Изучение кодирующих последовательностей вариабельных районов генома вируса

Размещено на http://www.Allbest.ru/

Федеральное государственное учреждение науки

Роспотребнадзор

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор”

Изучение кодирующих последовательностей вариабельных районов генома вируса натуральной оспы

И.В. Бабкин, И.Н. Бабкина

Новосибирская обл., Кольцово

Аннотация

Выполнен поиск потенциальных ОРТ в концевых вариабельных протяженных районах генома ВНО. Проведен детальный структурно-функциональный анализ этих рамок, и их сравнение как между собой, так и с гомологичными ОРТ различных ортопоксвирусов. Выявлены наиболее консервативные и гетерогенные среди изученных ОРТ 70 штаммов ВНО. У штаммов Нelder и Mary Российской коллекции впервые открыта уникальная для ВНО ОРТ длиной 111 а.к. Кроме того, только у штамма Helder ОРТ D14L распадается на две отдельные рамки трансляции. Обнаружен ряд неточностей в современных базах данных для ОРТ ВНО. Установлено, что доминирующим типом селекции для анализируемых ОРТ является стабилизирующий отбор. Определено, что ОРТ C3L ВНО находится под адаптивной селекцией, в отличие от ортологов, представленных в геноме других поксвирусов. Данных факт свидетельствует о важной роли этого гена при адаптации ВНО к человеку.

Ключевые слова: ортопоксвирусы, вирус натуральной оспы, генетический анализ

I.V. Babkin, I.N. Babkina. Study of coding sequences of variable regions in smallpox virus genome

Potential ORFs were sought in the extended segments of terminal variable regions in the variola virus genome. These ORFs underwent a detailed structural and functional analysis and were compared both between themselves and with homologous ORFs of various orthopoxviruses. The most conservative and heterogeneous ORFs of 70 VARV strains were detected. The unique for VARV ORF (111 a.a.) was revealed for Helder and Mary strains of the Russian collection. In addition, only in the Helder strain, ORF D14L was disintegrated into two separate ORFs. A number of ambiguities were found in the current databases for VARV ORF. The dominating type of evolution was ascertained to be stabilizing selection for analyzed ORF. It has been established that VARV ORF C3L, unlike other poxviral orthologs, undergoes an adaptive selection. These findings suggest that this gene plays an important role in human VARV adaptation.

Геном ортопоксвирусов представлен двухцепочечной молекулой ДНК, в нем выделяют центральную консервативную область и вариабельные концевые районы. Размер изученных геномов ортопоксвирусов варьирует от 184 до 228 т.п.н. Полный геном ортопоксвирусов способен кодировать приблизительно 200 полипептидов [7]. Протяженность его консервативной области составляет 101-102 т.п.н., в ней определяют около 100 родоспецифичных ОРТ, большинство из которых кодируют жизненно важные белки вируса. В вариабельных районах генома расположены ОРТ, значительная доля которых направляет синтез разнообразных молекулярных факторов вирулентности, белков-иммуномодуляторов и белков круга хозяев. Гены вариабельных районов обуславливают как меж-, так и внутривидовое биоразнообразие ортопоксвирусов [14]. Следовательно, сравнительное изучение ОРТ этих районов является актуальной задачей.

Ранее нами было проведено определение нуклеотидных последовательностей двух протяженных сегментов концевых вариабельных районов генома вируса натуральной оспы (ВНО) [1]. Целью данной работы было проведение подробного структурного анализа ОРТ, локализованных в вышеупомянутых районах генома ВНО. Также установили тип эволюционного отбора у изучаемых ОРТ в геномах ВНО и других ортопоксвирусов. Для этого проанализировали число синонимичных и несинонимичных нуклеотидных замен в потенциальных ОРТ, полученные величины могут использоваться для характеристики факторов естественного отбора, направляющих эволюцию данных генетических участков.

Материалы и методы

Нуклеотидные последовательности ортопоксвирусов были получены из базы данных GenBank. Для выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали программы BioEdit v.7.0 [8] и ClustalX v.1.8 [16]. Поиск ОРТ в изучаемых последовательностях выполняли с помощью программ BioEdit v.7.0 [8] и Sequin v.7.30.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей различных ортопоксвирусов проводили методом объединения ближайших соседей с помощью программы Mega v.3.1 [10]. Достоверность дерева была тестирована перестановочным анализом по 1000 итераций.

