Молекулярно-біологічне вивчення геномних і реплікативних РНК фіто- та міковірусів як основа для створення рослинних біотехнологій

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

УДК 578.864:577.53.082

03.00.06 - вірусологія

03.00.20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНЕ ВИВЧЕННЯ ГЕНОМНИХ І РЕПЛІКАТИВНИХ РНК ФІТО- ТА МІКОВІРУСІВ ЯК ОСНОВА ДЛЯ СТВОРЕННЯ РОСЛИННИХ БІОТЕХНОЛОГІЙ

Мельничук Максим Дмитрович

Київ 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі екобіотехнології та біорізноманіття Національного аграрного університету Кабінету Міністрів України

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік УААН

Бойко Анатолій Леонідович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Щербатенко Іван Степанович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних вірусів

доктор біологічних наук, професор Стародуб Микола Федорович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, завідувач відділу сенсорних та регуляторних систем

доктор біологічних наук, професор Радавський Юрій Леонідович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу структури та функції білків та пептидів

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться 17 травня 2006 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розіслано “14” квітня 2006 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Геноми фіто- і міковірусів із дволанцюговими геномними РНК (длРНК) - унікальні й високопрактичні моделі для фундаментальної основи пізнання принципів будови, функціонування, практичного використання, розробки експрес-діагностикумів, синтезу специфічних молекулярних праймерів, створення банків вірусних генів, біотехнологічного оздоровлення рослин, пізнання принципів, а також законів еволюції та екології вірусів. Такими властивостями відзначаються і фітовіруси із одноланцюговими РНК, які на стадії реплікації утворюють специфічні длРНК [Valverde, 1990; Van der Lende, 1995; Zhou, 1998; Osaki, 2002].

За останні двадцять років вивчення структури геному і можливість одночасного існування фіто- та міковірусних представників царства Vira на рослині-господарі практично не було досліджено. При цьому не рідко навіть не визначався видовий склад мікроміцетів рослин і не перевірялось інфікування останніх вірусами мікроскопічних грибів. Із-за подібних порушень первинної вірусної діагностики і технологій ведення господарювання в агроценозах останнє безперечно призводить до зниження врожайності та погіршення якості продукції рослинництва [Бойко, 1990; Тavantzis, 1994; Поліщук, 1998].

На сьогодні в зв'язку із бурхливим розвитком біотехнологій вивчаються трофічні зв'язки вірусів в біогеоценозі, розробляються підходи щодо отримання біотехнологічними методами оздоровлених від вірусів культурних рослин, нових гібридів і сортів рослин із природною й штучною резистентністю до вірусів, цінним морфогенетичним потенціалом та якістю [Митрофанова, 1997; Кунах, 2001]. Значної уваги науковців світу привертають також питання із діагностики, ідентифікації і кількісного визначення наявності трансгенів в продукції, дотримання біоетики та норм екобіобезпеки при проведенні біотехнологічних досліджень. Вивчення фундаментальних основ функціонування, діагностики і ідентифікації вірусів рослин й грибів являється запорукою успіху сучасних біотехнологій підвищення кількості, якості та безпеки рослинницької продукції. Особливо це стосується впровадження трансгенних технологій в практику [Новожилов, Блюм, 2001; Messeguer, 2003; Ugozzoli, 2003; Heim, 2004].

Адже дані дослідження дволанцюгових форм РНК відкривають шлях до виявлення моно- і змішаних фіто- й міковірозів, з'ясування природи криптичних (латентних) вірусів рослин, уточнення систематичного положення та класифікації відомих, а також раніше не описаних вірусів, вирішення проблем з експрес-діагностики генетично-модифікованої продукції, впровадження у практику безвірусного насінництва, а також оздоровлених методами біотехнології промислових культур в цілому.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Основні експериментальні дослідження з дисертаційної роботи виконано у проблемній лабораторії фітовірусології та біотехнології Національного аграрного університету України (НАУ) в рамках науково-технічних програм за темами: № 110/55А-ПЛ “Наукове обгрунтування та дослідження ефективності біотехнологічних методів для використання в клітинній біології та селекції” (№ державної реєстрації 0198U004095), № 110/34 ПЛ “Вивчення механізмів взаємодії фітовірусів із клітинами та розробка методів діагностики вірозів і отримання безвірусних рослин” (№ державної реєстрації 0198 U 004073). Із 2002 р. по теперішній час робота продовжується за науковими темами: №110/11Ф “Розробка технологій мікроклонального розмноження цінних сільськогосподарських, технічних та декоративних культур біотехнологічними методами та ДНК паспортизація сортів рослин” (№ державної реєстрації 0043706 0103U004745) та 110/7Ф “Розробка вітчизняних молекулярно-біологічних діагностичних систем для виявлення латентних вірусів і трансгенів з метою отримання генетично-модифікованих рослин та їх клонування на безвірусній основі” (№ державної реєстрації 00493706 0103U005653).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - відпрацювати і впровадити в Україні систему вірусологічних біотехнологій для ідентифікації фіто- і міковірусів та оздоровлення рослин від вірусів.

Відповідно до поставленої мети передбачалось вирішення наступних задач:

1. Відпрацювати і вдосконалити існуючу методику виділення й очистки длРНК з рослин та грибів шляхом хроматографії в градієнті целюлози.

2. Оптимізувати методи виділення і очистки длРНК міковірусів та реплікативних РНК фітовірусів із рослин картоплі, перцю, хмелю, цукрових буряків.

3. Розробити тест-систему для виявлення трансгенних сортів картоплі, стійких до колорадського жука, і оцінити їх стійкість до деяких збудників інфекційних хвороб, розповсюджених в Україні.

4. На основі РТ ПЛР розробити молекулярно-біологічну систему ідентифікації вірусних РНК в рослинах цукрових буряків та виділених із них культурах мікроміцетів.

5. Створити кДНК-бібліотеки вірусних генів на підставі длРНК і сиквенувати фрагменти клонованих генів.

6. Визначити спорідненість клонованих фрагментів длРНК з геномними РНК відомих фітовірусів і міковірусів з метою ідентифікації нових вірусів.

7. Отримати чисті культури штамів грибів, інфікованих міковірусами, визначити їх систематичне положення, кількісний вміст вірусу та його вплив на клітини грибів. фітовірус трансгенний ген реплікативний

8. Оптимізувати і впровадити у виробництво біотехнологію створення промислових плантацій хмелю на безвірусній основі.

