Морфологическая характеристика репаративной регенерации фетальной печени крыс

Разработка воспроизводимой модели резекции фетальной печени крысы. Оценка динамики восстановления массы оперированной фетальной печени через 1, 2, 3, 7, 10, 14 и 25 суток после резекции. Исследование суточной динамики митотической активности гепатоцитов.

Рубрика Биология и естествознание
Вид автореферат
Язык русский
Дата добавления 11.04.2018
Размер файла 1,2 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Морфологическая характеристика репаративной регенерации фетальной печени крыс

Ельчанинов Андрей Владимирович

Москва - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Большакова Галина Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Яглов Валентин Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Боронихина Татьяна Владимировна

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится «26»__мая___2011 года в _12.00__часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при Учреждении Российской академии наук Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН по адресу:117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д.3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН

Автореферат разослан «___» апреля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Л.П. Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Репаративная регенерация печени млекопитающих в разные периоды постнатальной жизни подробно изучена [Сидорова В.Ф., 1976]. В частности, показано, что у новорожденных млекопитающих печень после резекции хорошо регенерирует. При этом масса органа восстанавливается за счет размножения и гипертрофии гепатоцитов, а отрастания значительного количества паренхимы от раневой поверхности не происходит, что характерно для регенерационной гипертрофии [Сидорова В.Ф., Рябинина З.А., Лейкина Е.М., 1966; Michalopoulos G.K., DeFrances M.C., 1997]. Следовательно, способность печени к регенерации формируется во время органогенеза в пренатальном периоде. Однако сведения о восстановительном росте печени плодов млекопитающих отсутствуют.

С самого начала изучения феномена регенерации многие исследователи отмечали некоторое сходство между этим процессом и эмбриональным развитием органов. Особенно это заметно при развитии и регенерации конечности амфибий [Лиознер Л.Д., 1982]. Сходные черты между эмбриональным развитием и регенерацией можно обнаружить и при восстановлении паренхиматозных органов. Например, после удаления части печени у взрослых млекопитающих гепатоциты начинают активно размножаться и синтезировать б-фетопротеин - маркер гепатобластов, чего не отмечается в печени взрослых особей в норме [Michalopoulos G.K., DeFrances M.C., 1997]. Однако между эмбриональным развитием и регенерацией органов есть коренные различия. При регенерации печени в постнатальном периоде удаленные доли не формируются вновь [Сидорова В.Ф., Рябинина З.А., Лейкина Е.М., 1966].

В регенерирующих фетальных органах млекопитающих восстановительный процесс сочетается с органогенезом. В связи с этим неизвестно, будут ли наносимая травма и последующая регенерация изменять дальнейший ход развития данного органа.

Помимо фундаментальной значимости, изучение регенерации в пренатальном периоде у млекопитающих имеет и практическую ценность. В конце 90-х годов ХХ века в клиническую практику внедрен ряд операций на плодах человека, поэтому выяснение восстановительной способности органов млекопитающих в пренатальном периоде после механической травмы является актуальным [Rychik J. et al., 2004].

Врожденные опухоли печени человека характеризуются крайне тяжелой клинической картиной и высокой смертностью пациентов. Клиническое течение таких опухолей часто осложняется водянкой плода, респираторным дистресс синдромом новорожденных, сердечной недостаточностью. Наиболее часто среди врожденных опухолей печени встречается гемангиома, мезенхимальная гамартрома, гепатобластома [Isaacs H. Jr., 2007]. Разработка экспериментальных моделей повреждения печени плодов млекопитающих, а также изучение закономерностей регенерации фетальной печени позволит обосновать и внедрить в клиническую практику раннее хирургическое лечение врожденных опухолей печени человека.

Цель исследования Ї изучить особенности репаративной регенерации печени плода крысы после резекции.

Задачи исследования:

Разработать воспроизводимую модель резекции фетальной печени крысы;

Проследить динамику восстановления массы оперированной фетальной печени через 1, 2, 3, 7, 10, 14 и 25 сут после резекции;

Изучить изменение объемной доли гепатоцитов и гемопоэтических клеток в печени плодов крысы в ответ на резекцию через 3 ч, 1, 2, 3 и 7 сут после операции;

Исследовать пролиферацию гепатоцитов с помощью определения их митотического индекса, а также с использованием иммуногистохимического маркера пролиферации Ki67 через 6 ч, 1, 2, 3, 7, 10 и 14 сут после резекции печени плодов крысы;

Изучить суточную динамику митотической активности гепатоцитов в течение 48 ч после резекции в печени плодов крысы;

С помощью определения соотношения митотических фаз оценить стабильность времени митоза гепатоцитов в оперированной печени плодов крысы; печень гепатоцит резекция регенерация

Проследить динамику изменения площади гепатоцитов и их ядер в оперированной и интактной печени плодов крысы через 1, 2, 3, 7, 10, 14 и 25 сут после резекции, и таким образом, оценить вклад гипертрофии гепатоцитов в регенерацию печени плода крысы;

С помощью гистологических методов исследовать процессы роста в области резекции печени плодов крысы, оценить в перираневой зоне пролиферацию гепатоцитов с помощью определения их митотического индекса, а также с использованием иммуногистохимического маркера пролиферации Ki67, на основании полученных результатов определить способ регенерации печени плода крысы.

Научная новизна

Разработана оригинальная воспроизводимая модель резекции печени плода крысы со стандартным объемом повреждения (22±3,7% массы органа).

Впервые показано, что печень плода крысы способна к регенерации в очень короткий срок. Масса печени плодов, оперированных на 17-ые сут развития, восстанавливается уже через 2 сут после резекции.

С помощью морфометрического анализа показано, что наносимая травма и регенерация не вызывают изменения соотношения гепатоцитов и гемопоэтических клеток печени плода, что свидетельствует об отсутствии ускоренного угасания гемопоэза в печени плодов крысы.

