Оценка антимикробной активности и токсичности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оценка антимикробной активности и токсичности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Формирование устойчивости бактерий к антимикробным препаратам остается одной из самых актуальных проблем современной медицинской и ветеринарной микробиологии (Навашин, 1994; Сидоренко, 1995, 1998; Страчунский, Козлов, 2001). Природная лекарственная резистентность является постоянным видовым признаком микроорганизмов и обусловлена отсутствием или недоступностью мишени действия антибиотика; в этом случае традиционные антибиотики клинически неэффективны. Примером может служить резистентность микоплазм и псевдомонад к бензилпенициллину или бактерий к противогрибковым препаратам (Егоров, Сазыкин, 1999). Приобретенная устойчивость связана со способностью отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при концентрациях антибиотиков, которые подавляют рост основной части микробной популяции. Различают первичную, имеющуюся до начала лечения антимикробными препаратами, и вторичную приобретенную устойчивость, которая развивается и возрастает в процессе антимикробной терапии и обусловлена изменением генома микробной клетки в результате мутаций или внехромосомного (плазмидного) переноса генетической информации от одной микробной клетки к другой с последующей селекцией устойчивых штаммов микроорганизмов (Розенфельд, 1986; Сазыкин, 1998; Сидоренко, 1999; Романова, 2001; Страчунский и др., 2002).

Особое внимание с точки зрения клинической значимости и уровня антибиотикорезистентности заслуживают метициллинорезистентные стафилококки (MRSA), у которых метициллинрезистентность является маркером полирезистентности ко всем в-лактамным антибиотикам и ассоциирована с устойчивостью к аминогликозидам, линкозамидам и фторхинолонам. Кроме того, MRSA имеют тенденцию к эпидемическому распространению, что делает данную проблему крайне важной (Фомина, 1997; Сазыкин, 1998; Яковлев, 1999; Белобородова и др., 2000; Проценко и др., 2005).

Одним из перспективных путей преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов является поиск и внедрение в практику новых антибактериальных веществ, в том числе с отличным от широко применяемых антибиотиков строением и механизмом действия (Яковлев, 1999; Страчунский, 2001). В связи с вышеизложенным, поиск веществ с антибактериальной активностью среди новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений разных классов и изучение их антибактериального действия на различные микроорганизмы является актуальным и имеет прикладное значение.

Цель работы: изучение антимикробной активности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений разных классов, токсичности наиболее перспективных соединений и их влияния на метаболические процессы в организме лабораторных животных.

Задачи исследования:

1. Провести отбор перспективных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений различных классов по антимикробной активности на модели стандартных тест-штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

2. Оценить антибактериальное действие отобранных соединений на клинические штаммы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

3. Выявить взаимосвязь проявления антимикробной активности отобранных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений с особенностями их химической структуры.

4. Изучить токсичность отобранных соединений на биотест-объектах Daphnia magna Straus и на белых лабораторных мышах.

5. Определить влияние отобранных соединений на активность ключевых ферментов метаболизма, состояние белкового, липидного и углеводного обменов в организме лабораторных животных по биохимическим показателям крови.

Научная новизна. В работе впервые дана характеристика антимикробной активности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений разных классов: фенилпентендиона, халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, енамина, семикарбазона в отношении тест-штаммов бактерий Escherichia coli 113-13, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus 209 P и грибов Candida albicans 18; отобраны 10 наиболее перспективных в плане дальнейшего изучения. Все соединения были синтезированы на кафедре органической и биоорганической химии Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского. Отмечена высокая антибактериальная активность препарата ПНВ-1 из ряда фенилпентендиона по отношению ко всем используемым бактериям. Выявлены 8 перспективных антистафилококковых препаратов из ряда халкона (№44, 47), полифункциональнозамещенных эфиров (№45, 46, 49), енаминов (№4), семикарбазонов (№9, 10). Показана фунгицидная активность в отношении стандартного тест-штамма Candida albicans 18 соединения из ряда енаминов (№4).