9. Провести клітинну селекцію сортових ліній хмелю на стійкість до стресових факторів середовища з метою створення нового сорту з високою врожайністю, товарною якістю і стійкістю до фітопатогенів.

Об'єкти дослідження - рослини картоплі (Solanum tuberosum L.), хмелю (Humulus lupulus L.), перцю (Capsicum annum L.), цукрових буряків (Beta vulgaris L.), РНК вмісні фіто- і міковіруси, ізольовані молекули РНК, ДНК копії, ізольовані гени, трансгени, інфіковані й безвірусні клітини рослин та грибів, мікроскопічні гриби, оздоровлені та клоновані рослини.

Предмет дослідження - РНК вмісні фіто- і міковіруси, длРНК, кДНК вірусних фрагментів геному, їх окремих генів, біологічна, біохімічна, мікроскопічна й молекулярно-біологічна діагностика, ідентифікація, класифікація, створення біотехнології оздоровлення, клонування та клітинної селекції безвірусних рослин на прикладі хмелю в промислових масштабах.

Методи дослідження - вірусологічні, біотехнологічні, молекулярно-біологічні, біохімічні, фізико-хімічні, серологічні, зокрема, імуноферментний аналіз (ІФА), хроматографія в градієнті целюлози, електрофорез в агарозному і поліакриламідному гелях (ПААГ), трансмісійна й сканувальна електронна мікроскопія, реверс транскрипція, полімеразно-ланцюгова реакція (ПЛР), клонування, сиквенування кДНК вірусних длРНК, культивування та розмноження рослин in vitro тощо.

Наукова новизна одержаних результатів. Шляхом аналізу клонованих фрагментів длРНК, виділених із рослин цукрових буряків, ідентифіковано, визначено морфологічні та біологічні властивості нового міковірусу Helicobasidium purpureum Рartitivirus. Встановлено і зареєстровано в світових генетичних банках даних нуклеотидну та амінокислотну послідовності фрагмента гена РНК-залежної РНК-полімерази.

Виявлено високий рівень ураження деяких чистих культур мікроміцетів міковірусом Helicobasidium purpureum Partitivirus. Концентрація вірусу в культурі Shizophillum sp., визначена методом ПЛР у реальному часі, становить 7,33 Х 1010 вірусних часток на 50 мг міцелію.

Підтверджено можливість змішаних фіто- і міковірусних інфекцій в рослинах цукрових буряків, що виявляється як спорідненість длРНК, виділених із рослин, з геномними РНК фітовірусів та міковірусів.

Вперше показано, що репліказа криптичного вірусу цукрових буряків (Beet cryptic virus 3) не входить в єдиний кластер ферментів репліказ міковірусів родини Partitiviridae. Ці дані підтверджують тезу щодо сумнівності існування криптичних партітівірусів цукрових буряків.

Вперше визначено видовий склад мікроміцетів у листках, коренеплодах та ризосфері цукрових буряків і отримано чисті культури грибів, уражених міковірусом Helicobasidium purpureum Partitivirus.

Методом молекулярної ідентифікації видів за нуклеотидними послідовностями внутрішніх трансляційних спейсерів рибосомальних генів визначено належність вірусінфікованих культур базидіальних грибів до родів Peniofora, Thanatephorus, Schizophillum.

З'ясовано причетність міковірусів до виникнення гнилей коренеплодів цукрових буряків, що викликаються мікроміцетами, і показано можливість оцінки шкодочинності мікопатогенів за наявністю в рослинах вірусних длРНК.

Практичне значення отриманих результатів. Вдосконалена методика виділення і очистки, а також оптимізовані процедури ідентифікації дволанцюгових геномних РНК міковірусів та реплікативних РНК фітовірусів впроваджені в лабораторну практику. На їх підставі розроблено "Спосіб діагностики та ідентифікації РНК-вмісних фітовірусів", запатентований в Україні.

Розроблена молекулярно-біологічна технологія ідентифікації 35S промотора вірусу мозаїки цвітної капусти та гена Cry IIIA в геномах трансгенних сортів картоплі, стійких до колорадського жука, являє собою першу вітчизняну тест-систему для виявлення генетично модифікованих рослин.

Встановлені властивості нового міковірусу, отримані кДНК-бібліотеки вірусних генів, а також сиквенси фрагментів гена РНК-залежної РНК-полімерази міковірусу Helicobasidium purpureum Рartitivirus й гена цитоплазматичних включень потівірусу мозаїки буряків являють інтерес для вивчення структурно-функціональної організації, походження і еволюції вірусів, а також їх систематики та класифікації.

На підставі визначення видового складу мікроміцетів цукрових буряків і виявлення впливу міковірусів на фітопатогенні властивості грибів вперше в Україні запропоновано оцінювати шкодочинність мікопатогенів та необхідність захисту рослин за наявністю в них вірусних длРНК. Науково-технічну розробку "Оцінка на вірусоносійство та ступінь ураженості цукрових буряків з метою вивчення розповсюдженості деяких фітопатогенних вірусів та мікроскопічних грибів", впроваджено у виробництво.

Вперше розроблена, запатентована і впроваджена в Україні біотехнологія формування промислових плантацій хмелю на безвірусній основі дає можливість забезпечити конкурентноспроможність хмелярства за рахунок підвищення життєздатності, стійкості до фітопатогенів, енергії росту, сортової однорідності та врожайності рослин, а також товарної якості продукції.

Новий сорт хмелю "Національний", отриманий методом клітинної селекції, зареєстровано Держсортслужбою України і рекомендовано для застосування у пивоварінні.

Результати дисертаційної роботи використовуються у навчальному процесі в Національному аграрному університеті України, які включені в лабораторні і лекційні матеріали спецкурсів "Фітовірусологія", "Біотехнологія рослин" та "Екобіотехнологія". Указом Президента України від 19 грудня 2005 року № 1782/2005 за підручник “Біотехнологія рослин” дисертант удостоєний Державної премії України в галузі науки і техніки.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу сплановано і виконано автором з участю наукового консультанта д.б.н., професора, академіка УААН А.Л. Бойка. Ідеї, гіпотези та теоретичні концепції роботи належать здобувачеві. Автор дисертації є основним виконавцем досліджень. Роль співавторів в проведенні експериментів визначена у відповідних публікаціях та письмових угодах. Окремі результати досліджень опубліковані у співавторстві (Смирнова С.О., Спиридонов В.Г., Мартин Г.Г., Дьячкова О.О., Клюваденко А.А., Кожукало В.Є., Зубова Т.І., Олексієнко І.П., Дубін О.В., Оверченко В.В., Кляченко О.Л.), і цитуються при обговоренні деяких висновків дисертаційної роботи. Експериментальні дані, що увійшли в дисертаційну роботу, не дублюються, сплановані, виконані і належать особисто дисертанту.

