Участь специфічних білків-акцепторів токоферолу в регуляції синтезу лейкотриєнів
Дослідження особливостей окисного метаболізму арахідонової кислоти за умов різного забезпечення організму токоферолом. Аналіз методів отримання комплексів токоферолу та токоферилхінону з токоферолзв’язуючими білками цитозольної фракції печінки щурів.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 14.09.2015 |
| Размер файла | 44,1 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Національна Академія Наук України
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН уКраїни
УДК 577.161.3
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Участь специфічних білків-акцепторів токоферолу в регуляції синтезу лейкотриєнів
03.00.04 - біохімія
Сілонов Сергій Борисович
Київ - 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м. Київ.
Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України Донченко Георгій Вікторович, завідувач відділу біохімії коферментів інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор, член-кор. НАН України та член-кор. АМН України Чекман Іван Сергійович, завідувач кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України;
кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Даценко Зоя Михайлівна, завідувач лабораторії технології біопрепаратів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Захист відбудеться “22” грудня 2008 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9.
Автореферат розісланий “20” листопада 2008 року.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Кірсенко О.В. арахідоновий токоферол цитозольний метаболізм
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Багаторічні численні дослідження показали, що -токоферол - це високоактивна життєво необхідна сполука, яка регулює широкий спектр біохімічних процесів, що забезпечують нормальне функціонування організму. Вітамін Е ефективний інгібітор активних форм кисню, він стабілізує структурно-функціональні властивості мембрани та справляє модулюючу дію на ферментні комплекси, пов'язані з механізмом оновлення мембранних структур, тим самим приймає участь у всіх трьох стадіях антиоксидантного захисту (M. Birringer (2001), Y. Saral (2002).
Дослідження властивостей біомембран та умов їх стабілізації показали, що -токоферол стабілізує структурно-функціональні властивості мембрани не лише завдяки своїм антиоксидантним властивостям, але і безпосередньо, взаємодіючи з їх компонентами (A.T. Diplock, J.A. Lucy (1973), В.І. Скрипін (1984).
В останні роки збільшилась кількість наукових робіт, що свідчать про безпосередню участь поліненасичених жирних кислот, зокрема арахідонової, у клітинних процесах регуляції діяльності різних ферментів, передачі клітинних сигналів та транспортуванні іонів (S. Clement (1997), E.A. Capper. (2001)). Мембрани клітин містять від 0,2 до 22 % арахідонової кислоти в етерифікованому вигляді у складі мембранних фосфоліпідів (S.A. Kliewer (1997), М.Г. Сергеева, (2006)). Вивільнення арахідонової кислоти відбувається під дією фосфоліпази А2 з подальшими ензиматичними перетвореннями, що ведуть до утворення лейкотриєнів та ліпоксинів, тромбоксанів, простагландинів та простациклінів, ейкозатетраєнових кислот (S.A. Kliewer (1997), A.A. Caro (2006), М.Г. Сергеева (2006)). До чинників, які впливають на властивості клітинних мембран та прискорюють вивільнення арахідонової кислоти, належать різні запальні та алергічні реакції, пошкодження тканин, гіпоксія, оксидативний стрес (J.K. Beckman, (1987), H. Fujishima (1999)).
Лейкотриєни є фізіологічно активними перекисами ліпідів, їх утворення відбувається внаслідок процесів перекисного окислення арахідонової кислоти, тому основний вплив на їх синтез здійснюється системами клітини. Метаболіти арахідонової кислоти за ліпоксигеназного шляху окислення - лейкотриєни В4, С4, D4 та Е4 - відіграють важливу роль в патогенезі ряду захворювань запальної та алергічної природи, порушеннях серцево-судинної системи, шокових станах, тому проблема вивчення механізмів контролю та регуляції біосинтезу цих медіаторів ліпідної природи з надзвичайно високою біологічною активністю є актуальною (Г.О. Камінська (1993), А. Сала (1998)). У зв'язку з цим значний інтерес становить дослідження процесів регуляції метаболізму лейкотриєнів.
Згідно з даними літератури і раніше отриманими експериментальними даними від-ділу біохімії коферментів встановлено, що в механізмах регуляції окисного метаболізму арахідонової кислоти важливе значення має -токоферол (Г.В. Донченко (1985), О.О. Капралов, Г.В. Донченко, Г.В. Петрова (2002), K. Schafer (2004), A. Fytianou (2006)).
На основі того, що в клітині концентрація токоферолу значно менша від тієї, що необхідна в системі in vitro для термінування реакцій перекисного окислення, було зроблене припущення про вплив -токоферолу на активність 5-ліпоксигенази у комплексі з токоферолзв'язуючими білками. Виходячи з цього важливим є вивчення механізму дії токоферолу на перетворення арахідонової кислоти за участі 5-ліпоксигенази (R. D. Conwell (1980), P. Reddann (1989)).
Наукові пошуки в даному напрямку надзвичайно важливі для розробки нових та модифікації існуючих способів впливу на перебіг процесів ліпоксигеназного окислення арахідонової кислоти, в результаті якого утворюються такі важливі медіатори запалення, як лейкотриєни.
Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в межах тематичних планів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (за проблемами “Біохімія людини і тварин” і “Молекулярна біологія”: теми № державної реєстрації. 01974004372 “Дослідження механізмів реалізації біологічної дії вітамінів, коферментів та їх специфічних білків-акцепторів в регуляції метаболізму спеціалізованих клітин” (1997-2001 рр.); № ДР 0102U000628 “Дослідження молекулярних механізмів взаємодії вітамінів, коферментів та їх білків-акцепторів в регуляції внутрішньоклітинного метаболізму в нормі та патології” (2002-2006 рр.), № ДР 0102U000628 “Дослідження молекулярних механізмів реалізації біологічної ролі вітамінів, коферментів та їхніх білків-акцепторів у забезпеченні функціонування та життєздатності клітин за норми та за умов деяких патологій” (2007-2011 рр.), № ДР 0107U003251 “З'ясування функціональної ролі специфічних білків-акцепторів вітамінів в клітинному метаболізмі”(2001-2003 рр.).
Мета досліджень та завдання. Основна мета досліджень полягає у з'ясуванні впливу токоферолу на окисний метаболізм арахідонової кислоти та біосинтез лейкотриєнів в організмі щурів в дослідах in vitro та in vivo.
Для досягнення поставленої мети необхідно виконати наступні завдання:
1). Вивчити in vivo стан обміну ліпідів в клітинах печінки щурів за умов моделювання Е-гіповітамінозу.
2). Дослідити in vivo особливості окисного метаболізму арахідонової кислоти за умов різного забезпечення організму -токоферолом.
3). Одержати комплекси токоферолу та токоферилхінону з токоферолзв'язуючими білками цитозольної фракції печінки щурів.
4). Вивчити вплив токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з білками-акцепторами на активність ферментів, що приймають участь у метаболізмі лейкотриєнів in vitro.
Об'єкти досліджень: кров, тканина печінки щурів.
Предмет досліджень:перебіг метаболічних перетворень арахідонової кислоти при участі ліпоксигенази за умов різної забезпеченості організму токоферолом.
Методи досліджень:хроматографічні (тонкошарова, гель-фільтрація, високоефективна рідинна, газова), спектрофотометричні, ензиматичні, імунологічні, фізико-хімічні, потенціометричні, ультрацентрифугування.
