Размещено на http://www.allbest.ru/

Исследование адаптивной реакции популяции дрожжевых клеток на действие ионизирующего излучения



ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в радиобиологии и радиоэкологии наиболее актуальным направлением является изучение эффектов «малых» доз. Это обусловлено тем, что биологические объекты подвергаются облучению в «малых» дозах от естественного радиационного фона и в результате различных техногенных факторов. «Большие» дозы в настоящее время получают лишь больные при лучевой терапии и отдельные лица при авариях на производствах атомной промышленности. Вопрос о биологических эффектах действия «малых» доз ионизирующего излучения, а также проблема их количественной оценки продолжают оставаться предметом многочисленных дискуссий и мнений по поводу их опасности для человека и среды его обитания. Понятие «малые дозы» не имеет единого определения. Принято считать, что «малые» дозы _ это дозы, равные естественному фоновому облучению или превышающие его в десять раз; это дозовые пределы для профессиональных работников или дозы, незначительно превышающие их и не оказывающие непосредственного влияния на состояние здоровья. ионизирующий излучение клетка дрожжевой

В последние годы в радиобиологии были открыты новые эффекты воздействия ионизирующего излучения в области «малых» доз. К ним относятся эффект гормезиса, адаптивный ответ, гиперчувствительность. Все это приводит к изменению радиочувствительности биологического объекта и поэтому требует детального исследования. Так, на примере изменения радиочувствительности одноклеточных организмов предварительным облучением «малой» дозы можно оценить эффект адаптации клеток к повреждающему облучению.

Целью данной работы является экспериментальное исследование адаптивной реакции популяции дрожжевых клеток на действие ионизирующего излучения.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести литературный обзор по теме исследования.

2. Освоить методы культивирования дрожжей и количественного учета клеток в камере Горяева.

3. Приготовить образцы популяции дрожжевых клеток.

4. Построить кривую выживаемости популяции дрожжевых клеток при облучении в диапазоне доз 2-12 кГр.

5. Определить значения показателей летальной дозы излучения LD₅₀ и LD₃₇.

6. Исследовать адаптивный ответ дрожжевых клеток на действие "малыми" дозами излучения.



1. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ

1.1 Ионизирующее излучение: основные характеристики

Ионизирующим излучением (ИИ) называется поток заряженных или нейтральных частиц, при взаимодействии которых свеществом образуются электрические заряды различных знаков.[1]К ИИ относятся электромагнитные и корпускулярные излучения, энергия которых превышает величину «потенциала ионизации» 10-12 эВ. [2]

Характеристиками ИИ являютсятип частиц, их энергия, направление распространения, интенсивность, энергетическое, пространственное и временное распределения.[1]

По своему характеру взаимодействия со средой ИИ разделяют на непосредственно ИИ и косвенно ИИ.

Непосредственное ИИ, это излучение, состоящее из заряженных частиц, имеющих кинетическую энергию, достаточную для ионизации при столкновениях. В качестве примера это могут быть протоны, электроны, альфа-частицы и т. д

Косвенное ИИ, это излучение, состоящее из незаряженных частиц, которые могут создавать непосредственно ионизирующее излучение и (или) вызывать ядерные превращения. Например, нейтроны, г-кванты.

Обычно различают первичное и вторичное ИИ. Первичное ИИ, это излучение, которое в рассматриваемом процессе взаимодействия со средой принимается за исходное. ВторичноеИИ возникает в результате взаимодействия первичного ионизирующего излучения с данной средой. [3]



1.2 Прямое и косвенное действие ионизирующего излучения на клетку

ИИ обладают очень высоким биологическим эффектом. Они способны вызывать ионизацию любых химических соединений биосубстратов, образовывать активные радикалы в клетках живых тканей. Вследствие этого результатом биологического действия радиации является, как правило, нарушение нормальных биохимических процессов с последующими функциональными и морфологическими изменениями в клетках и тканях животных или человека.

В основе первичных радиационно-химических изменений молекул среды лежать два механизма, обозначаемые как прямое и косвенное действие ИИ.

