Микробиологическая лаборатория. Приготовление препаратов

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЗНАКОМСТВО С МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИЕЙ

Цель микробиологических исследований - установить факт наличия или отсутствия возбудителя в организме больного и на объектах окружающей среды.

Объект изучения медицинских микробиологических лабораторий - патогенные биологические агенты.

Задачи микробиологических исследований - идентифицировать микроорганизмы в исследуемом материале, определить их видовую принадлежность, а также установить чувствительность выделенных микроорганизмов к антимикробным препаратам.

Основные методы выявления микроорганизмов

1. Микроскопические методы включают приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер, так как многие микроорганизмы лишены морфологических и тинкториальных особенностей.

2. Микробиологические методы позволяет точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале: включает культивирование, выделение чистой культуры и идентификацию микроорганизмов с учетом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, токсигенных и антигенных свойств.

3. Биологические методы направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение возбудителя, включают заражение лабораторных животных с последующим исследованием их.

4. Серологические методы выявления специфических антител и антигенов возбудителя - важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний.

5. Аллергологические методы. Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний (кожно-аллергические пробы).

Оборудование микробиологической лаборатории

Для выращивания, хранения культур, стерилизации лабораторной посуды и других целей используется следующая аппаратура.

1. Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная температура.

2. Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.

3. Холодильник. Используется в микробиологических лабораториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, вакцин, сывороток и прочих биологически активных препаратов при температуре около 4°С.

4. Центрифуги. Применяются для осаждения микроорганизмов, эритроцитов и других клеток, для разделения неоднородных жидкостей (эмульсии, суспензии).

5. Сушильно-стерилизационный шкаф (печь Пастера). Предназначена для воздушной стерилизации лабораторной посуды и других материалов.

6. Стерилизатор паровой (автоклав). Предназначен для стерилизации паром под давлением.

Основные правила поведения и работы в микробиологической лаборатории

1. В помещение микробиологической лаборатории нельзя входить без специальной одежды - халата и белой шапочки или косынки, сменной обуви.

2. Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнее платье на халат.

3. В помещении бактериологической лаборатории категорически запрещается курить, принимать пищу, хранить продукты питания.

4. Весь материал, поступающий в лабораторию, должен рассматриваться как инфицированный.

5. При распаковке присланного заразного материала необходимо соблюдать осторожность: банки, содержащие материал для исследования, при получении обтирают снаружи дезинфицирующим раствором и ставят не прямо на стол, а на подносы или кюветы.

6. Переливание жидкостей, содержащих патогенных микробов, производят над сосудом, наполненым дезинфицирующим раствором.

7. О случаях аварии с посудой, содержащей заразный материал, или пролевания жидкого заразного материала надо немедленно сообщить заведующему лабораторией или его заместителю. Мероприятия по обеззараживанию загрязненных патогенным материалом осуществляется немедленно.

8. Поступающий в лабораторию материал для исследования регистрируют в специальном журнале и маркируют.

9. По окончании работы руки, инструменты, рабочее место обрабатывают дезинфицирующим раствором. Зараженный материал и ненужные культуры подлежат обязательному уничтожению, по возможности в тот же день.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ. ДЛЯ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях используют для этой цели препаровальные иглы.

Приготовление препарата для изучения микроорганизмов в нативном виде.

Метод «висячей капли». Препарат готовят на покровном стекле, в центре которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края.

Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40Х и исследуют препарат.

Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40Х.

После микроскопии препараты «раздавленной» капли или «висячей» капли опускают в дезинфицирующий раствор.

Приготовление фиксированных препаратов-мазков.

Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок. При таком распределении материала в мазке при микроскопии можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидком виде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать.

Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур микроорганизмов фиксируют погружением на 15-20 мин. в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт и другие фиксирующие жидкости.

Рис. 1. Фиксация прапарата-мазка пламенем.

МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ

Простой метод. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.

Сложные методы. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоты и др. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Окрас методом Грама является сложным методом.

Рис.2. Окрас методом Грама (схема).

· На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель слить.

· Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.

· Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

· Промыть водой.

· Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.

ЗНАКОМСТВО С МИКРОСКОПИЧЕСКОЙ ТЕХНИКОЙ. РАБОТА С БИОЛОГИЧЕСКИМ МИКРОСКОПОМ

Для микроскопических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный и другие) и специальные методы микроскопии (фазово-контрастный, темнопольный и др.).

Рис. 3. Светооптический биологический микроскоп.

При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует строго придерживаться определенного порядка в работе:

1. на приготовленный и окрашенный мазок на предметном стекле нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами;

2. повернуть револьвер до отметки иммерсионного объектива Х90;

3. осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла;

4. установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта;

5. провести окончательную фокусировку препарата микроскопическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота.

Рис. 4. Иммерсионный объектив (с черной полосой) погружают в каплю масла на препарате-мазке.

По окончании работы с микроскопом необходимо вытереть масло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый объектив Х8.

ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРЫ ПО МОРФОЛОГИЧЕСКИМ И ТИНКТОРИАЛЬНЫМ ПРИЗНАКАМ

При микроскопии мазков изучают морфологические и тинкториальные свойства культур бактерий: форму, структуру и размер клеток, наличие спор, капсулы, жгутиков, пилей, расположение клеток относительно друг друга, цвет в соответствии с использованными методами окраски, наличие и характер подвижности.

Рис. 5. Стрептококки (род. Streptococcus), стафилококки (род Staphylococcus), менингококки (род Neisseria).

