Зимографическая детекция гидролаз Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп с использованием специфических субстратов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Зимографическая детекция гидролаз Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп с использованием специфических субстратов

Проблема холеры остаётся актуальной в связи с продолжающимся её пандемическим распространением. Это свидетельствует о необходимости всестороннего изучения возбудителя заболевания, включая особенности его энзимома (части протеома, обладающего ферментативной активностью). Большой интерес вызывают гидролитические ферменты микроорганизма, играющие роль в проявлении патогенности нехолерогенных вибрионов, и дополнительных факторов, усиливающих вирулентность холерного вибриона [4], [5], [10]. Установлено участие некоторых гидролаз, таких как нуклеазы и хитиназы, в выживании холерного вибриона в объектах окружающей среды (ООС) и формировании биоплёнки [8, 9]. Интерес к гидролазам, как возможным факторам патогенности возбудителя, обусловлен и тем, что выявленные ферменты могут быть использованы в качестве компонентов субъединичной вакцины против холеры [1], а также для создания антибактериальных противоферментных препаратов [11]. Однако к настоящему времени гидролитические ферменты холерного вибриона O1 и O139 серогрупп изучены далеко не полностью, в литературе данных о cоставе, активности ферментов, их субстратной специфичности и межштаммовых различиях вибрионов недостаточно. Исследование гидролаз будет способствовать пониманию роли ферментов в патогенезе заболевания.

Одним из наиболее информативных и высокочувствительных способов детекции гидролаз является метод диск-электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем различные белковые и небелковые субстраты, получивший название «зимография» [7]. Существенным преимуществом такого подхода с использованием прямой зимографии по сравнению с другими рутинными биохимическими методами является возможность определения спектра и субстратной специфичности гидролаз в сложных биологических смесях, а также их локализации в бактериальной клетке. Поэтому использование зимографического метода исследования для обнаружения и характеристики комплекса гидролитических ферментов холерного вибриона представляется весьма актуальным и перспективным.

С учётом изложенного цель работы - зимографическая детекция гидролитических ферментов штаммов V. cholerae О1 El Tor и V. cholerae О139 в отношении специфических субстратов.

В работе использовано 16 штаммов V. cholerae О1 El Tor и V. cholerae О139, полученных из музея живых культур Иркутского противочумного института, которые были разделены на две группы: первая группа - токсигенные штаммы, выделенные от больных и из ООС во время вспышки холеры, вторая группа - нетоксигенные штаммы, выделенные из ООС в благополучный по холере период. Для получения препаратов супернатанта культуральной жидкости (СКЖ) бактерии культивировали на щелочном МПА (pH 7,6) при 37 єС в течение 24 ч. Суточную культуру смывали физраствором и засевали во флаконы с МПБ (pH 7,6) в концентрации 2Ч10⁸ м. к. /мл. После двухчасовой инкубации при комнатной температуре во флаконы для обеззараживания засеянной культуры холерного вибриона добавляли мертиолят натрия в концентрации 0,01% и бактериальную суспензию выдерживали на холоду в течение двух суток. После контроля и подтверждения специфической стерильности суспензию центрифугировали при 10000 об/мин. Супернатант бесклеточной культуральной жидкости подвергали диализу и лиофильному высушиванию.