Наукова новизна одержаних результатів. Застосовуючи різні підходи було показано, що:
1). при моделюванні стану Е-гіповітамінозу за умов недостатнього забезпечення організму щурів токоферолом встановлено зниження рівня цистеїніл лейкотриєнів у крові, де відбувається їх синтез, і печінці, яка приймає участь в їх подальших перетвореннях та утилізації. При корекції рівня -токоферолу в організмі тварин у печінці спостерігається підвищення вмісту загальних та індивідуальних цистеїніл лейкотриєнів, що може свідчити про дію токоферолу на інтенсивність обміну цистеїніл лейкотриєнів;
2). В дослідах in vitro при вивченні впливу токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів із специфічними токоферолзв'язуючими білками (ТЗБ) на активність ферментів, які приймають участь у метаболізмі лейкотриєнів вперше встановлено, що токоферол, токоферилхінон і особливо їх комплекси з ТЗБ гальмують активність 5-ліпоксигенази, яка приймає участь у перетворенні арахідонової кислоти до лейкотриєну А4. комплекси токоферолу та токоферилхінону з ТЗБ підвищують активність лейкотрієн-А4-гідролази, що супроводжується збільшенням вмісту лейкотриєну В4. Токоферол та його комплекс з ТЗБ, стимулюючи активність лейкотрієн-С4-синтази, активують утворення першого у ланцюгу цистеїніл лейкотриєнів лейкотриєну С4. Дані, одержані в дослідах іn vitro та in vivo відзначаються новизною та свідчать про те, що обмін лейкотриєнів залежить від рівня забезпечення організму токоферолом.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати щодо механізму реалізації впливу токоферолу на перетворення арахідонової кислоти за 5-ліпоксигеназним шляхом її окислення мають значний прикладний інтерес. Вони свідчать про те, що рівень токоферолу в організмі є важливим регулюючим чинником обміну лейкотриєнів - медіаторів запальних процесів. Одержані дані також можуть бути використані для створення нової групи фармакологічних препаратів, здатних впливати на тривалість та перебіг запальних процесів, а також використовуються у лекціях з курсів “Біохімія” та “Біохімія вітамінів та коферментів” на кафедрах біотехнології Київського національного університету ім. Т.Шевченка та біології Національного університету ”Києво-Могилянська академія”.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження є самостійною роботою автора. Автором проаналізовано літературу з теми дослідження, проведено експериментальну частину роботи, здійснено статистичну обробку одержаних результатів, оформлено дисертаційну роботу. Аналіз одержаних результатів, формулювання основних положень та висновки дисертаційного дослідження обговорювалися спільно з науковим керівником. Друковані праці підготовлені за безпосередньої участі автора.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на VІ Українському біохімічному з'їзді (м. Київ, 1996.), NATO Advanced Study Institute Co-sponsored by FEBS “Free Radicals, Oxidative Stress and Antioxidants. Pathological and Physiological Significance” (Turkey, Antalia, 1997.), 17 Internationаl Congress of Biochemistry and molecular Biology in conjunction with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and molecular Biology” (San Francisco, California, 1997.), VІ міжнародній конференції “Біоантиоксидант” (м. Москва, 2002.), VІІІ Українському біохімічному з'їзді (м. Чернівці, 2002.), 5th Parnas Conference “Molecular Mechanismes of Cellular Signaling” (Kyiv, 2005.), ІХ Українському біохімічному з'їзді (м. Харків, 2006.), Республиканской научной конференции “Молекулярная медицина и биохимическая фармакология” (Білорусь, м. Гродно, 2007).
Публікації. Результати досліджень опубліковані в 5 статтях у наукових фахових виданнях та 11 тезах доповідей у збірках наукових конференцій.
Структура та об'єм дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, обґрунтування моделі досліджень, методів досліджень, результатів досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, переліку використаних джерел. Робота викладена на 146 сторінках основного тексту, містить 13 таблиць, 20 рисунків та 4 схеми. Список використаних джерел включає 287, в тому числі зарубіжних авторів 245.
Основний зміст роботи
Огляд літератури. Розглянуто функції вітаміну Е та його вплив на ліпоксигеназний шлях окисного метаболізму арахідонової кислоти та активність ферментативних процесів перекисного окислення ліпідів, що призводять до утворення біологічно активних медіаторів запалення - лейкотриєнів.
Матеріали та методи досліджень. Для досягнення поставленої мети і вирішення поставлених задач було створено експериментальні моделі in vivo та in vitro. Нашим завданням було змоделювати стан Е-гіповітамінозу у щурів та дослідити склад ліпідів печінки щурів за умов різного рівня забезпечення вітаміном Е. Для проведення експерименту in vitro одержано комплекси токоферолу та токоферилхінону з токоферолзв'язуючими білками з цитозолю печінки щурів (самці лінії Вістар масою 130-250 г, які утримувались у стандартних умовах віварію при відповідному освітленні та годуванні ad libitum), та досліджено дію токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з токоферолзв'язуючими білками на активність ферментів метаболізму арахідонової кислоти за ліпоксигеназного шляху її перетворення.
У дослідах in vivo використовували самців щурів масою 40-50 г, які утримувались на Е-гіповітамінозному раціоні А40 (Edwin E.E. 1961), дефіцитному на токоферол, протягом 70 діб. В досліді було 3 групи тварин: 1- тварини контрольної групи, яким в раціон додавався токоферол у кількості 100 мг/кг дієти (з розрахунку 10 г на 1 тварину на добу), 2- група тварин, що утримувались на Е-гіповітамінозному раціоні, 3- група тварин, яким проводили корекцію стану Е-гіповітамінозу (60-70 доба) веденням per os (через зонд) 1 мг токоферолу /100 г маси тіла. Критерієм якості створеної моделі Е-гіповітамінозу було вірогідне зниження вмісту токоферолу в печінці (Донченко Г.В., 1988) та зниження Са2+ в сироватці крові, що свідчить про ушкодження механізмів регуляції клітинного метаболізму за тривалої нестачі токоферолу в організмі дослідних тварин.
Вміст холестеролу та жирних кислот визначали за методом (Гольдберг К.А., 1974), фосфоліпідів шляхом тонкошарової хроматографії (Svetashev V.I., 1972).
Фракцію токоферолзв'язуючих білків отримували з цитозолю печінки щурів шляхом гель-фільтрації (Catignani L.I., 1980) на колонці 3х90 см, з Toyoperl M-90, швидкість елюції 0,8 мл / хв, =280 нм. використовували 2-й пік з подальшим зв'язуванням з токоферолом, токоферилхіноном у спеціальній перфузійній камері (Пархомець В.П., 1993).
Визначення активності ферментів: арахідонат-5-ліпоксигенази (Клаус Д., 1990) проводилося за методикою (Ochi K., 1983), соєвої лінолеат-5-ліпоксигенази за методикою (Powell W.S., 1980), лейкотрієн-А4-гідролази (Orning L., 1994) за методикою (Radmark O., 1984), лейкотриєн-С4-синтетази (Penrose J.F., 1992) за методикою (Nicholson D.W., 1992).
Дослідження вмісту сумарних та індивідуальних цистеїніл лейкотриєнів (Anderson W.H., 1983) проводили шляхом імуноферментного аналізу (Isono T., 1985) з використанням Biotrak TM лейкотриєн C4/D4/E4 імуноферментної системи Amersham Pharmacia Biotech.