Под прямым действием понимают такие изменения, которые возникают в результате поглощения энергии излучения самими исследуемыми молекулами («мишенями»). Под косвенным действием понимают изменения молекул в растворе, вызванные продуктами радиолиза воды или растворенных веществ, а не энергией излучения, поглощенной самими исследуемыми молекулами.

Если мы рассматриваем косвенное действие ИИ, то наиболее существенное действие оказывает процесс радиолиза воды, составляющей основную массу вещества клетки (до 90%). При радиолизе воды молекула ионизируется заряженной частицей, теряя при этом электрон:

Ионизируемая молекула воды реагирует с другой нейтральной молекулой воды, в результате чего образуется радикал гидроксила ОН*



Свободный электрон взаимодействует с окружающими молекулами воды; возникает сильно возбужденная молекула H₂O*, которая, в свою очередь, диссонирует с образованием двух радикалов: ОН* и Н*

Свободные радикалы содержат неспаренные электроны и поэтому отличаются чрезвычайно высокой реакционной способностью. Время их жизни в воде не более 10^-5 с. За этот период они либо рекомбинируют друг с другом, либо реагируют с растворенными субстратом.

В присутствии кислорода образуются и другие продукты радиолиза, обладающие окислительными свойствами: гидропероксиданый радикал ; пероксид и атомарный кислород:

Кроме этих окислительных продуктов в процессе радиолиза воды возникает стабилизированная форма электрона -- гидратированные электроны (e^-·aq). Они также обладают высокой реакционной способ ностью, но уже в качестве восстановителя, а потому реагируют с про дуктами радиолиза и другими легко восстанавливающимися вещества ми, в частности с дисульфидными группами. Другим восстановителем, образующимся в процессе радиолиза воды, является атомарный водо род.

В клетке организма в аналогичной ситуации процесс протекает значительно сложнее, чем при облучении воды, так как поглощающим веществом здесь служат крупные органические молекулы, повреждае мые прямым действием радиации либо продуктами радиолиза воды. Возникающие при этом органические радикалы также обладают не спаренными электронами, а, следовательно, крайне реакционноспособны. Располагая большим количеством энергии, они легко могут привести к разрыву химических связей в жизненно важных макромолекулах. Именно этот процесс и происходит чаще всего в промежутке между образованием ионных пар и формированием конечных химиче ских продуктов.

Кроме того, биологический эффект облучения усиливается за счет кислорода, который всегда присутствует в среде и обладает сенсибилизирующим действием.

Следует иметь в виду, что изменения облучаемого субстрата в клет ке, возникающие на каждом из этапов, не всегда являются оконча тельными. Как правило, эти изменения на молекулярном уровне но сят промежуточный характер, и конечный результат в каждом конкрет ном случае не может быть предсказан, так как наряду с повреждением может произойти и репарация (восстановление) исходного состояния.[4]

1.3 Реакции клетки на действие ионизирующего излучения

На уровне клетки и субклеточных структур ИИ вызывают различные реакции - от временной задержки деления клеток до их гибели.

В основе радиационного повреждения клеток лежат нарушения ультраструктуры органелл и связанные с этим изменения обмена веществ. В таблице 1 представлены все уровни радиационных повреждений.

Таблица 1. Радиационные повреждения на всех уровнях

ВРЕМЯ	ЭФФЕКТ ВОЗДЕЙСТВИЯ
10-24 - 10-4 c 10-16 - 10-8 c	Поглощение энергии (рентгеновское, г-нейтронное излучения) Поглощение энергии (электроны, протоны, б-, в- частицы)
10-12 - 10-8 c	Физико-химическая стадия. Перенос энергии в виде ионизации на первичной траектории. Ионизированные и электронно-возбужденные молекулы.
10-7 - 10-5 c, несколько часов	Химические повреждения. Прямое действие. Косвенное действие. Свободные радикалы, образующиеся из воды. Возбуждение молекулы до теплового равновесия.
Микросекунды, секунды, минуты, несколько часов	Биомолекулярные повреждения; изменения молекул белков, нуклеиновых кислот под влиянием нарушения процессов обмена.
Минуты, часы, недели	Ранние биологические и физиологические эффекты. Биохимические повреждения. Гибель клеток и отдельных животных.
Годы, столетия	Отдаленные биологические эффекты; стойкое нарушение функций; генетические мутации, действующие на потомство; соматические эффекты (рак, лейкоз, сокращение продолжительности жизни, гибель организма).

