Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Українська академія аграрних наук

Спеціальність 03.00.20 - Біотехнологія

Морфогенез в культурі in vitro сегментів стебла і клональне мікророзмноження Arnica Chamissonis Less. SSP. Foliosa (Nutt.) Maguire

Зеленіна Галина Артемівна

Ялта - 2007

Дисертація є рукописом

Робота виконана у Південному біотехнологічному центрі у рослинництві УААН і МОН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Ігнатова Світлана Олександрівна, Південний біотехнологічний центр у рослинництві УААН і МОН України, завідувач лабораторії культури тканин.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, Бугара Олександр Михайлович, Таврійський національний університет ім.В.І. Вернадського МОН України, завідувач кафедри фізіології рослин і біотехнології; кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Єгорова Наталія Олексіївна, Інститут ефіроолійних і лікарських рослин УААН, завідувач лабораторії біотехнології.

Провідна установа: Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться “_12 ” _квітня 2007 р. у _13⁰⁰_ годин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 при Нікітському ботанічному саді - Національному науковому центрі за адресою: 98648, Україна, Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад-Національний науковий центр.

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Нікітського ботанічного саду-Національного наукового центру: 98648, Україна, Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр.

Автореферат розісланий “_04 ” березня 2007 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради,кандидат біологічних наук С.Ю. Садогурський.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В зв'язку з екологічним забрудненням навколишнього середовища та виснаженням ресурсів цінних лікарських рослин стає актуальною проблема їх культивування. Одержання для створення промислових плантацій достатньої кількості садивного матеріалу, однорідного за темпами розвитку та вмістом фармакологічно активних речовин, гарантує метод клонального мікророзмноження рослин.

При розробці способу клонального мікророзмноження рослин кожного виду необхідно визначити стратегію розмноження, вибрати та ввести в культуру in vitro первинний експлант, дібрати умови, які б сприяли реалізації його морфогенетичного потенціалу. Для досягнення високого коефіцієнта розмноження важливим є вивчення процесів, що обмежують виживання рослин-регенерантів в період їх адаптації до природних умов вирощування. Ефективність розробленого способу клонального мікророзмноження лікарських рослин має бути підтвердженою тестуванням їхньої сировини на вміст фармакологічно активних компонентів.

Arnica chamissonis Less. ssp. foliosa (Nutt.) Maguire (арніка облиснена, в подальшому A. foliosa) - вид родини Asteraceae, інтродуцент з Північної Америки, придатний для культивування на півдні України (Собко, Дубенец, 1988). Лікарська сировина A. foliosa за своїми біохімічними властивостями (Муравьева, 1978) здатна ефективно замінювати сировину арніки гірської Arnica montana L., що занесена до Червоної книги (Мінарченко, Тимченко, 2002) та культивування якої поза ареалом виду (альпійською та субальпійською зонами Карпат) неможливе (Пенкаускене, Римкене, 1983). У науковій літературі дані щодо культивування in vitro експлантів A. foliosa поодинокі: Kalynyak Р.Р. et al. (1994) одержали калусні лінії з тканин кореня; дані щодо розробки способу клонального мікророзмноження відсутні. В зв'язку з вищевикладеним вивчення морфогенетичних процесів в культурі in vitro сегментів стебла A. foliosa з метою розробки способу клонального мікророзмноження рослин виду є актуальним і має науковий та практичний інтерес.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дослідження були проведені в лабораторії культури тканин Південного біотехнологічного центру у рослинництві УААН і МОНУ у рамках програми “Сільськогосподарська біотехнологія 2001-2005 рр.”, що затверджена загальним наказом Міністерства аграрної політики України і Української академії аграрних наук від 24.10.2001 р. № 318/92 та Постановою Президії УААН від 29.01.2002 р., протокол № 2 і включена до переліку науково-технічних програм УААН на 2001-2005 рр. Дослідження здійснювались за Підпрограмою 1 “Новітні біотехнології в рослинництві”, напрямком 1.1 “Методи культури тканин і клітин сільськогосподарських рослин” (номер державної реєстрації в Укр. ІНТЕІ - 0104U002695, проблемою 1.1.1. “Створення цінного селекційного матеріалу сільськогосподарських рослин з використанням культури in vitro” (номер державної реєстрації в Укр. ІНТЕІ - 0104U003556).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи - визначити шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу стеблових експлантів A. foliosa in vitro та розробити спосіб клонального мікророзмноження цієї цінної лікарської культури. Відповідно до поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- одержати асептичну культуру донорного ювенільного матеріалу та первинних експлантів;