Установлена самая высокая антимикробная активность по отношению к метициллинорезистентным клиническим штаммам стафилококка соединения ПНВ-1 из ряда фенилпентендиона по сравнению с другими изучаемыми соединениями; МПК для MRSA составила 3,12 мкг/мл, для MRSE - 1,28 мкг/мл. Данное соединение также обладало высокой антимикробной активностью в отношении метициллиночувствительных клинических штаммов S. aureus, S. epidermidis и S. hominis, (МПК 0,80 мкг/мл). Этот же препарат был эффективен и в отношении клинических штаммов Escherichia coli и Proteus vulgaris.

Впервые установлена зависимость антимикробной активности изучаемых соединений от значений их молекулярной массы, пространственных характеристик молекул, распределения электронных зарядов и наличия определенных химических функциональных групп для комплексного взаимодействия с мембраной бактериальной клетки.

Определены показатели токсичности отобранных соединений на биотест-объектах D.magna и белых лабораторных мышах и отобраны 4 нетоксичных препарата, для которых впервые изучено влияние на метаболическую активность в организме лабораторных животных по биохимическим показателям крови.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволили отобрать перспективные соединения с антимикробной активностью в отношении стандартных тест-штаммов E. coli 113-13, B. cereus 8035, S. aureus 209 P, и C. albicans 18, и клинических штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, не обладающие токсичностью по отношению к биотест-объектам и не оказывающие существенного влияния на активность ключевых ферментов, состояние белкового, углеводного и липидного обменов в организме лабораторных животных. Данные препараты могут быть рекомендованы для углубленного лабораторного и доклинического изучения в качестве возможных средств этиотропной химиотерапии инфекционных заболеваний. Соединения с лабораторным шифром ПНВ-1, 44, 46 и 4 являются перспективными антистафилококковыми препаратами.

Результаты проведенных исследований позволяют проводить направленный синтез новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений с антимикробной активностью в ряду фенилпентендиона, халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, семикарбазонов и енамина. Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, кафедре экологии Саратовского государственного технического университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Антимикробной активностью по отношению к стандартным и клиническим штаммам грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также к низшим грибам обладают 10 представителей новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений классов фенилпентендиона, халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, семикарбазонов, енаминов.

2. Перспективные по антимикробной активности соединения классов фенилпентендиона (ПНВ-1), халкона (№44), енаминов (№4) и полифункциональнозамещенных эфиров (№46) являются малотоксичными для гидробионтов (Daphnia magna) и белых лабораторных мышей.

3. Отобранные поликарбонильные карбо- и гетероциклические соединения ПНВ-1, №44, №46, №4 в концентрациях 1 и 10 мкг/мл не вызывают выраженных изменений активности ключевых ферментов метаболизма и показателей белкового и углеводного обменов в организме белых мышей.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научных конференциях различного ранга: научной коференции молодых ученых вузов Поволжского региона «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2006-2009), межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2008); XI Международном конгрессе по антимикробной терапии (Москва, 2009); общероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные медицинские технологии» (Москва, 2009).

Работа выполнена на кафедре микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского в рамках темы НИР «Разработка методологии создания и тестирования новых препаратов с антимикробной активностью» совместно с сотрудниками Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского в период с 2005 по 2009 годы. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно.

Исследования были частично поддержаны 2 грантами: CRDF RUB 1-570-SA-04 при финансовой поддержке Palomar Medical Technologies, Burlington, USA; грант «Проведение научных исследований молодыми учеными (4 очередь)» 2006-РИ-19.0/001/028 в рамках федеральной целевой научно-технической программы «Исследование и разработка по приоритетным направлениям развития науки и техники».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, собственных исследований, заключения, выводов, приложения и списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 146 страницах текста, включают 10 рисунков, 13 таблиц. Список использованных литературных источников включает 171 наименование, в том числе 51 иностранных авторов.

Содержание работы

Материалы и методы

В работе в качестве экспериментальных моделей по изучению антимикробной активности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений были использованы стандартные тест-штаммы Escherichia coli 113-13, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus 209 P, Candida albicans 18, полученные из ГИСК им. Л.А. Тарасевича, клинические штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий: S. aureus MRSA, S. aureus MSSA, S. epidermidis MRSE, S. epidermidis MSSE, S. hominis, Salmonella enteritidis, E. coli, Proteus vulgaris - из музея бактериальных культур Государственного научного учреждения Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Россельхозакадемии.