Выявлено, что гипертрофия гепатоцитов не играет существенной роли в восстановлении массы фетальной печени крысы, регенерация осуществляется практически только за счет митотического размножения гепатоцитов.

При исследовании пролиферации гепатоцитов установлено, что резекция фетальной печени крысы стимулирует размножение клеток как в перираневой зоне, так и на расстоянии от нее. Это свидетельствует о равномерном росте печени, и о способе ее регенерации - регенерационной гипертрофии.

Показано, что наносимая травма не вызывает нарушения прохождения гепатоцитами стадий митотического цикла. Об этом свидетельствуют незначительные изменения соотношения фаз митоза на разных сроках после операции, сильная положительная корреляция между индексом метафаз и митотическим индексом в опыте и контроле, а также предшествование многократного увеличение количества Ki67-положительных гепатоцитов пику митотического индекса.

На основании того, что после резекции печени плода крысы сохраняется динамика увеличения массы органа, соотношение гепатоцитов и гемопоэтических клеток, прохождение гепатоцитами митотического цикла, сроки возрастной гипертрофии гепатоцитов не изменяются в оперированной печени, можно заключить, что резекция 22±3,7% массы не нарушает общего хода развития печени плода крысы.

Научно-практическая значимость

В результате проведенного исследования получены новые данные, которые теоретически обосновывают возможность операции на печени плода при определенных видах врожденной патологии (гепатобластома и др. опухоли) и высокую вероятность благоприятного исхода.

Полученные данные могут быть использованы в процессе преподавания в вузах медицинского и биологического профиля по специальностям гистология, эмбриология, цитология и патологическая анатомия.

Оригинальная модель повреждения печени в пренатальном возрасте может быть использована в научно-исследовательских разработках.

Положения, выносимые на защиту

Печень плода после удаления части паренхимы способна к регенерации, которая осуществляется так же, как и у взрослых животных, по способу регенерационной гипертрофии. Однако имеются возрастные особенности: регенерация печени плодов осуществляется без участия гипертрофии гепатоцитов. Масса оперированной печени увеличивается за счет митотического размножения гепатоцитов, распределенных равномерно по всему органу. Суточная периодичность пролиферации гепатоцитов как в регенерирующей, так и интактной печени плодов крысы не выявлена.

После резекции фетальной печени и в ходе последующей регенерации соотношение гепатоцитов и гемопоэтических клеток оперированной печени плодов крыс не отличается от таковых у одновозрастных интактных животных, то есть регенерация протекает органотипически.

Наносимая травма не вызывает изменения общего хода развития фетальной печени крысы по сравнению с контролем, что проявляется в динамике увеличения массы оперированной печени, в отсутствии ускоренного угасания гемопоэза и гипертрофии гепатоцитов.

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения работы доложены и обсуждены на конференциях «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (г. Москва, 2010), на VII Всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 2010), на межлабораторных конференциях НИИ морфологии человека РАМН (март, апрель 2011).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материала и методов исследования, главы собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы.

Объем диссертации составляет 126 страниц компьютерного текста и включает 10 таблиц и 31 рисунка. Список литературы включает 161 источников, из которых 33 отечественных и 128 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Объект исследования

В работе использовали 17-суточные плоды крыс Вистар от самок с датированной беременностью. Срок гестации устанавливали по обнаружению сперматозоидов во влагалищном мазке крысы (нулевые сутки). Всего было исследовано 229 плодов в возрасте 17, 18, 19 сут внутриутробного развития, 56 крысы в возрасте 3-21 сут.

Методы исследования

Методика повреждения печени и ее воспроизводимость были предварительно отработаны на 120 плодах. Оперирование и вывод животных из эксперимента осуществляли под эфирным наркозом. При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии УРАМН НИИ морфологии человека РАМН (протокол № 6 от 18.05.2009).

Выбор срока беременности, на котором производили операцию, обусловливался несколькими причинами. Во-первых, 17-суточные плоды имеют достаточные размеры для манипуляций; во-вторых, после операции на этом сроке развития остается достаточно времени для развертывания репаративого процесса именно во внутриутробном периоде.

Методика операции

Под эфирным наркозом разрезали переднюю брюшную стенку крысы, в рану выводили рог матки с плодами, при этом печень плода была хорошо видна. Разрезали стенку матки и плодные оболочки, делали небольшой (3-4 мм) надрез кожи плода в середине проекции печени справа.

После надреза кожи плода с помощью препаровальной иглы в рану выводили свободный край печени и отсекали его, проводили термокоагуляцию раневой поверхности. Далее ушивали кожу плода и стенку матки. Потерю амниотической жидкости восполняли теплым физиологическим раствором. Рог матки возвращали в брюшную полость. У каждой самки оперировали 5-6 плодов, остальные служили контролем. Всего прооперировано 528 плодов, из них выжило 254. Таким образом, смертность оперированных плодов составила примерно 50 %.

Все оперированные самки и контрольные плоды выжили.

Проводили две серии опытов. В первой серии изучали влияние резекции плода крысы на общее развитие печени в пренатальном и раннем постнатальном периоде. Животных усыпляли эфиром и выводили из эксперимента через 3 ч, 6 ч, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 25 сут после операции.

Печень взвешивали, фиксировали в жидкости Карнуа, обезвоживали в этиловом спирте, проводили через хлороформ, заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином с докраской эозином и по Маллори. Опытные и контрольные группы состояли из 7-10 животных. Всего в 1 серии исследовано 134 животных.

Для оценки клеточного состава фетальной печени определяли объемную плотность гепатоцитов, гемопоэтических клеток. Морфометрический анализ проводили методом «полей» с помощью сетки из 10 узлов, свободно передвигаемой по всей области на нескольких срезах (200 тест-точек на печень) при общем увеличении светового микроскопа 1500.