- провести порівняльне гістологічне вивчення сегментів стебла в інтактній ювенільній рослині та при культивуванні на живильному середовищі з цитокініном;

- визначити морфогенетичні потенції стеблових експлантів в залежності від їх місця розташування на пагоні;

- вивчити вплив трофічних та гормональних факторів культивування in vitro на ефективність клонального мікророзмноження;

- визначити умови вкорінення in vitro одержаних мікропагонів;

- порівняти вміст фармакологічно активного компоненту арніфоліну в сировині рослин, що вегетативно розмножені in vitro та in vivo;

- визначити особливості водного обміну рослин-регенерантів в умовах in vitro та при адаптації in vivo;

- розробити спосіб клонального мікророзмноження A. foliosa.

Об'єкт досліджень - морфогенез та процеси регенерації в культурі вегетативних органів in vitro.

Предмет досліджень - особливості регенерації в культурі in vitro стеблових сегментів і клональне мікророзмноження A. foliosa.

Методи досліджень: методи культури ізольованих органів і тканин рослин in vitro, гістологічні, цитологічні, біометричні, біохімічні, фізіологічні методи та методи статистичного аналізу і планування експерименту.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено формування de novo чисельних меристематичних зон у тканинах стеблових експлантів A. foliosa при їх культивуванні на живильних середовищах МС з цитокініном БАП. клональне мікророзмноження стебловий сегмент

Вперше в культурі in vitro виявлено рівень регенераційної здатності стеблових сегментів A. foliosa, що залежав від умов вирощування донорних рослин та місця розташування експланту на пагоні.

З використанням матриці планування експерименту та статистичного аналізу визначено значущість окремих компонентів і проведено оптимізацію складу живильного середовища МС для підвищення ефективності клонального мікророзмноження A. foliosa.

Вперше показано вплив концентрації мінеральних солей та наявності активованого вугілля в складі живильного середовища для вкорінення регенерантів на рівень біосинтезу основних пігментів у їхніх листях.

Вперше встановлено адекватність вмісту арніфоліну в листях і суцвіттях рослин, що вегетативно розмножені in vitro та in vivo. Вперше виявлено особливості водного обміну рослин-регенерантів A. foliosa in vitro і при послідовній адаптації до умов in vivo.

Практичне значення одержаних результатів.

Розроблений спосіб клонального мікророзмноження A. foliosa пропонується для масового одержання садивного матеріалу при створенні багаторічних промислових плантацій цієї цінної лікарської рослини на півдні України.

Одержані в результаті досліджень рослини-регенеранти (1000 шт.) передані у ботанічий сад Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова (ОНУ) для збагачення колекції рідкісних видів лікарських рослин. Результати досліджень використовуються у навчальній програмі підготовки студентів кафедр ботаніки, генетики та молекулярної біології біологічного факультету ОНУ.

Особистий внесок здобувача в результати досліджень. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням автора. Здобувачем проведено критичний аналіз вітчизняної та іноземної літератури, розроблено структуру дисертації.

Здобувачем виконано статистичну обрабку та аналіз одержаних результатів, сформульовані положення та висновки дисертації. Результати спостережень представлені в 11 наукових публікаціях, частина яких написана без співавторів.

У спільних роботах здобувачеві належать матеріали щодо культивування експлантів і рослин-регенерантів A. foliosa in vitro.