Для исследования использовали 66 новых карбо- и гетероциклических соединений 10 классов: фенилпентендионы, гидроксициклогексаноны, гидроиндазолы, оксимы, халконы, полифункциональнозамещенные эфиры, циклогексеноны, тетрагидротриазолохиназолины, енамины, семикарбазоны. Все соединения были синтезированы на кафедре органической и биоорганической химии Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского. Квантовохимические расчеты для молекулярных характеристик изучаемых соединений проводили полуэмпирическим методом в валентных приближениях самосогласованного поля (ССП) молекулярных орбиталей с линейной комбинацией атомных орбиталей (МО ЛКАО) с параметризацией PM₃ с полной оптимизацией геометрии (процедура Бройдена-Флетчера-Гольдфарба-Шанно) (Dewar, Thiels, 1977). Для расчетов использовалась оболочка HyperChem 7.01 Professional (Dewar, McKee, Rzepa, 1978).

Определение чувствительности тест-штаммов ко всем исследуемым соединениям проводили методом двукратных серийных разведений в бульоне Мюллера-Хинтона (рН 7,2-7,4), содержащих различные концентрации изучаемых соединений (Методические указания, 2004). В ходе исследования определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) 66 исследуемых соединений. Для определения бактерицидного или бактериостатического действия веществ делали мерный высев из всех опытных пробирок на агар Мюллера-Хинтона. Для дальнейшей работы отбирали соединения c антимикробной активностью в отношении тестируемых штаммов. В связи с низкой растворимостью соединений в воде их предварительно растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО), а затем готовили рабочие концентрации препаратов путем добавления физиологического раствора. При всех используемых рабочих концентрациях веществ концентрация растворителя составляла от 0,1 до 0,002% и не влияла на чистоту экспериментов, что было подтверждено специально проведенными контрольными исследованиями. Опыт сопровождался двумя контролями: посев культуры в жидкой питательной среде без препарата, и с максимальным количеством растворителя (0,1% ДМСО), использовавшимся в ряду разведений исследуемых веществ.

Исследование токсичности поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений с антимикробной активностью проводили в два этапа: биотестирование на тест-объектах дафниях больших (Daphnia magna Straus) с определением летальных и безвредных концентраций (Методические указания, 2001), и определение острой токсичности на лабораторных животных - на половозрелых белых мышах-самцах массой 18-20 г., путем однократного введения различных концентраций препаратов (Методические рекомендации, 1997). Препараты вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл. На основании полученных результатов рассчитывали величину LD₅₀ и проводили оценку токсичности изучаемых соединений (Гуськова, 1990).

Одновременно проводили определение основных биохимических показателей крови лабораторных животных по общепринятой методике (Камышников, 2000). Биохимические исследования проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BS 3000 P. Определяли активность ключевых ферментов: аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (КК), щелочной фосфатазы (ЩФ); а также концентрацию общего белка, мочевины, глюкозы. На основании полученных значений вычисляли коэффициент де Ритиса и индекс ферментемии (Малинин, 2009).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым методикам (Ашмарин и др., 1970). Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 (for Windows; «Stat Soft Inc.», США), Microsoft Excel 2003 (for Windows XP).

Полученные результаты и их обсуждение

На первом этапе работы был проведен скрининг 66 новых карбо- и гетероциклических соединений различных классов на антимикробную активностью по отношению к стандартным тест-штаммам микроорганизмов (табл. 1).

