Експресія генів інтерферону альфа, першої субодиниці його рецептора та протеїнкінази Р на ранньому етапі регенерації печінки щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ ІНТЕРФЕРОНУ АЛЬФА, ЙОГО РЕЦЕПТОРА ТА ПРОТЕЇНКІНАЗИ Р НА РАННЬОМУ ЕТАПІ РЕГЕНЕРАЦІЇ ПЕЧІНКИ У ЩУРІВ

03.00.03 - молекулярна біологія

ПЕРЕПЕЛЮК Марина Миколаївна

КИЇВ-2009

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

печінка гепатектомія купфер білок

Актуальність теми. З того часу, як було відкрите явище регенерації печінки у гризунів, науковців цікавило питання, що змушує клітини печінки, які до операції перебували у стані спокою, почати ділитися.

У більшості спеціалізованих клітин проліферація є несумісною з функціонуванням диференційованих клітин (Гилберт, 1995). Проте внаслідок класичної операції видалення 2/3 печінки у щурів, клітини цього органу вже через 4 год готові до проходження клітинного циклу (Michalopoulos, 1990) і поділу, а через тиждень майже повністю відновлюється маса органу (Grisham, 1962). Період часу від операції видалення 2/3 органа до 12 год після неї, коли починається синтез ДНК у гепатоцитах, називається пререплікативним.

До цього часу не отримано чіткої відповіді на те, що саме змушує клітини печінки переходити зі стану спокою (G0) до поділу і через деякий час знов повертатися до високодиференційованої спеціалізації.

Соматичні спеціалізовані клітини можна репрограмувати і повернути їх до плюрипотентного стану за допомогою індукції ектопічної експресії транскрипційних факторів (Maherali et al., 2007). Проте in vitro цей процес повільний та неефективний і потребує декількох тижнів. Більшість клітин в експерименті in vitro так і не досягає повного репрограмування (Mikkelsen et al., 2008). Тому дивовижним є той факт, що гепатоцити швидко, впорядковано і ефективно діляться, у той самий час зберігаючи значною мірою свої високоспеціалізовані функції.

Процес регенерації печінки цікавий не тільки для фундаментальної науки. При захворюваннях цього органу передумовою успішного видужання є відновлення гепатоцитів, загиблих у результаті вірусного чи токсичного ураження (хронічний гепатит, ушкодження печінки передозуванням лікарських та токсичних речовин) (Taub, 2003). Операції на печінці у людей, трансплантація донорної печінки теж призводять до проліферації клітин і до регенерації тканини. Регенерація частини печінки відбувається як у донора, так і у реципієнта (Pascher et al., 2002). Від ефективності відновлювального процесу залежить успішність оперативного втручання.

У процесі дослідження регенерації печінки спочатку була з'ясовано участь факторів росту, зокрема фактора росту гепатоцитів, трансформуючого фактора росту альфа, епідермального фактора росту тощо. Потім стало зрозуміло, що печінка повинна бути підготовлена до дії цих біологічно активних молекул іншими факторами, такими як фактор некрозу пухлин альфа та інтерлейкін-6. Нещодавно відкриті також інші учасники цього процесу - поліаміни, компоненти комплементу С3а та С5а, ліпополісахариди симбіонтної мікрофлори (Taub, 2004). Незаперечною є участь ендокринної та нервової системи у регулюванні регенерації печінки. Перелік факторів, відомих на сьогодні, не є остаточним.

У процесі попередніх досліджень увагу автора та колег привернули функціональні особливості інтерферону альфа (IFNб) та його можлива роль у перепрограмуванні клітин, що є необхідною складовою регенерації печінки. IFNб слушно вважається антипроліферативним агентом, і його участь у переході клітин від спокою до проліферації видавалася малоймовірною. З іншого боку, цей цитокін за допомогою своєї системи здатний інгібувати синтез рибосомної РНК, гальмувати трансляцію вибіркових молекул РНК через фосфорилювання еукаріотного фактора ініціації трансляції 2 (eIF2) та зв'язування з фактором 3, сприяти розщепленню рибосомної та матричної РНК через активацію РНКази L (Samuel, 2001). Ці та інші процеси можуть служити зняттю «старої» та впровадження «нової» програми для клітин печінки. IFNб привернув увагу також тому, що він широко використовується в медичній практиці для лікування вірусних та онкологічних захворювань (Воронцова, Кудрявец 2000). Крім того, нещодавно було доведено, що IFNб здатний стимулювати сплячі стовбурові клітини до поділу (Essers et al., 2009), що вказує на його пропроліферативні властивості. Незважаючи на останні досягнення, широкий спектр біологічної активності IFNб все ще залишається до кінця нез'ясованим.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України і виконувалася в рамках теми «Особливості функціонування та множинність форм фактора елонгації трансляції 1 вищих еукаріотів» (шифр теми - 2.2.4.9, № державної реєстрації 0105V005340, 2006-2010 рр.). Дослідження також підтримано грантом Українського Науково-Технологічного Центру (УНТЦ) № 4381 за темою «Новітні технології у вивченні функціональної активності інтерферону альфа» (2007-2009 рр.), грантом Всесвітньої федерації вчених у сфері «Медицина» на тему «Інтерферон альфа та його роль у переході клітин від спокою до проліферації» (2006-2007 рр.), короткостроковими грантами ЮНЕСКО для проведення досліджень в Інституті онкології імені М. Склодовської-Кюрі (м.Глівіце, Польща).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було вивчення експресії генів Ifna1(interferon alpha 1), рецептора до інтерферону Ifnar1 (interferon alpha, beta and omega receptor1), Ifnb1 (interferon beta 1) та гена Pkr (protein kinase R; синоніми - Eif2ak2, eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2, білок p68) у печінці щурів, що регенерує.

Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

Провести попередні дослідження вмісту мРНК IFNб, методом зворотної транскрипції - полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) у інтактній печінці щурів та печінці після часткової гепатектомії (ЧГЕ) та лапаратомії ( ЛАП).

Виділити гепатоцити та клітини Купфера з інтактної печінки щурів та печінки після ЧГЕ та ЛАП; отримати напрацьовані або клоновані фрагменти кДНК Ifna1, Ifnar1, Pkr та рибосомного білка Rps12 (ribosomal protein 12) як стандарти для кількісної полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі (кПЛР-РЧ) для визначеня експресії генів Ifna1, Ifnar1, Pkr та Rps12 у цих клітинах після ЧГЕ та ЛАП.

Оцінити за допомогою біологічного (антивірусного) тесту вміст білка IFNб у печінці, селезінці та сироватці крові.

Детектувати у гепатоцитах та клітинах Купфера вміст білка PKR та його субклітинну локалізацію Вестерн-блот аналізом та імуногістохімічним методом, відповідно.

Об'єкт дослідження: пререплікативний процес у печінці, зумовлений ЧГЕ та початковий етап реакції гострої фази, зумовлений ЛАП.

Предмет дослідження: експресія генів Ifna1, Ifnar1, Pkr в печінці щурів у процесі переходу органу від спокою до проліферації та на початковому етапі реакції гострої фази.

Методи дослідження: молекулярно-біологічні (виділення ДНК, РНК, кПЛР-РЧ, зворотна транскрипція, напрацювання та клонування ампліконів); цитологічні методи (визначення вмісту IFN І типу за резистентністю клітин невриноми гасерового вузла щурів до дії віруса везикулярного стоматиту, виділення гепатоцитів та клітин Купфера); імунохімічні методи (Вестерн-блот аналіз, імуногістохімія); операції часткової гепатектомії та лапаратомії.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше з'ясовано як змінюється експресія гена Ifna1 на рівні мРНК у суцільній тканині печінки, а генів Ifna1, Ifnar1, Pkr та Rps12 - на рівні мРНК окремо в гепатоцитах та клітинах Купфера протягом 12 годин після ЧГЕ та ЛАП, які спричиняють, відповідно, перехід високодиференційованої тканини до поділу та реакцію гострої фази. Показано, що експресія генів Ifna1, Pkr та Ifnar1 та субклітинна локалізація білка Pkr має клітинно-специфічний характер. Доведено, що ЧГЕ спричиняє активацію експресії гена Ifna1, у той час як ЛАП пригнічує її. Вперше оцінено функціональні можливості печінки синтезувати ендогенний IFNб за дії індуктора експресії генів IFN I типу - полі(І) -полі(Ц). Методом імуногістохімії визначено внутрішньоклітинну локалізацію PKR у печінці після ЧГЕ та ЛАП. Показано, що у цитоплазмі гепатоцитів інтактних тварин та тварин після ЧГЕ і ЛАП білок PKR виявляється у 100% клітин. Вперше доведено, що у пререплікативний період поряд з активацією синтезу Pkr-специфічної РНК відбувається перерозподіл білка PKR між ядром і цитоплазмою з тимчасовим виявленням білка PKR тільки у цитоплазмі.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень з експресії гена Ifna1 та його мішеней поглиблюють існуючі уявлення щодо процесів, які відбуваються у печінці після її ушкодження та після травм іншої локалізації в організмі. Визначення кількості ендогенного IFNб, який утворюється у печінці при її ушкодженні, можна рекомендувати брати до уваги при призначенні IFNб як лікувального засобу при хворобах цього органа. Отримані результати також свідчать про неоднозначність проблеми нормалізації результатів за використання продуктів генів «домашнього господарства» при дослідженні явищ, які відбуваються в часі, та при порівнянні вмісту РНК або білка у клітинах різного типу. Дисертаційна робота є доробком, що свідчить про необхідність подальших досліджень «нетрадиційної» дії IFNб, а саме такої, що не належить до його антивірусної, імуномодулюючої та антипроліферативної активності.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені у дисертації, одержано автором особисто або за безпосередньої участі у виконанні експериментів. Зокрема, автором самостійно виділено ДНК, РНК, проведено реакції ЗТ-ПЛР, імуногістохімію, Вестерн-блот аналіз.

Планування та аналіз результатів експериментів, написання статей та операції ЧГЕ та ЛАП проведено спільно з науковим керівником, д.б.н.М.Ю.Оболенською. Визначення антивірусної активності сироватки крові, гомогенатів печінки та селезінки проведено разом з д.мед.н., професором С.Л.Рибалко та Д.Б.Федорченко на базі Інституту епідеміології та інфекційних хвороб імені Л.В.Громашевського. Клонування ПЛР-продуктів для кількісного оцінювання вмісту специфічних мРНК проведено спільно із А.В.Кукліним та Я.В.Щербою. Підбір специфічних праймерів здійснено спільно із А.М.Слончаком. РНК для пілотних експериментів на тотальній печінці виділено з О.П.Якунчиковою, О.С.Губар та Л.Я.Сазоновою. Пошук ISRE-сайтів у промоторах генів програмою COTRASIF здійснено з Б.Т.Токовенко. Гепатоцити та клітини Купфера з інтактної печінки для експериментів на культурі клітин виділено з Н.В.Макогон. Імуногістохімічні дослідження проведено на базі Інституту онкології імені Марії-Склодовської-Кюрі, м. Глівіце, Польща, з А.Гоглер за організаційного сприяння С.Шале.