Значну частину досліджень виконано також на базі дослідних господарств та лабораторій Національного аграрного університету (НДГ “Великоснітинське” ім. О.В. Музиченка), в лабораторії вірусології Університету штату Луїзіана, США (зав. лабораторії проф. Rodrigo A. Valverde), Інституті молекулярної біології та генетики НАН України (ст.н.с. Дмитренко В.В.), Інституті мікробіології і вірусології НАН України ім. Д.К. Заболотного (д.б.н. Жданова Н.М.), Інституті ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (д.б.н. Бухало А.С.), відділі хмелю Інституту сільського господарства Полісся УААН (к.б.н. Шабликін В.В., к.б.н. Михайличенко К.П., к.б.н. Заграфова М.Й.), Інституті вірусології ім. Луї Пастера м. Страсбург, Франція (зав. лабораторії доктор Barbara Winsor), лабораторно-тепличних господарствах МПП “Апекс”, польових стаціонарах Науково-технологічного селекційного центру “Полісся” (Вознюк С.І.). Автор висловлює щиру подяку за корисні поради і допомогу в плануванні, проведенні експериментів та обговоренні результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які увійшли в дисертаційну роботу, доповідались і апробовані на семінарах кафедри екобіотехнології та біорізноманіття НАУ, Міжнародній конференції з проблем рослинного онтогенезу в природному та трансформованому середовищі (Львів, 1998), Міжнародній конференції “Біологічні ресурси та віруси” (Київ, 1998), International Hop Growers Convention (Pulawy, Poland, 1998), 3rd International Symposium Recent Adv. In Plant Biotechnology (Stara Lesna, High Tatras, Slovak Republic, 1999), UK - Ukraine Workshop on Plant biotechnology (Norwich, UK, 1999), ІV - Міжнародній виставці навчальних закладів “Сучасна освіта в Україні - 2001” (Київ, 2001), 37th Croatian symposium on agriculture with an International Participation. (Opatija, Croatia, 2001), 2nd Global Conference of GCHERA “Bringing the world agricultural higher education and research community together to meet global challenges” (San Francisco, California USA, 2001), ІІІ Міжнародній конференції “Біологічні ресурси та віруси” (Київ, 2001), Bulgarian - Ukrainian Seminar on Plant biotechnology (Lessidren, Bulgaria, 2001), Международной конференции молодых учених, посвященной 185 - летию Харьковского государстенного аграрного университета им. В.В. Докучаева. (Харьков, 2001), International Symposium Plant under Enviromental stress. (K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology. Moscow, 2001), FAO/WHO Global Forum of Food Safety Regulators “Improving Efficiency and Transparency in Food Safety Systems Sharing Experiences” (Marrakech, Morocco, 2002), 2nd Ukrainian - Bulgarian Workshop on Plant Biotechnology. (Yalta, Crimea, Ukraine, 2002), VІ Міжнародній виставці навчальних закладів “Сучасна освіта в Україні - 2003” (Київ, 2003), 3rd Global Conference of GCHERA “Global reforms in higher education and research: Responding to challenges to quality and safety of food and agricultural products” (Kyiv, 2003), Міжнародній конференції “Promoting quality internships and work experience for Students and Professionals Worldwide” (Costa Rica, 2003), науково-практичному семінарі “Проблеми використання генетично-модифікованих та клонованих організмів” (Біла Церква, 2004), ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні питання гігієни харчування та безпечності харчових продуктів: збагачення раціону харчування: медичні проблеми, практичні рішення”. (Київ, 2004), Міжнародній конференції “Науково-методичне забезпечення викладання біологічних дисциплін в аграрних ВУЗах” (Київ, 2004), Міжнародній конференції “Біоекотехнології та біопалива в агропромисловому виробництві” (Київ, 2004), V Симпозіумі Україна-Австрія (Київ, 2004), IV Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 2004), ІІ з'їзді токсикологів України (Київ, 2004), VІII Міжнародній виставці навчальних закладів “Сучасна освіта в Україні - 2005” (Київ, 2005), NATO Advanced Reasearch Workshop “ Significance pf virus diseases for crop biosecurity in a developing European community” (Kyiv, 2005), 4rd Global Conference of GCHERA “Strengthening the Service Mission of Universities and Research Institutions for Sustainable Global Development” (Hagzhou, China, 2005), ІХ Міжнародній виставці “Екологія-2006”, Київ, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 50 наукових праць, в тому числі, 5 підручників, навчальних посібників та лабораторних практикумів, 30 статей у провідних фахових журналах, 1 стаття у збірці наукових праць, 2 патенти України на винаходи, 1 методична рекомендація та 11 тез доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методів і об'єктів досліджень, експериментальної частини, аналізу й узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел та додатків. Робота викладена на 297 сторінках основного тексту, містить 11 таблиць та 95 рисунків. Список використаних джерел включає 301 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Для проведення біотестування на вірусну інфекцію проводили механічну інокуляцію чутливих рослин-індикаторів (тютюну, кабачків, томатів, лободи, квасолі, перцю, тощо) із використанням 0,05 М КФБ рН 7,4 в якому гомогенізували висічки із симптоматичних листків дослідних рослин картоплі, хмелю, перцю та цукрових буряків. Зовнішні симптоми ураження фіксували на 7 - 21 добу .

Виділення фітовірусів здійснювали за стандартними методиками ультрацентрифугування із деякими власними модифікаціями. Віруси виділяли з листків та пагонів рослин з вірусспецифічними симптомами із використанням різних екстрагуючих буферних систем: 0,1М Na- фосфатний буфер рН 7,0; 7,4; 8,0; 0,1М трис-НCl рН 7,0; 7,4; 0,3М гліциновий буфер рН 8,5; 0,1М боратний буфер рН 7,6; 7,5. Ступінь чистоти вірусних препаратів визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 230-280 нм [Adams, Barbara, 1982; Мельничук та ін. 1997].