Было установлено, что соединения классов гидроксициклогексанонов, гидроиндазолов, оксимов, циклогексенонов и тетрагидротриазолохиназолинов не обладали антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам. Из пяти изученных соединений фенилпентендиона только два препарата обладали антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам микроорганизмов. Препарат ПНВ-1 (2,4 - дихлор - 1,3,5 - трифенил-2-пентен - 1,5 - дион) характеризовался эффективным антимикробным действием в отношении грамположительных бактерий - S. aureus 209 P и B. cereus 8035. МПК для каждого из этих микроорганизмов составила 6,75 мкг/мл, при этом проявлялось бактерицидное действие данного препарата. В отношении E. coli 113-13 в зависимости от концентрации ПНВ-1 обладал бактериостатическим и бактерицидным действием. Концентрации ПНВ-1 от 1 мкг/мл и выше оказывали выраженное бактерицидное действие на E. coli 113-13.

антимикробный поликарбонильный токсичность

Таблица 1. Антимикробная активность исследуемых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений

Препарат ПНВ-Б (1,3,5 - трифенил-2-пентен - 1,5 - дион) проявил низкую антимикробную активность в отношении стандартных тест-штаммов по сравнению с ПНВ-1. Выявлено антимикробное действие только на S. aureus 209 P, для которого МПК составила больше 12,5 мкг/мл.

Исследованные соединения ряда халкона (3 - (диметиламино) бензилиден) пентан - 2,4 - дион - (№44) и этил-2 - (4-гидроксибензилиден) - 3-оксобутаноат - (№47) характеризовались бактерицидным действием в отношении S. aureus 209 Р (МПК 1,6 мкг/мл). Однако эти вещества не обладали антимикробной активностью в отношении E. сoli 113-13 и B. cereus 8035.

Из 5 представителей полифункциональнозамещенных эфиров было отобрано три вещества: 2,2' - ди - (3 - (3-метокси-4-гидроксифенил) - 2,4 - диацетил -5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил) - диэтиловый (№46), 2,2' - ди - (3-фенил - 2,4 - ди-ацетил-5-гидрокси-5-метил-циклоген-1-ил) - диэтиловый (№45) и 2,2' - ди - (3 - (3-нитрофенил) - 2,4 - диацетил-5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил) - этиловый (№49). Установлены бактерицидные свойства этих соединений в отношении S. aureus 209 Р (МПК 0.8 мкг/мл). В отношении E. сoli 113-13 и B. cereus 8035 исследованные препараты антимикробной активностью не обладали.

Среди 6 изученных представителей енаминов антимикробной активностью обладал только один препарат - этил-2-метил-4 - (1-пиперидил) - 6 - (3-нитрофенил) - циклогекса - 1,3 - диенкарбоксилат с лабораторным шифром №4. Это соединение характеризовалось эффективными бактерицидными свойствами в отношении S. aureus 209 Р при МПК 1,6 мкг/мл.

Из 6 соединений семикарбазонов выявлена высокая антимикробная активность двух препаратов: диэтил-4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2 - (4-метоксифенил) - циклогексан - 1,3 - дикарбоксилат - препарат №9 и диэтил-4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-тиенилциклогексан - 1,3 - дикарбоксилат - препарат №10. Эти соединения оказывали бактерицидное действие на S. aureus 209 Р, МПК для которого составила 1,6 мкг/мл.

Из всех 66 протестированных карбо- и гетероциклических соединений только препарат №4 из ряда енаминов проявил выраженную фунгицидную активность в отношении Candida albicans 18, МПК составила 6,75 мкг/мл.

Таким образом, на первом этапе работы среди 66 изученных карбо- и гетероциклических соединений были выявлены 10 представителей 5 различных классов с антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам грамположительных и грамотрицательных бактерий, и Candida albicans 18. Для дальнейшей работы были отобраны 9 препаратов, которые имели значения МПК не более 10 мкг/мл для всех стандартных тест-штаммов микроорганизмов.

