Исследование некоторых физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Исследование некоторых физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной

03.01.04 - биохимия

Дьяконова Галина Вячеславовна

Ростов-на-Дону, 2010

Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии человека и животных биологического факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный университет».

Научный руководитель: доктор биологических наук, Заслуженный деятель науки РФ, профессор Проскуряков Марк Тихонович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Колмакова Татьяна Сергеевна

кандидат технических наук, доцент Рыльская Лариса Анатольевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»

Защита состоится «23» июня 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.212.208.07 по биологическим наукам в ФГОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б.Садовая, 105/42, ауд. 203.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148)

Автореферат разослан «____» ____________ 20__ г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.В. Асланян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности. Основным источником их получения является поджелудочная железа и слизистая желудка крупного рогатого скота и свиней. Данный ресурс является ограниченным. Поэтому остается актуальным поиск новых продуцентов гидролаз, а также расширение знаний о свойствах таких ферментов. Особого внимания этот вопрос заслуживает в связи с возрастающим дефицитом в пищевой промышленности протеиназ сычужного действия. Одной из перспективных групп являются базидиальные грибы. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что среди базидиальных дереворазрушающих грибов имеются активные продуценты молокосвертывающих протеиназ (Бойко, Стадничук, 2001). По сравнению с широко используемыми продуцентами молокосвертывающих протеиназ родов Endothia и Aspergyllus базидиомицеты имеют ряд преимуществ. Например, отсутствие плодоношения в культуре, что позволяет снизить риск развития аллергических заболеваний, а также отсутствие загрязнения ферментных препаратов бактериальными культурами. Установлено, что гриб Irpex lacteus Fr. способен образовывать протеиназы, которые могут стать заменителями сычужного фермента (Kikuchi, Kobayashi, Kusakabe, 1985). Способы получения соответствующего ферментного препарата и молочных продуктов с использованием данного ферментного препарата защищены международными патентами (United States Patent 3607655, 3212905, 3275453). Скрининговые исследования показали наличие молокосвертывающей активности у многих видов базидиальных грибов (Федорова, 1973), в том числе и для некоторых, культивируемых в промышленных масштабах. Например, в культуральном фильтрате вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.) обнаружены протеиназы, способные створаживать молоко. Данный вид гриба выращивается по всему миру, не токсичен, а его плодовые тела перспективны для всестороннего исследования, так как могут являться относительно дешевым и удобным сырьем для получения ферментных препаратов.

Целью нашей работы являлось выделение, очистка и исследование физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.), а также изучение возможности использования ферментного препарата сычужного действия из плодовых тел вешенки обыкновенной в промышленности.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение и очистка молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной.

2. Исследование физико-химических свойств ферментов (оптимумы активности и стабильности, изоэлектрическая точка, взаимодействие с ингибиторами). фермент пищевой вешенка

3. Изучение возможности применения ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной для получения сырного сгустка.

Научная новизна работы. Установлено, что молокосвертывающая активность экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной связана с наличием трех белков-ферментов с близкими молекулярными массами 35 - 40 кДа, которые находятся в состоянии проферментов и имеют точки изоэлектрофокусирования 4,2, 6,7 и 8,8. Ферменты с изоточками 4,2 и 6,7 являлись металлопротеиназами, а с изоточкой 8,8 относился к классу сериновых протеиназ. Показано, что молокосвертывающие ферменты сохраняют активность при их высаливании 100% насыщенным раствором NaCl. Условия, при которых из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной в стабильном состоянии хлоридом натрия осаждаются молокосвертывающие ферменты, установлены впервые.

Разработаны научные основы применения плодовых тел вешенки обыкновенной в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В плодовых телах Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm обнаружена высокая молокосвертывающая активность, принадлежащая трем протеолитическим ферментам, два из которых являются металлопротеиназами, а один относится к классу сериновых протеиназ.

2. Молокосвертывающие ферменты гриба находятся в состоянии проферментов, автоактивация которых происходит в течение двух часов при 35 єС и рН 6,01.

3. Молокосвертывающие ферменты вешенки обыкновенной при осаждении из экстракта 100 % раствором, насыщенным хлоридом натрия и рН 3,6 сохраняются в стабильном состоянии.

4. Молокосвертывающие ферменты из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной могут использоваться для получения сырного сгустка.

Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа выполнена в области фундаментальных исследований биохимии грибов порядка Agaricales. Установлен тип строения активных центров молокосвертывающих ферментов плодовых тел вешенки обыкновенной. Полученные результаты расширяют данные о физико-химических свойствах протеолитических ферментов грибов.