Для серологічної діагностики вірусів застосовували ІФА DAS-ELISA з власною модифікацією. Для цього зразки рослинних проб масою 1г гомогенізували у 4 мл буфера для екстракції (Е), який готували з використанням карбонату натрію 1,59 г/л і додавали бікарбонат натрію 2,93 г/л, азід натрію в кількості 0,2 г/л та полівінілпіролідон (MW 40000) 20,0 г/л. Рецептура приготування Е буфера розроблена компанією Agdia. Концентрацію білка супернатанта вимірювали за методом Бредфорда. Дослідні зразки використовували в кількості 20 мкг/мл у трьох повторностях. Сенсибілізацію полістерольних планшет (Nunc “Maxisorb”) проводили специфічними поліклональними кролячими сироватками до Х-ВК, S-ВК, М-ВК, Y-ВК та ВТМ виробництва Чернігівського НДІ с/г мікробіології УААН у кількості 10 мкг/мл протягом ночі при +4оС. Кон'югат протеїн А-пероксидази хрону для виявлення комплексів антиген-антитіло використовували у розведенні 1/1000, розчин субстрату для пероксидази хрону та хромоген ОФД (ортофенілендіамін) фірми “Діапроф-Мед”. Результати аналізу фіксували на імуноферментному аналізаторі STAT FAX 303 PLUS “Awareness technology” при довжині хвилі 492/630 нм. Контролями слугували зразки, розбавлені в 1 мл дистильованої води, при цьому ставили не менше одного негативного і позитивного в кожній плашці.

При роботі із трансгенною Bt-картоплею, трансформованої геном CryIIIA [Perlak et al, 1993] використовували листки, стебла та бульби. Геномну картопляну ДНК виділяли з проростків за описаною методикою [Boom et al, 1990], але з власною модифікацією із застосуванням 4% водної суспензії сорбенту (Silica) для осаджування сорбенту.

Для виділення і очищення длРНК вірусного походження використовували целюлозний градієнт (Whatman CF-11). Гомогенізацію рослинних зразків масою 3,5 г проводили в буферному розчині STE (0,1M NaCl, 0,05 M tris-HCl, 1,0 mM EDTA, pH 7,0), а виділення та очистку нуклеїнових кислот - класичним фенольним методом. Фракцію вірусних длРНК переводили на STE буфер без етанолу і концентрували в двох об'ємах охолодженого 95% етилового спирту та 0,1 об'єму 0,2 М натрій ацетату, рН 5,5 [Morris, Dodds, 1979]. Отримані зразки длРНК ресуспендували в 200 мкл STE буфера, обробляли ферментом DNAase 1 (№ D-4638, Sigma, USA) в розведенні 10 mg:1 ml дистильованої води і здійснювали електрофорез в 1% агарозному гелі та 6% ПААГ використовуючи прилад фірми “BIORAD”. Маркерами слугували комерційні молекули ДНК фага лямбда після обробки ферментами EcoR1 та Hind III, маркер DNA ladder та DNA ladder plus.

Цитологічні і мікроскопічні дослідження виконані в трансмісійних та сканувальних електронних мікроскопах ЭМВ 100А (НАУ), JEM 1200 ЕХ, JEM- 100 (Луїзіанський університет, США) при інструментальних збільшеннях 20 - 150 тисяч із використанням 2% ФВК, рН 7,0 та 2% уранілацетату (УА). Дизайн та синтез специфічних олігонуклеотидних праймерів для ПЛР проводили власноруч за допомогою комп'ютерної програми “Primer Express” (Applied Biosystems) чи on-line, із використанням програми Primer 3 (http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3)/ і подані в табл. 1.

Таблиця 1 - Використані в роботі синтезовані олігонуклеотидні праймери

Для отримання компетентних клітин E.coli брали 50 мл розчину А та інокулювали клітинами одиничної колонії E.coli. Культуру вирощували до оптичної густини DO600 0,3-0,4, клітини осаджували центрифугуванням. Після вилучення супернатанту клітинний осад суспендували в 0,5 мл розчині А з наступним додаванням 2,5 мл розчину В. Отриману суспензію розділяли на аліквоти по 200 мкл, зберігали при температурі -70оС.

Трансформацію E.coli плазмідною ДНК визначали за методикою [Nishimura, Morita, 1990]. Після інкубації клітини висівали в чашки з агаризованим LB середовищем, яке містило необхідний селективний антибіотик (ампіцилін або канаміцин). Для виявлення нуклеотидної послідовності плазмідну ДНК виділяли за допомогою набору Midi plasmid purification kit Genomed.

Реакції рестрикції і лігування ДНК здійснювали в реакційній суміші об'ємом 20 мкл з додаванням 1 мкг ДНК та по одній одиниці активності кожного з ферментів рестрикції. Суміш інкубували протягом 3 год при 37оС, після чого додавали 3 мкл буфера для електрофорезу та наносили у лунки 1% агарозного гелю. Після завершення електрофорезу гель забарвлювали 1% розчином бромового етидію, аналізували в умовах ультрафіолету і фотографували за допомогою системи “BIOTEST”.

Електропорацію E. coli чужерідною ДНК проводили в кюветах 1мм (Equibio) на електропораторі Gene Pulser (BioRad) з опором 200 Ом, ємність конденсаторів складала 25 мкФ, напруга - 1,8 кВ, імпульс - 3,8 мс.

Клонування фрагментів ПЛР у Т-вектор виконували за методом прямого клонування генів. Для цього РНК переводили у кДНК. Реакцію реверстранскрипції (РТ) моделювали з 0,2 мкг дослідного зразка длРНК, який попередньо обробляли ДНКазою RQ1 (Promega) та денатуровано нагріванням до 1000С. Синтез першого ланцюга кДНК ініціювали за допомогою 0,15 мкг праймера P1-6N та зворотної транскриптази AMV (Promega). Реакцію проводили за стандартних умов: 1 год при 420С та 30 хв при 520С. Після інкубації праймер P1-6N вилучали з реакційної суміші за допомогою ультрафільтрації через колонку Nanosep-30 (Pall filtron). Для ампліфікації одержаної кДНК до реакційної суміші додавали 1мкМ праймеру Р1 та ініціювали полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) з використанням Taq полімерази за наступних умов: початкова денатурація при 950С-4 хв десять циклів: 950С-1хв., 550С-2хв., 720С-3хв., та тридцять циклів: 940С-50с, 550С-1хв, 720С-1,5хв; заключний синтез при 720С-10хв.