З усіма зазначеними колегами автор має спільні публікації.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи доповідались на поточних наукових семінарах Інституту молекулярної біології та генетики НАН України та наукових конференціях: 12-ій Щорічній науковій конференції у НаУКМА (21 - 25 січня 2005 р., Київ, Україна); 5-ій Парнасівській конференції (26 - 29 квітня 2005 р., Київ, Україна); Конференції «Запобігання раку- 2006» (16 - 18 лютого 2006 р., Санкт-Галлен, Швейцарія); 40-му Щорічному з'їзді ESCI (16 - 18 березня 2006 р., Прага, Чехія); 2-ій Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (21 - 24 березня 2006 р., Львів, Україна); 3-ій Міжнародній конференції молодих вчених (15 - 18 травня 2007р., Одеса, Україна) та на Конференції молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (20 - 22 вересня 2007 р., Київ, Україна).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 статей у наукових фахових журналах та тези 7 доповідей у збірниках матеріалів з'їздів та конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 126 сторінках машинописного тексту. Вона містить 45 рисунків, 3 таблиці. Список використаної літератури охоплює 130 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи досліджень. У дослідах використовували білих безпорідних щурів 4-6 місячного віку вагою 200 - 250 г. Операцію ЧГЕ проводили за класичною методикою (Higgins, Anderson, 1931). За ЛАП розрізали черевну стінку щура, торкалися печінки і зашивали черевну стінку. Зразки брали у інтактних тварин, а також через 1, 3, 6 та 12 год після операцій.

Гепатоцити та клітини Купфера виділяли за модифікованим методом Беррі та Френда (Berry, Friend, 1969) перфузією печінки розчином 0,05 % колагенази з подальшим розділенням та очищенням клітин у процесі диференційного центрифугування, доповненого додатковими обробками ферментами.

Тотальну РНК виділяли за методом Хомчинського (Chomczynski, Sacchi, 1987), тотальну кДНК синтезували за допомогою зворотної транскриптази та випадкових гексамерних праймерів. Специфічні фрагменти кДНК Ifna1, Ifnar1, Pkr та Rps12 напрацьовано методом ПЛР із використанням специфічних праймерів (Синтол, Москва).

Послідовності відповідних кДНК взято з бази даних NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Праймери та умови ампліфікації специфічних фрагментів підібрано в програмі Vector NTI suite, а їхню специфічність перевіряли у програмі Blastn.

Для кількісного вимірювання вмісту специфічних мРНК у складі тотальної РНК методом кПЛР-РЧ напрацьовано у реакції ПЛР-фрагменти кДНК Ifna1, Ifnar1, Rps12 і Pkr, з яких перші три клоновано, а останній очищено.

З метою визначення вмісту індивідуальної РНК у тотальній РНК у кожному експерименті для кПЛР-РЧ будували калібрувальну криву з розведеннями відповідної плазмідної ДНК, або очищеного ПЛР-продукту. Після розрахунків результати кПЛР-РЧ наводили в аттомолях індивідуальних РНК в одному мг тотальної РНК. Для кПЛР-РЧ використовували спеціальний набір реактивів з SYBR Green I та пасивним референтним барвником ROX (Синтол, Москва).

Оцінку вмісту індивідуальних білків PKR, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH) та глюкокінази (GKK) оцінювали методом Вестерн-блот аналізу. Для цього отримували лізати зразків печінки та виділених гепатоцитів та клітин Купфера; білки розділяли одномірним SDS-електрофорезом у поліакриламідному гелі. Електрофореграми сканували та кількісно оцінювали інтенсивність сигналів у програмі GelPro 3.0.

Для імуногістохімічного виявлення внутрішньоклітинного розподілу білка PKR тканину печінки фіксували в 4 % формальдегіді, обробляли за стандартною методикою за участі специфічних антитіл.

Антивірусну активність білка IFNб/в у печінці, селезінці та сироватці крові оцінювали за біологічним тестом, який базується на визначенні стійкості клітин невриноми гасерового вузла щурів до вірусу везикулярного стоматиту після попередньої обробки клітин рідиною, що містить IFNб/в. Рівень індукції синтезу IFNб в печінці після ЧГЕ порівнювали з таким рівнем індукції після введення внутрішньочеревно полі(І)-полі(Ц) (330 мкг на щура), а також з рівнем IFNб в селезінці та сироватці крові.

Статистичну обробку отриманих даних проводили за методом Стьюдента у програмі Origin 7.5. Результати представлено у вигляді середніх арифметичних значень з урахуванням стандартних відхилень.

Результати досліджень та обговорення.

Експресія генів Ifna1 та Ifn1 у суцільній тканині печінки після ЧГЕ та ЛАП. Операція ЧГЕ стимулює регенераційні процеси в печінці. Однак, як будь-яке хірургічне втручання, вона також провокує запальні реакції гострої фази. Для того, щоб відокремити ці два процеси, в якості негативного контролю була використана операція ЛАП, яка не порушувала цілісності печінки, але викликала відповідь на неспецифічне хірургічне втручання. На першому етапі було досліджено можливу участь IFNб у негайно-ранній відповіді печінки на ЧГЕ. Методом ЗТ-ПЛР було показано, що кількість Ifna1-специфічної мРНК у тотальній РНК суцільної печінки зростає через 1 год після ЧГЕ і повертається до вихідного рівня через 3 год

Після ЛАП, навпаки, вміст Ifna1-специфічної мРНК у тотальній РНК одразу після операції суттєво знижується і в кінці досліджуваного періоду стає майже в три рази меншим порівняно з вихідним рівнем.

Поставало питання чи задіяні у цьому процесі інші члени родини інтерферонів, зокрема IFNв, який, як і IFNб, належить до IFN І типу, та використовує з ним один і той самий рецептор. За даної чутливості методів не було визначено експресії гена, що кодує IFNв.