Разработаны способы получения ферментных препаратов и методы выделения молокосвертывающих протеиназ. Для промышленного использования разработана линия производства молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной. Показана возможность использования такого препарата в сыроделии на стадии образования сгустка.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы научных исследований-2007» и международной научно-практической конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании 2007».

Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ (0,34 п.л., личный вклад 80 %), в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ - 2 статьи и 2 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 90 страницах и состоит из введения, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографии (55 отечественных и 63 зарубежных источника). Диссертация содержит 7 таблиц и 18 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом к данной работе послужили плодовые тела Вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm). Плодовые тела гомогенизировали без добавления жидкости при помощи ручного гомогенизатора, замораживали, затем размораживали однократно, отделяли экстракт путем фильтрации. Экстракт хранили при -18єС не более 30 дней.

Определение количества растворимого белка в экстракте плодовых тел вешенки проводили по методу Брэдфорда (Bradford, 1976). При проведении гельхроматографии, ионообменной хроматографии и изоэлектрического фокусирования для определения содержания белка во фракциях измеряли оптическую плотность при 280 нм (Досон и др., 1991).

Молокосвертывающую активность на всех этапах исследования определяли по модифицированной методике Пятницкого (Пятницкий, Проскуряков, 1969); активность кислых протеиназ - по модифицированному методу Ансона (Нортроп и др., 1950); активность щелочных протеиназ - по методу Кунитца (Нортроп и др., 1950).

Молекулярные массы молокосвертывающих ферментов из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной определяли с помощью гель-хроматографии (Остерман, 1985) на колонке 1,9х75 см с сефадексом G-75 Superfine фирмы «Pharmacia» (Швеция), уравновешенной 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,0. Белки элюировали со скоростью 12 мл/ч, объем фракций 4 мл.

Для очистки молокосвертывающих протеиназ использовали метод ионообменной хроматографии на колонке 1,4х25 см. В качестве сорбента применяли КМ-целлюлозу. Перед нанесением образца на колонку, ее уравновешивали 0,01 М ацетатным буфером рН 4,4.

Метод изоэлектрического фокусирования (Ригетти, 1986) применяли для установления количества компонентов молокосвертывающей фракции белков экстракта вешенки обыкновенной и подбора условий для проведения ионообменной хроматографии.

Для установления типа строения активного центра использовали метод ингибиторного анализа. В ходе эксперимента применяли ФМСФ (ингибитор сериновых протеиназ), ЭДТА (ингибитор металлопротеиназ), моноиодацетат (ингибитор тиоловых ферментов) и пепстатин (ингибитор аспартильных протеиназ).

Для установления оптимумов рН активности и стабильности применяли универсальную буферную смесь (УБС) (Джорджеску, Пуэнеску, 1963) со значениями рН от 2 до 12 с интервалом в 0,5. рН доводили с помощью 1н раствора HCl и 1 н раствора NaOH.

Статистическая обработка результатов проводилась в программе STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной определяли содержание белка и оценивали протеолитическую активность по природным субстратам: казеину и молочно-ацетатной смеси. Согласно полученным нами данным, на один грамм сырых плодовых тел вешенки приходилось 9,40 ± 0,66 мг белка, 12,4±1,64 усл. Е казеинолитической активности (по методу Кунитца) и 3,22±0,66 усл. Е молокосвертывающей активности.

При дополнительном экстрагировании дистиллированной водой в соотношении 1:1 (по массе) была установлена молокосвертывающая активность, составившая около 20 % от ферментативной активности первого экстракта. С тем, чтобы определить оптимальные условия дополнительного экстрагирования, нами проведено исследование экстракции молокосвертывающих ферментов при различных значениях рН экстрагирующей жидкости в диапазоне от 3 до 11 (рис. 1). Было установлено, что оптимальное значение рН экстрагирования молокосвертывающей активности находится в диапазоне от 6,8 до 7,3. Такая среда получается при экстрагировании дистиллированной водой.

Рис. 1. Зависимость молокосвертывающей активности в экстракте вешенки от рН экстрагирующей жидкости.

* обозначены достоверные изменения (р?0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

На основании полученных данных дальнейшие исследования проводили в объединенных экстрактах плодовых тел гриба.