Для створення кДНК бібліотеки вірусних длРНК клонували ПЛР продукти у вектор pGEM-T із використанням “pGEM®-T Easy Vector Systems” (Promega), трансформували бактеріальні клітини E. coli штаму XL-1 blue (Stratagene).

Рекомбінантні бактеріальні клони відбирали за допомогою блакитно-білої селекції після інкубації трансформованих бактеріальних клітин на селективному середовищі з X-Gal та IPTG. Подальший етап добору проводили за розміром фрагментів кДНК в ПЛР з використанням пари олігонуклеотидних праймерів Т7Р/SP6P. Бактеріальні клони з фрагментом кДНК більше 500 пнз вирощували і виділяли плазмідну ДНК за допомогою “Plasmid purification kit” (Qiagen) та визначали нуклеотидну послідовність фрагмента кДНК за допомогою автоматичного секвенатору ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Для проведення ПЛР длРНК міковірусів зразки переводили у кДНК в реакції реверстранскрипції. Для цього реакційну суміш, яка містила близько 1 мкг длРНК та 0,2 мкг раптових гексануклеотидів (Random primers), денатурували нагріванням при 950С протягом 5 хв з наступним охолодженням у льоді, після чого додавали реакційний буфер (50мМ Трис-HCl, pH 8.3, 50 мM KCl, 4мM MgCl2, 10 мM DTT), 1 мМ dNTPs та 200 U зворотної траскриптази (M-MuLV). Реакційну суміш інкубували годину при 370С, потім фермент інактивували прогріванням до 650С протягом 10 хв. Ампліфікацію специфічного фрагмента гена, що кодує консервативну послідовність вірусної РНК-залежної РНК полімерази міковірусів, проводили у реакційному буфері: 67мМ трис-HCl, pH 8.3, 17 мM (NH4)2SO4, 2,5 мM MgCl2, 0,1% Tween-20, 0,3 мг/мл BSA, 8% гліцеролу, додавали 2мкл попередньої реакції реверс траскрипції, 0,5 мкМ кожного з специфічних олігонуклеотидних праймерів ВMV1/ВMV2, 0,2 мМ dNTPs та 0,25 U термостабільної Taq-полімерази. Температурний режим ампліфікації: початкова денатурація при 940С - 2 хв, 30 циклів денатурації при 940С - 30 с, відпалу праймерів при 620С - 30 с, синтезу при 720С - 30 с, заключний синтез при 720С - 2 хв. Реакцію реверс-транскрипції та ПЛР проводили в програмованому термоциклері GeneAmp 2400 (Applied Biosystems, США). Після ампліфікації продукти ПЛР розділяли електрофорезом у 1,5% агарозному гелі, фарбували бромовим етидієм та досліджували у променях ультрафіолетового світла.

Отримання кДНК. Реакцію реверс-транскрипції проводили із 0,2 мкг сумарної РНК. Синтез першого ланцюга кДНК ініціювали за допомогою 0,15 мкг випадкових гексануклеотидів (рандом - праймерів) та 200 U зворотної транскриптази M-MLV.

Проведення полімеразної ланцюгової реакції. Для ампліфікації фрагментів кДНК до реакційної суміші додавали 0,5 мкМ специфічних олігонуклеотидних праймерів (табл. 1). Як внутрішній контроль використовували праймери до ділянки ДНК картоплі, що кодує фактор елонгації EF1-б. Параметри ампліфікації: денатурація ДНК (940С Х 30с), відпал праймерів (550С Х 30с), полімеризація - (720С Х 30с), кількість циклів - 35.

Для виявлення 35S промотору ВМЦК трансгенних рослин синтезовано олігонуклеотидні праймери 35SF та 35SR. Позитивним контролем слугувала плазмідна ДНК pBI121 (Clontech), яка містила у своєму складі копію 35S промотору ВМЦК. Для виявлення специфічного CryIIIA трансгену використовували дві пари праймерів в трьох комбінаціях CryF1/CryR1, CryF2/CryR2 та CryF1/CryR2 (табл. 1). Реакційна суміш ПЛР об'ємом 25мкл містила 5х ПЛР буфер, 3мМ МgSO4, 0,2 мM dNTPs, по 0,5 мкМ кожного праймеру, одну одиницю Taq полімерази (Amplysens) та 15-20нг зразків ДНК. Ампліфікацію ДНК здійснювали за модифікацією Touchdown ПЛР.

Для молекулярної ідентифікації мікроміцетів із рослин цукрових буряків використовували метод ампліфікації з метою визначення нуклеотидної послідовності рибосомальних генів. ПЛР проводили із використанням праймерів ITS1/ITS4 за стандартних умов із параметрами ампліфікації: 35 циклів денатурації ДНК (940С Х 30с), відпал праймерів (550С Х 30с), полімеризація (720С Х 30с).

Northern blot аналіз для ідентифікації специфічних фрагментів геному фіто- та міковірусів. Гібридизаційний аналіз застосовували для ідентифікації фрагментів длРНК після їх розділення електрофорезом в агарозному гелі. Трансфер РНК на нейлонову мембрану (Hybond N) здійснювали пасивно і фіксували на мембрані опроміненням УФ світлом. Зондом для гібридизації слугував специфічний продукт реверс-транскрипції, одержаний на матриці длРНК і очищений з агарозного гелю за допомогою QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), який мітили радіоактивною міткою dCTP32 (50 мCi) методом розсіяної приманки. Гібридизували протягом ночі при 420С у розчині: 5х Денхард, 5х SSC, 0,1% SDS, 50% формамід і 100 мкг/мл денатурованої ДНК з тимуса теляти. Радіоавтографію фільтра отримували в касеті з підсилюючим екраном протягом 8 год при - 700С і використанням рентгенівської плівки AGFA.

Кількісний аналіз методом ПЛР у реальному часі визначали на приладі Sequence Detection System, 7000 (Applied Biosystems, США) в присутності інтеркалюючого барвника SYBR Green-I. В реакції використовували праймери BMV1/2 (табл. 1). Оптимізацію реакції ампліфікації здійснювали згідно стандартного протоколу (PE, Applied Biosystems, User Bulletin №2 applied to SYBR Green-I core reagent protocol). Паралельно із експериментальними зразками аналізували серії контролів: позитивного, негативного та NTC (проба, що не містить ДНК, no template control). Для оцінки якості та відтворюваності результатів реакції проводили у двох повтореннях. Дані експериментів оброблено статистично з використанням програми ABI Prism version 1.2.