Повреждения цитоплазматических структур проявляются в нарушении энергетического обеспечения клеток и проницаемости клеточной мембраны, нарушении обмена веществ, целостности лизосом, что ведёт к гибели клеток.

Изменения в ядре клетки под влиянием приводят к торможению синтеза ДНК. Возникают однонитевые и двунитевые разрывы, приводящие к хромосомным нарушениям. Появляются генные мутации. При однонитевых разрывах и других незначительных повреждениях могут идти репаративные процессы. Повреждения ядра приводит к синтезу изменённых белков, которые впоследствии способствуют образованию злокачественных опухолей, вторичных радиотоксинов, вызывающих лучевую болезнь и преждевременное старение. Наиболее чреваты последствиями повреждения генома клетки и хромосомного аппарата, ведущие к нарушению механизма митоза.

Малые дозы ИИ вызывают обратимые изменения клетки. Они проявляются сразу или через несколько минут после облучения и с течением времени исчезают. К ним относятся: ингибирование нуклеинового обмена, изменения проницаемости клеточных мембран, задержка митозов, изменения хроматина ядер и др.

При «больших» дозах облучения в клетках наступают летальные изменения, приводящие к их гибели до вступления в митоз, интерфазная гибель, либо в момент митотического деления, митотическая репродуктивная гибель.

Основной причиной репродуктивной гибели клеток являются структурные повреждения ДНК, возникшие под влиянием облучения. Погибают все делящиеся клетки. Гибель клеток ведёт к опустошению тканей, нарушению их структуры и функции.

Полное подавление митозов наступает после воздействия больших доз ИИ, когда клетка значительное время продолжает жить, но необратимо утрачивает способность к делению. В результате такой необратимой реакции на облучение часто образуются патологические формы гигантских клеток, содержащие несколько наборов хромосом вследствие их репликации в пределах одной и той же не разделившейся клетки.

1.4 Зависимость биологического эффекта от дозы излучения. Кривая«доза-эффект»

Строгие количественные эксперименты впервые были проведены в конце 20-х годов. Для количественных экспериментов радиобиологи стали использовать клоны генетически однородных клеток, вирусные частицы, препараты макромолекул, т. е. такие системы, в которых легко определить реакцию единичного объекта на действие излучения в данной дозе.

Уже в первых радиобиологических исследованиях отмечалась важнейшая закономерность -- вероятностная природа проявления реакции клеток на облучение. При оценке зависимости доли погибших клеток от величины дозы облучения выяснялось, что различные одноклеточные объекты гибнут при самых малых дозах облучения, с ростом дозы увеличивается число погибших клеток, однако даже при облучении в очень высоких дозах некоторое число клеток сохраняет жизнеспособность.

Существенно, что с ростом дозы облучения наблюдалось увеличение не столько степени проявления эффекта (глубины поражения отдельной клетки), сколько доли летально пораженных клеток в облученной популяции.

Примеры типичных графических кривых, отражающих зависимость доли выживших клеток от величины дозы облучения (кривые «доза-эффект»).

На графике на оси абсцисс откладывают величину дозы, а на оси ординат - меру радиобиологического эффекта: выживаемость клеток, выход хромосомных аберраций, интенсивность дыхания и т. п.

Для построения этих кривых определенное количество объектов данного вида облучали в широком диапазоне доз; после облучения в каждой дозе определяли долю объектов, сохранивших исходные свойства, по отношению к их общему числу до облучения. Основными параметрами, которые определяются при построении кривой, является максимальный возможный эффект (Е_max) и доза, что вызывает полумаксимальный эффект (LD₅₀). [1]

1.5 Адаптивная реакция дрожжевых клеток

Адаптивный ответ - это реакция биологических объектов, которая заключается в том, что после действия адаптирующих малых доз, при повторном облучении через определенный интервал времени больших повреждающих доз, радиобиологических эффект от повреждающей дозы понижается. Другими словами приобретение биологическим объектом устойчивость к поражающему действию излучения в большой дозе.