Специфически стерильные препараты субклеточных фракций: наружной мембраны (НМ) и мочевинного экстракта (МЭ) получали посредством лизиса живых клеток холерного вибриона 4,5 М раствором мочевины с последующим дифференциальным центрифугированием и лиофильным высушиванием супернатантов [3]. Выявление гидролаз в полученных препаратах проводили методом прямой зимографии в полиакриламидном геле и в тестах радиальной энзимодиффузии со специфическими субстратами, взятыми в конечной концентрации 0,1% (вес/объем) по методу С. Heussen и E. Dowdle [6]. В качестве субстратов использовали коммерческие препараты желатина, муцина, гликольхитозана, дрожжевой РНК («Sigma-Aldrich»), из которых готовили маточные водные растворы каждого субстрата в 1% концентрации для последующего введения расчётного количества субстрата в полиакриламидный гель (ПААГ). Тесты радиальной энзимодиффузии проводили в 1% агарозном геле, используя вышеуказанные субстраты в конечной концентрации 0,5% (вес/объём). О наличии гидролитической активности судили по образованию неокрашенных зон гидролиза на фоне окрашенного ПААГ в случае энзим-электрофореза и появлению прозрачных зон гидролиза на фоне мутного субстрата - в случае теста радиальной энзимодиффузии в агарозном геле. Наличие липолитических ферментов определяли методом электрофореза в 10% ПААГ с его последующим постэлектрофоретическим переносом на пластину 1% агарозного геля, содержащего в качестве субстрата 0,5% Твин-20 или Тритон Х-305 и инкубацией гелей при 37 єС в течение 24 ч. О наличии активности фермента судили по образованию на агарозных репликах белых полос вследствие гидролиза субстрата. Анализ полученных зимограмм осуществляли, используя систему гель-документирования Gel-Doc XR⁺ и программу Image Lab 2.01 («Bio-Rad», США). Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с расчетом среднеарифметических величин и их средних ошибок [2].

В результате проведённых исследований установлено (рис. 1, 2, 3, 4, 5), что субклеточные фракции (препараты НМ и МЭ), а также препараты СКЖ, полученные из большинства штаммов холерного вибриона Эль Тор и холерного вибриона O139 серогруппы, содержат гидролазы, обладающие хитозаназной, липолитической, лецитиназной, муциназной, РНК-азной и протеазной активностью.

Исследование хитозаназ. С применением зимографического метода показано, что в препаратах СКЖ токсигенного V. cholerae O1 биовара Эль Тор (И-1300) и четырёх нетоксигенных штаммов этого биовара (129-05-B, И-1368, И-638, И-680) обнаружено 8-9 полипептидов с хитозаназной активностью (рис 1А, Б треки 2, 3, 4, 7, 8). В препарате СКЖ токсигенного штамма V. cholerae O1 Эль Тор М-878 выявлено пять хитозаназ, располагающихся в высокомолекулярной и низкомолекулярной зонах электрофореграмм (рис. 1А, Б, трек 1). В препаратах СКЖ нетоксигенного V. cholerae O1 Эль Тор 2-01 и токсигенного V. cholerae O139 И-12 обнаружено по две хитозаназы. При этом в одном случае хитозаназная активность на зимограмме проявилась в низкомолекулярной зоне, а в другом - в высокомолекулярной (рис. 1А, треки 9 и 10; 1Б треки 9 и 10). СКЖ двух токсигенных V. cholerae O1 Эль Тор И-1334 и И-1263 показали слабую хитозаназную активность. У препаратов МЭ, полученных из взятых в исследование штаммов обнаружено от одного до пяти полипептидов с хитозаназной активностью, у препаратов НМ отмечается от одной до четырёх активных полипептидных полос, менее интенсивно гидролизующих субстрат. Важно отметить, что при окрашивании ПААГ раствором Кумасси R-250 хитозаназы выявляются хуже, тогда как при окрашивании флуоресцентным красителем Calcofluor white M2R обнаруживается по одной гидролазе, располагающейся в низкомолекулярной зоне (рис. 1А треки 5 и 6, Б треки 5 и 6), что свидетельствует о большей чувствительности этого красителя по сравнению с Кумасси R-250 в отношении хитинолитических ферментов.

Исследование липолитических ферментов. Анализ гелей после переноса при исследовании липолитической активности в субклеточных фракциях показал, что препарат МЭ токсигенного штамма V. cholerae Эль Тор O1 М-878 содержит шесть активных белков (рис. 1В, трек 1). В остальных препаратах субклеточных фракций, приготовленных из взятых в опыт штаммов, выявляется от одного до двух полипептидов с липолитической активностью. На некоторых треках, кроме чётко сформированных зон имеются диффузные зоны проявления гидролиза (рис. 1В, треки 7, 8, 9, 10), а у препарата НМ токсигенного V. cholerae Эль Тор И-1342 липолитическая активность проявляется только в следовых количествах (рис. 1В, трек 5).