Нуклеотидну послідовність зразків визначали методом капілярного електрофорезу на приладі ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Для пошуку і аналізу нуклеотидних послідовностей й виведених на їх основі амінокислотних послідовностей в базах даних DDBJ/EMBL/GenBank використовували програми BLAST та оцінювали за критерієм Е (E values) для кожної із пари вирівняних послідовностей. Вирівнювання (alignment) нуклеотидних або амінокислотних послідовностей проводили за допомогою програми CLUSTAL W. Для адекватнішої оцінки філогенетичного аналізу здійснювали два різні і незалежні методи, зокрема найменших квадратів та Parsimony. Обидва методи включені у пакет програм для оцінки філогенії (PHYLIP, версія 3,5). На підставі одержаних даних будували дендрограми, які відображали філогенетичні взаємовідносини між обраними таксономічними одиницями.

Приготування живильних середовищ для культивування рослин в умовах in vitro. В дослідах в основному використовували живильні середовища за прописом Мурасіге-Скуга та Уайта [Калинин и др., 1992].

Приготування живильних середовищ для культивування мікроскопічних грибів в умовах in vitro. Ендофітну (внутрішню) мікобіоту листків та коренеплодів культивували на твердих живильних середовищах. В усіх випадках для культивування грибів використовували модифіковане середовище Чапека із стандартною мінеральною часткою, але без сахарози. Для вилучення епіфітної (поверхневої) мікобіоти буряків застосовували метод змиву з поверхні листків, і наступним розведенням й отриманням суспензії та глибинним посівом у розтоплене живильне середовище. Для дослідження видового складу ризосфери застосовували метод ґрунтових розведень. На 3, 7 та 10 добу під мікроскопом оцінювали поверхню чашки на виявлення колоній грибів [Мирчинк, 1988].

Ідентифікація та особливості культивування ізолятів грибів. Ряд ізолятів ідентифіковано з використанням полімерзно-ланцюгової реакції. До моменту ідентифікації гриби вирощували на картопляно- глюкозному агарі (КГА) у термостаті при температурі 21 - 250С.

Стерилізацію та введення в культуру in vitro рослинних експлантів проводили для отримання стерильного вихідного матеріалу і подальшого його введення в культуру in vitro. Для картоплі, хмелю і цукрових буряків режими стерилізації встановлювали експериментально, згідно загальних правил. Для стерилізації інтактних рослин користувалися набором стерилізуючих речовин: гіпохлоритом натрію і кальцію, препаратами срібла, сулемою, перекисом водню, перманганатом калію. Далі експланти переносили у стерильні автоклавовані пробірки на безгормональні і гормональні живильні середовища й переносили у світлову культуральну кімнату з освітленням 400 лк та температурою 25±1°С [Бутенко, 1989].

Оздоровлення in vitro рослинних культур від бактеріозів, грибів і вірусів проводили із застосуванням методу термотерапії в поєднанні з культурою апікальних меристем. Для розробки модельної біотехнології масового розмноження в промислових масштабах і гарантії отримання вільного від вірусів рослинного матеріалу використовували передані за актом первинні експланти оригінальних сортів хмелю Слов'янка та Заграва Інститутом сільського господарства Полісся УААН.

Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали комп'ютерною програмою Microsoft, а саме Microsoft Excel з врахуванням критерію t Ст'юдента. Основний підхід при статистичних опрацюваннях біотехнологічних маніпуляцій грунтувався на автоматичному застосуванні базових комп'ютерних програм, які були інстальовані виробником при проведенні багатьох аналізів, таких як ПЛР в реальному часі тощо.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Оптимізація і модифікація методу виділення, очистки та діагностики дволанцюгових РНК вірусів. Використання модифікованого методу хроматографії в градієнті целюлози і електрофорезу в 6% ПААГ дозволило провести діагностику і ідентифікацію РНК вмісних фіто- та міковірусів шляхом виділення геномних одноланцюгових РНК (олРНК) чи проміжної вірусної форми длРНК на стадії її біосинтезу (реплікації). Запропонована нами модифікація даного методу, на відміну від класичного [Morris, Dodds, 1979], ґрунтується на проведенні чисельних досліджень і спрямована на прискорення стадії целюлозної хроматографії нуклеїнових кислот та фракціонування длРНК. В результаті аналізу методики нами запропоновано проводити стадію першого низькошвидкісного центрифугування за умов зниження обертів кутового ротору з 8000 до 6000g. Таке центрифугування здійснюється після першого фенольного виділення загальних нуклеїнових кислот. Водночас рекомендовано проводити тільки одну (замість двох) стадію градієнта целюлози для длРНК з досліджуваного зразка. В результаті першої модифікації методу в досліджуваному зразку зберігається більша кількість загальних нуклеїнових кислот. Внаслідок їх целюлозно-хроматографічної очистки в подальшому можливо за одну стадію провести фракціонування вірусних длРНК, що значно скорочує час проведення методу і заощаджує матеріальні витрати дослідника. Після збирання фракції нуклеїнових кислот, з метою переконання в чистоті препарату, їх обробляли ферментом - ДНКазою. Зразок для електрофорезу отримували ресуспендуванням кінцевої фракції длРНК після целюлозного градієнта в 200 мкл буферу STE, що вистачає для проведення п'яти циклів електрофорезів при напрузі 100V протягом 3,5 годин. Це дозволило детально розділити вірусні длРНК для всіх типів вірусів залежно від морфології та заряду (рис. 1).

Особливості діагностики та ідентифікації вірусів трансгенної картоплі (Solanum tuberosum L.). Діагностика дволанцюгових вірусних РНК, трансгену CryIII A та 35S промотору. Листки і пагони трансгенних сортів картоплі NL Atlantic, Superior і Russet Burbank із симптомами скручування і хлорозу відбирали протягом вегетації до закінчення періоду цвітіння й тестували на вірусну інфекцію та присутність трансгенів. Показано, що при інокуляції індикаторних 16 добових рослин перцю (Capsicum annum L.) гомогенатом симптоматичних листків картоплі на 12 добу після інокуляції проявлялись зовнішні симптоми у вигляді скручування та слабкого пожовтіння листків.

Методом електронної мікроскопії виявлено вірусні частки, які повністю підтверджують результати аналізу на рослинах-індикаторах (рис. 2). При серологічній діагностиці трансгенної картоплі запропоновано власну модифікацію методу ІФА (DAS ELISA), де кон'югат специфічних антитіл з ферментною міткою було замінено на кон'югат протеїну А з пероксидазою, який специфічно зв'язується з Fc-фрагментами IgG. Дискретне значення (0,05) виявляли як середньоарифметичне сумарних сигналів (рис. 3).