Специфической особенностью радиационно АО является значительная, порой более чем на несколько порядков, разница в величинах адаптирующего и повреждающего воздействия. Обычно первая доза не вызывает регистрируемых нарушений, но при дополнительном облучении в высокой дозе наблюдается значительное снижение выхода радиогенетических повреждений, по сравнению с однократным острым облучением в суммарной дозе.

Кроме основного отличия в величине адаптирующей и повреждающей дозы стоит отметить некоторые характерные величины: время между завершением предварительного облучения адаптирующей дозой и началом облучения повреждающей дозой; и время сохранения АО клеток. В частности, для клеток интервал между облучениями может составлять от 4 до 6 часов, а длительность сохранения эффекта от часов до месяцев.

Обязательное соблюдение интервала времени между адаптирующей и повреждающей дозами указывает на то, что программа переключения клеток на АО требует сравнительно продолжительной перестройки радиорезистентности, которая может сохраняться в течение многих клеточных циклов. Так, если экспозиция адаптивного ответа на клеточном уровне обычно требует 4--6 часов, то сохраняться ответ может несколько часов, суток, месяцев.

Выделяют два возможных способа реализации, адаптирующего воздействия:

· включение новой генетической программы;

· индуцированные радиацией синтез белков и мобилизация антиокислителей, т.е. эндогенных защитных ресурсов клетки, в количествах, способных поддержать состояние готовности к АО в течении нескольких клеточных поколений

Таким образом, можно сделать вывод, что АО это специфическая общая реакция клеток, возникающая в ответ на незначительное повреждающее воздействие стресорного типа.



2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

В данной работе для проведения исследований в качестве биологического объекта взяты представители микроорганизмов: винные дрожжи, относящиеся к классу грибов.

Дрожжи - грибы, которые не образуют специфического вегетативного тела - мицелия и существуют в одноклеточной форме. Дрожжи живут в жидких или полужидких субстратах, в которых много органических веществ: например, в сахарном растворе, оставленном на несколько дней в помещении при комнатной температуре, появляется пена, а запах становится алкогольным - это дрожжи, попав из воздуха в раствор, начинают активно расти и размножаться.

Дрожжи имеют клетки шаровой, лимонообразной, овальной или яйцевидной,палочковидной или вытянутой, амебообразной, ветвистой формы размером от 5-6 до 10-14 мкм. Они размножаются при помощи почкования и спорообразования.

Винные дрожжи обладают более высокойспиртоустойчивостью по сравнению с другими дрожжами, а также способны подавлять другие микроорганизмы во время сбраживания вина.

Дрожжи в питательной среде растут до тех пор, пока содержание питательных компонентов среды, не достигнут минимума, после рост дрожжей прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ, то получим периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве). Кривая зависимости логарифма числа живых клеток от времени, называется кривой роста. Она имеет четыре фазы роста, протекающие с разными скоростями.

Промежуток времени между инокуляцией и достижением максимальной скорости деления находится в начальной фазе роста. Продолжительность этой фазы зависит от условий культивирования и возраста инокулята, а также от того, насколько пригодна для роста питательная среда. Когда происходит максимальная скорость деления клеток дрожжей, это означает, что дрожжи перешли во вторую стадию роста, называемая, экспоненциальной фазой роста. После периода экспоненциальной фазы рост клеток начинает замедление, это связано с большой плотности дрожжевых культур или накопления токсичных продуктов обмена. Эти факторы вызывают переход к третьей стационарной фазе. В стационарной фазе происходят такие процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки; другие еще долго сохраняют жизнеспособность - до тех пор, пока есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков. Когда все запасы истрачены и в питательной среде не осталось пригодных для питания веществ, происходит переход к последней фазе - фазе отмирания.