Исследование муциназ. Выраженной муциназной активностью в субстратном электрофорезе с применением коммерческого муцина установлено, что наибольшей активностью обладают препараты СКЖ преимущественно токсигенных штаммов V. cholerae O1 серогруппы (рис. 1Г, треки 1, 2, 3, 4). Лишь только у одного препарата СКЖ из нетоксигенного штамма V. cholerae O139 И-16 было обнаружено 5 полипептидов с муциназной активностью (рис. 1Г, трек 9).

мембрана серогруппа супернатант штамм

Рис. 1. Энзим-электрофорез препаратов субклеточных фракций и культуральной жидкости штаммов V. cholerae El Tor O1 и O139 серогрупп

А - детекция хитозаназной активности в 8% ПААГ с использованием 0,1% раствора гликольхитозана в качестве субстрата. V. cholerae El Tor O1: 1 - M-878 (ctx⁺); 2 - И-1300 (ctx⁺); 3 - 129-05-B (ctx-); 4 - И-1368 (ctx-); 5 - И-1334 (ctx⁺); 6 - И-1263 (ctx⁺); 7 - И-638 (ctx-); 8 - И-680 (ctx-); 9 - 2-01 (ctx-); V. cholerae O139: 10 - И-12 (ctx⁺). Окраска геля 0,1% раствором Кумасси ярко-синим R-250

Б - детекция хитозаназной активности в 8% ПААГ с использованием 0,1% раствора гликольхитозана в качестве субстрата. V. cholerae El Tor O1: 1 - M-878 (ctx⁺); 2 - И-1300 (ctx⁺); 3 - 129-05-B (ctx-); 4 - И-1368 (ctx-); 5 - И-1334 (ctx⁺); 6 - И-1263 (ctx⁺); 7 - И-638 (ctx-); 8 - И-680 (ctx-); 9 - 2-01 (ctx-); V. cholerae O139: 10 - И-12 (ctx⁺). Окраска геля 0,1% раствором Сalcofluor

В-детекция липолитической активности в препаратах НМ и МЭ холерного вибриона фракционированных в 13% ПААГ после наложения на 1% агарозный гель, содержащий в качестве субстрата раствор Тритона X-305. Штаммы V. cholerae O1 серогруппы: 1 - МЭ M-878 (ctx⁺); 2 - панкреатическая липаза; 3 - МЭ И-638 (ctx-); 4 - МЭ И-1263 (ctx⁺); 5 - НМ И-1342 (ctx⁺); 6 - МЭ И-1369 (ctx-); 7 - НМ И-1369 (ctx-); 8 - МЭ И-1298 (ctx⁺); 9 - НМ И-1298 (ctx⁺); штамм V. choleraeO139 серогруппы: 10 - МЭ И-16 (ctx-

Г - муциназная активность препаратов СКЖ в 8% ПААГ, импрегнированным 0,1% раствором муцина. V. cholerae cholerae O1: 1 - 569B (ctx⁺); V. cholerae El Tor O1: 2 - И-1300 (ctx⁺); 3 - И-1263 (ctx⁺); 4 - И-563 (ctx⁺); 5 - И-1291 (ctx-); 6 - И-1296 (ctx-); 7 - 2-01 (ctx-); 8 - И-1368 (ctx-); V. choleraeO139: 9 - И-16 (ctx-); 10 - И-12 (ctx⁺). Окраска 0,1% раствором Кумасси R-250