Для исследования митотической активности гепатоцитов определяли митотический индекс (МИ), выраженный в промилле (‰). Чтобы установить способ регенерации фетальной печени необходимо оценить процессы роста в области травмы. Для этого мы определяли МИ гепатоцитов отдельно для перираневой области и зоны вне ее.

Перираневой зоной мы считали неповрежденные ткани печени, находящиеся в пределах 100 мкм от края раневой поверхности. Ткани, расположенные дальше, чем 100 мкм от края раневой поверхности обозначим отдаленными.

На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали митозы гепатоцитов на 6000 клеток для каждого животного. При подсчете митозов учитывали их фазу, определяли процентную долю каждой фазы ко всем митозам и ее индекс по отношению ко всем просчитанным гепатоцитам, выраженный в ‰, что давало возможность оценить стабильность времени прохождения митоза гепатоцитами.

Во второй серии опытов изучали суточную динамику митотической активности гепатоцитов регенерирующей печени пода крысы. Животных выводили из эксперимента с интервалом 3 ч через 3 - 48 ч после операции. Опытные и контрольные группы состояли из 7-10 животных. Митотическую активность гепатоцитов печени плодов крысы определяли так же, как и в первой серии опытов. Всего во 2 серии исследовано 200 плодов.

Для изучения ядерно-цитоплазматических отношений гепатоцитов готовили мазки-отпечатки печени, фиксировали абсолютным этиловым спиртом, окрашивали гематоксилином и эозином. На цифровых микрофотографиях, сделанных при увеличении Ч1500, с помощью планшета, обводили контуры гепатоцитов и их ядер (100 гепатоцитов на каждое животное). Площадь ядра и цитоплазмы определяли в программе Image Scope M.

Чтобы оценить объем популяции размножающихся гепатоцитов в оперированной печени, мы использовали поликлональные антитела к ядерному белку Ki67, который выявляется в клетках в позднем G1-, G-2, S-периодах, а также в хромосомах делящихся клеток (в G0- и раннем G1-периоде Ki67 не обнаруживается) [Lindboe C.F., Torp S.H., 2002].

Иммуногистохимическое исследование печени проводили через 12, 15, 24, 36, 48 ч и 7, 10, 14 суток после операции (по 3 оперированных и контрольных животных на каждый срок). Материал фиксировали в жидкости Карнуа, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм на предметных стеклах Menzel-Glaser® SuperFrost® Plus GOLD.

Иммуногистохимическая реакция включала следующие этапы: (1) депарафинирование срезов и доведение их до воды через ряд спиртов нисходящей концентрации; (2) демаскировка антигена путем кипячения срезов в цитратном буфере (pH 6.0) - 30 мин, с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 20 мин; (3) инкубация срезов с блокатором эндогенной пероксидазы - 15 мин; (4) инкубация срезов с протеиновым блокатором - 10 мин; (5) инкубация срезов с первичными кроличьими антикрысиными антителами к Ki 67 (prediluted, Abcam, UK) - 2 ч при комнатной температуре или к каспазе 3 (разведение 1:100, Abcam, UK) - 12 ч при 4є; (6) инкубация срезов с биотинизированными овечьим антикроличьими вторичными антителами (Abcam, UK) - 15 мин; (7) инкубация срезов со стрептовидином, конъюгированным с пероксидазой (Abcam, UK); (8) инкубация срезов с раствором DAB (Abcam, UK) - 2 мин. После каждого этапа срезы споласкивали в PBS (pH 7.4).

Подмышечный лимфоузел взрослой крысы использовали как положительный контроль. Негативным контролем служили срезы, при постановке иммуногистохимической реакции с которыми первичные антитела не использовали.

Все срезы докрашивали гематоксилином Караччи. На препаратах подсчитывали меченые клетки, затем вычисляли индекс Ki67 на 2000 просмотренных гепатоцитов в процентах.

Для показателей площади и массы вычисляли средние значения и стандартное отклонение, для долей - среднее значение и стандартную ошибку среднего по формулам для долей. Границы 95%-ных доверительных интервалов для долей рассчитывали с помощью -трансформации. Абсолютные показатели при нормальном распределении сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента. При распределении, отличающемся от нормального, использовали тест Манна-Уитни. Сравнение двух выборочных долей проводили с помощью z-критерия. Соотношение фаз митозов сравнивали с помощью критерия ч2. Для выявления корреляционных отношений использовали коэффициент корреляции Спирмена. Сравнение показателей ядерно-цитоплазматических отношений и отношения массы печени к массе тела животного проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа. [Юнкеров В.И., Григорьев С.Г., 2002]. Различия считали значимыми при 5% уровне достоверности. Данные были проанализированы с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc.).

Результаты исследования и их обсуждение

Морфологические особенности нормальной и поврежденной фетальной печени

На 17-е сут печень плодов крысы состояла из плотной сети трабекул, образованных крупными гепатоцитами полигональной формы, подавляющее большинство которых содержало одно большое светлое ядро с одним крупным ядрышком. Эпителий желчных протоков при окраске гематоксилином и эозином не обнаруживался. Среди гепатоцитов и гемопоэтических клеток часто наблюдались фигуры митоза.

Через 3 ч после операции ткань в печени формировалась зона некроза, в которой преобладали округлые клетки с пикнотичным ядром и ярко оксифильной цитоплазмой. Строение печени вне зоны резекции визуально не отличалось от внутренней структуры печени контрольных плодов. Сходная картина наблюдалась через 6ч, 1 и 2-е сут после операции.