Далее мы будем рассматривать клетки дрожжей, находящиеся в стационарной фазе роста.

Основными критериями для выбора биообъекта стали: высокая скорость размножения, размер дрожжей и доступность.

Биологические объекты содержались в питательной среде состава: 4% сахара, 96% дистиллированной воды. Разведение суспензии и дальнейшее выдерживание дрожжевых клеток в питательной среде осуществлялось при температуре 20?С. Дрожжи разводились 0,16 г на 80 мл питательной среды, начальная концентрация клеток составляла 10⁸ клеток/мл. Начальную концентрацию определяли с помощью камеры Горяева и микроскопа МБИ-15.



2.2 Источники ионизирующего излучения и условия облучения

В данной работев качестве адаптирующего ИИиспользовался радионуклидный источник ¹³⁷Cs. При повторном воздействии ИИ, которое называется повреждающим, использовался поток электронов, полученных на линейном ускорителе.

Радионуклидный источник 137Cs

В работе использовали г - излучения изотопа ¹³⁷Cs с мощностью дозы 10^-4 - 10^-2 Гр/ч. Варьирование мощности дозы осуществляется изменением расстояния от источника. Энергия гамма-излучения радионуклида: 0,662 МэВ.

¹³⁷Cs извлекается методами соосаждения с гексацианоферратами железа, никеля, цинка или фторовольфраматом аммония из растворов, полученных при переработке отходов ядерных реакторов. ¹³⁷Cs является дочерним продуктомраспадануклида¹³⁷Xe(Т _Ѕ = 3,818 мин):

, (6)

¹³⁷Cs претерпеваетв--распад(Т _Ѕ = 30,17 лет), в результате которого образуется стабильный изотоп бария¹³⁷Ba:

, (7)

В 94,4% случаев распад происходит c промежуточным образованием ядерного изомера ¹³⁷Ba^m (его период полураспада составляет 2,55 мин), который в свою очередь переходит в основное состояние с испусканием гамма-кванта с энергией 661,7 кэВ (или конверсионного электрона с энергией 661,7 кэВ, уменьшенной на величину энергии связи электрона).

В данной работе использовался лабораторный источник, который находится в свинцовой бочке. Облучение с помощью данного источника проводилось в лаборатории прикладной ядерной физики кафедры ЭФ ФТИ УрФУ.

Линейный ускоритель электронов модели УЭЛР-10-10С2

В настоящее время в Физико-технологическом институте УрФУ расположен инновационно-внедренческий центр радиационной стерилизации. В нем расположен линейный ускоритель электронов модели УЭЛР-10-10С2 «КОРАД» который предназначен для использования в качестве источника электронов для радиационной стерилизации медицинских изделий, облучения продуктов питания, облучения заготовок термоусаживаемых изделий и других радиационно-технологических процессов.

На ускорителе образцы облучались дозами в пределах от 2 до 12 кГр. Для того чтобы получить желаемые дозы, на образцы выкладывалась защита из алюминия.

Для определения поглощенной дозы и контроля облучения используются дозиметры на основе сополимера с 4-диэтиламиноазобензоловым красителем СО ПД(Э)-1/10.

Дозиметр СО ПД(Э)-1/10, относящийся к цветовым визуальным индикаторам дозы, предназначен для определения поглощенной дозы фотонного и электронного излучения в диапазоне доз 1-10 кГр. Он представляет собой полимерную пленку размером 10 х 35 мм. Данный дозиметр может использоваться в водном растворе, что позволяет производить дозиметрический контроль в пробирках типа эппендорфас питательной средой.

Определение поглощенной дозы после облучения осуществляется путем измерения оптической плотности облученной полимерной пленки на спектрофотометре на длине волны 512 нм.



2.3 Методика анализа жизнеспособности клеток

Для изучения биологического эффекта действия ионизирующего излучения определялось жизнеспособность клеток в клеточной культуре при помощи микроскопа МБИ-15 и камеры Горяева.