Результати досліджень
Склад ліпідів печінки щурів за умов різного забезпечення вітаміном Е. вітамін-Е недостатність у тварин і людини супроводжується порушенням обміну Са2+. Оскільки ліпоксигеназний шлях перетворень арахідонової кислоти є Са2+ залежний, доцільним було визначити його вміст у крові всіх піддослідних тварин. З метою оцінки стану Е гіповітамінозу дослідних тварин було проведено дослідження вмісту токоферолу в печінці та Са2+ в крові щурів всіх груп.
Встановлено 2-х разове зниження рівня токоферолу в печінці та на 17% Са 2+ в крові тварин за умов Е-авітамінознозу порівняно з контрольними тваринами, але за умов корекції рівень токоферолу та Са2+ наближається до рівня контролю. Вірогідне зниження вмісту кальцію за Е-гіповітамінозу свідчить про ушкодження механізмів регуляції клітинного метаболізму за тривалої нестачі токоферолу в організмі. Одержані дані підтверджують, що у щурів за створених умов досліду спостерігається стан Е-гіповітамінозу.
У формуванні ліпідного матриксу біомембран важливе значення мають фізико-хімічні властивості ліпідних компонентів. Холестерол, фосфоліпіди та жирні кислоти є структурними компонентами мембран і важливими біорегуляторами, що відіграють значну роль в адаптаційних реакціях організму, регулюючи проникність та рідинність мембран. Тому важливо було встановити вплив тривалої нестачі токоферолу в організмі на вміст даних компонентів в печінці щурів.
Встановлено, що за Е-гіповітамінозу в печінці щурів знижується рівень холестеролу та загальних фосфоліпідів на 27%, тоді як за умов корекції токоферолом рівень холестеролу збільшується на 61% щодо контролю, а фосфоліпідів вірогідно не змінюється. І хоча вміст загальних фосфоліпідів не змінювався за умов корекції -токоферолом, логічно виникає інтерес дослідити рівень жирних кислот, що входять до складу фосфоліпідів за умов різної забезпеченості організму токоферолом (табл. 1), зокрема тих, які задіяні у процесах ліпідного поліморфізму.
За фізіологічних умов жирні кислоти знаходяться в основному у зв'язаному стані, кількість вільних жирних кислот надзвичайно мала і підвищений їх вміст є токсичним для функціональної активності клітин різних типів. Оскільки вітамін Е - це природний антиоксидант, а арахідонова кислота знаходиться в клітині у складі фосфоліпідів і дуже чутлива до процесів окислення, важливим є визначення її вмісту, а також інших поліненасичених жирних кислот в клітині за умов різної забезпеченості організму вітаміном Е.
Таблиця 1. Вміст жирних кислот фосфоліпідної фракції печінки щурів за умов різного забезпечення тварин вітаміном Е (М±м, n=6, мг./ 100 г).
|
Назва |
Контроль |
Е-гіповітаміноз |
Корекція |
||
|
1. |
14:0 Міристинова С13Н27СООН |
0,14±0,006 |
- |
0,07±0,002 |
|
|
2. |
15:0 Пентадецилова С14Н29СООН |
0,09±0,004 |
- |
0,07±0,003 |
|
|
3. |
16:0 Пальмітинова С15Н31СООН |
19,44±1,64 |
18,45±0,94 |
17,88±1,88 |
|
|
4. |
16:1 Пальмітолеїнова С15Н29СООН |
1,16±0,25 |
0,37±0,08* |
0,33±0,07* |
|
|
5. |
17:0 Маргаринова С16Н33СООН |
0,40±0,09 |
0,47±0,09 |
0,56±0,08 |
|
|
6. |
17:0 Гептадеценова С16Н31СООН |
0,05±0,009 |
- |
0,06±0,010 |
|
|
7. |
і-18:0 і-Стеаринова С11Н23СООН |
0,10±0,009 |
- |
0,06±0,005 |
|
|
8. |
18:0 Стеаринова С17Н35СООН |
22,12±1,54 |
29,66±1,46* |
26,76±4,56 |
|
|
9. |
18:1 Олеїнова С17Н33СООН |
14,59±0,06 |
11,41±1.33 |
12,64±1,55 |
|
|
10. |
18:2 Лінолева С17Н31СООН |
8,60±0,28 |
7,09±0,39* |
7,41±0,38* |
|
|
11. |
18:3 Ліноленова С17Н29СООН |
0,09±0,006 |
0,11±0,010 |
0,08±0,005 |
|
|
12. |
20:0 Арахінова С19Н39 СООН |
0,56±0,039 |
0,24±0,012* |
0,38±0,051 |
|
|
13. |
20:3 Ейкозатриєнова С19Н35СООН |
0,55±0,015 |
0,52±0,070 |
0,64±0,093 |
|
|
14. |
20:4 Арахідонова С19Н33СООН |
24,50±1,17 |
20,89±1,32* |
24,31±1,90 |
|
|
15. |
21:0 Генеікозанова С20Н41СООН |
0,13±0,019 |
0,07±0,010 |
0,03±0,009 |
|
|
16. |
22:0 Бегенова С21Н43СООН |
1,04±0,021 |
0,61±0,010* |
0,55±0,072* |
|
|
17. |
22:1 Ерукова С21Н41СООН |
0,22±0,009 |
0,09±0,006* |
0,11±0,008* |
|
|
18. |
22:3 Докозатриєнова С21Н37СООН |
1,19±0,002 |
0,36±0,015* |
0,74±0,030* |
|
|
19. |
22:5 Докозапентаєнова С21Н33СООН |
2,41±0,084 |
2,23±0,053 |
2,71±0,052 |
|
|
20. |
22:6 Докозагексаєнова С21Н31СООН |
4,18±0.87 |
3,34±0,44 |
4,37±0,92 |
*P<0.05 відносно контролю
В подальших дослідженнях ми з'ясовували, як впливає нестача вітаміну Е в організмі на вміст жирних кислот, що входять до складу фосфоліпідів печінки щурів (табл. 1).
Як видно з одержаних даних, сумарна кількість жирних кислот не зазнає вірогідних змін за досліджуваних умов. За умов Е-гіповітамінозу кількість стеаринової кислоти достовірно збільшується, арахінової та бегенової знижується на 57% та 41% відповідно, сумарний вміст насичених жирних кислот (міристинової, пальмітинової, стеаринової, арахінової та бегенової) не зазнає вірогідних змін, тоді як ненасичених (пальмітолеїнова, лінолевої, арахідонової) вірогідно знижується, а загальна їх кількість знижується на 18%. За умов корекції вітаміном Е вміст стеаринової кислоти повертається до рівню контролю, сумарний вміст насичених жирних кислот знаходиться в межах контролю; знижується вміст ненасичених жирних кислот - пальмітолеїнової, ерукової та докозатриєнової, загальна їх кількість суттєво не відрізняється від значень контролю.
Одержані дані свідчать про те, що нестача вітаміну Е в організмі викликає відносне зниження загальної кількості ненасичених жирних кислот, порушення співвідношення таких жирних кислот, як арахідонова/докозагексаєнова (АК/ДКГ) та 6/3 фосфоліпідної фракції печінки, але після введення токоферолу спостерігається тенденція до нормалізації їх рівня. Отже за Е-гіповітамінозу відбуваються певні зміни у жирнокислотному спектрі печінки щурів, вмісті холестеролу та індивідуальних фосфоліпідів, що може відігравати суттєву роль в розвитку пошкоджень клітини.
Активність ферментів метаболізму арахідонової кислоти за умов дії -токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з токоферолзв'язуючими білками в дослідах in vitro.