В соответствии с этим, при оценке содержания белка в плодовых телах вешенки обыкновенной предполагали, что в единице массы плодовых тел гриба содержится столько же растворимого белка, сколько в экстракте, полученном из этой массы плодовых тел. Таким образом, согласно полученным нами данным, на один грамм сырой массы гриба плодовых тел вешенки обыкновенной приходилось 11,75 ± 0,66 мг белка.

При оценке общей протеолитической активности щелочных протеиназ по методу Кунитца в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной установлено, что она составляла 15,50 ± 1,64 усл. Е казеинолитической активности на грамм сырой массы гриба. Такое стандартное отклонение можно объяснить тем, что активность протеиназ изменяется в ходе дифференцировки плодовых тел, а в различных партиях спорофоров вешенки могли находится плодовые тела разных стадий, причем их процентное соотношение в выборке могло несколько изменятся от партии к партии. Кроме того, в литературе отмечается, что активность ферментов базидиомицетов зависит от состава субстрата, на котором он выращен и от времени года, в которое проводился сбор (Горшина и др., 2003 с. 45.).

Молкосвертывающая активность экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной составила 4,03 ± 0,66 усл.Е/ г.сырого гриба.

Одним из важных показателей качества молокосвертывающего ферментного препарата является соотношение молокосвертывающей и протеолитической активности, так как при относительно высокой казеинолитической активности наблюдается не только формирование сгустка, но и дальнейший его гидролиз. Это приводит к появлению горьких пептидов и делает такой ферментный препарат не пригодным для использования в сыроделии. Для экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной, содержащего 11,75 ±0,66 мг белка, это соотношение было низко и составило 0,26, что в 12 раз ниже, чем у коммерческого препарата сычужного фермента (ТУ - 9219 - 002 - 05331581 - 98). В ходе дальнейшей работы проводились исследования с целью повышения данного соотношения. Для этого изучались условия, в которых наблюдалась максимальная молокосвертывающая активность и минимальная казеинолитическая.

Условия активации протеолитических ферментов в экстракте вешенки обыкновенной изучали при инкубации экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной с УБС в течение пяти часов при температуре 35єС и значениях рН от 4,0 до 8,5 (рис.2).

Рис. 2. Зависимость молокосвертывающей активности от времени инкубации и рН среды

* обозначены достоверные изменения (р?0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

Максимальная молокосвертывающая активность в экстракте отмечалась после 2 ч. преинкубации при 35єС и рН 6,01. Эти данные позволили предположить наличие проферментов в экстракте плодовых тел гриба.

Следующий этап исследований был направлен на определение диапазона рН стабильности протеолитической активности (по методу Кунитца) молокосвертывающих протеиназ из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной (рис. 3). Для этого полностью активированный экстракт, полученный после 2 ч. инкубации при 35єС и рН 6,01, смешивали с УБС рН в диапазоне от 3,0 до 10,0 с шагом 0,5.

Рис.3. Зависимость протеолитической акти вности молокосвертывающих ферментов от времени инкубации (при 35єС) и рН среды.

* обозначены достоверные изменения (р?0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

Результаты этой части исследования показали, ферментативная активность экстракта незначительно изменяется в течение 3 ч инкубации при значениях рН, близких к 5,0, а наиболее резко снижается при рН 8,4 и 9,5.

Исследование стабильности молокосвертывающей активности (рис. 4) показало, что после 6 ч. инкубации в диапазоне значений рН от 3,0 до 8,0 в полностью активированном экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной сохраняется от 25 % до 30 % от исходной молокосвертывающей активности.

Рис. 4. Остаточная молокосвертывающая активность при различных рН экстракта после 6,5 ч. инкубации при 35єС.

* обозначены достоверные изменения (р?0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

По данным литературы протеиназы некоторых грибов проявляют активность при широком диапазоне рН. Так, в работе Dohmae et al. (1995) для протеиназ вешенки обыкновенной указан диапазон рН от 4 до 9. Для вида Pleurotus eringii (Wang и др., 2001) указывается диапазон стабильности от 4 до 12 единиц рН. Металлопротеиназа другого гриба Lentinus edodes (Terashita и др., 1985) стабильна в диапазоне от 4,9 до 9,5 рН. В отношении диапазона стабильности исследуемый нами фермент приближается к химозину животных, который, как и фермент вешенки обыкновенной, быстро теряет активность при рН ниже 3,5 и выше 7,5 (Methods in enzymology, 1970).

С целью исследования физико-химических свойств молокосвертывающих протеиназ экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной мы изучили температурный оптимум ферментативной активности (рис. 5). Для этого исследовали скорость сворачивания МАС при различной температуре инкубации реакционной смеси.