На втором этапе работы была изучена антимикробная активность 9 отобранных перспективных препаратов в отношении клинических метициллинорезистентных (MR) и метициллиночувствительных (MS) штаммов стафилококков и грамотрицательных палочек. В работе были использованы 50 клинических штаммов стафилококков 3 видов: S. aureus, S. epidermidis, S. hominis. Из грамотрицательных палочек использовали 18 клинических штаммов таких бактерий как Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa. Установлено, что все отобранные препараты обладали антимикробной активностью в отношении различных видов клинических штаммов стафилококка. Результаты по антимикробной активности исследуемых соединений в отношении клинических штаммов стафилококка представлены в таблице 2. Из всех протестированных соединений наиболее перспективным оказался препарат из ряда фенилпентендиона ПНВ-1, поскольку он проявил наиболее высокую антимикробную активность в отношении метициллинорезистентных и метициллиночувствительных штаммов S. aureus и S. epidermidis, а также клинических штаммов S. hominis, МПК составила от 0,8 до 3,12 мкг/мл. Соединения ряда халкона (44, 47), полифункциональнозамещенных эфиров (45, 46, 49), енаминов (4) и семикарбазонов (9, 10) также проявляли антимикробную активность по отношению к исследованным штаммам стафилококка, что позволило отобрать эти препараты для дальнейших исследований.

Таблица 2. Минимальная подавляющая концентрация (мкг/мл) новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений

Было установлено, что из 9-ти отобранных препаратов только ПНВ-1 обладал антибактериальной активностью по отношению к клиническим штаммам грамотрицательных палочек E. coli и P. vulgaris при МПК 12,5 мкг/мл. Соединения рядов халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, енаминов и семикарбазонов не проявили антибактериальную активность по отношению к этим клиническим штаммам.

Представляло интерес провести анализ проявления антимикробной активности по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям в зависимости от химической структуры соединений.

Были проведены квантовохимические расчеты габаритных пространственных размеров молекул, а также определение молекулярного веса изучаемых соединений. Эффективную антимикробную активность в отношении грамотрицательных стандартных тест-штаммов и клинических штаммов E. coli соединения фенилпентендиона ПНВ-1 (2,4 - дихлор - 1,3,5 - трифенил-2-пентен - 1,5 - дион) можно объяснить наличием в его составе двух атомов хлора в положении 2 и 4 в структуре карбоцикла, которые отсутствуют у аналогичного по строению соединения фенилпентендиона ПНВ-Б (1,3,5 - трифенил-2-пентен - 1,5 - дион) (рис. 1). Вероятно, это обуславливает его способность проникать через пориновые каналы грамотрицательных бактерий. Каналы поринов имеют диаметр примерно 1 нм (или 10 Ангстрем) и через них могут проникать соединения с низкой молекулярной массой (до 600 дальтон) и определенной пространственной структурой, как соединение ПНВ-1 ряда фенилпентендиона. Другие исследованные соединения разных классов имеют гетероциклическую структуру, крупные объемные пространственные молекулы и большой молекулярный вес, и поэтому не способны проникать в бактериальную клетку грамотрицательных бактерий через эти каналы.

Для грамположительных бактерий важнейшим условием взаимодействия соединений с клеткой является их способность к межмолекулярной ассоциации с белками внешней мембраны. Все исследуемые нами соединения с антимикробной активностью имеют необходимые функциональные группы для такого взаимодействия.

а) ПНВ-1 б) ПНВ-Б

Рис. 1. Химическая структура соединений фенилпентендиона

а) №9 б) №10

Рис. 2. Химическая структура соединений ряда семикарбазона

енкарбонильный фрагмент

а) халкон б) полифункциональнозамещенный в) диенамин эфир

Рис. 3. Химическая структура соединений с енкарбонильным фрагментом

В частности, гидроксильные и метоксильные группы соединений классов халконов и семикарбазонов способны взаимодействовать за счет неподеленной электронной пары; карбонильные, сложноэфирные и нитрогруппы препаратов рядов халконов, полифункциональнозамещенных эфиров и диенамина - за счет поляризации и повышения электронной плотности на атомах кислорода (рис. 2, 3). Поэтому все эти соединения потенциально способны к ассоциациям с внешней мембраной клетки грамположительных бактерий.