Зв'язування токоферолу та токоферилхінону специфічними цитоплазматичними білками печінки щурів. Для дослідження впливу токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з токоферолзв'язуючими білками на обмін лейкотриєнів в дослідах in vitro було виділено цитозольну фракцію (-токоферолзв'язуючий білковий фактор Катігнані) та одержано комплекси токоферолу та токоферилхінону з ТЗБ.
Для визначення зв'язування токоферолу з ТЗБ з цитозолю печінки щурів використовували мічений за тритієм токоферол, який вводили в гідрофобний шар у спеціальній перфузійній камері та проводили інкубацію. Кількість перенесеного в нижній відсік камери ізотопу складала 4% від внесеного в гідрофобний шар. Розрахунок проводили за тритієвою міткою, як контроль використовувалося гідрофобне середовище без додавання токоферолу. Для визначення ефективності зв'язування токоферолу з тзб отриманий після вказаної процедури зв'язування з міченим токоферолом розчин цитозольних білків піддавали гель-фільтрації на колонці Sephadex G-150, визначали концентрацію білка та радіоактивність.
Як видно з наведених даних, пік виходу міченого токоферолу співпадає з другим піком білка після вільного виходу. Виходячи з цього, можна зробити висновок, що в розчині присутній комплекс токоферолу з ТЗБ. Одержані результати співпадають з даними літератури і свідчать про те, що білок, виділений із цитоплазми клітин печінки щурів, зв'язує мічений 3H-токоферол in vitro з високим ступенем спорідненості.
Активність арахідонат-5-ліпоксигенази за умов дії б-токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з токоферолзв'язуючими білками. встановлено, що присутність в інкубаційному середовищі токоферолу викликає достовірне зниження активності 5-ліпоксигенази, а при додаванні комплексів токоферолу (рис 4) та токоферилхінону з ТЗБ (рис 5) активність ферменту різко гальмується, і залишок її складає лише 7-5 % від контролю. Вільний токоферилхінон також проявляє вірогідний ефект, але вплив його на активність досліджуваного ферменту менш виражений.
Розраховані кінетичні константи Km і Vmax, що характеризують зміни активності арахідонат-5-ліпоксигенази наведені в таблиці 2.
отримані результати свідчать про значний інгібіторний вплив комплексів б-токоферолу і токоферилхінону на активність арахідонат-5-ліпоксигенази. Виявлена подібність дії комплексів токоферолу та токоферилхінону з ТЗБ на активність арахідонат-5-ліпоксигенази свідчить про можливість їх впливу на фермент за механізмом, відмінним від антиоксидантного. комплекси б-токоферолу та токоферилхінону з ТЗБ виявилися більш ефективними інгібіторами активності арахідонат-5-ліпоксигенази, ніж вільні б-токоферол та токоферилхінон. Ці дані свідчать про модулюючу дію токоферолу та токоферилхінону в комплексі з ТЗБ на активність арахідонат-5-ліпоксигенази.
Таблиця 2. Кінетичні характеристики арахідонат 5-ліпоксигеназної реакції (М±m, n = 5)
|
Км, мкМ |
Vmax, нмоль/хв/мг білка |
N коефіцієнт Хілла |
||
|
Контроль |
16±3 |
1006±5 |
1,920,10 |
|
|
Контроль+ б-токоферол |
26±3* |
813±10* |
1,100,06 |
|
|
Контроль+ токоферилхінон |
20±4 |
892±15* |
1,510,08 |
|
|
Контроль+ б-токоферол-ТЗБ |
16±2 |
72±10* |
1,340,08 |
|
|
Контроль+ токоферилхінон-ТЗБ |
15±3 |
59±8* |
1,310,07 |
*P<0.05 відносно контролю
Активність соєвої лінолеат-5-ліпоксигенази за умов дії б-токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з токоферолзв'язуючими білками. Встановлено, що комплекси токоферолу та токоферилхінону з ТЗБ ефективніше гальмують активність соєвої лінолеат-5-ліпоксигенази, ніж вільні токоферол та токоферилхінон.
Розраховані кінетичні константи, що характеризують зміни активності соєвої 5-ліпоксигенази, наведено в табл. 3.
Таблиця 3. Кінетичні характеристики активності лінолеат-5-ліпоксигенази (М±m, n=6).
|
Км, мкМ |
Vmax, мкмоль /хв/мг білка |
N коефіцієнт Хілла |
||
|
Контроль |
1,20±0,097 |
51,73±2,5 |
1,010,06 |
|
|
Контроль+ б-токоферол |
1,31±0,070 |
12,28±0,7* |
1,950,11 |
|
|
Контроль+ токоферилхінон |
1,47±0,108 |
33,08±3,4* |
2,750,21 |
|
|
Контроль+ комплекс б-токоферол-ТЗБ |
0,42±0,045** |
3,47±1,1** |
0,980,06 |
|
|
Контроль+комплекс токоферилхінон-ТЗБ |
0,56±0,053** |
3,44±1,0** |
1,820,10 |
*P<0.05 відносно контролю; **P<0.05 відносно -токоферолу (токоферилхінону)
пригнічення активності соєвої 5-ліпоксигенази комплексами токоферолу і токоферилхінону з ТЗБ виражене яскравіше, ніж власне токоферолом і токоферилхіноном.
Отже, незалежно від генезу ліпоксигенази її активність гальмується вільним токоферолом, токоферилхіноном і особливо значний гальмівний ефект спостерігається при дії їх комплексів з ТЗБ. б-токоферол та б-токоферилхінон в комплексі з ТЗБ тваринного походження справляють більш виражений інгібіторний вплив на активність соєвої 5-ліпоксигенази, ніж на фермент тваринного походження. Вільний токоферилхінон також гальмує активність як тваринної, так і рослинної ліпоксигенази, хоч дещо слабше від токоферолу.
Наші дослідження співпали з даними Reddanna (1989) стосовно того, що вплив -токоферолу і токоферилхінону на активність ферменту пов'язаний не лише з їх антиоксидантними властивостями, а значною мірою зумовлюється їх специфічною взаємодією з білками-ефекторами.
Активність лейкотриєн-А4-гідролази за умов дії б-токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з токоферолзв'язуючими білками.
Встановлено, що вільний токоферол та токоферилхінон не викликають вірогідних змін активності лейкотриєн-А4-гідролази, а їх комплекси з ТЗБ підвищують її активність відповідно на 33% та 29% відносно контролю. Одержані результати свідчать про те, що комплекси токоферолу та токоферилхінону з ТЗБ проявляють односпрямований, але більш виражений вплив на активність лейкотриєн-А4-гідролази, ніж вільні токоферол та токоферилхінон (табл.4).
Таблиця 4. Кінетичні характеристики лейкотриєн-А4-гідролазної реакції (М±m, n = 5)
|
Км, мкМ |
Vmax, нмоль/хв/мг білка |
N коефіцієнт Хілла |
||
|
Контроль |
3,0±0.4 |
7,0±0,5 |
1,230,07 |
|
|
Контроль +-токоферол |
2.5±0.6 |
7,5±0,5 |
1,530,09 |
|
|
Контроль +токоферилхінон |
2.5±0.6 |
6,0±0,6 |
1,280,08 |
|
|
Контроль+комплекс б-токоферол-ТЗБ |
2.5±0.4 |
9,3±0.4* |
1,260,07 |
|
|
Контроль+комплекс токоферилхінон-ТЗБ |
3,0±0.8 |
9,0±0.5* |
1,080,06 |
*P<0.05 відносно контролю
Ні вільний б-токоферол, ні токоферилхінон не спричиняють значного впливу на активність лейкотриєн-А4-гідролазної реакції, а їх комплекси з ТЗБ вірогідно підвищують її швидкість. Одержані результати дають можливість припустити, що за дії комплексів токоферолу та токоферилхінону з ТЗБ створюються належні умови для активації перетворення лейкотриєну А4 в лейкотриєн В4 за участі лейкотриєн-А4-гідролази, а значить відбувається опосередкований через ТЗБ вплив на перебіг гідролазної реакції.