Рис.5. Температурный оптимум активности молокосвертывающих ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной

* обозначены достоверные изменения (р?0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

Полученные данные показывают, что максимальная молокосвертывающая активность наблюдается при температуре 35єС. Это значение несколько ниже, чем для ферментов грибов Pleurotus eringii (Wang и др., 2001) и Tricholoma saponaceum (Kim, 2001) (45єС и 55єС соответственно).

При изучении термостабильности протеиназ из экстракта плодовых тел вешенки было установлено, что молокосвертывающая активность сохраняется до 50єС при рН 5. Дальнейшее повышение температуры резко инактивирует молокосвертывающие ферменты плодовых тел изучаемого гриба. При 4 єС молокосвертывающая активность сохраняется на одном уровне в течение месяца.

Рис. 6. Действие ингибиторов на молокосвертывающую активность в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной. А) действие ФМСФ, Б) действие пепстатина, В) действие моноиодацетата, Г) действие ЭДТА

* - достоверные изменения (р?0,05) молокосвертывающей активности по сравнению с контролем

В ходе выполнения работы изучали действие ФМСФ, пепстатина, моноиодацетата и ЭДТА, как ингибиторов молокосвертывающей активности. Контролем служил экстракт плодовых тел вешенки обыкновенной, инкубированный с дистиллированной водой без ингибитора (рис. 6).

Полученные выше данные анализа действия ингибиторов позволили предположить, что в экстракте плодовых тел вешенки содержатся сериновые и металлопротеиназы.

Дальнейшие исследования были направлены на очистку молокосвертыващих ферментов из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной. Первым этапом было выбрано осаждение неорганическими солями. В качестве реагентов выбрали сульфат аммония и хлорид натрия.

При ступенчатом фракционировании сульфатом аммония получили, что максимальная молокосвертывающая активность белка проявляется при осаждении сульфатом аммония в диапазоне от 0,3 до 0,7 степеней насыщения экстракта солью (рис. 7).

При получении ферментных препаратов для пищевой промышленности важным этапом является осаждение. В качестве реагента могут быть использованы различные неорганические соли или органические растворители. Удобным и нетоксичным реагентом считается хлорид натрия. Однако он не способствует стабильности осаждаемых протеолитических ферментов, а так же хуже осаждает белки из экстракта, чем, например, сульфат аммония.

Рис.7. Ферментативная активность осадка при ступенчатом фракционировании сульфатом аммония экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной.

а) протеолитическая активность по казеину; б) молокосвертывающая активность.

Рис. 8. Выход молокосвертывающей активности при осаждении хлоридом натрия в зависимости от рН экстракта

Нами была исследована возможность выделения молокосвертывающих ферментов из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной с помощью хлорида натрия. Было установлено, что при полном насыщении раствора солью при естественном значении рН 6,01 экстракта содержание белка в надосадочной жидкости составляло 11,75 ± 0,66 мг/ г сырой массы гриба и сохраняло до 80 % исходной молокосвертывающей активности, что составило 3,22 ± 0,66 усл. Е / г сырой массы гриба. В связи с этим была предпринята попытка увеличения выхода ферментативной активности осадка при значениях рН экстракта от 1,5 до 8,0 (рис. 8).

Результаты исследования показали, что максимальный выход молокосвертывающей активности наблюдался при рН экстракта 3,60, что составило 18 % от начальной молокосвертывающей активности экстракта, (0,78±0,08 усл. Е МАС на один грамм сырой массы гриба по отношению к 0,56 ± 0,03 мг белка/грамм сырой массы гриба). При этом в надосадочной жидкости сохранилось 40 % от исходной молокосвертывающей активности экстракта (1,73±0,08 усл. Е МАС/ г сырой массы гриба). Полученный таким образом осадок применяли для получения сырного сгустка. В результате проведенного эксперимента получили еще два пика осажденной активности - при рН 4,75 и рН 5,70. Это позволило предположить наличие трех изоформ молокосвертывающих ферментов в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной.

Полученный при осаждении сульфатом аммония белок подвергли хроматографическому разделению на колонке с сефадексом G-75 superfine (1,9х 75 см) уравновешенной 0,01 М ацетатным буфером рН 5,0. Скорость элюции 12 мл/ч, объем фракций 4 мл (рис. 9).

В результате исследований получили 2 белковых компонента, обладавших молокосвертывающей активностью, с молекулярной массой около 30 - 40 кДа.