Апробація результатів досліджень. Матеріали дисертаційної роботи представлені на ІІІ Українській конференції з медичної ботаніки (Київ, 1992), ІІ з'їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993), на міжнародних конференціях: “Молекулярная генетика, геномика и биотехнология” (Мінськ, 2004), “Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання” (Оброшино, 2005), “Молекулярная и прикладная генетика” (Мінськ, 2005), на конференції, присвяченій 140-річчю Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова (Одеса, 2005).

Публікації. Матеріали дисертації відображено в 11 публікаціях, у тому числі - в 4 статтях у виданнях, що затверджені ВАК України як спеціалізовані за біологічним напрямком, 6 - у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 141 сторінці машинописного тексту, складається зі вступу, 6 розділів, висновків, списку використаних літературних джерел (156 найменувань, з них - 48 іноземних), 2 додатків, включає 18 малюнків, 14 таблиць.

Основні результати досліджень

Клональне мікророзмноження як один з напрямків біотехнології лікарських рослин (огляд літератури).

У розділі представлений сучасний стан біотехнологічних досліджень в галузі лікарського рослинництва, зокрема рослин роду Arnica. Особливу увагу приділено клональному мікророзмноженню, розглянуті його принципи та теоретичні основи. Виділено шлях активації існуючих меристем як основний при одержанні генетично однорідного рослинного матеріалу. Розглянуто вплив основних факторів морфогенезу in vitro на ефективність клонального мікророзмноження рослин. Показано особливості рослин-регенерантів, що виникають при культивуванні in vitro. На основі критичного аналізу вітчизняної та іноземної літератури зроблено висновок щодо актуальності власних досліджень.

Матеріали і методи досліджень.

Дослідження з клонального мікророзмноження A. foliosa проведені на базі лабораторії культури тканин Південного біотехнологічного центру у рослинництві УААН і МОН України (м. Одеса).

У дослідженнях використовували ювенільні рослини, вирощені in vitro з насіння A. foliosa, люб'язно наданого науковим співробітником лабораторії медичної ботаніки Тернопільської медичної академії Марчішин С.М.

При проведенні експериментальних робіт використовували загальноприйняті методи культури ізольованих тканин та органів рослин in vitro (Калинин и др., 1992; Митрофанова, 1997). Для одержання асептичної культури первинних експлантів зі зрілого насіння A. foliosa розроблений оптимальний режим поверхневої стерилізації насіння. Насіння та стеблові експланти культивували на модифікованих живильних середовищах МС (Murashige, Skoog, 1962). Оптимізацію складу живильних середовищ проводили з використанням методу планування експерименту (Малышев, 1977). У роботі використовували синтетичні регулятори росту та агар фірм “Sigma” і “Serva”. Культуральні посудини з експлантами інкубували в умовах термостатованого приміщення при 22-24⁰С, з освітленням 3000-4000 лк, 16-годинним фотоперіодом і відносною вологістю повітря 60-70 %.

Гістологічні і цитологічні дослідження проводили на постійних та тимчасових препаратах, що були приготовлені загальноприйнятими методами (Паламарчук, Веселова, 1965; Паушева, 1988).

Хроматографічне визначення вмісту арніфоліну проводили за методикою, запропонованою Євстратової Р.І. та ін. (1964).

Статистичний аналіз експериментальних даних проводили з використанням пакету прикладних програм Microsoft Office для Windows за алгоритмами Рокицького П. Ф. (1973).

Введення в культуру in vitro експлантів a. foliosa

В якості вихідного матеріалу в наших експериментах використовували зріле насіння A. foliosa. У результаті проведених дослідів встановлений оптимальний режим поверхневої стерилізації насіння - обробка 15-% пероксидом водню протягом 15 хв. з наступним дворазовим промиванням стерильною водою. Культивування насіння in vitro на агаризованому живильному середовищі МС дозволило підвищити низьку лабораторну схожість насіння у 1,8 разу і протягом 30 діб одержати ювенільні рослини, що були донорами експлантів для подальших досліджень.