Активність лейкотриєн-С4-синтази за умов дії б-токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з токоферолзв'язуючими білками. при дослідженні дії токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з білками - акцепторами на активність лейкотриєн-С4-синтази мікросомальної фракції печінки щурів було з'ясовано, що при додаванні вільного токоферолу спостерігається вірогідне підвищення на 15% активності мікросомальної лейкотриєн-С4-синтази, а його комплекс з ТЗБ підвищує на 33% швидкість перетворення лейкотриєну А4 в лейкотриєн С4, про що свідчить зростання активності лейкотриєн-С4 -синтази. Внесення до інкубаційного середовища токоферилхінону та його комплексу з ТЗБ не впливає вірогідно на активність лейкотриєн-С4-синтази.
Таким чином, вплив токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з ТЗБ на активність ферментів, таких як 5-ліпоксигеназа, лейкотриєн-А4-гідролаза та лейкотриєн-С4-синтаза, що приймають участь в послідовному перетворенні лейкотриєнів, відрізняється за інтенсивністю та спрямованістю дії. Найбільш вираженою дією з поміж них відрізняється комплекс токоферолу з ТЗБ. Це дозволяє висловити припущення про участь токоферолу, токоферилхінону і значною мірою їх комплексів з цитоплазматичними білками-акцепторами в процесах регуляції синтезу лейкотриєнів в організмі.
Внесення до інкубаційного середовища токоферилхінону та його комплексу з ТЗБ не впливає вірогідно на активність лейкотриєн-С4-синтази.
Таким чином, вплив токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з ТЗБ на активність ферментів, таких як 5-ліпоксигеназа, лейкотриєн-А4-гідролаза та лейкотриєн-С4-синтаза, що приймають участь в послідовному перетворенні лейкотриєнів, відрізняється за інтенсивністю та спрямованістю дії. Найбільш вираженою дією з поміж них відрізняється комплекс токоферолу з ТЗБ. Це дозволяє висловити припущення про участь токоферолу, токоферилхінону і значною мірою їх комплексів з цитоплазматичними білками-акцепторами в процесах регуляції синтезу лейкотриєнів в організмі.
Так як припускають, що лейкотриєн-С4-синтаза є одним з ізоферментів мікросомальної глутатіон-S-трансферази, вивчали дію токоферолу, токоферилхінону та їх комплексів з ТЗБ на активність мікросомальної та цитозольної глутатіон-S-трансферази. Встановлено, що досліджувані чинники справляють подібний вплив на активність мікросомальної глутатіон-S-трансферази та лейкотриєн-С4-синтази і гальмують активність глутатіон-S-трансферази цитозолю незалежно від природи досліджуваних чинників. Одержані дані дозволяють вважати, що активність мікросомальної глутатіон-S-трансферази включає в себе і активність лейкотриєн-С4-синтази. Тим самим в подальших дослідженнях ми припускаємо можливість використання цього показника як певне відображення активності лейкотриєн-С4-синтази в обговоренні метаболізму лейкотриєнів.
Метаболізм лейкотриєнів в організмі щурів за умов Е-гіповітамінозу. В проведених нами дослідженнях з визначення вмісту арахідонової кислоти у фракції фосфоліпідів печінки щурів було встановлено вірогідне зниження її рівня за умов Е-гіповітамінозу на тлі двократного зниження рівня б-токоферолу. Введення б-токоферолу супроводжувалося поверненням вмісту арахідонової кислоти до рівня контролю. Одержане зниження вмісту арахідонової кислоти за умов значного зниження вмісту б-токоферолу співпадає з даними літератури, де в дослідах in vіvo та in vitro встановлено вплив б-токоферолу і його аналогів на метаболізм арахідонової кислоти (P. Reddann (1989, Y. Takenaka (1991). За умов Е-гіповітамінозу знижується кількість лінолевої та ейкозатетраєнової, та підвищується рівень ліноленової кислот (табл. 1), які приймають участь у синтезі арахідонової кислоти. Напевне, змінами рівня попередників також зумовлюється зниження її рівня в наших дослідженнях.
за Е-гіповітамінозу рівень цистеїніл лейкотриєнів знижувався на 30% порівняно з контролем і повертався до норми при додаванні токоферолу. В крові рівень сумарних цистеїніл лейкотриєнів знижується на 10% відносно контролю. При корекції їх вміст в печінці знаходився в межах контролю.
Дані про кількість індивідуальних цистеїніл лейкотрієнів було отримано при розділенні пулу лейкотрієнів методом високоефективної рідинної хроматографії з використанням зворотно-фазової колонки Beskman ODS C18.
Результати імуноферментного аналізу індивідуальних цистеїніл лейкотриєнів наведено в табл. 5.
Таблиця 5. Вміст цистеїніл лейкотриєнів (С4,D4,Е4) в печінці щурів за умов Е-гіповітамінозу (М± m, n=5, нг/г печінки)
|
Показники |
Контроль |
Е-гіповітаміноз |
Корекція |
|
|
Лейкотриєн С4 |
5,56 ±0,25 |
4,98±0,29* |
6,26±0,48** |
|
|
Лейкотриєн D4 |
2,34±0,22 |
2,07±0,12* |
4,44±0,35*** |
|
|
Лейкотриєн Е4 |
6,73±0,15 |
6,86±0,12 |
10,94±0,39*** |
*P<0.05 відносно контролю; **P<0.05 відносно Е - гіповітамінозу
за умов е-гіповітамінозу в печінці відбувається кількісне зниження лейкотриєнів С4'на 11%, D4 - на 12% при незмінному рівні Е4. При корекції токоферолом спостерігається зростання кількості всіх фракцій цистеїніл лейкотриєнів, зокрема вміст лейкотриєну С4 зростає на 26% в порівнянні зі станом Е-гіповітамінозу та на 13% перевищує контроль. Вміст лейкотриєну D4 зростає в 2,14 рази відносно гіповітамінозу і в 1,9 рази щодо контролю, а рівень лейкотриєну Е4 підвищується на 60% порівняно з Е-гіповітамінозом і на 63% відносно контролю.
В крові, як і в печінці, також спостерігається зниження вмісту лейкотриєну С4 на 11%, рівень лейкотриєну D4 знижується на 23%, що нижче, ніж в печінці, а лейкотриєну E4 - на 12% в той час як в печінці він залишається без змін (табл.6).
Таблиця 6. Вміст цистеїніл лейкотриєнів в крові щурів за умов Е- гіповітамінозу (Мm, n=3)
|
Контроль |
Е- гіповітаміноз |
||
|
Лейкотриєн С4 (нг/мл) |
2,580,29 |
2,280,09* |
|
|
Лейкотриєн D4 (нг/мл) |
1,870,23 |
1,450,21* |
|
|
Лейкотриєн Е4 (нг/мл) |
1,810,12 |
1,590,17* |
|
|
Лейкотриєн С4-E4(нг/мл) |
9,680,37 |
8,680,12* |
*P<0.05 відносно контролю
В наших дослідженнях недостатність вітаміну Е викликає зниження як синтезу сумарних лейкотриєнів, про що свідчить їх рівень у крові, так і прискорення їх розпаду та секреції - зниження їх вмісту в печінці. Звертає на себе увагу гальмування утворення всіх лейкотриєнів, особливо лейкотриєну D4. При розпаді лейкотриєнів відмічається, що лейкотриєн Е4 меншою мірою, ніж інші цистеїніл лейкотриєни, реагує на зниження вмісту токоферолу в організмі. Зростання вмісту як сумарних, так і індивідуальних лейкотриєнів за умов корекції підтверджують участь токоферолу в окисному метаболізмі арахідонової кислоти за ліпоксигеназного її перетворення.