Біологічна (антивірусна) активність IFNб/в у сироватці крові та гомогенатах печінки, селезінки інтактних та оперованих щурів. Результати, отримані на рівні РНК, підтверджено в біологічному тесті на рівні функціонально активного білка. Окрім печінки, досліджено антивірусну активність IFNб/в у селезінці, як тканині, яка продукує цей цитокін, та у крові, що його переносить і містить IFNб/в-продукуючі клітини.

Після ЧГЕ протягом пререплікативного періоду рівень IFNб/в у печінці, селезінці та сироватці крові змінюється. Через 0,5 год після ЧГЕ вміст IFNб/в у залишку печінки перевищує вміст у суцільній печінці до операції, зберігається на одному рівні щонайменше протягом 3 год та зменшується через 6 - 12 год. У селезінці, так само як і у печінці, через 0,5 год після ЧГЕ зростає вміст IFNб/в в усьому органі, проте він не досягає такого рівня як у печінці, а підвищення є швидкоминучим. У цей період часу IFNб/в не визначається у сироватці крові. Він визначається пізніше у низькому титрі, який незначно підвищується через 6 - 12 год після ЧГЕ, коли його кількість у печінці та селезінці зменшується. Ці результати вказують на те, що ЧГЕ стимулює синтез IFNб власними клітинами печінки та селезінки. Стосовно печінки треба зауважити, що оскільки у досліджуваних зразках не виявлено Ifnb1- специфічної мРНК, то зміни, зафіксовані за допомогою біологічного тесту у печінці, стосуються винятково гена Ifna1, а не Ifnb1. Таким чином, вміст IFNб у печінці упродовж досліджуваного регенераційного періоду в 2 і 3 рази перевищує вміст у селезінці та сироватці крові, відповідно.

Кількість «вільного» IFNб/в у сироватці залишається незначною і починає зростати тільки через 6 - 12 год, що можна пояснити потраплянням синтезованого цитокіну з печінки та селезінки у кров'яне русло.

Через 0,5 год після введення щурам полі(І)-полі(Ц) продукція IFNб/в у печінці в 6 разів перевищує ту, яка спостерігається після ЧГЕ. Цей результат свідчить про те, що відповідь печінки на ЧГЕ синтезом IFNб/в не є максимально можливою, ймовірно, через реакцію гострої фази як складової регенераційного процесу, під час якої синтез IFNб різко знижується.

Зважаючи на різнорідність клітинного складу печінки, наступні експерименти були присвячені визначенню експресії генів у гепатоцитах, що відповідають за основні біохімічні функції печінки, та клітинах Купфера, осілих макрофагах та продуцентах значної кількості цитокінів.

Імунологічний тест на чистоту клітинних препаратів. Виділені гепатоцити та клітини Купфера були ідентифіковано мікроскопічно за їхньою морфологією

Життєздатність клітин визначалась за включенням 0,2 % трипанового синього.

Для контролю за чистотою виділених клітин, у обох препаратах визначено контрольний антиген - фермент глюкокіназу (GKK), який експресується в гепатоцитах і не експресується в клітинах Купфера. Після Вестерн-блот аналізу специфічний сигнал отримано в тотальному лізаті із гепатоцитів і не отримано в клітинах Купфера, що свідчить про відсутність домішок гепатоцитів або їхніх уламків у препаратах клітин Купфера. Для порівняння наведено вміст білка GAPDH.

Вміст Ifna1-специфічної мРНК у тотальній РНК, виділеній із гепатоцитів та клітин Купфера, після ЧГЕ та ЛАП. Гепатоцити та клітини Купфера, ізольовані з інтактної та післяопераційної печінки, відрізняються вмістом специфічних РНК. У клітинах Купфера із інтактного органу вміст Ifna1 -специфічної мРНК в тотальній РНК в 2,5 раза більший, ніж у гепатоцитах

У клітинах Купфера вміст мРНК Ifna1 у тотальній РНК зростає вдвічі через 1 год після ЧГЕ і повертається до вихідного рівня через 3 год. У гепатоцитах він поступово зростає до 12 год, коли приблизно у 2 рази перевищує відповідне значення в інтактній печінці.

Профіль експресії Ifna1 в клітинах Купфера відповідає такому у суцільній тканині. Таким чином, саме клітини Купфера відповідають за початкове зростання Ifna1-РНК у печінці після ЧГЕ. Отримані нами дані вказують на те, що гепатоцити відповідають за синтез мРНК Ifna1 на більш пізньому етапі досліджуваного періоду. Враховуючи, що гепатоцити за об'ємом складають близько 80 % тканини печінки та 60 - 65 % загальної кількості клітин, то це підвищення може мати суттєве значення на пізніших строках регенерації печінки, тобто через 12 год після ЧГЕ.

На відміну від ЧГЕ, через годину після ЛАП спостерігали стрімке зниження вмісту Ifna1-специфічної мРНК у тотальній РНК як клітин Купфера, так і гепатоцитів. Таким чином, реакція гострої фази при неспецифічному хірургічному втручанні призводить до зниження експресії гена Ifna1, а регенераційні процеси - до її підвищення, яке проявляється неодночасно в клітинах різної природи.

Вміст Ifnar1-специфічної РНК у тотальній РНК, виділеній із гепатоцитів та клітин Купфера після ЧГЕ та ЛАП. Базальний рівень експресії Ifnar1 у гепатоцитах перевищує такий у клітинах Купфера приблизно у 4 рази. Отримані результати свідчать, що саме гепатоцити є головними мішенями IFN, що виробляється переважно клітинами Купфера.

Через 6-12 год після ЧГЕ у гепатоцитах спостерігали різке зростання Ifnar1-специфічної мРНК, яке починалось одразу після зростання Ifna1-специфічної РНК у цих клітинах. Цей факт вказує на те, що IFN, який продукується гепатоцитами, діє аутокринно. Підвищення вмісту Ifnar1-специфічної мРНК, яке відбувається після зростання вмісту Ifna1-мРНК, має опосередкований характер, оскільки ген Ifnar1 не містить IFN-респонсивного елемента.