Расчет отношения числа несинонимичных к числу синонимичных замещений (щ) выполнили установлением попарного числа несинонимичных и синонимичных замещений, нормализованного к числу потенциальных участков. Затем определяли их отношения с помощью метода максимального правдоподобия в пакете Paml.

Результаты и обсуждение

В статье академика РАМН Д.К. Львова с соавторами [4] утверждается необходимость расширенного изучения коллекций ВНО, так как этот вирус является в настоящее время «дремлющим вулканом» и его опасность для человечества со временем возрастает. Ранее нами было проведено исследование гетерогенности двух протяженных вариабельных сегментов генома 70 штаммов ВНО [1]. Левый сегмент генома имел размер около 13.5 тыс.п.н., правый сегмент - около 10.5 тыс.п.н. (рис. 1). Анализ, проведенный в рамках этого исследования, включал в себя поиск потенциальных ОРТ и их сравнение. Известно, что левый сегмент содержит 17 потенциальных ОРТ, а правый включает в себя от 13 ОРТ у штамма BSH75 до 15 ОРТ у GAR66. Предполагаемые функции белков, кодируемых выявленными ОРТ, были получены из базы данных GenBank (табл. 1, 2).

При сопоставлении длин гипотетических белков, закодированных в левом сегменте генома ВНО (табл. 1), установлено, что белки, кодируемые ОРТ D12L, P1L, P2L, O2L, O3L, C2L и C6L, неизменны по длине среди всех изученных штаммов. Для правого сегмента генома (табл. 2) белки, соответствующие ОРТ B1R, B3L, B6R, B7R, B9R (по номенклатуре ВНО штамма IND67) и ОРТ CDS_186 (по номенклатуре штамма ВНО UK52BUT), также постоянны по размеру полипептидов.

Максимальные различия в длинах потенциальных белков между штаммами ВНО наблюдаются для ОРТ D13L и С5L. Ортологи ОРТ С5L, обуславливающей синтез ингибитора апоптоза [5, 13, 15], имеются у всех ортопоксвирусов, последовательности которых анализировали. В начале этой рамки трансляции находятся повторяющиеся нуклеотидные последовательности, кодирующие различные отрицательно заряженные аминокислотные мотивы в зависимости от вида ортопоксвируса. У всех ортопоксвирусов последовательность, содержащая повторы, сильно варьирует по длине, приводя в случае ВНО к разнице в длине белка данной ОРТ от 222 до 339 а.к.

Единственное специфичное для всех штаммов из Африки (кроме Западной) отличие в нуклеотидной последовательности приводит к укорочению рамки трансляции O1L. Кроме того, специфическую длину этой ОРТ имеют штаммы из Западной Африки и Южной Америки. Данная ОРТ, кодирующая анкирин-подобный белок, может служить маркером географического происхождения штаммов ВНО.

Далее полученные для ВНО данные были соотнесены с гомологичными ОРТ других ортопоксвирусов. В результате изучения левого сегмента генома можно заключить, что рамки трансляции D13L и D13.5L образовались у ВНО вследствие разрушения протяженной ОРТ С2L (по номенклатуре вируса осповакцины (ВОВ) штамм Копенгаген), кодирующей kelch-подобный белок, а короткие - O3L и С1L - при деструкции протяженной ОРТ К2L, направляющей синтез анкирин-подобного белка (табл. 1). В правом сегменте генома ВНО (табл. 2) аналогичная ситуация обнаруживается для ОРТ J7R и J8R, образовавшихся из-за разрушения ОРТ A55R (по номенклатуре ВОВ Копенгаген), кодирующей kelch-подобный белок; и для ОРТ CDS_186 (по номенклатуре штамма ВНО UK52BUT) и B8R, появившихся при деструкции ОРТ B6R (по номенклатуре ВОВ Копенгаген), обуславливающий продукцию анкирин-подобного белка.

У ряда ортопоксвирусов в изученном правом сегменте генома находится протяженная ОРТ CMLV-M96-179 (по номенклатуре вируса оспы верблюдов штамм M96) с правой ориентацией, кодирующая schlafen-подобный белок (рис. 2). У всех исследованных штаммов ВНО эта ОРТ разрушена, при этом у штаммов ВНО из Западной Африки и Южной Америки в этом районе присутствуют две коротких ОРТ CDS_181 и CDS_183 по номенклатуре штамма ВНО UK52BUT (№10 и 12 в табл. 2). В нашей работе впервые у штаммов Mary и Helder Российской коллекции обнаружена новая для ВНО ОРТ, кодирующая белок длиной 111 а.к. и являющаяся другим фрагментом ОРТ CMLV-M96-179 (№7 в табл. 2, рис. 2). Также в этом районе имеются небольшие ОРТ с противоположной левой ориентацией - B2L, B3L и B4L по номенклатуре штамма ВНО IND67 (№8, 9, 11 в табл. 2), при этом ОРТ B2L отсутствует у штаммов из Западной Африки и Южной Америки.