Висновки
1. Виходячи з недостатньої з'ясованості молекулярних механізмів дії вітаміну Е на живі організми проведено дослідження впливу -токоферолу та його метаболіту -токоферилхінону на ліпоксигеназний шлях перетворення арахідонової кислоти. В умовах in vitro з'ясовано можливість взаємодії токоферолу та токоферилхінону з токоферолзв'язуючими білками на активність ферментів 5-ліпоксигеназного шляху перетворення арахідонової кислоти, та на моделі Е-гіповітамінозу в дослідах in vivo встановлено дію -токоферолу на рівень лейкотрієнів.
2. За Е-гіповітамінозу в печінці щурів знижується вміст холестеролу і сумарних фосфоліпідів та вірогідно зростає рівень фосфатидихоліну, лізофосфатидил-холіну, фосфатидилетаноламіну, а також знижується вміст кардіоліпіну, змінюється вміст жирних кислот фосфоліпідної фракції печінки щурів: спостерігається підвищення вмісту стеаринової, зниження гексадодецилової, олеїнової та лінолевої, арахідонової кислот. При корекції -токоферолом рівень холестеролу підвищується, відбувається зниження лізофосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну та підвищення фосфатидилсерину. За цих умов вміст стеаринової та арахідонової кислот знаходиться в межах контролю, а олеїнової та лінолевої - виявляється дещо нижчим.
3. Е-гіповітаміноз призводить до зниження вмісту загальних цистеїніл лейкотриєнів (в печінці на 30%, крові на 10%), рівня індивідуальних лейкотриєнів в печінці (С4 - на 11%, D4 - на 12%, E4 - не змінюється), а також активності глутатіон-S-трансферази мікросом на 68%. В крові має місце зниження кількості лейкотриєну С4 на 11%, D4 - на 23%, E4 - на 12%. При корекції терапевтичною дозою токоферолу рівень сумарних та індивідуальних лейкотриєнів та активності глутатіон-S-трансферази перевищує контроль, що свідчить про участь -токоферолу та його метаболіту -токоферилхінону в 5-ліпоксигеназному шляху окисного метаболізму арахідонової кислоти та впливу їх на кінцевий спектр лейкотриєнів.
4. -токоферол in vitro вірогідно знижує активність арахідонат-5-ліпоксигенази, а токоферилхiнон не проявляє такого впливу на активність ферменту. Комплекси токоферолу і токоферилхінону з токоферол-зв'язуючими білками інгібують активність ферменту в 14 та 17 разів відповідно порівняно з контролем.
5. В дослідах in vitro з'ясовано, що за впливу токоферолу в 3,4 рази знижується активнiсть соєвої лінолеат-5-ліпоксигенази, при дії токоферилхінону на 36%, а за впливу комплексів токоферолу з токоферолзв'язуючими білками активність ферменту знижується в 15 разів порівняно з контролем.
6. б-токоферол та б-токоферилхінон не впливають на активність лейкотриєн-А4-гідролази, а комплекси б-токоферолу та б-токоферилхінону з токоферолзв'язуючими білками викликають зростання активності ферменту на 33 % та 29% відповідно.
7. -токоферол та його комплекс з токоферолзв'язуючими білками підвищує активність лейкотриєн-С4-синтази на 15% та 33% відповідно, б-токоферилхінон, як і його комплекс з токоферолзв'язуючими білками, не викликають змін активності цього ферменту in vitro.
8. При концентрації глутатіону 5 мкмоль б-токоферол та б-токоферилхінон викликають підвищення активності мікросомальної глутатіон-S-трансферази ( на 75% та 45% відповідно), а у комплексі з білками акцепторами підвищують активність ферменту при концентраціях глутатіону вищих 10 мкмоль на 28% та 31 % відповідно. зростання рівня глутатіону викликає вірогідне зниження активності ферменту цитозольної фракції печінки щурів, яке спостерігається при дії кожного з досліджуваних чинників незалежно від їх природи.
9. -токоферол реалізує свою дію на активність ферментів 5-ліпоксигеназного шляху окисного метаболізму арахідонової кислоти за участю специфічних токоферолзв'язуючих білків. Доведено експериментально вплив б-токоферолу, б-токоферилхінону та їх комплексів з білками-акцепторами на перебіг ферментативних реакцій ПОЛ за ліпоксигеназного метаболізму арахідонової кислоти.
Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації
1.Пархомець в.п., палівода О.М., Сілонов C.Б., Геблер І.О., Нартіков О.В., Донченко Г.В. Вплив комплексу токоферолу з білками зв'язуючими токоферол на активність лейкотрієн А4 гідроксилази. // Вісник проблем біології і медицини.-1999. - №4.-С.39-42.
2.Пархомець В.П., Сілонов С.Б., Донченко Г.В. Вплив a-токоферолу, токоферилхінону та їхніх комплексів з токоферолзв'язуючими білками на активність ферментів метаболізму арахідонової кислоти. // Укр.біохім.журн. - 2001. - 73, №1.- С. 43-47.
3.Пархомець В.П., Донченко Г.В., Сілонов С.Б., Палівода О.М., Нартіков О.В., Геблер І.О. Вплив комплексів токоферолу та токоферилхінону з білками, що їх зв'язують, на активність лейкотрієн В4 ліпоксигенази. //Укр.біохім.журн.- 2001. - 73, №6. - С. 50-55.
4.Сілонов С.Б., Донченко Г.В., Морозова Р.П. Особливості обміну лейкотриєнів в організмі щурів за умов Е-гіповітамінозу. // Укр.біохім.журн.- 2008. - 80, №1. - С. 26-32.
5.Сілонов С.Б., Донченко Г.В., Морозова Р.П., Нартіков О.В. Цистеїніл лейкотрієни печінки та крові щурів за умов різного забезпечення організму -токоферолом //Лабораторна діагностика.- 2008. - №3 - С. 55-58.
6.V.P. Parkhomets, o.M. Palivoda, S.B. Sylonov, G.V. Donchenko Tocopherol-binding proteins intensify action of tocopherol to enzymes of leucotrienes synthesis. // NATO Advanced Study Institute Co-sponsored by FEBS “Free Radicals, Oxidative Stress and Antioxidants. Pathological and Physiological Significance” May 24-June 4, 1997 Antalia, Turkey. P.136.
7.G. V. Donchenko V.P. Parkhomets, o.M. Palivoda, S.B. Sylonov,A.V. Nartikov Tocopherol-binding proteins intensifity action of tocopherol to enzymes of leucotrienes synthesis. //17 Internationаl Congress of Biochemistry and moleculer Biology in conjunction with 1997 Annual Meeting of theAmerican Society for Biochemistry and moleculer Biology ” August 24-29, 1997. San Francisco, California //The FASEB journal ABSTRACTS. Volume11, №9. P A1344.