На следующем этапе оценивали острое токсическое действие различных концентраций отобранных соединений по смертности Daphnia magna Straus за 48 часов экспозиции. Через 24 часа экспозиции все особи дафний в опытных и контрольных растворах исследуемых соединений были живые, активно плавали, не отмечено никаких дополнительных морфологических изменений. Через 48 часов были определены показатели острой токсичности для всех исследуемых соединений (табл. 3). Установлено, что соединения №9, 10 из ряда семикарбазонов проявили высокую токсичность в отношении тест-организма во всех рабочих концентрациях от 3,2 до 1000 мкг/м, поэтому невозможно было определить средние летальные и безвредные концентрации этих веществ. Исследованные соединения из ряда полифункциональнозамещенных эфиров (№№45, 46, 49) оказывали различное действие на тест-объект. Препараты №45 и 49 обладали выраженным токсическим действием: ЛК_100-48 составили 1000 мкг/мл, ЛК_50-48 - 500 мкг/мл. Поскольку даже при низких концентрациях этих веществ (7,5 мкг/мл, 3,2 мкг/мл) наблюдалась гибель 20% дафний, то безвредные концентрации данных соединений (БК_10-48, БК_0-48) по отношению к изучаемому тест-объекту не были установлены. Для соединения №46 значения летальных концентраций были такими же, но значения БК_10-48 составили 30,1 мкг/мл, а БК_0-48 - 3,2-15,6 мкг/мл, что позволило судить о низкой токсичности данного соединения.

Соединения ряда халкона также проявили неодинаковое влияние на жизнеспособность тест-объектов. Препарат №47 был высокотоксичным даже при низких концентрациях по отношению к дафниям, вызывая гибель более 20%, что не позволило рассчитать значения БК_10-48 и БК_0-48. Препарат №44 был отнесен к малотоксичным, поскольку оказывал острое токсическое действие при концентрации 1000 мкг/мл и среднее летальное действие - при 500 мкг/мл; значения БК_10-48 составили от 15,6 до 30,1 мкг/мл, а БК_0-48 - 3,2-7,5 мкг/мл.

Таблица 3. Показатели острой токсичности исследуемых соединений (мкг/мл)

Наименьшей токсичностью из всех изученных соединений характеризовались ПНВ-1 из ряда фенилпентендионов и препарат №4 из енаминов, так как они имели наиболее высокие значения БК_10-48 -125-250 мкг/мл и БК_0-48 - 3,2-60,2 мкг/мл.

Таким образом, все исследованные соединения по отношению к тест-объекту были разделены на три группы: 1) высокотоксичные соединения (№№45, 47, 49); 2) малотоксичные соединения с низкими значениями БК_10-48 и БК_0-48 (№44, №46); 3) нетоксичные соединения с высокими значениями БК_10-48 и БК_0-48 (ПНВ-1 и №4). Для дальнейшей работы были отобраны 4 соединения, относящиеся ко второй и третьей группам, для которых определили острую токсичность на белых лабораторных мышах (табл. 4). Установлено, что все отобранные соединения по величине LD₅₀ (420 и 500 мг/кг) являются малотоксичными (Гуськова, 1990). В этой связи представляло интерес в дальнейших исследованиях провести оценку действия этих соединений на активность ключевых метаболических ферментов, состояние белкового и углеводного обменов в организме белых лабораторных мышей (рис. 2).

Таблица 4. Значения LD₅₀ карбо- и гетероциклических соединений

Показано, что соединения ПНВ-1, 46 и 4 в концентрации 10 мкг/мл увеличивали на 23, 22 и 56% соответственно активность АСТ по сравнению с контролем и действием в концентрации 1 мкг/мл. Все препараты, за исключением ПНВ-1, в дозе 10 мкг/мл уменьшали активность АЛТ по сравнению с контролем. Известно, что значения АЛТ отражают активность анаболических процессов периферической зоны метаболизма, в частности, цикла аланина (глюкозо-аланинового шунта). Коэффициент де Ритиса (соотношение АСТ и АЛТ) при всех дозах испытуемых препаратов был выше контрольных значений (за исключением препарата 4), что свидетельствовало об активизации центрального звена метаболизма, увеличении поступления субстратов в цикл Кребса и эффективности аэробного энергетического обмена (рис. 2 А).