Для изучения структурно-функциональной организации правого и левого сегмента генома были построены выровненные стопки нуклеотидных последовательностей всех ОРТ этих районов для 70 штаммов ВНО и 10 различных ортопоксвирусов. Далее рассчитали отношение числа несинонимичных к числу синонимичных замещений для кодирующих участков вирусных геномов. Также были созданы выровненные стопки аминокислотных последовательностей этих ОРТ. Для всех аминокислотных последовательностей осуществлен поиск консервативных доменов.

Проведенный анализ открытых рамок трансляции левого и правого сегмента генома ВНО и других ортопоксвирусов позволил нам сделать ряд выводов. ОРТ, кодирующие три kelch-подобных белка ортопоксвирусов (A55R, C2L, F3L по номенклатуре ВОВ Копенгаген), распадаются у ВНО на 5 более коротких ОРТ с потерей доменной структуры. ОРТ B4R, M1L и K1L ортопоксвирусов (по номенклатуре ВОВ Копенгаген) изучаемых сегментов генома кодируют анкирин-подобные белки, при этом у ВНО одна из этих рамок (K1L) расщепляется на две ОРТ. Было показано, что две оставшиеся полноразмерные ОРТ ВНО находятся под стабилизирующей селекцией (табл. 1, 2).

Было установлено, что ОРТ D12L, P1L, P2L, O1L, O2L, C2L, C4R, C5L, C6L, C8L, J6R, J7R, J8R, J9R, B1R, B6R, B7R, B9R (по номенклатуре ВНО IND67); ОРТ CDS_181 и CDS_183 (по номенклатуре ВНО UK52BUT); а также уникальная ОРТ, кодирующая белок длиной 111 а.к. у штаммов ВНО Нelder и Mary, находятся под действием стабилизирующей селекции между штаммами ВНО. ОРТ ВНО D13L, D13.5L, D14L, O3L, C1L, C7L, J10R, B8R (по номенклатуре ВНО IND67) и ОРТ CDS_186 (по номенклатуре ВНО UK52BUT) находятся под нейтральной селекцией и, возможно, не активны (табл. 1, 2). нуклеотидный вариабельный вирус натуральный оспа

Следует отметить, что в случаях, когда ОРТ ВНО оказывается значительно укороченной или разрушенной по сравнению с полноразмерными ортологами других ортопоксвирусов, как правило наблюдается нейтральный тип селекции. Исключениями являются ОРТ J7R, J8R и ОРТ ВНО, образовавшиеся при деструкции предшествующей ортопоксвирусной ОРТ CMLV-M96-179 (рис. 2). Анализ показал, что они находятся под действием отрицательного (стабилизирующего) эволюционного отбора. Можно предположить, что или разрушение этих районов в геноме ВНО произошло сравнительно недавно, и поэтому последовательности не успели накопить достаточное количество несинонимичных замен; или данные последовательности являются функционально значимыми.

В районе разрушенного гомолога ОРТ CMLV-M96-179 у штаммов ВНО обнаружены три рамки трансляции, имеющие противоположную транскрипционную ориентацию - B2L, B3L и B4L (табл. 2, рис. 2). Поиск консервативных доменов в аминокислотных последовательностях не дал положительного результата ни для одной из этих ОРТ. Ни у одного из других представителей ортопоксвирусов рамок, гомологичных этим ОРТ, не найдено. ОРТ B2L отсутствует у штаммов ВНО из Западной Африки и Южной Америки, ОРТ B3L имеется у всех изолятов ВНО, ОРТ B4L не обнаружена у штаммов из Конго. К сожалению, рассчитать щ между штаммами ВНО для этих трех ОРТ невозможно из-за малых размеров ОРТ и, как следствие, небольшого количества нуклеотидных замен.