Доведено, що зразки картоплі сорту NL Russet Burbank були уражені вірусами Y-ВК, S-ВК та Х-ВК. Отримані результати відображають кореляцію з попередніми даними стосовно підвищеної чутливості картоплі до Y-ВК [Valverde, 1990]. Cтійким до тестованих вірусів в умовах відкритого і закритого грунту виявився сорт NL Superior із фоновим показником чутливості (0,046) для S-ВК.

Результати виділення та електрофорезу длРНК фітовірусів, що уражували трансгенну картоплю, були дещо розбіжними по відношенню до результатів серологічної діагностики. Експериментальні дані дали можливість стверджувати про детекцію цим методом Х - вірусу картоплі, який відноситься до групи Potexvirus. Він має довжину 470 - 580 нм, геном представлений одноланцюговою лінійною РНК розміром 6,435 kb та масою 2,0 Х 106. На стадії відтворення в клітинах цей патоген утворює декілька фрагментів специфічних длРНК, які, згідно наших та раніше отриманих даних, описані як специфічні для Х-ВК [Valverde et al, 1990].

Важливим етапом наших досліджень було розробити молекулярно-біологічний діагностикум на основі ПЛР по виявленню 35S промотору трансгенної картоплі компанії Monsanto із ДНК вмісного вірусу мозаїки цвітної капусти (ВМЦК), який виступає регуляторним елементом в більш ніж 80% випадках для відомих генетично модифікованих рослин [Ho et al, 2000].

Для детекції 35S промотору ВМЦК використано синтезовані олігонуклеотидні праймери № 7 та 8 (табл. 1) з утворенням продукту довжиною 163 пари нуклеотидних залишків (пнз). Позитивним контролем слугувала плазмідна ДНК pBI121 (Clontech), яка містить у своєму складі копію 35S промотору ВМЦК. Для пошуку специфічного CryIIIA трансгену нами використано дві пари праймерів (табл. 1) в трьох комбінаціях № 11 і 12 (203 пнз), № 12 йа 13 (179 пнз), а також № 10 та 12 (1086 пнз).

Для збільшення чутливості та специфічності ПЛР запропоновано модифікацію методу - Touchdоwn [Don et al, 1991]. Суть її полягає в тому, що на перших 10 циклів температура відпалювання праймерів знижувалась з 67 до 62оС з інтервалом у 0,5оС у кожному циклі з подальшим продовженням реакції при температурі відпалювання 62оС.

За допомогою ПЛР показано, що сорти картоплі NL Russet Burbank та NL Superior дійсно містять трансген CryIIIA у складі геномної ДНК порівняно з нетрансгенними вітчизняної селекції (Слов'янка, Незабудка, Поляна) (рис. 4).

Доведено, також, що трансген CryIIIA в цих сортах картоплі знаходиться під контролем двох копій 35S промотору ВМЦК, які розташовані поруч, про що свідчить наявність двох продуктів ампліфікації з використанням 35S праймерів (рис. 5).

На підставі цього нами пропонується схематичне зображення частини генетичної конструкції, трансформованої в геном картоплі з наданням стійкості проти колорадського жука (рис. 6).

Необхідно зазначити, що розроблена тест-система з 2002 р. застосовується в практиці в наукових лабораторіях України та за кордоном [Богунов, Гнутова, 2004] для виявлення і ідентифікації специфічного трансгену CryIIIA у складі геномних копій в трансформованих Bt-рослинах й 35S промотору ВМЦК в генетично-модифікованих рослинах та отриманих з них продуктів.

Особливості виділення і ідентифікації карлавірусу хмелю (Humulus lupulus L.) та його дволанцюгової форми РНК при реплікації. Протягом 1998 - 2005 р обстежено рослини хмелю сортів, що занесені до Реєстру сортів України після 1995 р і вважаються новими та перспективними. Показано, що використовуючи буферний розчин 0,1М ФБР рН 7,4 з додаванням 0,001М ДТК та 0,01М NaCl вихід вірусу був максимальним. Для стабілізації віріонів до буфера додавали 0,005М - 0,001М MgCl2 або CaCl2. Концентрування вірусів оптимізували шляхом використання 4-6% ПЕГ м.м. 6000 в присутності 0,3М NaCl, або методом диференційного центрифугування при 30000 об/хв протягом 2 годин. Виділений препарат вірусу, як правило, мав типовий спектр поглинання нуклеопротеїна (А260/280) 1,12 - 1,25. Електронно-мікроскопічний аналіз препаратів свідчить, що віріони мають паличковидну морфологію із розміром в середньому 670 х 19 нм та внутрішнім каналом 3,5-3,7 нм, які віднесено до групи Carlavirus (рис. 7).

Для виділення і ідентифікації реплікативних длРНК карлавірусу хмелю нами запропоновано проведення аналізу з інфікованих експериментально інфекційним хмельовим соком індикаторних рослин квасолі та кабачків. Виділені два фрагмента длРНК із м.м. 5,5 х 106 і 5,2 х 106 являються характерними для карлавірусів, згідно наших та раніше отриманих даних, для шести досліджуваних вірусів цієї групи [Valverde, 1986] (рис. 8).

Виділення та ідентифікація реплікативних форм дволанцюгових РНК вірусу тютюнової мозаїки з рослин перцю (Capsicum anuum L.). Із мезофільних тканин перцю (Capsicum annum L.) виявлено вірусні частинки ВТМ розміром 300 Х 18 нм (рис. 9). Виділення і очищення вірусних длРНК ВТМ на стадії біосинтезу із рослин перцю показало розділення фракції длРНК на багато фрагментів і повністю підтверджує раніше отримані дані з виділення та ідентифікації длРНК ВТМ з інших рослин [Valverde, 1896] (рис. 10).