Универсальный исследовательский биологический микроскоп МБИ-15 предназначается для визуального наблюдения и фотографирования объектов в проходящем и падающем свете. В состав каждого микроскопа входят наборы объективов, окуляров, фотоокуляров и принадлежностей.

Микроскоп может применяться для исследований в области биологии, ботаники, зоологии, а также в других областях науки и техники.

Счетные камеры используются для подсчета крупных объектов - дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Состоит из толстого предметного стекла, имеющего прямоугольное углубление (камеру) с нанесенной микроскопической сеткой и тонкого покровного стекла. Камера разработана профессором Казанского университета Горяевым Н.К. Благодаря увеличенному объему сетки, отличается большей точностью подсчета, по сравнению с другими камерами.

Для того чтобы отличить живые клетки от мертвых, использовалась методика окрашивания. Метиленовая синь имеет способность присоединяться к молекулам кислот, таких, как, например, содержащаяся в клетках дрожжей дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). При этом живые клетки дрожжей способны разлагать метиленовую синь, проникшую через клеточную мембрану. В результате мертвые клетки окрасятся в синий цвет, а живые не окрасятся. Поскольку метиленовая синь токсична для клеток, ее концентрация была ниже 0,1%, и после того, как дрожжевые клетки были окрашены, они подсчитаны в течение получаса.

Обработку результатов проводили в программном пакете «MicrosoftExcel». Вычислялось среднеквадратическое отклонение полученных значений.



3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Построение кривой фазы роста дрожжевых клеток

В ходе экспериментов одной из главных задач было построение кривой фазы роста контрольной группы винных дрожжей. Для этого соблюдались постоянные условия, такие как, температура 20?С и концентрация сахара в растворе 4%. Дрожжи разводились 0,16 г на 8 мл раствора. Начальная концентрация живых клеток дрожжей составляла 10⁷ клеток/мл. Измерение количества клеток проводилось в счетной камере Горяева.

Представлена кривая фазы роста дрожжевой популяции в питательном растворе. Анализируя кривую фазы роста, видно, что экспоненциальная фаза роста дрожжевых культур продолжается в течении первых пяти часов после размещения дрожжевых клеток в питательную среду. После пяти часов дрожжи переходят в стационарную фазу роста, это означат, что число клеток остается константным, так как новые клетки образуются с той же скоростью, с которой погибают старые клетки. Клетки дрожжей сохраняют свою жизнеспособность, так как для этого в питательной среде достаточно необходимых веществ.

Главной задачей было определить стационарную фазу роста. Так как дрожжевые летки в стационарной стадии роста имеют 100% эффективность роста, очень гомогенны по своим размера и чувствительны к действию ионизирующего излучения. При облучении популяции дрожжей в логарифмической стадиичасть этих клеток являются диплоидными, имеющими двойной набор хромосом и характеризующимися повышенной устойчивостью к действию ионизирующего излучения. Именно по этой причине дрожжевые клетки в радиобиологических экспериментах не облучают в логарифмической стадии роста. Фаза отмирания начинается через 30 суток после помещения популяции дрожжей в питательную среду.



3.2 Построение кривой выживаемости

В сериях экспериментов были изучены закономерности выживаемости клеток винных дрожжей от дозы.

Для построения кривой "доза-эффект" образцы были облучены дозами 2 кГр, 4 кГр, 6 кГр, 8 кГр, 10 кГр, 12 кГр. Дрожжи находились в стационарной фазе роста. Во время воздействия ИИоблучаемые образцы и контрольные образцы размещались в пробирках типа эппендорф по 1,5 мл. Контроль на время облучения оставался в лаборатории в тех же условиях, что и облучаемые образцы. Для того чтобы получить желаемые дозына образцы выкладывалась защита из алюминия.