Обнаружено, что ген С3L, кодирующий синтез белка ингибитора РНК-зависимой протеинкиназы [6, 9], находится для ВНО относительно других ортопоксвирусов под действием расщепляющего отбора (адаптивная эволюция) (табл. 1). Ранее также было продемонстрировано, что этот ген кодирует белок, определяющий круг хозяев [11]. По-видимому, этот ген играет важную роль в специализации ВНО к человеку. Гомологи ОРТ С3L имеются в полном варианте у вируса оспы коров, оспы лошадей, осповакцины, татерапоксвируса и вируса оспы верблюдов. Эта ОРТ нарушена у вирусов оспы обезьян и эктромелии. При исследовании значений щ между ортопоксвирусами можно обнаружить, что эти величины между ВНО и остальными ортопоксвирусами варьируют от 2.4 до 3.0, при этом значения щ у последних колеблются от 0.3 до 1.1. Нами было проведено расширенное изучение типа эволюционного отбора, направленного на этот ген, для представителей семейства Poxviridae, относящихся к различным родам. Было обнаружено, что между поксвирусными ортологами показатель щ всегда меньше 1 и в большинстве случаев его значения оказываются менее 0.1. Этот ген находится под действием стабилизирующего отбора у представителей семейства Poxviridae за исключением ВНО.

Далее провели филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей ОРТ С3L ортопоксвирусов (рис. 3). В качестве внешней группы был выбран вирус эктромелии, топология филогении ортопоксвирусов была установлена ранее [2]. Следует отметить, что данный локус у ВНО имеет наибольшие отличия в нуклеотидной последовательности от вируса-предшественника, при этом ген С3L ВНО демонстрирует значительную генетическую удаленность даже от ближайших родственников - вируса оспы верблюдов и татерапоксвируса.

При анализе базы данных GenBank было обнаружено, что у некоторых штаммов ВНО депонирована ОРТ протяженностью 45 а.к., кодирующая белок гомологичный сосудистым эндотелиальным факторам роста. Однако, наш поиск консервативных доменов в этой ОРТ не привел к положительным результатам. Кроме того, для последовательностей ВНО и других ортопоксвирусов указано, что ОРТ В8R кодирует анкирин-подобный белок. Однако, поиск анкириновых повторов в этой ОРТ их не выявил.

В результате выполненного исследования можно сделать заключение о необходимости коррекции современной базы данных нуклеотидных последовательностей ортопоксвирусов. Целесообразно провести уточнение баз данных ОРТ ортопоксвирусов особенно для коротких ОРТ, находящихся под нейтральной селекцией, для которых не выявлены доменные структуры кодируемых пептидов. Следует также исправить ряд ошибок в этих базах при описании функций ОРТ. Необходимо дальнейшее изучение ОРТ, подвергающихся стабилизирующему отбору и являющихся фрагментами мутационно разрушенных ОРТ вируса-предшественника.

Нами впервые было показано, что Российские штаммы ВНО Нelder и Mary, выделенные в Танзании в 1962 г., имеют в составе генома уникальную для ВНО ОРТ длиной 111 а.к., являющуюся частью ОРТ CMLV-M96-179, кодирующей schlafen-подобный белок ортопоксвирусов (рис. 2); а также, что у штамма Helder ОРТ D14L распадается на две отдельные рамки трансляции.

В ходе работы проведен анализ потенциальных ОРТ для изученных сегментов 70 штаммов ВНО и их сравнение с гомологичными последовательностями других ортопоксвирусов. Для большинства ОРТ установлен тип естественного отбора, направляющего эволюцию данного генетического участка. Установлено, что доминирующим типом эволюционного отбора для выявленных ОРТ левого и правого концевых сегментов генома ВНО является стабилизирующий, несмотря на значительную вариабельность нуклеотидных структур этих районов. При этом в левом сегменте локализованы полноразмерные ОРТ, направляющие синтез семи потенциальных иммуномодулирующих белков. В правом сегменте расположены три ОРТ, кодирующие пептиды с такими свойствами. Девять генов из обоих изучаемых сегментов генома ВНО, обуславливающих продукцию иммуномодуляторов, подвержены стабилизирующему отбору, а ОРТ C3L находится под адаптивной селекцией. Это свидетельствует о том, что данный ген играет важную роль в адаптации вируса к человеку, и дальнейшее его исследование может пролить свет на эволюцию такого опасного патогена как ВНО.

Литература

1. Бабкин И.В., Непомнящих Т.С., Максютов Р.А. и др. Сравнительный анализ концевых вариабельных районов генома вируса натуральной оспы // Молекул. биол. - 2008. - Т. 42. - C. 612-624.

2. Бабкин И.В., Щелкунов С.Н. Молекулярная эволюция поксвирусов // Генетика. - 2008. - Т. 44. - №8. - C. 1029-1044.