Гістологічне вивчення поперечних зрізів експлантів (рис. 1) показало, що сегменти стебла в області вузла містять по дві симетрично розташовані пазушні бруньки розміром 150-200 мкм, а верхівка - апікальну бруньку розміром близько 100 мкм.

Встановлено, що середня кількість мікропагонів на експлант, що характеризує його регенераційну здатність, залежала від місця розташування сегмента на стеблі. Так, сегменти базальної частини регенерували у два рази більше мікропагонів, ніж верхівка, й у 1,5 рази більше, ніж сегменти середньої частини стебла. Слід відмітити, що верхівка стебла містила одну бруньку, таким чином, її регенераційна здатність порівнювалася із здатністю експлантів базальної частини стебла, але життєздатність експлантів верхівки була значно меншою. Таким чином, використання стеблових експлантів було доцільним при клональному мікророзмноженні рослин дослідженого виду A. foliosa, причому сегменти базальної частини стебла мали найбільший регенераційний потенціал у культурі in vitro.

Гістологічне вивчення сегментів стебла А. foliosa після 14 діб культивування на живильному середовищі МС з доданням 2 мг/л БАП (рис.2) дозволило виявити утворення de novo численних меристематичних зон за периметром експланту, з яких у подальшому розвивалися мікропагони, тоді як на живильному середовищі МС без додання фітогормонів відмічали тільки розвиток існуючих бруньок.

Таким чином, в стеблових сегментах рослин A. foliosa в присутності цитокініну БАП у складі живильного середовища морфогенез експлантів in vitro відбувався двома шляхами - активацією існуючих меристем бруньок та формуванням de novo меристематичних зон у тканинах експлантів.

Вивчення можливості попередньої активації меристем донорних рослин.

З метою вивчення можливості попереднього стимулювання процесів закладки нових меристематичних зон у тканинах стебла ще на етапі вирощування донорних ювенільних рослин, звільнене від поверхневої інфекції насіння A. foliosa висаджували на живильні середовища МС з доданням БАП або ГК (1-2 мг/л). Стеблові експланти від вирощених на даних живильних середовищах донорних рослин використовували для подальшого клонального мікророзмноження. Як видно з представлених даних (табл. 1), додання в живильне середовище для пророщування насіння БАП або ГК, по-перше, викликало підвищення його схожості. Так, БАП, в залежності від концентрації, стимулював схожість насіння в 1,3-1,8; ГК - в 1,6 разу в порівнянні з контролем. По-друге, виявлено позитивну післядію фітогормонів, що використовували у живильних середовищах для вирощування донорних рослин, на регенераційну здатність експлантів при подальшому культивуванні. В результаті, середня кількість мікропагонів на експлант при використанні БАП достовірно зростала у 5,5 та 10,8 разів залежно від концентрації, а при використанні ГК - у 5,8 разів, у порівнянні з контролем (вирощування рослин та культивування експлантів на безгормональному середовищі МС). При доданні 2 мг/л БАП як в середовище для пророщування насіння, так і в середовище для подальшого клонального мікророзмноження, кількість мікропагонів на експлант зросла ще більше (у 13,8 разів).

Таблиця 1 Залежність схожості насіння in vitro і регенераційної здатності експлантів A. foliosa від гормонального складу живильних середовищ

Таке збільшення регенераційної здатності експлантів відбувалося, на нашу думку, в результаті накопичення екзогенних фітогормонів у тканинах донорних рослин та, як наслідок, закладки нових зон меристематичної активності в тканинах досліджених рослин і взятих від них експлантів.

Таким чином, встановлена можливість попередньої активації меристем донорних рослин A. foliosa при вирощуванні їх з насіння in vitro. При цьому ефективність клонального мікророзмноження зростала в 1,8 разу у порівнянні з використанням експлантів від донорних рослин, що були одержані на безгормональному живильному середовищі, і стимуляція меристематичної активності в них не відбулася.

Вплив гормональних компонентів живильного середовища на реалізацію регенераційного потенціалу експлантів.