8.Пархомець в.п., палівода О.М., Сілонов C.Б., Донченко Г.В. токоферол- зв'язуючі білки посилюють дію токоферолу на ферменти синтезу лейкотрієнів. // VI1 Український біохімічний з'їзд. тези доп. - київ, 1997. - Ч.3 - С.167.
9.Пархомець В.П., Сілонов С.Б., Донченко Г.В. Вплив a-токоферолу, токо-ферилхінону та їх комплексів з токоферолзв'язуючими білками на активність ферментів метаболізму арахідонової кислоти. //Укр.біохім.журн. -2000.- 72, №6. - С 121.
10.Силонов С.Б., Морозова Р.П., Донченко Г. В. Арахидоновая кислота и ферменты глутатионовой системы в печени крыс при Е гиповитаминозе. // VI Международная конференция “Биоантиоксидант”. Тезисы докл. - (16-19 апреля 2002 г. г. Москва).- Москва, 2002. - С. 524.
11.Сілонов С.Б., Морозова Р.П. дія комплексів токоферолу та токоферилхінону з білками акцепторами на активність трансфераз. // VIIІ Український біохімічний з'їзд. Тези доп. (1-3 жовтня 2002 р., м. Чернівці). - Укр.біохім.журн.-2002. - т. 74, №4а (додаток 1). - С. 79.
12. Сілонов С.Б., Морозова Р.П., Донченко Г.В. дія токоферолу на метаболізм лейкотрієнів. // V Міжнародна Парнасівська конференція. (26-29 квітня 2002 р., м. Київ, Україна). Укр. біохім. журн. - 2002. - 77, №2. - С. 232.
13. Сілонов С.Б. Обмін лейкотрієнів за умов Е-гіповітамінозу у щурів. // ІХ Український біохімічний з'їзд. Тези доп. (24-27 жовтня 2006 р., м. Харків). Укр. біохім. журн. - 2006. -Т.2.- С.108.
14. Силонов C.Б., Донченко Г.В. Кальций и уровень цистеинил лейкотриенов в организме крыс в условиях Е-гиповитаминоза // : Материалы Республиканской научной конференции, Сборник Молекулярная медицина и биохимическая фармакология - Гродно -2007. - С. 322-323.
15. Сілонов C.Б., Донченко Г.В. Вплив - токоферолу на окисний метаболізм арахідонової кислоти //Національна науково-технічна конференція з міжнародною участю “Актуальні проблеми синтезу і створення нових біологічно активних сполук та фармацевтичних препаратів”. тези доп.- (15-18 жовтня 2008 р., м. Львів). - Видавництво Національного університету “Львівська Політехніка”. - с. 212.
16. Сілонов C.Б., Донченко Г.В. окисний метаболізм арахідонової кислоти в умовах різної забезпеченості організму щурів токоферолом. Тези конференції “Актуальні проблеми сучасної біохімії та клітинної біології» 30-31 жовтня 2008. - Дніпропетровськ. - С.73
Анотація
Сілонов С.Б. Участь специфічних білків-акцепторів -токоферолу в регуляції синтезу лейкотриєнів Рукопис
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2008.
Дисертаційну роботу присвячено вивченню впливу токоферолу на окисний метаболізм арахідонової кислоти по ліпоксигеназному шляху перетворення. одержано нові дані відносно вивчення дії токоферолу на механізми перетворення арахідонової кислоти, пов'язані з обміном лейкотриєнів. Вивчено вплив Е-гіповітамінозу та його корекції на обмін ліпідів за вмістом токоферолу, холестеролу, загальних та індивідуальних фосфоліпідів, жирних кислот фосфоліпідної фракції печінки. Досліджено інтенсивність 5-ліпоксигеназного шляху перетворення арахідонової кислоти за вмістом арахідонової кислоти, сумарних та індивідуальних цистеїніл лейкотриєнів в крові і клітинах печінки щурів, а також мікросомальної глутатіон-S-трансферази за умов різного забезпечення токоферолом. Одержано комплекси токоферолу та токоферилхінону з токоферолзв'язуючими білками, виділеними з цитозолю печінки щурів. Досліджується роль токоферолзв'язуючих білків в процесах регуляції токоферолом утворення лейкотриєнів, зокрема вивчається вплив комплексів токоферол-токоферолзв'язуючі білки та токоферилхінон - токоферолзв'язуючі білки на активність ферментів синтезу лейкотриєнів 5-ліпоксигенази, лейкотриєн А4 гідролази, лейкотриєн С4 синтази, мікросомальної та цитозольної глутатіон-S-трансферази в дослідах in vitro.
Ключові слова: токоферол, токоферилхінон, токоферолзв'язуючі білки, арахідонова кислота, цистеїніл лейкотриєни, 5-ліпоксигеназа, лейкотриєн А4 гідролаза, лейкотриєн С4 cинтаза, глутатіон-S-трансфераза, фосфоліпіди, метаболізм.
Аннотация
Силонов С. Б. Участие специфических белков-акцепторов токоферола в регулировании синтеза лейкотриенов. Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2008.
Диссертационная работу посвящена изучению влияния токоферола на окислительный метаболизм арахидоновой кислоты по липоксигеназному пути превращения.
Получены новые данные относительно действия токоферола на механизмы превращения арахидоновой кислоты, связанные с обменом лейкотриенов. Изучено влияние Е-гиповитаминоза и его коррекции на обмен липидов по содержанию токоферола, холестерола, общих и индивидуальных фосфолипидов, жирных кислот фосфолипидной фракции печени крыс. В опытах in vivo, при моделировании состояния Е-гиповитаминоза, в условиях недостаточного обеспечения организма крыс -токоферолом, установлено снижение уровня суммарных и индивидуальных цистеинил лейкотриенов в крови, где происходит их синтез, и в печени, принимающей участие в их превращении и утилизации. При распаде цистеинил лейкотриенов отмечается, что лейкотриен Е, в меньшей степени чем другие цистеинил лейкотриены, реагирует на снижение содержания -токоферола в организме. Увеличение содержания суммарных и индивидуальных цистеинил лейкотриенов в условиях коррекции -токоферолом подтверждает участие -токоферола в окислительном метаболизме арахидоновой кислоты при ее липоксигеназном пути превращении. Исследована активность микросомальной глутатион-S-трансферазы в условиях разного обеспечения токоферолом. Получены комплексы токоферола и токоферилхинона с токоферолсвязывающими белками, выделенными из цитозоля печени крыс. Изучается роль токоферолсвязывающих белков в процессах регуляции токоферолом образования лейкотриенов, влияние комплексов токоферол-токоферолсвязывающие белки и токоферилхинон - токоферолсвязывающие белки на активность ферментов синтеза лейкотриенов: 5-липоксигеназы, лейкотриен А4 гидролазы, лейкотриен С4 синтазы, микросомальной и цитозольной глутатион-S-трансферазы в опытах in vitro.
Ключевые слова: токоферол, токоферилхинон, токоферолсвязывающие белки, арахидоновая кислота, цистеинил лейкотриены, 5-липоксигеназа, лейкотриен А4 гидролаза, лейкотрен С4 cинтаза, глутатион-S-трансфераза, фосфолипиды, метаболизм.
Summary
Silonov S.B. participation of specific -tocopherol binding proteins in the leucotriene synthesis regulation. Manuscript.