3. Бабкина И.Н., Бабкин И.В., Ли Ю. и др. Филогенетическое сравнение геномов различных штаммов вируса натуральной оспы // Докл. РАН. - 2004. - Т. 398. - С. 316-319.

4. Львов Д. К., Зверев В. В., Гинцбург А. Л. и др. Натуральная оспа -- дремлющий вулкан // Вопр. вирусол. - 2008. - №4. - С. 4-8.

5. Fischer S.F., Ludwig H., Holzapfel J. et al. Modified vaccinia virus Ankara protein F1L is a novel BH3-domain-binding protein and acts together with the early viral protein E3L to block virus-associated apoptosis // Cell Death Differ. - 2006. - Vol. 13. - P. 109-118.

6. Garcia M.A., Meurs E.F., Esteban M. The dsRNA protein kinase PKR: Virus and cell control // Biochimie. - 2007. - Vol. 89. - P. 799-811.

7. Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E. et al. The complete DNA sequence of vaccinia virus // Virology. - 1990. - Vol. 179. - P. 247-266.

8. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucl. Acids. Symp. Ser. - 1999. - Vol. 41. - P. 95-98.

9. Kawagishi-Kobayashi M., Silverman J.B., Ung T.L., Dever T.E. Regulation of the protein kinase PKR by the vaccinia virus pseudosubstrate inhibitor K3L is dependent on residues conserved between the K3L protein and the PKR substrate eIF2alpha // Mol. Cell. Biol. - 1997. - Vol. 17. - P. 4146-4158.

10. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Brief. Bioinform. - 2004. - Vol. 5. - P. 150-163.

11. Langland J.O., Jacobs B.L. The role of the PKR-inhibitory genes, E3L and K3L, in determining vaccinia virus host range // Virology. - 2002. - Vol. 299. - P. 133-141.

12. Li W.H., Graur D. Fundamentals of molecular evolution. - Sunderland, Mass. USA: Sinauer Associates Inc. - 1991. - 261 p.

13. Postigo A., Cross J.R., Downward J., Way M. Interaction of F1L with the BH3 domain of Bak is responsible for inhibiting vaccinia-induced apoptosis // Cell Death Differ. - 2006. - Vol. 13. - P. 1651-1662.

14. Shchelkunov S.N., Marennikova S.S., Moyer R.W. Orthopoxviruses pathogenic for humans. - Berlin, Heidelberg, New York: Springer. 2005. - 425 p.

15. Stewart T.L., Wasilenko S.T., Barry M. Vaccinia virus F1L protein is a tail-anchored protein that functions at the mitochondria to inhibit apoptosis // J. Virol. - 2005. - V. 79. - P. 1084-1098.

16. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F. et al. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucl. Acids Res. - 1997. - Vol. 24. - P. 4876-4882.

Приложение

Таблица 1

ОРТ левого сегмента генома ВНО, функции кодируемых ими белков и тип эволюционного отбора. Наименования ОРТ приведены в соответствии с номенклатурой штамма ВНО IND67

Таблица 2

ОРТ правого сегмента генома ВНО, функции кодируемых ими белков и тип эволюционного отбора. Наименования ОРТ приведены в соответствии с номенклатурой штамма ВНО IND67

Примечание. н: данной ОРТ нет в составе генома ВНО штамм IND67: тип эволюционного отбора не определен, *: ОРТ по номенклатуре ВНО штамм UK52BUT.

Размещено на http://www.Allbest.ru/

Рис. 1. Схема расположения изученных сегментов на геноме ВНО штамм IND67

Двунаправленными стрелками обозначены левый (L) и правый (R) сегменты генома ВНО. В верхней строке приведены координаты на геноме в т.п.н. Латинскими буквами обозначены HindIII и XhoI фрагменты генома.

Рис. 2. Схема расположения гомологов ОРТ CMLV-M96-179

Границы и направление ОРТ указаны стрелками. Названия ОРТ ВНО приведены под стрелками. Черным цветом выделены домены белка, кодируемого ОРТ CMLV-M96-179. * - данная ОРТ представлена в геноме вируса оспы верблюдов, оспы коров, оспы обезьян, эктромелии и татерапоксвируса

Размещено на http://www.Allbest.ru/

Рис. 3. Филограмма, построенная методом объединения ближайших соседей по результатам анализа нуклеотидных последовательностей ОРТ С3L ортопоксвирусов

Цифры показывают индексы статистической надежности узлов дерева (приведены значения, превышающее 70%). Снизу приведена шкала дивергенции (замен на сайт).

Размещено на Allbest.ru