З метою підвищення ефективності клонального мікророзмноження A. foliosa вивчали вплив на цей процес різних цитокінінів, що широко використовуються в практиці розмноження рослин in vitro: кінетіну, БАП, 2-iР, зеатину (похідних пуринів), тідіазурону (похідного сечовини). Встановлено, що кожний з цитокінінів, що додано у живильне середовище МС, достовірно підвищував рівень регенераційної здатності стеблових експлантів у порівнянні з культивуванням сегментів на безгормональному середовищі. Однак, додання у живильне середовище 2 мг/л БАП було більш ефективним тому, що сприяло регенерації експлантами більшої кількості (у середньому 4-5 шт.) морфологічно нормальних мікропагонів. Використання тідіазурону в даній концентрації приводило до утворення мікропагонів з аномальною морфологією.

Оптимізація складу живильного середовища з використанням методу планування експерименту.

Одним із визначальних факторів, від яких залежить ефективність клонального мікророзмноження, є склад живильного середовища. Причому, на процес впливають не тільки концентрації компонентів середовища, але й їх співвідношення. Визначення оптимальних співвідношень живильних речовин для культивування дібраних експлантів доцільно проводити за допомогою методу планування експерименту. Оптимізацію складу живильного середовища МС для культивування стеблових експлантів A. foliosa проводили за методом В. П. Малишева (1977), що базується на одержанні графічних залежностей критерію оптимізації від концентрації окремих компонентів живильного середовища. Використання цього методу дозволило відібрати кращий склад середовища за шістьма факторами (компонентами) на 5 рівнях (концентраціях). Для цього була розроблена матриця експерименту з 25 варіантів живильних середовищ МС, в складі яких кожний рівень будь-якого фактору зустрічався один раз з кожним рівнем інших факторів. Критеріями оптимізації були обрані такі показники, як середня кількість мікропагонів на експлант і коефіцієнт розмноження (загальна кількість мікропагонів від однієї рослини) за пасаж, що характеризували регенераційний потенціал стеблових експлантів A. foliosa. Статистична обробка даних показала високу позитивну кореляцію (r = + 0,94) обох критеріїв оптимізації.

Графічні відображення залежності регенераційної здатності експлантів A. foliosa від вмісту окремих компонентів живильного середовища (рис. 3) дозволили встановити їх оптимальні концентрації. Так, вплив концентрації сахарози в живильному середовищі МС на регенераційну здатність експлантів графічно представлений у вигляді кривої з достовірними максимумом і мінімумом. Причому, перехід від максимальної регенераційної активності експлантів до мінімальної відбувався різко при підвищенні концентрації сахарози в живильному середовищі з 3 до 4 %.

Графічно залежність регенераційної здатності експлантів від концентрації цитокініну БАП представлена у вигляді плавної кривої з оптимумом дії при 3 мг/л. Менші концентрації БАП лімітували, а більші - інгібували регенераційні процеси в тканинах експлантів. Крім того, кореляційний аналіз одержаних даних показав, що концентрація БАП у живильному середовищі для культивування експлантів і кількість утворених коренів у рослин-регенерантів знаходились у зворотній залежності.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. Рівень регенераційної здатності стеблових експлантів А. foliosa в залежності від концентрації компонентів живильного середовища

Графік впливу концентрації нітрату амонію на регенераційну здатність експлантів мав вигляд складної кривої з двома максимумами і мінімумами. Причому, максимальний ефект відзначався як при відсутності нітрату амонію в живильному середовищі, так і при його концентрації 1 г/л. Мінімальний ефект зафіксовано при концентраціях 0,5 і 2 г/л. Таким чином, чіткого впливу присутності цього компоненту на реалізацію морфогенетичного потенціалу експлантів не виявлено. Однак, при культивуванні експлантів на живильних середовищах без нітрату амонію спостерігали виражений хлороз одержаних пагонів при високій активності меристем експлантів.