Через 3-е сут (возраст плодов - 20 сут) в области травмы погибающих клеток и форменных элементов крови становилось заметно меньше. Между нормальной паренхимой и зоной некроза была видна граница, в области которой при окрашивании по Маллори выявлялись единичные коллагеновые волокна. На расстоянии от раневой поверхности в периваскулярной соединительной ткани появлялись первые желчные протоки. Как у оперированных, так и у интактных плодов в синусоидах уменьшалось количество гемопоэтических клеток.

На 7-е сут после операции (2 сут после рождения) в печени оперированных и контрольных животных происходило значительное угасание гемопоэза. В области периваскулярной соединительной ткани обособлялись желчные протоки. В области повреждения количество соединительной ткани увеличивалось.

На 10-е и 14-е сутки после операции (6 и 10 сут постнатальной жизни соответственно) строение печени оперированных животных вдали от области травмы не отличалось от такового у неоперированного контроля. Паренхима состояла из гепатоцитов, организованных в трабекулы, которые вблизи сосудов приобретали радиальное направление. Среди гепатоцитов иногда встречались двуядерные. В синусоидах обнаруживались немногочисленные скопления гемопоэтических клеток. Выявлялись портальные триады с хорошо дифференцированными желчными протоками.

Через 25 сут после операции (21сут постнатальной жизни) в печени контрольных животных гепатоциты были организованы в дольки, гемопоэтические клетки полностью отсутствовали. Паренхима печени экспериментальных животных вне области травмы не отличалась от контрольной. По сравнению с предыдущими сроками в области резекции в соединительной ткани происходило увеличение плотности коллагеновых волокон.

Таким образом, при резекции печени 17-суточных плодов крысы отрастания паренхимы печени от раневой поверхности не происходило. В области травмы наблюдалось образование соединительной ткани.

Восстановление массы печени

Массу оперированной печени определяли через 3ч, 6ч, 1, 2, 3, 7, 10, 14 и 25 сут после операции (Рис.1).

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис. 1. Масса печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия).

f - фетальный период, post - постнатальный период. По оси абсцисс - возраст/сутки после операции, по оси ординат - масса печени в мг.

*,**,*** Ї статистически значимые различия по сравнению с одновозрастным контролем (p<0,05).

Масса печени подопытных плодов через 3 ч после операции составила 99±9,7 мг, масса печени контрольных плодов - 127,1±15,7 мг. Исходя из полученных данных, можно заключить, что разработанный способ операции позволил удалить 22,0±3,7% массы печени. Масса оперированной печени плодов была достоверно меньше, чем у одновозрастных интактных животных через 3 ч, 6 ч и 1 сут после операции (p<0,05). Через 2-е сут и далее до 25 сут включительно после частичной гепатэктомии масса печени не отличалась от контрольной (p>0,05).

Таким образом, масса фетальной печени крыс после 20% резекции восстанавливалась через 2 сут после частичной гепатэктомии, то есть еще в пренатальном периоде. Полученные данные подтверждают общую возрастную закономерность регенерации печени - зависимость скорости регенерации от возраста животных, то есть чем моложе животные, тем быстрее у него регенерирует печень [Сидорова В.Ф., 1969; Bucher N.R., Swaffield M.N., 1964]. Масса печени оперированных животных положительно коррелирует с массой печени контрольных животных (r=0,97; p<0,05), следовательно, нанесенная травма не вызывает изменения характера дальнейшего роста печени.

Клеточный состав печени после гепатэктомии в пренатальном периоде

Соотношение гепатоцитов и гемопоэтических клеток в печени определяли через 3 ч, 1, 2, 3 и 7 сут после операции. Более половины объема печени 17-ти суточных плодов крысы занимали гепатоциты и гемопоэтические клетки. С возрастом объемная доля кроветворных клеток постепенно снижалась, а гепатоцитов нарастала (Рис.2, 3), что согласуется с данными литературы [Greengard O., Federman M., Knox W.E., 1972; Vassy J. et al., 1988]. Сходная динамика клеточного состава наблюдалась и в печени оперированных плодов. По сравнению с одновозрастным контролем объемная плотность гепатоцитов и гемопоэтических клеток в оперированной печени через 3 часа после операции не отличалась от контрольных значений, через 2, 3 и 7 сут, когда масса печени восстанавливалась, различий также не было (Рис.2, 3). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии отека печени в ответ на травму, а также об отсутствии преждевременного угасания гемопоэза в оперированной печени плодов крысы. Подобный тип восстановительного процесса можно рассматривать как органотипический [Бабаева А.Г., 2009].

По некоторым представлениям, регенерация в постнатальном периоде вызывает ускорение возрастного созревания данного органа [Сидорова В.Ф., 1969]. Однако, пренатальная травма и последующая регенерация не вызывают ускорения развития печени в позднем пренатальном и раннем постнатальном периоде, так как преждевременное угасание гемопоэза в оперированной печени плодов крысы отсутствовало.

Рис.2. Объемная плотность гепатоцитов в печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия)

По оси абсцисс - возраст/сутки после операции, по оси ординат - объемная плотность (%).

f - фетальный период, post - постнатальный период.

* Ї статистически значимые различия по сравнению с одновозрастным контролем (p<0,05).

Рис 3. Объемная плотность гемопоэтических клеток в печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия)

По оси абсцисс - возраст/сутки после операции, по оси ординат - объемная плотность (%).

f - фетальный период, post - постнатальный период.

* Ї статистически значимые различия по сравнению с одновозрастным контролем (p<0,05).