Исследование лецитиназ. Показано, что препараты НМ взятых в исследование штаммов обладают фосфолипазной (лецитиназной) активностью. При этом активность более выражена у препаратов НМ, полученных из токсигенных штаммов холерного вибриона (рис. 2, треки 3, 5, 6). Наличие лецитиназной активности выявлено в препаратах CКЖ у взятых в исследование трёх токсигенных изолятов холерного вибриона - V. cholerae cholerae 569B, V. cholerae O1 Эль Тор И-563 и V. cholerae O139 И-11 (рис. 3, треки 1, 4, 9). Электрофоретический анализ СКЖ классического холерного вибриона показал наличие трёх высокомолекулярных полипептидов с лецитиназной активностью (рис. 3, трек 1). Отмечается схожесть электрофоретической картины у препаратов СКЖ холерного вибриона Эль Тор И-563 и холерного вибриона O139 серогруппы И-11, формирующих диффузную зону лецитиназной активности с двумя полипептидами с молекулярными массами, лежащими в диапазоне от 80 до 120 кДа (рис. 3, треки 4 и 9).

Рис. 2. Энзим-электрофорез препаратов субклеточных фракций штаммов V. cholerae eltor O1 и O139 серогрупп в 8% ПААГ с 0,1% лецитином. Окраска 0,25% раствором Кумасси ярко-синимV. cholerae eltor O1: 1 - МЭ M-878 (ctx⁺); 2 - НМ И-638 (ctx-); 3 - НМ И-1263 (ctx⁺); 4 - МЭ 129-05-B (ctx-); 5 - НМ И-1342 (ctx⁺); 6 - НМ М-800 (ctx⁺); 7 - МЭ И-1327 (ctx-); 8 - МЭ И-1407 (ctx-); V. cholerae eltor O139: 9 - МЭ И-12 (ctx⁺); 10 - НМ И-16 (ctx-)

Рис. 3. Энзим-электрофорез препаратов культуральных фильтратов V. cholerae classicae, V. cholerae O1 и O139 серогрупп в 8% ПААГ с 0,1% лецитином в качестве субстрата. Окраска 0,25% раствором Кумасси R-250.

1. V. cholerae cholerae O1: 1 - 569B (ctx⁺); V. cholerae eltor O1: 2 - И-1300 (ctx⁺); 3 - И-1263 (ctx⁺); 4 - И-563 (ctx⁺); 5 - И-1296 (ctx-); 6 - И-1299 (ctx-); 7 - 2-01 (ctx-); 8 - И-1407 (ctx-); V. cholerae O139: 9 - И-11 (ctx⁺); 10 - И-12 (ctx⁺)

Исследование РНК-аз. В отношении дрожжевой РНК гидролазной активностью обладают все препараты МЭ V. cholerae, в отличие от препаратов НМ, что свидетельствует, о том, что РНК-азы являются растворимыми внутриклеточными ферментами. Отмечается, что РНК-азная активность препаратов МЭ всех токсигенных штаммов холерного вибриона (М-878, И-1342, 569B, V. choleraeO139 И-12) заметно выше (проявление полос более чёткое и интенсивное) по сравнению с препаратами МЭ штаммов, не продуцирующих энтеротоксин (рис. 4, треки 1, 7, 8, 9).

Рис. 4. Энзим-электрофорез препаратов МЭ V. cholerae O1 и V. cholerae O139 серогрупп в 8% ПААГ с 0,1% дрожжевой РНК. Окраска 0,1% раствором толуидинового синего

1. V. cholerae El Tor O1: 1 - M-878 (ctx⁺); 2 - 129-05-B (ctx-); 3 - И-1263 (ctx⁺); 4 - И-638 (ctx-); 5 - 2-01 (ctx-); 6 - И-1369 (ctx-); 7 - И-1342 (ctx⁺); V. cholerae cholerae O1: 8 - 569B (ctx⁺); V. choleraeO139: 9 - И-12 (ctx⁺); 10 - И-16 (ctx-).

Исследование протеазной активности. Тест радиальной энзимодиффузии в агарозе с импрегнированным желатином показал, что все препараты СКЖ штаммов V. cholerae O1 и O139 cерогрупп обладают протеазной активностью разной степени интенсивности. Установлено, что нетоксигенные штаммы отличаются большей протеолитической активностью, чем токсигенные. Так, например, размер зон гидролиза желатина у препаратов СКЖ, полученных из нетоксигенных штаммов составил в среднем (7,3±0,02) мм, (P<0,05), (рис. 5, лунки 3, 4, 5, 9,10, 12). У препаратов, полученных из токсигенных штаммов он составил в среднем (2,6±0,03) мм (P<0,05) (рис. 5, лунки 2, 6, 7, 8, 11).