Thesis for a scientific degree of candidate (Ph.D) of biological sciences by speciality 03.00.04-biochemistry. O.V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Science, of Ukraine, Kyiv, 2008
The dissertation is devoted to investigating of the -tocopherol influence on the 5-lipohygenase way of arachidonic acid metabolism. The new data about -tocopherol mechanism action on the arachidonic acid metabolism associate leucotriene metabolism have been obtained. E- hypovitaminosis and correction influence on the lipid metabolism as consist of the tocopherol, cholesterol, phospholipids in rat liver have been explored. Intension 5-lipoxygenase way arachidonic acid metabolism at the arachidonic acid, cystienil-leucotriens concentration in rat liver and blood have been explored. Microsomal glutathione-S-transferases at the different -tocopherol provision condition have been investigated. -tocopherol and tocopherylquinone complex with -tocopherol binding proteins of the rat liver cytosol have been received. Tocopherol binding proteins in the regulation process by tocopherol leucotriene composition have been investigated. The influence both tocopherol binding proteins complex with the -tocopherol and tocopherol binding proteins complex with the tocopherylquinone on the leucotriene enzyme activity of the: 5-lipoxygenase, leucotriene A4 hydrolase, leucotriene C4 synthase, microsomal and cytosol glutathione-S-transferases in the in vitro experiment has been investigated.
Key words: tocopherol, tocopherylquinone, tocopherol binding proteins, arachidonic acid, cystienil-leucotriens, 5-lipoxygenase leucotriene A4 hydrolase, leucotriene C4 synthase, microsomal glutathione-S-transferases, phospholipids, metabolism.
...Подобные документы
Ідентифікація лимонної кислоти в якості продукту метаболізму цвільових грибів. Реалізація синтезу лимонної кислоти у мікроорганізмів. Варіанти синтезу в виробництві кислоти (незмінний, незмінний із доливами, метод плівок). Характеристика умов ферментації.
контрольная работа [23,3 K], добавлен 12.03.2016Речовини, які використовуються організмом для енергетичних і пластичних цілей. Насичені жирні кислоти. Прості та складні вуглеводи. Основні джерела вуглеводів у харчуванні людини. Значення вітамінів та їх активну участь в обмінних процесах організму.
презентация [841,0 K], добавлен 16.10.2013Характеристика білків позаклітинного матриксу печінки. Порушення структури еластину. Будова та синтез молекули колагену. Стелатні клітини печінки як основні продуценти компонентів позаклітинного матриксу печінки. Накопичення та зберігання вітаміну А.
курсовая работа [1,1 M], добавлен 25.03.2013Аналіз сутності, складу, будови, особливостей структури білків - складних високомолекулярних природних органічних речовин, що складаються з амінокислот, сполучених пептидними зв'язками. Порівняльні розміри білків та пептидів. Функції білків в організмі.
презентация [357,5 K], добавлен 10.11.2010Вільні амінокислоти у регуляторних і адаптаційних процесах організму. Надходження важких металів і кадмію та пошкодження макромолекул та надмолекулярних компонентів клітини. Вплив кадмію сульфату на азотний і вуглеводний обмін в організмі щурів.
автореферат [46,9 K], добавлен 09.03.2009Накопичення продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків. Ефективність функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту. Вільнорадикальні процеси в мозку при експериментальному гіпотиреозі в щурів при фізичному навантаженні.
автореферат [84,7 K], добавлен 20.02.2009Фізико-хімічні, біологічні, фармакологічні властивості і застосування металів нанорозмірів. Методи отримання та характеристика наночастинок золота, їх взаємодія з білками, з бактеріальними клітинами; вплив на ферментативну активність пухлинних клітин.
презентация [362,3 K], добавлен 20.09.2013Синтез мітохондріальних білків і особливості формування мітохондрій. Система синтезу білка в мітохондріях. Продукти мітохондріального білкового синтезу. Синтез мітохондріальних білків у цитоплазмі. Формування окремих компонентів мембран.
реферат [32,1 K], добавлен 07.08.2007Управління обміном вуглеводів. Математичний аналіз системи регуляції рівня кальцію в плазмі. Основна модель регуляції обміну заліза у клітинах. Управління обміном білків, жирів і неорганічних речовин. Баланс тепла в організмі. Регуляція температури тіла.
реферат [25,9 K], добавлен 09.10.2010Вплив попереднього періодичного помірного загального охолодження щурів-самців у віці 3 та 6 місяців на формування та наслідки емоційно-больового стресу при визначенні функціонального стану церебральних механізмів регуляції загальної активності.
автореферат [58,6 K], добавлен 12.02.2014Роль білків (білкових речовин) в живій природі, їх структура та біологічні функції. Трансляція і загальні вимоги до синтезу білка в безклітинній системі: рібосоми, аміноацил-тРНК-синтетази, транспортні РНК. Природа генетичної коди. Етапи синтезу білка.
реферат [31,7 K], добавлен 05.10.2009Будова, фізичні та хімічні властивості білків. Для виявлення білків у різних матеріалах застосовують кольорові реакції, найважливішими з яких є ксантопротеїнова і біуретова. Елементарний склад, молекулярна маса білків. Застосування білків у промисловості.
реферат [296,8 K], добавлен 09.11.2010Загальний біоморфологічний опис Gіnkgo bіloba. Поширення рослини в Україні. Орфографічні та кліматичні умови міста Львова. Фармакологічні властивості, будова і функції білків в рослинному організмі. Аналіз методів дослідження і характеристика обладнання.
дипломная работа [3,9 M], добавлен 09.06.2014Дослідження штамів мікроорганізмів. Використання мутантів мікроорганізмів. Промисловий синтез амінокислот. Мікробіологічний синтез глутамінової кислоти, лізину, метіоніну, треонина, ізолейцину та триптофану. Ход реакцій і блокуванням етапів синтезу.
реферат [34,9 K], добавлен 25.08.2010Основі регуляції різноманітної діяльності організму. Функції нервової та ендокринної систем. Реакція організму на будь-яке подразнення. Механізм утворення умовних рефлексів. Роль підкіркових структур та кори великого мозку. Гальмування умовних рефлексів.
реферат [30,7 K], добавлен 30.03.2012Характеристика біотехнології отримання ембріонів in vitro, напрямки та перспективи її вдосконалення. Умови середовища культивування ооцит-кумулюсних комплексів. Впровадження біоритмічно осцилюючих параметрів культивування біологічних мікрооб’єктів.
статья [150,5 K], добавлен 21.09.2017Визначення терміну життя білків в організмі. Будова протеасоми як спеціального білкового утворення. Роль убіквіну в процесі утилізації білків. Методи виявлення злоякісних утворень або ослаблення імунної системи клітин. Функціональне призначення лізосоми.
презентация [111,1 K], добавлен 24.09.2014Класифікація антигенів, поняття антигенності, імуногенності. Роботи по антигенній структурі глобулярних білків. Послідовні та переривчасті антигенні детермінанти, їх властивості. Блокування зв'язування специфічних антитіл із білком в природному епітопі.
реферат [23,6 K], добавлен 14.09.2010Організація організму людини як цілісної живої системи. Виокремлені рівні: молекулярний, клітинний, клітинно-органний, організменний, популяційно-видовий, біоценотичний, біосферний. Розвиток організму людини - онтогенез. Методи дослідження генетики.
контрольная работа [22,6 K], добавлен 09.01.2009Застосування регуляторів росту в сучасних технологіях виробництва продукції рослинництва. Роль фітогормонів в обміні речовин та морфогенезі клітини. Дослідження впливу розчину бета-індолілоцтової кислоти на морфометричні показники проростків рослин.
статья [16,7 K], добавлен 02.12.2014