Достовірного впливу присутності ІОК, вітамінів, мезо-інозиту в складі живильного середовища на регенераційну здатність експлантів та, як наслідок, на ефективність клонального мікророзмноження не встановлено. Таким чином, значущими факторами оптимізації живильного середовища для оцінювання регенераційної здатності стеблових експлантів A. foliosa виявилися сахароза і БАП. В результаті експерименту спрощений варіант живильного середовища МС зі зменшеним до 1 г/л вмістом нітрату амонію, виключенням мезо-інозиту, вітамінів і доданням 3 мг/л БАП був оптимальним для клонального мікророзмноження рослин A. foliosa. На живильному середовищі даного складу регенераційна здатність експлантів зростала у 1,5 рази в порівнянні з показниками до проведення оптимізації (МС з 2 мг/л БАП) і складала 7-8 мікропагонів на експлант.

Вплив факторів культивування in vitro на реалізацію морфогенетичного потенціалу експлантів.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. Реалізація морфогенетичного потенціалу сегментів стебла A. foliosa в культурі in vitro

На прикладі культивування сегментів стебла A. foliosa вперше було зроблено спробу оцінити вплив окремих факторів морфогенезу in vitro на реалізацію регенераційного потенціалу експлантів.

Максимальна реалізація морфогенетичного потенціалу експлантів in vitro в наших дослідженнях (до 32 мікропагонів за пасаж) була досягнута при оптимальних параметрах всіх досліджених факторів: попередньої активації меристем донорних рослин, культивування експлантів на живильному середовищі оптимального складу, збільшення тривалості пасажу до 45 діб. Однак, життєздатність одержаних за таких умов регенерантів при подальшому культивуванні in vitro була низькою і складала всього 10,60,8%, замість 88,72,5% в контрольному варіанті (відмінності достовірні при Р<0,02). Таким чином, теоретично можливо реалізовувати регенераційний потенціалу експлантів дослідженого виду в широкому діапазоні. Проте, на практиці необхідно одержувати життєздатні регенеранти, для чого доцільно обмежувати тривалість пасажів та концентрації фітогормонів при культивуванні in vitro.

Підбір складу живильного середовища для вкорінення регенерантів in vitro.

Для вкорінення одержних мікропагонів A. foliosa оптимізували склад живильного середовища МС. При цьому вивчали вплив концентрації мінеральних солей і додавання активованого вугілля у живильне середовище на показники росту та розвитку рослин-регенерантів (табл. 2, 3).

Таблиця 2 Ефективність вкорінення та інтенсивність росту рослин-регенерантів А. foliosa в залежності від складу живильного середовища

З представлених результатів (табл. 2) видно, що зменшення концентрації мінеральних солей вдвічі та наявність активованого вугілля в складі живильного середовища сприяли значному посиленню ростових процесів як у надземній, так і у підземній частинах регенерантів. На стандартному живильному середовищі МС вкорінення мікропагонів взагалі не відбувалося, а на оптимальному за нашою модифікацією середовищі відмічали 98-100% вкорінення регенерантів. Значні поліпшення ростових процесів відбувалися вже при зменшенні вдвічі концентрації мінеральних солей, додання активованого вугілля посилювало позитивний ефект. Так, висота та кількість листя у рослин-регенерантів зростали в 1,5; біомаса - у 1,8; сумарна довжина корінців - у два рази.

Крім того, завдяки присутності активованого вугілля в складі оптимального для вкорінення живильного середовища зменшувався вміст води в тканинах регенерантів, що дозволяло уникнути вітріфікації, яка, в багатьох випадках, має місце в культурі in vitrо та знижує життєздатність отриманних рослин-регенерантів. Концентрація мінеральних солей і наявність активованого вугілля в складі живильного середовища для укорінення також в значній мірі впливали на вміст основних пігментів у листі рослин-регенерантів (табл. 3).

Таблиця 3 Вміст пігментів в листях регенерантів А. foliosa в залежності від складу живильного середовища (мг/г сирої маси листків)