Подсчет клеток в камере Горяева осуществлять сразу после облучения, через час и через сутки. Выживаемость оценивалась по отношению к контролю, который не облучался, но находился в тех же условиях, что и облученные образцы. Полученные кривые «доза-эффект» для дрожжевой культуры при облучении образцов на линейном ускоритель электронов модели УЭЛР-10-10С2

При анализе кривых «доза - эффект»можно сказать, что выживаемость клеток уменьшается с увеличением дозы ионизирующего излучения. Эффект наблюдается при подсчете клеток сразу же после облучения. Через час после облучения выживаемость уменьшается. Также по анализу кривой можно определить показатели LD₅₀ и LD₃₇, которые составили 4 кГр и 6 кГр соответственно. Данный показатель соответствует литературным данным.

Данная кривая «доза-эффект» позволяет экспериментально определить значения показателей летальной дозы излучения LD50 и LD37. Эти значения нам понадобятся для дальнейшего эксперимента по адаптивной реакции популяции дрожжевых клеток. В этом эксперименте мы будем сравнивать показатели летальной дозы для образцов без предварительного облучения и с предварительным облучением.



3.3 Проявление адаптивной реакции дрожжевых клеток

В экспериментах был изучен адаптивный ответ на повторное облучение дрожжевых клеток. Была выделена контрольная группа (КГ1) винных дрожжей, которая не подвергалась адаптирующему облучение, и образцы (КГ2), которые облучались предварительно адаптирующей дозой. Обе группы образца находились в равных условиях обитания. КГ2 была помещена под источник г-излучения ¹³⁷Cs на 3-е суток. Мощность адаптирующей дозы составила 10^-3 Гр/ч. Поглощенная доза предварительного облучения составила 10,69 сГр. Адаптивная доза должна быть меньше 30 сГр.Если она будет больше, то превысит верхний порог «малых доз» [9]. После этого выдерживался заданный интервал времени между адаптирующим и повреждающим облучением.

Для последующего острого облучения концентрации клеток доводили до уровня 10⁶ клеток/мл, разводя суспензию питательной средой. Острое облучение проводилось на линейном ускорителе, дозы повторного острого облучения составляли 2кГр, 4кГр, 8 кГр и 12кГр. Подсчет клеток осуществляли сразу после облучения, через час и через сутки.

Выживаемость оценивалась по отношению к контролю, который не облучался, но находился в тех же условиях, что и облученные образцы. Был проведен расчет параметра ФИД (фактор изменения дозы) - это отношение равноэффективных повреждающей дозе с предварительной адаптивной дозой к повреждающей дозе без предварительного облучения, вызывающие падения уровня выживаемости на 50%.

В сериях экспериментов была изучена закономерность зависимости величины адаптивного ответа от длительности интервала между адаптирующим и повреждающим облучением для популяции клеток.

Полученные результаты свидетельствуют о проявлении адаптивного ответа у популяции дрожжевых клеток на действие ионизирующего излучения. Также можно заметить, что в интервале между адаптирующим и повреждающим облучением меньше 4-5 часов адаптирующего ответа мы не наблюдаем. Это может быть связано с тем, чтоинтервала времени не хватило для перестройки радиорезистентности дрожжевых клеток, чтобы запустить программу переключения клеток на адаптивный ответ.

По кривым «доза - эффект» можно определить значения показателей летальной дозы излучения LD₅₀. Для интервала времени 5 часов LD₅₀(КГ1) = 4кГр и LD₅₀(КГ2) = 6кГр, для интервала времени 1 сутки LD₅₀(КГ1) = 4кГр и LD₅₀(КГ2) = 6,5кГр, для интервала времени 2 суток LD₅₀(КГ1)= 3кГр иLD₅₀(КГ2) = 7кГр.

Начиная с интервала временимежду адаптирующим и повреждающим облучением, равного 5 часов,величина адаптивного ответа, оцениваемая по параметру ФИД, растет. Для интервала 5 часов ФИД = 1,5, для интервала 1 сутки ФИД = 1,62 и для интервала 2 суток ФИД = 2,33.

Полученные данные о зависимости величины адаптивного ответа делящихся дрожжевых клеток от длительности промежутка между адаптирующим и повреждающим облучениемпоказывают, что существует оптимальный для формирования адаптивного ответа промежуток времени, после которого наблюдается повышение резистентности клеток к последующему облучению.