Рис. 5. RED-тест препаратов культуральных фильтратов V. cholerae eltor O1 и V. cholerae O139 серогрупп в 1% агарозном геле с использованием 0,5% желатина в качестве субстрата.

1 - Положительный контроль - трипсин; 2 - M-878 (ctx⁺); 3 - 129-05-B (ctx-); 4 - И-638 (ctx-); 5 - И-680 (ctx-); 6 - И-1263 (ctx⁺); 7 - И-1300 (ctx⁺); 8 - И-1334 (ctx⁺); 9 - И-1368 (ctx-); 10 - 2-01 (ctx-); V. cholerae O139: 11- И-12 (ctx⁺); 12 - O139 И-16 (ctx-)

Результаты количественного изучения гидролазной активности препаратов субклеточных фракций и препаратов СКЖ, полученных из штаммов V. cholerae разного происхождения, представлены в таблице 1. По данным RED-теста, препараты, полученные из токсигенных штаммов холерного вибриона, отличаются более высокой суммарной активностью ферментов (хитозаназной, липолитической, лецитиназной, РНКазной и др.) по сравнению с препаратами, полученными из нетоксигенных штаммов.

Гидролазная активность штаммов Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп разного происхождения

Примечание: + - величина, соответствующая зоне гидролиза минимум одного белка (одна полоса) в ПААГ; - отсутствие полосы гидролиза (активности); М-среднее значение зоны активности в RED-тестах; Й₉₅ - 95% доверительный интервал; n - число повторов определения образцов с материалом.

Наличие хитинолитической активности в препаратах СКЖ указывает на секрецию хитозаназ холерными вибрионами. Сравнение хитозаназной активности препаратов субклеточных фракций из штаммов V. cholerae El Tor O1 M-878, И-1334, И-1263, 2-01 и V. cholerae O139 И-12 показало более высокую активность указанных ферментов токсигенных штаммов по сравнению с нетоксигенными.

Феномен формирования диффузных зон при изучении липолитической активности можно объяснить замедленной диффузией фермента в агарозный гель с субстратом или частичной его деградацией в процессе электрофореза или во время блоттинга. При сравнении реплик, полученных после переноса с ПААГ, и исходного окрашенного геля, оказалось, что основной липолитической активностью обладают белки, молекулярная масса которых лежит в диапазоне от 31 до 100 кДа. Установлена значительная вариабельность липолитической активности в зависимости от используемого субстрата и токсигенности штаммов холерного вибриона. Более высокая способность препаратов МЭ, приготовленных из нетоксигенных штаммов вибриона Эль Тор O1 и из токсигенных штаммов холерного вибриона O139 серогруппы к гидролизу субстратов, содержащих короткоцепочечные жирные кислоты (Твин-20) может быть обусловлена преобладанием в препаратах указанных штаммов эстераз. Более высокая активность препаратов МЭ из токсигенных штаммов в отношении Тритона X-305, в состав которых входят длинноцепочечные жирные кислоты, можно связать с действием липаз. Обнаруженные различия в липолитической активности препаратов в отношении используемых субстратов отражают индивидуальные свойства взятых в исследование штаммов, и, по-видимому, связаны как с разным составом липолитических ферментов, удельной активностью полученных из них препаратов, так и чувствительностью к факторам внешней среды и в целом отражают интенсивность липидного обмена микробной клетки.

Обнаруженные закономерности в проявлении муциназной активности, заключающиеся в её определении преимущественно у токсигенных штаммов, могут свидетельствовать о существенном вкладе муколитических ферментов в патогенез холерной инфекции.