Митотический индекс гепатоцитов вне зоны повреждения в пре- и постнатальном периодах после резекции печени плодов крыс

Митотический индекс определяли через 6 ч, 1, 2, 3, 7, 10 и 14 сут после операции (Рис.4.). В печени оперированных подов по сравнению с одновозрастным контролем через 6 ч после операции МИ гепатоцитов статистически значимо снижался, а через 1 сут происходил статистически значимый подъем МИ гепатоцитов (p<0,05). Динамика МИ гепатоцитов в оперированной печени схожа с таковой в печени контрольных животных, что подтверждается наличием сильной положительной корреляции между МИ в опытных и контрольных группах (r= 0,79, p= 0,015). В печени оперированных и контрольных плодов митотическое размножение гепатоцитов к концу пренатальном периода практически прекращалось. В течение первых суток постнатальной жизни пролиферация гепатоцитов вновь активировалась и далее с возрастом постепенно угасала. Эти результаты согласуются с литературными данными [Awad M.M. et al., 1997; Sigal S.H. et. al., 1999]. Поскольку повышение МИ гепатоцитов в оперированной печени предшествовало по времени восстановлению массы печени, то усиление митотической активности гепатоцитов, скорее всего, связано с восстановительным ростом печени.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис. 4. Митотический индекс гепатоцитов в пренатальном и раннем постнатальном периоде в печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия)

По оси абсцисс - возраст/сутки после операции, по оси ординат - митотический индекс гепатоцитов (‰).

f - фетальный период, post - постнатальный период, планки погрешности - доверительные интервалы. *Ї статистически значимые различия (p<0,05)

Суточная динамика митотической активности гепатоцитов вне зоны повреждения в печени плодов крыс после резекции

При изучении суточной динамики митотической активности гепатоцитов отмечено, что МИ через 6 ч после операции в опыте был достоверно ниже (p<0,05), чем в контроле, что, видимо, связано с операционным стрессом (Рис.5). Далее МИ гепатоцитов статистически значимо увеличивался по сравнению с предыдущим сроком, и через 9 ч после операции МИ в опыте и контроле не различались (p>0,05). Через 12 ч и далее, вплоть до 36 ч после операции включительно, а также через 42 ч после операции, у подопытных животных МИ был достоверно выше, чем в контроле (p<0,05).

Сравнивая полученные данные о пролиферации гепатоцитов в регенерирующей печени плода крысы с полученными ранее данными о пролиферации в регенерирующей печени в постнатальном периоде [Романова Л.К., 1984, Bucher N.R., Swaffield M.N., DiTroia A.F., 1964], можно заключить, что в пренатальном периоде пролиферация гепатоцитов активируется раньше.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис 5. Митотический индекс гепатоцитов вне зоны резекции в печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия) в течение 48 ч после резекции печени плода

По оси абсцисс верхняя шкала - часы после операции, нижняя шкала - время суток, по оси ординат - митотический индекс гепатоцитов (‰).

Планки погрешности - доверительные интервалы.

Наибольшего значения МИ достигал через 12 ч (14±0,6‰) после операции и через 24 ч (16,1±0,6‰). Как известно, пик митозов гепатоцитов в постнатальном периоде возникает только при достаточно обширных резекциях печени, при этом, чем моложе животное, тем меньшее количество паренхимы печени необходимо резецировать [Bucher N.R., Swaffield M.N., DiTroia A.F., 1964; Lambotte L. et al., 1997]. Таким образом, резекция примерно 20% массы печени 17-суточных плодов крысы является достаточно сильным регенерационным стимулом для органа.

Циркадный ритм митотической активности гепатоцитов как в оперированной, так и в контрольной печени плодов не был выявлен. Это, видимо, связано с тем, что установление суточной активности, так называемых генов биологических часов в печени (Bmal-1, Clock, Per1-2, Cry1-2) происходит лишь в постнатальном периоде [Slбdek M. et al., 2006; Yamazaki S. et al., 2009].

Оценка стабильности времени митоза гепатоцитов вне перираневой зоны после резекции печени плодов крыс

Косвенно оценить прохождение клетками митоза можно с помощью определения соотношение митотических фаз [Алов И.А., 1972; Доброхотов В.Н., Валвас В.С., 1981; Большакова Г.Б., 2008]. Соотношение фаз митозов гепатоцитов изучали через 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 39, 42 ч, а также через 2, 7 и 10 сут (Рис.6).

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис.6 Соотношение фаз митоза гепатоцитов печени вне зоны резекции и в контроле

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - доля митотических фаз.

Чаще всего среди делящихся гепатоцитов в опыте и контроле встречались метафазы (Рис. 6), их доля на разных сроках после операции колебалась в пределах 50-70%. Следовательно, длительность деления гепатоцитов плодной печени зависит главным образом от времени метафазы. Поскольку достоверных различий между долями метафаз в опыте и контроле на большинстве сроков не было обнаружено (Рис. 7), то можно предположить, что и длительность всего митоза в опыте и контроле не различалась. Уменьшение доли метафаз по сравнению с контролем через 36 ч после вмешательства является отражением, на наш взгляд, завершения периода активной пролиферации гепатоцитов в регенерирующей печени плодов крысы, поскольку совпадало со значительным снижением митотической активности гепатоцитов на этом сроке.

Корреляционный анализ выявил сильную положительную корреляцию между митотическим индексом гепатоцитов и индексом метафаз в опытных и контрольных группах (r=0,96, p<0,05 и r=0,90, p<0,05 соответственно), что исключает наличие блока митоза.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис. 7. Доля метафаз гепатоцитов в перираневой области, вне ее и в контроле

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - доля метафаз (%), планки погрешности - доверительные интервалы.

Белые столбики - доля метафаз гепатоцитов в перираневой области, серые столбики - доля метафаз вдали от области повреждения, черные столбики - доля метафаз гепатоцитов в контроле. * Ї статистически значимые различия (p<0,05).