Після ЛАП рівень експресії гена Ifnar1 залишається майже незмінним як у гепатоцитах, так і в клітинах Купфера і супроводжується суттєвим зниженням продукції Ifna1-РНК клітинами обох типів.

Вміст Pkr-специфічної РНК у тотальній РНК, виділеній із гепатоцитів та клітин Купфера після ЧГЕ та ЛАП. PKR - це серин-треонінова кіназа, що фосфорилює еукаріотний фактор ініціації трансляції 2б, таким чином модулюючи трансляцію білків. Крім того, PKR є мішенню і водночас геном первинної відповіді на дію IFN.

Методом кПЛР-РЧ показано, що вміст Pkr-специфічних мРНК у складі тотальної клітинної РНК на порядок більший у гепатоцитах, ніж у клітинах Купфера. У гепатоцитах їх вміст поступово зростає впродовж 12 год після ЧГЕ, а після ЛАП, навпаки, різко знижується через 1- 6 год, але повертається до вихідного рівня до 12 год (

У клітинах Купфера після обох операцій спостерігається первинне незначне зменшення вмісту Pkr-специфічних РНК з подальшим зростанням і спадом до рівня нижче вихідного до 12 год. Кількісно дане зростання дещо більше виражене після ЛАП, ніж після ЧГЕ, де воно не виходить далеко за межі вихідного рівня

Це означає, що ЧГЕ викликає значні зміни експресії Pkr в обох типах клітин, у той час як ЛАП - тільки у гепатоцитах.

Вміст білка PKR у гепатоцитах та клітинах Купфера після ЧГЕ та ЛАП. У гепатоцитах за даними Вестерн-блот аналізу рівень білка, на відміну від рівня РНК, залишається майже незмінним протягом досліджуваного періоду після обох операцій

У клітинах Купфера, навпаки, спостерігається підвищення рівня білка через 3 год після ЧГЕ, що відповідає змінам на рівні РНК.

Той факт, що після ЧГЕ та ЛАП у гепатоцитах рівень білка залишається майже незмінним, а рівень мРНК суттєво змінюється, потребує подальших досліджень посттранскрипційної регуляції рівня мРНК Pkr.

Субклітинна локалізація PKR. Оскільки значних змін у кількості білка PKR після ЧГЕ та ЛАП не виявлено (на відміну від змін вмісту відповідної мРНК), автор з'ясувала його субклітинну локалізацію методом імуногістохімічного аналізу.

У інтактних тварин та тварин через 1 та 3 год після ЧГЕ PKR-білок за його специфічним забарвленням виявляється в ядрі і в цитоплазмі гепатоцитів, при чому у цитоплазмі він виявляється у 100%, а в ядрі - у 46% клітин. Через 6 год після ЧГЕ білок виявляється тільки у цитоплазмі гепатоцитів і не виявляється у ядрах. Через 12 год після запуску регенерації печінки білок PKR знову виявляється в ядрах.

Після ЛАП розподіл білка між ядром і цитоплазмою суттєво не змінюється. Ці дані означають, що після ЧГЕ, але не після ЛАП відбувається перерозподіл у розташуванні білка PKR у гепатоцитах.

Відомо, що ядерна фракція PKR під впливом IFNб PKR переміщується у цитоплазму (Jeffrey et al., 1995). Можна припустити, що під час регенерації печінки, саме IFN, який продукується печінкою ендогенно, спричиняє тимчасове переміщення PKR гепатоцитів із ядра у цитоплазму.

Координована експресія досліджуваних генів після ЧГЕ. Отримані дані свідчать про те, що ЧГЕ стимулює координовану експресію генів Ifna1, рецептора до нього (Ifnar1) та ферменту (Pkr), який опосередковує передачу сигналу від цього рецептора. Таким чином, синтезований IFNб секретується і зв'язується з рецепторами як на клітинах Купфера, так і на прилеглих клітинах, і передає сигнал всередину клітин. Вірогідно, що як індуктор гена Pkr, він обумовлює суттєве підвищення Pkr-РНК у гепатоцитах та незначне коливання у клітинах Купфера. Підвищена експресія Pkr-РНК у гепатоцитах, у свою чергу, може стимулювати в них експресію гена Ifna1, адже показано, що білок PKR характеризується не тільки суто кіназною активністю, але й інтегрований у внутрішньоклітинні шляхи передачі сигналів до транскрипційних факторів NF-кB та АР-1 і через них здатний активувати експресію гена Ifna1 (Garcia et al., 2006). Експресія рецептора до IFNa - Ifnar1 - невідомим опосередкованим способом включається у загальну координовану експресію генів.

Пригнічення експресії генів після ЛАП. Експресія досліджуваних генів після ЛАП принципово відрізняється від їхньої експресії після ЧГЕ.

Нами висловлено гіпотезу, що зниження експресії гена Ifna1 після ЛАП відбувається на рівні регуляції транскрипції гена і може бути обумовлене дією глюкокортикоїдів (Chikanza, Kozaci, 2004), які продукуються як реакція на хірургічний стрес і негативно регулюють транскрипційні фактори NF-кB, AP-1 та STAT3, що необхідні для синтезу мРНК з гена Ifna1.

Печінка синтезує білки гострої фази у відповідь на ушкодження організму будь-якої локалізації (як у випадку після ЛАП) та, звісно ж, на ушкодження самої печінки (ЧГЕ). Тому, якщо після ЛАП печінка включається у системну відповідь організму на ушкодження, то після ЧГЕ ця відповідь з боку печінки ускладнюється через життєво необхідні регенеративні процеси, які відбуваються у печінці паралельно з реакцією гострої фази.