Особливості виділення та ідентифікації РНК-вмісних вірусів цукрових буряків (Beta vulgaris L.) на стадії реплікації. Із рослин цукрових буряків основну увагу при виділенні длРНК привернули три зразки серед яких були вихідні та гібридна форми БЦ-90 із Сквирського р-ну Київської області. За результатами досліджень із таких рослин виділено три пари длРНК вірусів з високим електрофоретичним розподілом (рис. 11)

За попередніми оцінками, одну пару ізольованих длРНК віднесено до представників фітовірусів родини Partitiviridae, що вміщують дволанцюгову геномну РНК. Загальний розмір геному таких вірусів становить 3,34 kb і представлений двома фрагментами 1,74 kb й 1,6 kb, що співпадає із отриманими нами даними (рис. 14, трек 1, 3). Таку пару длРНК попередньо ідентифіковано як представника Beet 3 Alphacryptovirus [Jordan, 1983]. Дві інші пари длРНК із розмірами 4,2 і 4,6 kb й 1,9 та 2,18 kb відповідно нами ідентифіковано як вірусні, причому останнє твердження пов'язували із значним проявом зовнішніх симптомів на листках рослин, що зовсім не характерно для представників криптовірусів цукрових буряків [Brunt, 1997].

Повторення трьох пар длРНК вірусів у зразках (рис.14, трек 1) свідчить про їх залежність у інфекційному процесі культури цукрових буряків. Тепличні досліди з використанням відібраних інфікованих рослин (коренеплодів) з агроценозів засвідчили підвищену чутливість уражених вірусами буряків до мікопатогенів, зокрема гриба Botrytis cinea Fr., що викликає сіру гниль коренеплодів. У природі, і нашому випадку, він індукував появу побуріння та загнивання уражених коренеплодів, які з часом вкривались сірим пухким нальотом - конідіальним спороношенням гриба як це описано раніше [Пересыпкин, 1991]. Водночас залежно до кількості фрагментів длРНК коренеплодів простежувалась посилена деградація (гниття) буряків. Саме у тих рослин, що містили по три пари длРНК (рис. 11, зразок № 1), вихід рослин після періоду зберігання у сховищі складав біля однієї половини. Таким чином, в результаті виділення длРНК фітовірусів і діагностики зразків цукрових буряків було акцентовано увагу на те, що функціонування латентних вірусів цукрових буряків до кінця не досліджено.

Для подальшої роботи з перегляду наявності криптовірусів цукрових буряків нами поставлено завдання вивчити молекулярно-біологічні властивості і ідентифікувати геномні дволанцюгові РНК цукрових буряків та показати систематичну належність цих длРНК тощо.

Біотехнологічні прийоми з клонування та сиквенування фрагментів дволанцюгових РНК цукрових буряків. Для аналізів длРНК ізольованих із 3,5г листового матеріалу цукрових буряків згідно стандартної методики з власними модифікаціями [Bar-Joseph et al, 1983; Мельничук, Валверді, 2001; Мельничук, 2004] на останньому етапі фракцію длРНК розчиняли у 200мкл DEPC-H2O, визначали концентрацію та розділяли електрофорезом в 1% агарозному гелі (рис. 12).

Результати електрофоретичного аналізу зафіксували наявність трьох дискретних фрагментів длРНК, розміри яких становили близько 1,4, 1,8 і 4,0 kb (рис. 12, трек 1); фрагменти розміром біля 1,4 та 1,8 kb, складали мажорну фракцію длРНК, фрагмент розміром 4,0 kb, ледве фіксувався.

Із-за відсутності безпосередньої інформації щодо існування типу збудника, яку можна отримати тільки після визначення нуклеотидної послідовності, для ідентифікації патогенів нами клоновано кДНК, одержану в реакції реверс-транскрипції (РТ) із використанням длРНК, виділених з листків цукрових буряків. Комп'ютерний аналіз нуклеотидних послідовностей виявив спорідненість фрагментів длРНК до вірусів родини Potyviridae та Partitiviridae.

Принципова схема клонування кДНК, синтезованої на матриці виділених вірусних длРНК, представлена на рис. 13. Нами одержано достатньо високий спектр фрагментів кДНК від 100 до 1000 пнз. (рис. 12, трек 2). Подальша ампліфікація кДНК із використанням специфічного праймеру Р1, комплементарні ділянки до якого представлені у всіх фрагментів кДНК та клонування у відповідний бактеріальний вектор, дозволили ізолювати кожну молекулу кДНК від пулу фрагментів, присутніх у реакційній суміші.

Після трансформації бактерій E. coli кДНК бібліотекою вірусних генів відібрано 85 білих клонів. Подальший етап відбору проводили за розміром фрагментів кДНК в ПЛР з використанням пари олігонуклеотидних праймерів № 3 та 4 (табл.1). На заключному етапі відібрано шість позитивних клонів, які ми назвали pBV1/1, pBV2/1, pBV7/1, pBV8/1, pBV12/1, pBV14/1. Наявні в базах даних білкові послідовності, що мали критерій Е менше ніж 1х10-2, оцінювали як гомологічні (табл. 2). Одержані результати свідчать, що клони pBV7/1 і pBV14/1 належать до потівірусу мозаїки буряків (ВМБ) й кодують часткову амінокислотну послідовність протеїнів СІ, 6К2 та NІa-Vpg специфічного вірусу. Клони pBV1/1, pBV2/1, pBV8/1 і pBV12/1 відзначались високими рівнями гомології і кодували часткові фрагменти РНК-залежної РНК полімерази (РзРп) міковірусів, що належать до родини Partitiviridae. Звідси, на нашу думку, крім вірусної інфекції ВМБ, рослини цукрових буряків також були уражені грибами, які були інфікованими міковірусами.

Таблиця 2 - Ідентифікація виділених вірусних дволанцюгових РНК з листків цукрових буряків

* - РНК-залежна РНК полімераза

При виділенні вірус-специфічних длРНК з рослинних екстрактів нами паралельно виділено і длРНК міковірусів з грибів, якими одночасно були уражені рослини цукрових буряків. Окрім длРНК, які представляли реплікативну форму потівірусу мозаїки, водночас зафіксовано длРНК неописаного раніше міковірусу, геном якого представлений двома фрагментами длРНК, розміром 1,8 та 1,9 kbp.

Порівняльний генетичний аналіз і ідентифікація відомих та раніше не описаних вірусів цукрових буряків. Аналіз амінокислотних послідовностей, які кодують клоновані нами кДНК клони, виявив високий ступінь гомології (близько 50%) у клонів pBV1, 2, 8, 12 із частковими послідовностями РзРп міковірусів, що уражують фітопатогенні базідіальні гриби Heterobasidion annosum та Helicobasidium mompa. Встановлено, що ці віруси, згідно існуючої класифікації, належать до родини Рartitiviridae, а також до інших длРНК міковірусів цієї родини (табл. 3).