Иммуногистохимическое исследование пролиферации гепатоцитов вне зоны повреждения

Иммуногистохимичекое исследование печени оперированных и интактных животных проводили через 12 , 15, 24, 36, 48 ч, а также через 7, 10 и 14 сут после операции. Индекс Ki67 гепатоцитов регенерирующей печени плода через 12 ч, 15 ч и 24 ч после операции (Рис. 8) был статистически значимо выше, чем в контроле (p<0,05). Наибольшего значения индекса Ki67 гепатоцитов в опыте достигал через 15 ч после операции (8,4±0,3%). Таким образом, при восстановлении массы фетальной печени пролиферация охватывала большее количество гепатоцитов, чем предполагалось на основании данных о митотической активности. Через 7 сут после операции (3 сут постнатальной жизни) индекс Ki67 в опытной группе был статистически значимо выше, чем в контроле (p <0,05). Возможно, это объясняется тем, что у подопытных плодов из-за дополнительного операционного стресса пролиферация гепатоцитов после родов возобновилась с некоторым опозданием по сравнению с одновозрастным контролем, в котором она уже начала снижаться.

Клетки, в которых началась экспрессия Ki67, в дальнейшем с большой вероятностью вступают в митоз [Lindboe C.F., Torp S.H., 2002], поэтому данный маркер в совокупности с подсчетом митозов можно также использовать для оценки прохождения стадий митотического цикла. Пик индекса Ki67 наблюдался на 9 ч раньше наибольшего подъема МИ гепатоцитов, то есть можно утверждать, что пролиферирующие фетальные гепатоциты быстро проходили стадии клеточного цикла, предшествующие делению, и без задержки вступали в митоз.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис. 8 Индекс Ki67 гепатоцитов вне зоны резекции в печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия)

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - индекс Ki67 гепатоцитов (%).

Планки погрешности - доверительные интервалы.

*Ї статистически значимые различия по сравнению с одновозрастным контролем (p<0,05)

Характеристика пролиферации гепатоцитов в перираневой области

Митотическую активность гепатоцитов в перираневой зоне регенерирующей печени плода крысы изучали через 6, 9, 12, 15, 18, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48ч, а также через 7 и 10 сут. МИ в околораневой зоне ни на одном из сроков после операции не превышал МИ вне области резекции (Рис. 9). Через 6, 9, 12, 18 и 24 ч он был статистически значимо меньше чем МИ на расстоянии от места повреждения (p<0,05). По сравнению с интактным контролем МИ гепатоцитов перираневой зоны через 6 после операции был достоверно ниже (p<0,05), а через 24, 30, 36, и через 42 ч достоверно выше (p<0,05). Через 7 и 10 суток после операции различий между МИ гепатоцитов в перираневой области, вне нее и в контроле не было. Обнаружена сильная положительная корреляция между МИ гепатоцитов вблизи от места травмы и на расстоянии от нее (r=0,78, p<0,005).

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис. 9. Митотический индекс гепатоцитов перираневой зоны (непрерывная линия) и на расстоянии от нее (пунктирная линия) в печени оперированных животных

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - митотический индекс гепатоцитов (‰).

Планки погрешности - доверительные интервалы.

*Ї статистически значимые различия (p<0,05)

Чаще всего среди делящихся гепатоцитов в перираневой области, как и на отдалении от нее и в контроле встречались метафазы (Рис.7, Рис.10). Корреляционный анализ выявил сильную положительную корреляцию между митотическим индексом гепатоцитов и индексом метафаз вблизи от зоны повреждения (r=0,97, p<0,05), что свидетельствует о стабильности течения и отсутствии блока митоза гепатоцитов в перираневой зоне.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис. 10. Соотношение фаз митоза гепатоцитов в перираневой области и в контроле

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - доля митотических фаз.

Индекс Ki67 гепатоцитов в перираневой области определяли через 12 , 15, 24, 36, 48 ч, а также через 7 и 10 сут после операции (Рис.11). Индекс Ki67 гепатоцитов перираневой области был статистически значимо меньше чем на расстоянии от области травмы через 12 ч и 15 ч после операции, а через 10 сут после вмешательства (7 сут постнатальной жизни) достоверно выше (p<0,05). По сравнению с одновозрастным контролем через 15, 24 ч и 10 сут после вмешательства индекс Ki67 гепатоцитов в зоне повреждения был достоверно больше (p<0,05), а через 36 ч ниже, чем в контроле (p<0,05). Индекс Ki67 в перираневой области положительно коррелирует с индексом Ki67 вне зоны резекции (r=0,857, p=0,006).

Таким образом, активность пролиферация гепатоцитов в перираневой области ни на одном из сроков исследования достоверно не превышал активность пролиферации гепатоцитов на расстоянии от зоны резекции. Полученные данные свидетельствуют о том, что значительного отрастания паренхимы от раневой поверхности при регенерации печени плодов крыс не происходит, то есть способ регенерации фетальной печени - регенерационная гипертрофия [Сидорова В.Ф., Рябинина З.А., Лейкина Е.М., 1966; Бабаева А.Г., 2009].

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис. 11 Индекс Ki 67 гепатоцитов оперированной печени в перираневой области (непрерывная линия) и на расстоянии от нее (пунктирная линия)

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - индекс Ki 67 гепатоцитов (%).

Планки погрешности - доверительные интервалы.