Таким чином, у даній роботі досліджено експресію генів у суцільній тканині печінки, гепатоцитах та клітинах Купфера протягом пререплікативної фази після ЧГЕ та реакції гострої фази після ЛАП. Результати проведених досліджень свідчать про значення IFNб та генів, індукованих ним, для проходження обох досліджуваних процесів.

ВИСНОВКИ

Досліджено експресію генів, які кодують IFNб, першу субодиницю його рецептора IFNAR1 та протеїнкіназу Р (PKR) у печінці щурів після ЧГЕ та ЛАП, що спричиняють, відповідно, перехід клітин печінки від спокою до проліферації (регенераційні процеси) та неспецифічну реакцію (гостра фаза).

Встановлено, що активація синтезу IFNб після ЧГЕ здійснюється переважно клітинами печінки протягом пререплікативного періоду.

Доведено, що печінка є потужним продуцентом IFN І типу в інтактних тварин, тварин після ЧГЕ та введення полі(І)-полі(Ц).

Вперше з'ясовано, що у печінці після ЧГЕ підвищується експресія гена Ifna1 протягом пререплікативного періоду. У цьому процесі клітини Купфера активуються раніше гепатоцитів.

Показано, що неспецифічна реакція печінки, викликана ЛАП супроводжується вираженим довготривалим зниженням експресії гена Ifna1, яке виявляється одночасно в клітинах Купфера та в гепатоцитах.

З'ясовано, що експресія генів Ifna1, Pkr та Ifnar1 та субклітинна локалізація білка Pkr має клітинно-специфічний характер.

Виявлено, що гепатоцити є мішенями IFNб, який продукують клітини Купфера. Підвищена експресія гена Ifna1 клітинами Купфера супроводжується підвищеною експресією генів Ifnar1 та Pkr у гепатоцитах.

Показано, що після ЧГЕ рівень експресії гена Ifnar1 у клітинах Купфера не змінюється, що запобігає активації в них синтезу білків IFNб, PKR та зумовлює короткотривалість дії IFNб. Показано, що у цитоплазмі гепатоцитів інтактних тварин та тварин після ЧГЕ і ЛАП білок PKR виявляється у 100% клітин. Вперше доведено, що у пререплікативний період поряд з активацією синтезу Pkr-специфічної РНК відбувається перерозподіл білка PKR між ядром і цитоплазмою з тимчасовим виявленням білка PKR тільки у цитоплазмі.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Перепелюк М.М. Методичні підходи до вивчення експресії інтерферону альфа в інтактній та регенеруючій печінці щурів / М.М.Перепелюк, А.М.Слончак, М.Ю.Оболенська // Вісник КНУ імені Шевченка. Серія Біологія. - Т.45 - 46. - 2005. - С.85 - 87. Особистий внесок здобувача - апробація двох методів виділення РНК - з CsCl та за методом Хомчинського, аналіз продукту.

Експресія генів, які кодують б-інтерферон, його рецептор, протеїнкіназу R та рибонуклеазу L в інтактній та регенеруючій печінці щурів / М.М.Перепелюк, А.М.Слончак, Л.Я.Сазонова, О.С.Губар, О.П.Якунчикова, М.Ю.Оболенська // Наукові записки НаУКМА. Біологія та екологія.- 2005. -Т.43. - C. 25 - 33. Особистий внесок здобувача - планування експериментів, визначення змін експресії генів Ifna1, Ifnar1, Pkr та Rnasel методом ЗТ-ПЛР.

Вміст інтерферону б/в в печінці щурів після часткової гепатектомії / М.М.Перепелюк, Д.Б.Федорченко, С.Л.Рибалко, М.Ю.Оболенська // Науковий вісник Чернівецького університету. - 2006. - Вип. 297: Біологія. - С.88 - 93. Особистий внесок здобувача - виділення РНК, ЗТ-ПЛР та аналіз ампліконів.

Експресія інтерферону б в печінці щурів після часткової гепатектомії / М.М.Перепелюк, Д.Б.Федорченко, С.Л.Рибалко, М.Ю.Оболенська // Біополімери і клітина. - 2006. - Т.22, №4. - С.283 -290. Особистий внесок здобувача - визначення вмісту IFNб та IFNв в печінці після ЧГЕ та ЛАП методом ЗТ-ПЛР.

Інтерферон б та протеїнкіназа Р в процесі відновлення печінки щурів після часткової гепатектомії / М.М.Перепелюк, А.В.Куклін, Я.В.Щерба, Б.Т.Токовенко, Н.В.Макогон, А.Гоглер, С.Шале, М.Ю.Оболенська // Biopolymers and cell. - 2009. - Т.25, №2. - С.145 - 149. Особистий внесок здобувача - визначення змін експресії білка PKR та його внутрішньоклітинної локалізації після ЧГЕ і ЛАП методами Вестерн-блот аналізу та імуногістохімії; написання основної частини статті.

Expression of IFN-, its receptor, RNase L and Protein kinase R in regenerating rat liver / M.M.Perepelyuk, A.M.Slonchak, D.B.Fedorchenko, L.Ya.Sazonova, O.S.Gubar, O.P.Yakunchikova, S.L.Rybalko, M.Yu.Obolenskaya // Український біохімічний журнал (спеціальний випуск). - 2005. - Vol. 77, №2. - 217. Особистий внесок здобувача - виділення РНК з тотальної печінки, ЗТ-ПЛР визначення Ifna1-, Ifnar1-, RnaseL-, Pkr- та Rps12-специфічних мРНК в інтактній печінці та печінці після ЧГЕ і ЛАП.