В целом обнаруженные в ходе проведённых экспериментов различия в степени гидролитической активности у препаратов, полученных из штаммов холерного вибриона разного происхождения, указывают на некоторые закономерности: в среднем гидролитическая активность нетоксигенных штаммов (хитозаназная) выше таковой токсигенных штаммов холерного вибриона, что говорит об их вкладе в адаптационно-приспособительный потенциал нетоксигенных изолятов, выделенных из ООС. Выявленная более высокая РНК-азная и липолитическая активность у препаратов из токсигенных штаммов может указывать на роль данных ферментов в вирулентности возбудителя. Отмеченная превосходящая суммарная гидролитическая активность препаратов СКЖ по сравнению с препаратами субклеточных фракций, говорит о повышенной активности секретируемых ферментов у взятых в исследование штаммов холерного вибриона.

Таким образом, в результате проведённого зимографического анализа с применением комплекса специфических субстратов, установлено наличие в полученных из штаммов V. cholerae O1 и O139 препаратов МЭ, НМ и СКЖ хитозаназной, липолитической, лецитиназной, муциназной, РНК-азной и протеолитической активности. В ходе экспериментов с помощью прямой зимографии в ПААГ удалось добиться стабильно воспроизводимых и сопоставимых результатов по детекции гидролаз, относящимся к разным классам и по их продукции в препаратах выявить межштаммовые отличия. Прослеживается также зависимость степени активности обнаруженных гидролаз в тестах радиальной энзимодиффузии от токсигенности исходных штаммов, что может быть использовано для дополнительной фенотипической характеристики штаммов в отношении их потенциальной эпидзначимости и персистентного потенциала. Штаммы-продуценты обнаруженных гидролаз в дальнейшем могут быть использованы для выделения и очистки этих ферментов в качестве протективных антигенов для конструирования субъединичной вакцины против холеры.

Список литературы

мембрана серогруппа супернатант штамм

1. Адамов А.К. Метаболический иммунитет к холере / А.К. Адамов - Саратов: Изд-во Саратовского университета., 1982. - 176 с.

2. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьёв. - Л.: Медгиз., 1962. - 180 с.

3. Марков Е.Ю. Наружные мембраны холерного вибриона как потенциальный компонент химической вакцины / Е.Ю. Марков, Л.Я. Урбанович, Е.П. Голубинский [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1995. - Вып 2. (Приложение). - С. 86-89.

4. Finkelstein R.A. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease, colonial variation, virulence, and detachment / R.A. Finkelstein, M Boesman-Finkelstein, Y. Chang, [et al.] // Infect. Immun. - 1992. - Vol.60, N2. - P.472-478.

5. Galen J.E. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin / J.E. Galen, J.M. Ketley, A. Fasano [et al.] // Infect. Immun. - 1992. - Vol.60, N2. - P. 1358-1362.

6. Heussen C. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates / C. Heussen, E.B. Dowdle // Anal. Biochem. - 1980. - Vol.102, N1. - P. 196-202.

7. Lantz M.S. Zymographic techniques for detection and characterization of microbial proteases / M.S. Lantz, P. Ciborowski // Methods Enzymol. - 1994. - Vol.235. - P. 563-594.

8. Mondal M. The Vibrio cholerae extracellular chitinase ChiA2 is important for survival and pathogenesis in the host intestine / M. Mondal, D. Nag, H. Koley [et al.] // PLoS One. - 2014. - Vol. 9, N9. - P. e103119.

9. Seper A. Extracellular nucleases and extracellular DNA play important roles in Vibrio cholerae biofilm formation / A. Seper, V.H.I. Fengler, S. Roier [et al.] // Mol. Microbiol. - 2011. - Vol. 82, N4. - P. 1015-1037.

10. Shinoda S. Proteases produced by Vibrio cholerae and other pathogenic vibrios: pathogenic roles and expression / S. Shinoda - New York: Springer, 2011. - P. 245-258.

11. Zang P. Targeting druggable enzymome by exploiting natural medicines: An in silico-in vitro integrated approach to combating multidrug resistance in bacterial infection / P. Zang, A. Gong, P. Zhang [et al.] // Pharm. Biol. - 2016. - Vol.54, N4. - P. 604-618.

Размещено на Allbest.ru