* Ї статистически значимые различия (p<0,05)

Площадь гепатоцитов и их ядер в пре- и постнатальном периодах после резекции печени плодов крыс

Площадь гепатоцитов и их ядер определяли через 1, 2, 3, 7, 10, 14 и 25 сут после операции (Рис. 12, 13). С возрастом площадь гепатоцитов и их ядер в оперированной и интактной печени статистически значимо снижалась (p<0,05). Площадь одноядерных гепатоцитов и их ядер, ядерно-цитоплазматические отношения гепатоцитов в опытных группах ни на одном из сроков исследования не отличались от контроля (p>0,05). Гепатоциты печени плодов крысы представлены практически полностью одноядерными клетками [Бродский В.Я., Урываева И.В., 1981; Gupta S., 2000; Margall-Ducos G. et al., 2007], что согласуется с нашими данными. Образование двуядерных клеток в результате ацитокинетического митоза является ключевым этапом в процессе полиплоидизации гепатоцитов [Nadal C., Zajdela F., 1966; Бродский В.Я., Урываева И.В., 1981; Gupta S., 2000]. Двуядерные гепатоцитов обнаруживались в небольшом количестве в мазках-отпечатках печени оперированных и контрольных животных только через 25 сут после резекции (21 сут постнатальной жизни), а увеличения площади ядер регенерирующей печени плода не выявлено. Следовательно, можно предположить, что в ходе регенерации фетальной печени повышения плоидности гепатоцитов не происходило.

Полиплоидизация и гипертрофия гепатоцитов является адаптивной реакцией печени на рабочее напряжение, вызванное удалением части паренхимы органа. Печень в пренатальном периоде не несет большой функциональной нагрузки (Guo Y. et al., 2009). Резекция фетальной печени в объеме около 20% также, видимо, не приводило к резкому рабочему напряжению органа. Вероятно, поэтому гипертрофия гепатоцитов и повышение плоидности их ядер не наблюдалось.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис. 12 Площадь ядер гепатоцитов оперированных (непрерывная линия) и контрольных (пунктирная линия) животных.

По оси абсцисс - возраст/сутки после операции, по оси ординат - площадь гепатоцитов в мкм 2.

f - фетальный период, post - постнатальный период

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис. 13. Площадь гепатоцитов оперированных (непрерывная линия) и контрольных (пунктирная линия) животных.

По оси абсцисс - возраст/сутки после операции, по оси ординат - площадь гепатоцитов в мкм 2.

f - фетальный период, post - постнатальный период

Таким образом, разработана оригинальная воспроизводимая модель резекции 22,0±3,7% массы печени 17-суточного плода крысы. Печень плодов крыс способна к органотипической регенерации, ее масса полностью восстанавливалась уже через 2 суток после операции. Восстановление массы печени плодов после резекции осуществлялась за счет митотического размножения гепатоцитов, а их гипертрофия отсутствовала. После частичной гепатэктомии печени плодов пролиферация гепатоцитов активизировалась через 9-12 ч, наибольшего значения митотический индекс достигал через 24 ч после операции. Суточная периодичность пролиферации гепатоцитов как в регенерирующей, так и интактной печени плодов крысы не выявлена. В области раневой поверхности отрастания паренхимы не происходило. Таким образом, печень плодов крыс регенерировала по способу регенерационной гипертрофии.

ВЫВОДЫ

1. Фетальная печень крыс способна к органотипической регенерации. Масса печени плодов, оперированных на 17-ые сут развития, восстанавливается через 2 сут после резекции 22,0±3,7% массы органа.

2. Печень плодов крыс регенерирует по способу регенерационной гипертрофия, отрастания паренхимы от раневой поверхности не происходит.

3. Регенерация печени плодов крысы происходит за счет усиления митотической активности гепатоцитов, поскольку гипертрофия гепатоцитов отсутствует.

4. В печени плодов крысы пролиферация гепатоцитов активируется через 9-12 часов после резекции. Максимальный уровень пролиферации гепатоцитов (16,02±0,61‰) наблюдается через 24 ч после повреждения печени плодов крысы.

5. Суточная периодичность пролиферации гепатоцитов как в регенерирующей, так и интактной печени плодов крысы не выявлена.

6. Резекция 22,0±3,7% массы печени не нарушает общего хода развития печени плода крысы по сравнению с одновозрастным контролем: сохраняется динамика увеличения массы органа, соотношение гепатоцитов и гемопоэтических клеток, прохождение митотического цикла гепатоцитами, отсутствует гипертрофия гепатоцитов.

7. Впервые разработанная воспроизводимая модель регенерации печени плодов крысы позволяет изучать восстановление паренхиматозных органов плодов млекопитающих.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Ельчанинов А.В., Большакова Г.Б. Модель регенерации печени плодов крыс // В сб.: Актуальные проблемы морфогенеза в норме и патологии. М.: 2010, с.66-67.

Ельчанинов А.В., Большакова Г.Б. Реакция гепатоцитов на пренатальную травму печени // VIII Всероссийская конференция по патологии клетки. Москва, 2010, с.98-99

Ельчанинов А.В., Большакова Г.Б. Репаративная регенерация печени плодов крыс после частичной гепатэктомии // Бюлл. эксперим. биол. и мед.Ї 2010.Ї т.150, № 9.Ї с.352-355

Ельчанинов А.В., Большакова Г.Б. Динамика пролиферации гепатоцитов регенерирующей печени плода крысы // Бюлл. эксперим. биол. и мед.Ї 2011.Ї т.151, № 3.Ї с.352-355

Ельчанинов А.В., Большакова Г.Б. Размер гепатоцитов и их ядер в регенерирующей фетальной печени крыс // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П.Павлова .Ї 2011.Ї № 2.Ї с.8-12.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

  • Кровоснабжение и функции печени, описание строения печеночной дольки как функциональной единицы. Участие печени в белковом обмене, синтезе белков крови, углеводном обмене, синтезе гликогена, жировом обмене, выработке желчи. Строение желчных протоков.

    презентация [1,2 M], добавлен 27.03.2019

  • Возможные механизмы магниторецепции. Пути создания ослабленного геомагнитного поля. Анализ его влияния на биосистемы и организм человека. Исследование суточной динамики и ритмической составляющей поведения крыс под воздействием гипогеомагнитных условий.