Рис. 6. Кишечная палочка (род. Escherichia), дифтерийная палочка (род Corynebacterium), микобактерии туберкулеза (род Mycobacterium).

Рис. 7. Возбудитель сибирской язвы (род Bacillus), возбудитель газовой гангрены (род Clostridium).

ОТБОР И ДОСТАВКА МАТЕРИАЛА В ЛАБОРАТОРИЮ

Основные правила взятия и направления материала в микробиологическую лабораторию.

Результаты микробиологических исследований во многом зависят от правильного выбора, соблюдения всех правил отбора материала и направления его в лабораторию. Выбор материала определяется клинической картиной заболевания, предполагаемой локализацией возбудителя в организме на данном этапе и путей его выделения в окружающую среду.

1. Материал берут в ранние сроки заболевания, до начала антимикробной терапии в достаточном количестве.

2. Следует исключить попадание в материал антибиотиков, антисептиков, дезинфектантов.

3. При заборе, хранении и направлении материала в лабораторию строго соблюдаются правила техники бактериологической безопасности.

4. Материал собирают, соблюдая правила асептики для предупреждения его возможной контаминации нормальной микрофлорой организма больного и микроорганизмами окружающей среды. Используют стерильные инструменты и стерильную посуду, закрывающуюся ватно-марлевыми пробками. После взятия материала его в максимально короткие сроки направляют в лабораторию. При отсутствии такой возможности материал, за исключением ликвора, сохраняют непродолжительное время в холодильнике при 4°С.

5. Материал транспортируют в специальных биксах, пеналах или металлических контейнерах, которые после использования подвергают дезинфекции.

6. В микробиологической лаборатории все остатки патологического материала подлежат уничтожению (путем автоклавирования или сжигания).

Все материалы, направляемые в лабораторию, должны иметь сопроводительный документ - направление на специальном бланке, где указаны фамилия, имя, отчество больного, возраст, вид материала, дата взятия, предполагаемый клинический диагноз и другие сведения.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериологические методы исследования - это совокупность методов изучения свойств микроорганизмов, определения их систематического положения. Для этого необходимо прежде всего изолировать отдельные виды микробов и вырастить их в виде так называемых «чистых культур», а затем идентифицировать, т.е. установить соответствие выделенных микроорганизмов видам, описанным в специальных определителях.

Колония - это популяция микробных клеток одного вида, сформировавшаяся в результате деления одной микробной клетки в условиях культивирования на плотной питательной среде при оптимальной температуре.

Чистая культура - масса клеток, состоящая из микроорганизмов, принадлежащих одному виду и полученных как потомство одной клетки. Чистую культуру обычно получают путем пересева на стерильную питательную среду клеток, взятых из отдельно стоящей колонии бактерий.

Культуральные свойства бактерий устанавливаются по морфологии колоний и особенности роста культуры на питательных средах.

Биохимические признаки (свойства) бактерий определяются набором ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Питательные среды предназначены для накопления, выделения, изучения и сохранения микроорганизмов.

По составу питательные среды могут быть синтетическими и натуральными.

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими (0, 2-0, 7% агара) иплотными (1, 5-2% агара).

Различают питательные среды общего назначения (универсальные) и специальные питательные среды. Питательные среды общего назначения пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и применения в качестве основы для приготовления специальных питательных сред. Специальные питательные среды предназначены для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изучения их свойств и хранения.

Рис. 7. Плотные питательные среды в чашках Петри.

МЕТОДЫ ПОСЕВОВ

В зависимости от цели исследования, характера посевного материала и среды используют различные методы посева. Все они включают обязательную цель: оградить посев от посторонних микробов, поэтому посев производят в асептических условиях.

Для посевов на плотные питательные среды применяют шпатель, бактериологическую петлю, иглу, тампон. При посеве проводят петлей по поверхности среды линии, оставляя при этом клетки бактерий на среде. После посева чашки закрывают и переворачивают их вверх дном. Надписи на чашках делают со стороны дна, а на пробирках - в верхней части.

Рис. 8. Посев культуры на плотную питательную среду (слева); результат посева: видны колонии бактерий (в центре и справа).

При посеве на жидкую среду петлю слегка погружают в жидкость и растирают посевной материал на стенке пробирки, после чего смывают его средой.

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ БАКТЕРИЙ

микробиологический бактерия гриб посев

Для успешного культивирования, помимо правильно подобранных сред и правильно произведенного посева, необходимы оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение воздухом). Культивирование анаэробов сложнее, чем аэробов, для удаления воздуха из питательной среды используют различные способы.

Выделение отдельных видов бактерий (чистой культуры) из исследуемого материала, содержащего, как правило, смесь различных микроорганизмов, является одним из этапов любого бактериологического исследования. Чистой культурой микробов получают из изолированной микробной колонии.

При выделении чистой культуры из крови (гемокультуры) ее предварительно «подращивают» в жидкой среде: 10-15 мл стерильно взятой крови засевают в 100-150 мл жидкой среды. Соотношение засеваемой крови и питательной среды 1:10 не случайно - так достигается разведение крови (неразведенная кровь губительно действует на микроорганизмы).

Этапы выделения чистой культуры бактерий

I этап (нативный материал)

Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре).

Посев на плотные питательные среды (получение колоний).

II этап (изолированные колонии)

Изучение колоний (культуральные свойства бактерий).

Микроскопическое изучение микробов в окрашенном мазке (морфологические свойства бактерий).

Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры.

III этап (чистая культура)

Определение культуральных, морфологических, биохимических

и других свойств для идентификации культуры бактерий

Размещено на Allbest.ru