Interferon б/в content in rat liver after partial hepatectomy / M.M.Perepelyuk, D.B.Fedorchenko, S.L.Rybalko, M.Yu.Obolenskaya // European Journal of Clinical Investigation. - March 2006. - Vol.36, Suppl.1. - P.11. Особистий внесок здобувача - визначення специфічних мРНК в інтактній та післяопераційній печінці.

Interferon alpha/beta in rat liver after partial hepatectomy as growth modulator of hepatocytes / M.M. Perepelyuk, D.B.Fedorchenko, S.L.Rybalko, M.Yu.Obolenskaya // European Journal of Cancer Suplements. - February 2006. - Vol.4, №1. - P. 60. Особистий внесок здобувача - визначення Ifna1-, Ifnb1- та Rps12-специфічної мРНК в інтактній печінці, печінці після ЧГЕ і ЛАП та розділених гепатоцитах та клітинах Купфера.

Експресія інтерферону б в печінці щурів у відсутності вірусної інфекції / М.М.Перепелюк, Д.Б.Федорченко, С.Л.Рибалко, М.Ю.Оболенська // Молодь та поступ біології: Збірник тез Другої Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів (21-24 березня 2006 року, м.Львів). - Львів, 2006. - С.345 - 346. Особистий внесок здобувача - визначення специфічних мРНК в інтактній та післяопераційній печінці.

Interferon alpha and its targets in intact and partially hepatoctemized rat liver / M.M.Perepelyuk, A.V.Kuklin, O.P.Jakunchikova, D.B.Fedorchenko, M.Yu.Obolenskaya // Матеріали ІІІ Міжнародної конференції молодих вчених «Розмаїття живого. Екологія. Адаптація. Еволюція» (15 - 18 травня 2007 року) - С.215. Особистий внесок здобувача - виділення РНК із зразків печінки після ЧГЕ та ЛАП та ЗТ-ПЛР аналіз.

Novel technologies in the study of IFN alpha activity / B.Tokovenko, A.Kuklin, M.Perepelyuk, M.Obolenskaya // Abstracts of the conference “XI Gliwice Scientific Meetings 2007” - November 2007 - P.46. Особистий внесок здобувача - виділення РНК, проведення Вестерн-блот аналізу та імуногістохімії.

Interferon-б and its targets in regenerating rat liver / M. Perepelyuk, A.Kuklin, O.Jakunchikova, M.Obolenskaya // Abstracts of the conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120^th anniversary of M. Vavilov. - 20 - 22 September 2007. - Kyiv, Ukraine. - P.69. Особистий внесок здобувача - визначення специфічних мРНК в інтактній та післяопераційній печінці, написання основного тексту тез.

АНОТАЦІЯ

Перепелюк М. М. Експресія генів інтерферону альфа, першої субодиниці його рецептора та протеїнкінази Р на ранньому етапі регенерації печінки щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2009.

Досліджено експресію генів Ifna1, Pkr та Ifnar1 у печінці щурів після часткової гепатектомії (ЧГЕ) та лапаратомії (ЛАП), які спричиняють, відповідно, перехід клітин печінки від спокою до проліферації та реакцію гострої фази. Вперше з'ясовано, що перехід клітин печінки від спокою до проліферації супроводжується ранньою активацією синтезу мРНК IFNб в клітинах Купфера з подальшою активацією в гепатоцитах синтезу Pkr-, Ifna1- та Ifnar1-специфічних мРНК. Показано, що реакція гострої фази в печінці після ЛАП супроводжується вираженим зниженням експресії генів Ifna1 та Pkr в клітинах Купфера. Встановлено, що активація синтезу IFNб після ЧГЕ не є максимально можливою через реакцію гострої фази. З'ясовано, що експресія генів Ifna1, Ifnar1, Pkr та їхня відповідь на ЧГЕ та ЛАП має клітинно-специфічний характер. Вперше доведено, що після ЧГЕ в гепатоцитах відбувається перерозподіл білка PKR між ядром і цитоплазмою з тимчасовим виявленням білка PKR тільки в цитоплазмі.

Ключові слова: інтерферон альфа, рецептор до інтерферону альфа (перша субодиниця, протеїнкіназа Р, часткова гепатектомія, лапаратомія.

АННОТАЦИЯ

Перепелюк М. М. Экспрессия генов интерферона альфа, первой субединицы его рецептора и протеинкиназы Р на раннем этапе регенерации печени крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2009.

Работа посвящена исследованию экспрессии генов, кодирующих IFN, рецептор IFN и протеинкиназу Р (PKR) в печени крыс после частичной гепатэктомии (ЧГЭ) и лапаратомии (ЛАП). Печень крыс после ЧГЭ и ЛАП использовали, соответственно, как модели регенерационного процесса и реакции острой фазы в ответ на повреждение, которая является составляющей регенерационного процесса.

Содержание белка IFN определяли по его антивирусной активности в суммарном гомогенате клеток печени, а относительное содержание Ifna1- и Ifn1-специфических мРНК - в суммарной РНК печени с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Показано, что в печени интактных крыс и крыс после ЧГЭ экспрессируется Ifna1-специфическая РНК и белок IFN. Ifn1-специфическая РНК не детектируется. ЧГЭ вызывает повышение уровня Ifna1-специфической РНК и белка в процессе перехода неактивной в пролиферативном отношении печени к пролиферации. ЛАП приводит к стремительному снижению экспрессии гена Ifna1, что определяется на уровне как мРНК, так и белка.

В количественном отношении повышение экспрессии гена Ifna1 в начале регенерационного процесса меньше максимально возможного, что показано в опытах со стимулятором синтеза IFN І типа, поли(И)-поли(Ц), что предположительно происходит из-за негативного вклада реакции острой фазы, которая является неотъемлемым компонентом регенерационного процесса. Показано, что печень является мощным продуцентом IFN І в интактных животных, а также крыс после ЧГЭ и введения поли (И)-поли(Ц).