Рис.9. Гель-хроматография на сефадексе G-75 белков из плодовых тел вешенки. Скорость элюции 12 мл/ч. Объем фракции 4 мл.

При этом ферментативная активность второго компонента была значительно выше. Она составляла 93 % от нанесенной на колонку молокосвертывающей активности и 91 % - от общей протеолитической.

Ингибиторный анализ белков, входящих в состав первого и второго пиков элюата показал, что молокосвертывающая активность компонента I не угнеталась ни одним из использованных ингибиторов. Молокосвертывающая активность компонента II угнеталась ФМСФ и ЭДТА. Это позволило предположить, что в плодовых телах вешенки имеются три способные створаживать молоко протеиназы, относящиеся к сериновым и металлозависимым. Причем эти ферменты близки по молекулярной массе. Моноиодацетат не подавлял активность обоих компонентов, что указывало на отсутствие молокосвертывающих цистеиновых протеиназ в плодовых телах вешенки.

Для проверки предположения о наличии трех молокосвертывающих ферментов в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной было проведено изоэлектрическое фокусирование. Результаты этого исследования подтвердили наше предположение (рис.10). Было обнаружено три белковых компонента с изоточками 4,2, 6,7 и 8,8, обладающих молокосвертывающей активностью.

При этом белок с изоточкой 4,2 составил 55 % от нанесенного на колонку белка (37 мг из 65 мг) и 56 % молокосвертывающей активности (13,5 усл. Е МАС из 25 усл. Е МАС).

Рис. 10. Изоэлектрическое фокусирование белков из плодовых тел вешенки обыкновенной, полученных после осаждения сульфатом аммония. Продолжительность 24 ч. Объем фракции 2,5 мл.

Ингибиторный анализ белковых компонентов, полученных методом изоэлектрического фокусирования, показал, что молокосвертывающая активность компонента с изоточкой 4,2 полностью угнеталась ЭДТА, а ФМСФ на нее не действовал. Молокосвертывающая активность компонента с изоточкой 6,7 подавлялась ФМСФ на 50 %,а ЭДТА ? на 100%. ФМСФ полностью подавлял молокосвертывающую активность компонента с изоточкой 8,8, тогда как ЭДТА не оказывал на нее действия. Таким образом, компонент с изоточкой 4,2 принадлежит к классу металлопротеиназ, компонент с изоточкой 8,8 - к классу сериновых. Можно также предположить, что компонент с изоточкой 6,7 также принадлежит к классу металлопротеиназ.

После осаждения белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной при рН 3,6 был получен ферментный препарат (выход 18 %). Его свойства сравнили с четырьмя ферментными препаратами сычужного действия (алтазим, сычужный фермент, сычужно-говяжий и курино-говяжий), а также с ацидин-пепсином и свежим экстрактом плодовых тел вешенки.

Таблица. Сравнение ферментативной активности осадка экстракта вешенки с другими препаратами сычужного действия

Удельная молокосвертывающая активность осадка вешенки с NaCl ниже активности сычужного фермента, ацидин-пепсина и экстракта плодовых тел. Однако, соотношение молокосвертывающей и общей протеолитической активности исследуемого ферментного препарата - 1,26, являющееся важнейшей характеристикой молокосвертывающих ферментов, используемых в сыроделии, было близко к двум ферментным препаратам сычужно - говяжьему - 1,92 и курино - говяжьему - 1,02. Удельная активность полученного осадка по отношению к молокосвертывающей активности была ниже, чем у других препаратов, что объясняется более низкой степенью очистки по сравнению с другими.

Полученный молокосвертывающий ферментный препарат сравнили также с препаратами грибного происхождения, применяемыми в сыроделии (препараты Irpex lacteus и Endothia parasitica), а так же с протеиназой растительного происхождения, полученной из артишока и сычужным ферментом. Установлено, что молокосвертывающий ферментный препарат вешенки обыкновенной имеет оптимум активности несколько ниже, чем известные препараты из Irpex lacteus и Endothia parasitica, кроме того, полученный нами препарат имеет более низкий предел термостабильности. Этот факт имеет значение для применения в сыроделии, так как одной из проблем, связанных с использованием молокосвертывающих препаратов микробного и грибного происхождения является их высокая остаточная протеолитическая активность. Эта проблема ведет к появлению дополнительных технологических операций. В противоположность известным препаратам, полученный нами инактивируется при более низкой температуре. Кроме того, полученный нами препарат действует в тех же условиях кислотности среды, что и химозин (рН 3,5 - 7,0).