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе были проведены эксперименты по изучению влияния ионизирующего излучения на популяцию дрожжевых клеток; определены зависимости выживаемости от поглощенной дозы и построена кривая «доза - эффект»; было проведено исследование адаптивной реакции популяции дрожжевых клеток на действие ионизирующего излучения при разном интервале времени между адаптирующим и повреждающим облучением;

В ходе работы были решены все поставленные задачи. Рассмотрены и изучены основные методы культивирования дрожжей и подсчет клеток в камере Горяева.

Результаты, представленные в этом исследовании, показывают, что воздействия «малых» дозы ионизирующего излучения на популяцию дрожжевых клеток вызывают адаптивный ответ на действие «больших» доз.



СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Черняев А.П. Взаимодействие ионизирующего излучения с веществом/ А.П. Черняев - Москва: ФИЗМАТЛИТ, 2004. - 152 с.

2. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующее излучение) / Ю.Б. Кудряшов - Москва: ФИЗМАТЛИТ, 2004. - 448 с.

3. Лощаков И.И. Введение в дозиметрию и защита от ионизирующих излучений / И.И. Лощаков - Санкт-Петербург: Издательство Политехнического университета, 2008. - 145 с.

4. Ярмоненко С. П. Радиобиология человека и животных: Учебник для биологических специальностей Вузов/ С. П. Ярмоненко- Москва: Высшая школа, 1988. - 424 c.

5. Булдаков Л.А. Радиоактивное излучение и здоровье/ Л.А. Булдаков, В.С. Калистратова - Москва: Информ - Атом, 2003. - с. 165

6. Горшкова Т.А. Особенности проявления адаптивной реакции дрожжевых клеток на действие ионизирующего излучения/ Т.А. Горшкова, Л.Н. Комарова, Н.М. Кабакова, В.Г. Петин - Москва: Тез.докл. Пятый съезд по радиационным исследованиям.- 2006. - Т. 1. - с. 144

7. Петин В.Г. Некоторые эффекты радиационного гормезиса бактериальных и дрожжевых клеток / И.И. Морозов, Н.М. Кабакова, Т.А. Горшкова - Москва. - 2003. - Т. 43, № 2. - с. 176-178.

8. Богданов И.М Проблема оценки эффектов воздействия «малых» доз ионизирующего излучения / И.М. Богданов, М.А. Сорокина, А.И. Маслюк - Томск: Бюллетень сибирской медицины. - 2005. - № 2. -с. 145-151.

9. Боднарчук И.А. Гипотеза о механизме индукции адаптивного ответа при облучении клеток млекопитающих в малых дозах / И.А. Боднарчук - Москва: Радиационная биология. Радиоэкология, Т. 42. - 2002.- с. 36-43.

10. Студопедия [Электронный ресурс]/ Адаптивный ответ; - Режим доступа: http://studopedia.ru/13_143482_adaptivniy-otvet.html,свободный.

11. Тесты и задачи по клинической лабораторной диагностике [Электронный ресурс]/ Работа с камерой Горяева; - Режим доступа: http://cldtest.ru/hdbk/chamber, свободный.

12. Бурьян, Н. И. Микробиология виноделия. / Н. И. Бурьян, Л. В. Тюрина. - М.: Пищевая промышленность, 1979. -- 271 с.

13. Бабьева, И.П. Биология дрожжей. / И. П. Бабьева, И. Ю. Чернов. - М., 2004. - 239 с.

14. Виноградов Ю. А. Ионизирующая радиация/ Ю. А. Виноградов -Москва: СОЛОН-Р , - 2002. -с. 224.

15. Календо Г.С. Ранние реакции клеток на ионизирующее излучение и их роль в защите и сенсибилизации / Г.С. Календо -Москва: Успехи современной биологии. - 1972. - с. 96.

16. Грейб Р. Дейсвтие малых доз ионизирующего излучения. Эффект Петко / Р. Грейб - В кн.: Ядерная энциклопедия. Москва: Благотворительный фонд Ярошенской, 1996. - с. 387-394.

Размещено на Allbest.ru

...