовищі (10).

Розглянемо інший приклад - повернення субстрату з біомаси, що розпалася, не відбувається, тобто коефіцієнт повернення .

Апроксимація динаміки концентрації азоту у середовищі рівнянням (11) (рис. 10) дозволяє розрахувати значення дійсної потреби спіруліни в азоті: для повного середовища - Y_S⁰ = 81 мг N / г АСР, для розведення 1:1 - Y_S⁰ = 68 мг N / г АСР, для розведення 1:3 - Y_S⁰ = 67 мг N / г АСР. Перерахування зазначених величин на клітинний вміст білка дає відповідність з експериментально визначеними значенням (табл. 3).

Таблиця 3. Відповідність експериментальних (Дробецкая и др., 2001) і розрахункових значень вмісту білка у біомасі S. platensis

Розведення середовища	Літературні дані, % АСР	Розрахункове значення, % АСР
Повне середовище	53	52
1:1	48	43
1:3	45	42

Отримані результати показують, що при культивуванні спіруліни в умовах накопичувальної культури динаміка мінерального азоту у середовищі відповідає параболічному (11), а не лінійному закону (10). Це означає, що азот, який виділяється із біомаси, яка розпалась внаслідок темнового дихання, не може бути повторно задіяний у біосинтетичних процесах, а переходить у яку-небудь недоступну для водоростей форму. Цей факт пояснює «втрати» азоту (частка асимільованого у складі біомаси азоту становить 42 - 47% від загальної кількості спожитого із середовища нітратного азоту (Дробецкая, 2005) при культивуванні спіруліни в умовах накопичувальної культури.

Висновки

1. Розроблено математичну модель, що описує ріст культури мікроводоростей і динаміку вмісту її біохімічних складових. В основі моделі лежить положення про те, що кожна фаза росту накопичувальної культури характеризується сталістю однієї кінетичної характеристики, і, таким чином, описується окремим рівнянням.

2. Розраховані кінетичні характеристики (максимальна питома швидкість росту, максимальна продуктивність, питома швидкість дихання) трьох видів мікроводоростей (Spirulina platensis, Dunaliella salina, Porphyridium cruentum) при заданих умовах культивування.

3. Показано, що в експоненціальній фазі ріст культури мікроводоростей обмежений тільки зовнішніми світловими умовами, причому, обмеження відбувається за питомою швидкістю росту.

4. Показано, що наявність лінійної фази свідчить про лімітування росту культури мікроводоростей потоком вуглецю в газоподібній формі, причому швидкість росту культури визначається величиною газового потоку.

5. Запропоновано модель для опису динаміки біохімічних компонентів культури мікроводоростей. Біомаса являє суму її біохімічних складових, і при відомих кінетичних характеристиках культури можна розрахувати вміст заданого біохімічного компонента в біомасі в будь-який момент часу.

6. На основі відомих уявлень про дійсний та спостережуваний економічні коефіцієнти та уявлення про темнове дихання культури, як розпад біомаси, побудовано модель, яка дозволяє описати динаміку мінерального субстрату в середовищі як для періодичної, так і для безперервної культури.

7. Експериментально визначені величини дійсної потреби для трьох видів мікроводоростей. Отримані такі значення: S. platensis - 81 мг азоту на 1 г АСР, D. salina - 82 мг азоту на 1 г АСР, P. cruentum - 81 мг азоту на 1 г АСР.

8. Розраховані характеристики росту культур S. platensis та P. cruentum для різних початкових концентрацій азоту в поживному середовищі. Показано, що зі зменшенням початкових концентрацій азоту величина дійсної потреби зменшується, а величина питомої швидкості дихання не змінюється.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Боровков А.Б. Истинная потребность Dunaliella salina в азоте и фосфоре / А.Б. Боровков, А.С. Лелеков // Современные проблемы альгологии: междунар. конф., 24 - 27 сентября 2008 г.: тезисы докл. - Ростов-на-Дону, 2008. - C. 64 - 65.

2. Геворгиз Р.Г. Применение простейших моделей для описания накопительных кривых / Р.Г. Геворгиз, А.С. Лелеков // Экология моря. - 2005. - Bып. 67. - C. 38 - 43.

3. Геворгиз Р.Г. Расчёт КПД фотобиосинтеза у низших фототрофов. 1. Непрерывная культура. / Р.Г. Геворгиз, М.Г. Шматок, А.С. Лелеков // Экология моря. - 2005. - Bып. 70. - C. 31 - 36.

4. Горбунова С.Ю. Динамика азота и фосфора в среде при интенсивном культивировании микроводоросли Dunaliella salina / С.Ю. Горбунова, А.С. Лелеков, А.Б. Боровков // Экология моря. - 2007. - Вып. 74. - С. 21 - 24.

5. Гудвилович И.Н. Влияние различных концентраций минерального азота в среде на содержание B-фикоэритрина в клетках Porphyridium cruentum Nag. / И.Н. Гудвилович, А.С. Лелеков // Экология моря. - 2008. - Вып. 76. - С. 45 - 48.

6. Лелеков А.С. Оптимизация роста Spirulina platensis в проточной культуре / А.С. Лелеков, С.Ю. Скляренко, Р.Г. Геворгиз // Экология моря. - 2005. - Вып. 70. - С. 37 - 41.

7. Лелеков А.С. Простейшие модели роста микроводорослей. 4. Экспоненциальная и линейная фазы роста / А.С. Лелеков, Р.П. Тренкеншу // Экология моря. - 2007. - Вып. 74. - С. 47 - 49.

8. Лелеков А.С. Управление биохимическим составом микроводорослей в квазинепрерывном режиме / А.С. Лелеков // Понт Эвксинский 4: междунар. науч.-практ. конф., 24 - 27 мая 2005 г.: тезисы докл. - Севастополь, 2005. - С. 76 - 77.

9. Лелеков А.С. Определение истинной потребности Dunaliella salina в нитратном азоте / А.С. Лелеков // Понт Эвксинский 5: междунар. науч.-практ. конф., 24 - 27 сентября 2007 г.: тезисы докл. - Севастополь, 2007. - С. 51 - 52.

10. Лелеков А.С. Моделирование роста морской микроводоросли Porphiridium cruentum в квазинепрерывной культуре / А.С. Лелеков // Современные проблемы альгологии: междунар. науч.-практ. конф., 24 - 27 сентября 2008 г.: тезисы докл. - Ростов-на-Дону, 2008. - С. 210 - 211.

11. Лелеков А.С. Экспоненциальная и линейная фазы роста культуры микроводорослей / А.С. Лелеков // Актуальнi проблемы ботанiки та екологiї: междунар. конф. молодих учених-ботанiкiв, 17 - 20 сентября 2007 г.: тезисы докл. - Київ, 2007. - С. 15 - 16.

12. Тренкеншу Р.П. Простейшие модели роста микроводорослей. 3. Потребность микроводорослей в элементах минерального питания / Р.П. Тренкеншу, А.С. Лелеков // Экология моря. - 2005. - Вып. 70. - С. 53 - 61.

Размещено на Allbest.ru

...