Одной из задач было исследование возможности получения сырного сгустка с помощью молокосвертывающих ферментов из экстракта плодовых тел вешенки. Сравнили способность полученного осадка образовывать сырный сгусток с сычужным ферментом и экстрактом вешенки. Оценка органолептических качеств показала, что все образцы обладали нежной, однородной консистенцией, соответствующей требованиям, предъявляемым к мягким сырам. Образцы, приготовленные с использованием вешенки, имели кремовый оттенок, равномерный по всей массе, и легкий грибной аромат. Присутствие горечи в полученных образцах допустимо для мягких сыров.

Таким образом, полученный по разработанному нами способу ферментный препарат, сходен по некоторым свойствам с применяемыми в сыроделии препаратами и может быть использован после доработки в пищевой промышленности. Полученный по разработанному нами способу ферментный препарат может применяться в пищевой промышленности, например в сыроделии на стадии сычужного свертывания при производстве мягких сыров, а также на стадии созревания сыров с плесенью в качестве дополнения к грибному инокуляту.

ВЫВОДЫ

1. В плодовых телах Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm присутствуют три фермента, обладающие молокосвертывающей активностью. Ингибиторный анализ показал, что два из них являются металлопротеиназами, а один - относится к классу сериновых протеиназ, которые находятся в состоянии проферментов.

2. Интервал стабильности молокосвертывающих протеиназ находился в диапазоне рН 3,5 - 7,5. Оптимальные температурные условия активности молокосвертывающих протеиназ экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной соответствуют температуре 35єС, молокосвертывающая активность ферментов сохраняется до 50 єС.

3. Молокосвертывающие ферменты плодовых тел вешенки обыкновенной с точками изоэлектрофокусирования в кислой (4,2) и слабокислой (6,7) средах являются металлопротеиназами, с изоточкой в щелочной среде (8,8) - сериновой протеиназой.

4. Фермент с изоточкой 4,2 вносит максимальный вклад в суммарную молокосвертывающую активность экстракта плодовых тел вешенки (55 % от общей активности экстракта) и протеолитической активности (56 % от общей активности экстракта).

5. Установленно, что молокосвертывающие ферменты сохраняют активность при их высаливании 100% насыщенным раствором NaCl при рН 3,6 и могут применяться в сыроделии на стадии образования сырного сгустка.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т., Кожухова М.А. Выделение и характеристика фермента сычужного действия из плодовых тел вешенки обыкновенной// Известия ВУЗов. Пищевая технология, № 1 (302), 2008, Краснодар: Изд-во КубГТУ. С. 114 - 115 . - 0,08п.л., личный вклад 80 %

2. Патент на полезную модель № 79100 РФ (3с.).- Приоритет от 01.09.2008. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т., Бархатова Т.В., Кожухова М.А.Линия производства молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной. - 0,12 п.л., личный вклад 80 %

3. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т. Очистка и характеристика молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.)// Прикладная биохимия и микробиология , 2009, Т. 45, № 6, с. 690 - 692. - 0, 12 п.л., личный вклад 80 %

4. Патент на изобретение № 2380416 РФ (6с.).- Приоритет от 04.08.2008.Зарегестрирован 27.01.2010. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т., Бархатова Т.В., Кожухова М.А.Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной. - 0,24 п.л., личный вклад 80 %

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т. Протеазы сычужного действия в плодовых телах вешенки Pleurotus ostreatus//Сборник научных работ «Естествознание и гуманизм»Т.4. - Томск: 2007. - С. 45 - 46. - 0,04 п.л., личный вклад 80 %

2. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т. Выделение и очистка молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки Pleurotus ostreatus //Материалы III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы научных исследований - 2007» Т.8. - Днепропетровск: «Наука и образование». - 2007. - с. 34 - 35. - 0,04 п.л., личный вклад 80 %

3. Лебедева Г.В. Изучение молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной // Сборник научных трудов по материалам международной научно-практической конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании 2007». Т.20. Биология, Сельское хозяйство, Искусствоведение и архитектура. - Одесса: Черноморье, 2007. - С. 3 - 4. - 0,04 п.л., личный вклад 100%.

4. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т. Очистка и характеристика молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) // VI Симпозиум Химия протеолитических ферментов. Тезисы докладов и стендовых сообщений. М.:. - С. 85. - 0,02 п.л., личный вклад 80 %

Размещено на Allbest.ru