Ввиду разнородности клеточного состава печени дальнейшие експерименты были проведены на выделенных клетках печени - гепатоцитах и клетках Купфера.

Методом полимеразной цепной реакии в реальном времени было показано, что гепатоциты и клетки Купфера, изолированные из интактной и послеоперационной печени, отличаются по содержанию специфических РНК.

Так, в тотальной РНК гепатоцитов из интактной печени содержание всех исследованных РНК (Ifnar1, Pkr, Rps12) за исключением РНК Ifna1 выше, чем в тотальной РНК из клеток Купфера. В клетках Купфера содержание Ifna1-специфической РНК в тотальной РНК в 2,5 раза выше, чем в гепатоцитах.

По содержанию в тотальной РНК исследуемые РНК располагаются в убывающей последовательности: Pkr>Rps12>Ifnar1>Ifna1(гепатоциты) и Rps12 ?Pkr >Ifna1>Ifnar1 (клетки Купфера). Содержание мРНК Ifna1 и Ifnar1 на мг тотальной РНК, приблизительно на порядок меньше, чем мРНК Pkr. Ifna1 и Ifnar, как гены цитокина и его рецептора, экспрессируются в сравнительно небольшой степени, что характерно для сигнальных молекул и их передатчиков.

На выделенных клетках печени было показано, что именно клетки Купфера отвечают за первичный кратковременный подъем экспрессии гена Ifna1, который соответствует профилю экспрессии гена Ifna1 в тотальной печени. После повышения экспрессии гена Ifna1в клетках Купфера возрастает количество Pkr-специфический мРНК. В это же время повышается содержание Pkr-РНК в гепатоцитах. Содержание мРНК рецептора к IFNб как в гепатоцитах, так и в клетках Купфера возрастает после повышения количества мРНК Ifna1.

На основании полученных данных нами предлагается следующая последовательность событий. ЧГЭ стимулирует активацию клеток Купфера и продукцию ими многогочисленных цитокинов, а среди них и интерферона. IFNб выделяется из клетки и паракринно действует на близлежащие гепатоциты. Так как в промоторе гена Pkr существует IFNб-респонсивная область, то в гепатоцитах запускается синтез мРНК Pkr. Так как известно, что белок PKR принимает участие в передаче стимулирующего сигнала к промотору интерферона, предполагается, что эндогенная PKR включает синтез IFNб в гепатоцитах. Повышение содержания мРНК Ifnar1, которое следует за повышением содержания Ifna1, носит опосредованный характер, так как ген Ifnar1 не имеет IFNб-респонсивного елемента.

После операции ЛАП происходит стремительное падение мРНК Ifna1 в клетках обоих типов. Уровень мРНК рецептора остается почти неизменным. Содержание Pkr-специфической мРНК характеризуется кратковременным повышением в клетках Купфера и значительным понижением в гепатоцитах.

Методом Вестерн-блот анализа было показано, что в гепатоцитах после обеих операций уровень белка PKR остается почти неизменным, в то же время уровень мРНК Pkr существенно изменяется. У клетках Купфера же изменения уровня белка четко коррелируют с процессами на уровне мРНК.

Методом иммуногистохимического анализа было определено, что после ЧГЭ происхоит перераспределение белка PKR в гепатоцитах. У интактных животных белок PKR определяется в ядре (46 %) и цитоплазме гепатоцитов (100% клеток). Через 6 часов после ЧГЭ белок не определяется в ядре, а только в цитоплазме. Через 12 часов после запуска регенерации печени PKR снова определяется в ядре. После ЛАП распределение белка между ядром и цитоплазмой существенно не меняется. Такая релокализация белка PKR возможно связана с выполнением им своих специфических функций в цитоплазме.

Таким образом, ответ со стороны экспрессии всех исследуемых генов в клетках обоих типов имеет выраженный клеточноспецифический характер и свидетельствует об активации и ингибировании системы IFNб соответственно в процессе восстановления печени после ЧГЭ и реакции острой фазы после ЛАП.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о значении IFNб и генов, которые им индуцируются, для прохождения процессов, вызванных ЧГЭ и ЛАП.

Ключевые слова: интерферон альфа, рецептор к интерферону альфа (первая субъединица), протеинкиназа Р, частичная гепатэктомия, лапаратомия.

SUMMARY

Perepelyuk М. М. Expression of genes that encode interferon alpha, first subunit of its receptor and protein kinase R during early stage of rat liver regeneration. - Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.03 - molecular biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

Expression of genes of Ifna1, Ifnar1 and Pkr have been studied in the rat liver after partial hepatectomy (PHE) and laparatomy (LAP), which induce liver cell transition from quiescence to proliferation and acute phase response, respectively. It has been revealed that the liver cell transition from quiescence to proliferation is accompanied by the short-term increase in Ifna1-specific mRNA in Kupffer cells, followed by increase of Pkr-, Ifna1- and Ifnar1-specific mRNAs in hepatocytes. In contrast, the liver-specific reaction of acute phase response after LAP manifests itself in steep down-regulation of Ifna1 and Pkr genes expression. Therefore activation of IFNб synthesis after PHE is not maximally possible because of acute phase response going in parallel. The expression of Ifna1, Ifnar1 and Pkr genes occurs in hepatocytes and Kupffer cells in cell-specific manner. It has been shown that PHE induces redistribution of PKR protein in hepatocytes between nuclei and cytoplasm, with its preferential localization in cytoplasm.

Key words: interferon alpha, receptor to interferon alpha (first subunit), protein kinase R, partial hepatectomy, laparatomy.

Размещено на Allbest.ru