    курсовая работа [1,2 M], добавлен 03.12.2014

  • Анатомо-физиологические особенности у детей раннего возраста. Разнообразные и очень важные функции, которые выполняет печень. Функциональные возможности печени у маленьких детей. Ферментативная система у новорожденных. Нарушение обезвреживающей функции.

    презентация [270,8 K], добавлен 02.02.2016

  • Белки и липиды как основные компоненты мембран. Фосфолипидный состав субклеточных мембран печени крысы. Длинные углеводородные цепи. Мембраны грамположительных бактерий. Пути биосинтеза мембранных липидов и механизмы их доставки к местам назначения.

    реферат [1,3 M], добавлен 30.07.2009

  • Зубы: молочные, постоянные, их формула и строение. Желудок: положение, части, строение стенки, функции. Структурно-функциональные единицы легких, печени, почек. Сердце: размеры, форма, положение, границы. Особенности строения и функций нервной системы.

    курс лекций [144,7 K], добавлен 04.06.2012

  • Общие сведения о декоративных крысах и их разновидностях. Основы крысиной генетики, принципы наследования. Типы окраса крыс. Лабораторные крысы, использование крыс как биоматериала. Возможные наследственные заболевания. Влияние генной модификации.

    курсовая работа [32,8 K], добавлен 17.12.2013

  • Протеолиз белков, структура и функции нейтральных протеаз. Обмен белков при гипотермии и спячке. Исследование активности нейтральных протеаз в мозгу, печени и сердечной мышце в динамике зимней спячки сусликов. Температурная зависимость активности.

    диссертация [609,4 K], добавлен 15.07.2012

  • Изучение видового состава рыб в уловах Старомайнского залива мелкоячеистой сетью. Определение годовой динамики встречаемости рыб в уловах. Сравнительный анализ уловов на различных участках водоемов. Исследование суточной активности фоновых видов рыб.

    дипломная работа [1,8 M], добавлен 01.08.2015

  • Наиболее важные черты общей организации млекопитающих, их строение на примере крысы. Порядок вскрытия крыс, знакомство с общим расположением внутренних органов, топография. Кровеносная, дыхательная, пищеварительная, мочеполовая и нервная системы крысы.

    реферат [557,3 K], добавлен 09.12.2009

  • Понятие и структура витамина А как жирорастворимого вещества, накапливающегося в печени. Его назначение, функциональные особенности и анализ лечебных свойств. Симптомы гопо- и гипервитаминоза, оценка негативного влияния данных состояний на организм.

    презентация [416,7 K], добавлен 08.02.2015

  • Общая характеристика и основные этапы обмена липидов, особенности процесса переваривания. Порядок всасывания продуктов переваривания липидов. Исследование различных органов и систем в данном процессе: стенок и жировой ткани кишечника, легких и печени.

    презентация [4,5 M], добавлен 31.01.2014

  • Изучение влияния пирроксана на активность основных карбоксипептидаз в нервной ткани крыс позволило выяснить, что так как при воздействии активность КПН и ФМСФ-КП изменяется однонаправлено, то оба фермента обладают сходной биологической функцией.

    курсовая работа [64,5 K], добавлен 15.12.2008

  • Особенности строения печени. Знакомство с функциями микрофлоры толстого кишечника. Анализ состава желудочного сока, рассмотрение фаз секреции. Общая характеристика ферментов слюны: амилаза, мальмаза, лизоцим. Рассмотрение пищеварительной системы.

    презентация [1,2 M], добавлен 14.10.2016

  • Физиология зубочелюстной области. Анализ роли полости рта в пищеварении. Изучение органов желудочно-кишечного тракта. Регуляция выделения слюны. Пищеварительная функция печени. Состав желудочного сока. Характеристика основных фаз и функций глотания.

    презентация [3,1 M], добавлен 13.12.2013

  • Креатинфосфатный путь ресинтеза АТФ (офеатинкиназный, алактатный), его биохимическая оценка. Уравнение анаэробного расщепления гликогена. Аэробный путь ресинтеза аденозинтрифосфата. Биохимические изменения в мышцах, головном мозге, печени, крови, моче.

    курсовая работа [367,0 K], добавлен 19.12.2012

  • Исследование биологической роли ферментов в механизмах взаимодействия адренергической и пептидергической систем. Определение активности ферментов флюорометрическим методом. Изучение гипофиза, гипоталамуса, больших полушарий и четверохолмия самцов крыс.

    статья [14,0 K], добавлен 01.09.2013

  • История развития физиологии пищеварения. Характеристика пищеварения и пищевых веществ. Строение и функция пищеварительного аппарата. Пищеварение в ротовой полости и глотание, в желудке, в тонком кишечнике. Строение печени и желчевыделительного аппарата.

    реферат [2,2 M], добавлен 21.10.2013

  • Крупные железы пищеварительного аппарата. Развитие печени и поджелудочной железы. Строение зрительного анализатора. Веки и образования конъюнктивы. Эмбриогенез органа зрения. Наружное, среднее и внутреннее ухо. Слуховые косточки и их соединения.

    реферат [10,3 M], добавлен 30.11.2010

  • Характеристика пиявок, которые относятся к отряду класса кольчатых червей. История открытия этого вида, их отличительные особенности и типы. Применение пиявок в медицине, гирудотерапия - кровопускание с помощью пиявок, при заболеваниях сердца, печени.

    реферат [21,6 K], добавлен 17.02.2010

  • Описание анатомического устройства основных органов пищеварительной системы - глотки, пищевода, желудка, толстой и тонкой кишки, печени, поджелудочной железы и брюшинной полости. Рассмотрение механизмов переваривания и всасывания макронутриентов.

    реферат [171,1 K], добавлен 23.04.2011

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.