При введении мышам всех исследуемых препаратов, кроме ПНВ-1 в дозе 1 мкг/мл, активность ЛДГ в сыворотке крови мышей была выше, чем в контроле, а активность КК - ниже по сравнению с контрольными показателями. При этом не выявлена сколько-нибудь значительная корреляция между значениями КК и ЩФ.

Значения индекса ферментемии при введении мышам препаратов №44 и ПНВ-1 в концентрации 1 мкг/мл и №46 и №4 в концентрации 10 мкг/мл были существенно выше, чем в контроле (рис. 2 Б). В целом индекс ферментемии характеризует совокупную активность ключевых ферментов метаболизма и коррелирует со значениями коэффициента де Ритиса, однако имеется существенная разница по отношению к контролю.

Наибольшая концентрация общего белка отмечена при введении препаратов №44 и ПНВ-1 в концентрации 1 мкг/мл (рис. 2 В). Введение препаратов №46 и №4 в дозе 10 мкг/мл мышам увеличивало концентрацию глюкозы, а введение 10 мкг/мл ПНВ-1 уменьшало по сравнению с контролем (рис. 2 Г). При этом показатели общего белка и глюкозы у животных всех опытных групп находились в пределах референтных значений, что указывало на то, что негативные изменения метаболизма либо были скомпенсированы или отсутствовали.

Следовательно введение препаратов ПНВ-1, 44, 46, 4 в концентрациях 1 мкг/мл и 10 мкг/мл не нарушало функции основных метаболических процессов и не вызывало признаков интоксикации в организме лабораторных животных.

Таким образом, в нашем исследовании впервые была установлена антимикробная активность 10 новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений 5 классов: фенилпентендионы, халконы, полифункцинальнозамещенные эфиры, енамины и семикарбазоны.

Данные препараты могут быть рекомендованы для углубленного лабораторного и доклинического изучения в качестве возможных средств этиотропной химиотерапии инфекционных заболеваний. Соединения с лабораторным шифром ПНВ-1, 44, 46 и 4 являются перспективными антистафилококковыми препаратами.

Выводы

1. Установлена антимикробная активность в отношении стандартных тест-штаммов Escherichia coli 113-13, Staphylococcus aureus 209 P, Bacillus cereus 8035 и Candida albicans 18 десяти препаратов из 66 изученных новых представителей карбо- и гетероциклических соединений; отобранные перспективные поликарбонильные препараты относятся к классам: фенилпентендиона, халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, семикарбазонов и енаминов.

2. Отобранные соединения фенилпентендиона (ПНВ-1, ПНВ-Б), халкона (№№44, 47), полифункциональнозамещенных эфиров (№45, 46, 49), диенамин (№4) и семикарбазоны (№№9, 10) оказывают выраженное антимикробное действие на метициллиноустойчивые и метициллиночувствительные клинические штаммы стафилококков разных видов при значениях минимальных подавляющих концентраций в интервале от 0,8 до 12,5 мкг/мл. Препарат фенилпентендиона ПНВ-1 эффективен также в отношении клинических штаммов грамотрицательных палочек Escherichia coli 18, 57, 59 и Proteus vulgaris 3, 4, 9 (МПК 12,5 мкг/мл).

3. Проявление антимикробной активности изучаемых соединений связано с комплексным взаимодействием с мембраной бактериальной клетки и зависит от значений их молекулярной массы, пространственных характеристик молекул, наличия гидроксильных, метоксильных, карбонильных и нитрогрупп, за счет поляризации и повышения электронной плотности на атомах кислорода.

4. Выявлена слабая токсичность отобранных соединений с антимикробной активностью ПНВ-1, №№44, 46, 4 при биотестировании на гидробионтах (Daphnia magna Straus) при значениях безвредных концентраций 3,2; 60,2; 125 и 250 мкг/мл и белых лабораторных мышах (LD₅₀ 420 и 500 мг/кг); показано отсутствие признаков интоксикации в организме экспериментальных животных.

5. Установлено, что введение препаратов ПНВ-1, 44, 46, 4 в концентрациях 1 и 10 мкг/мл не вызывает достоверных изменений показателей белкового, углеводного обменов и активности ключевых ферментов метаболизма в организме экспериментальных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пермякова, Н.Ф. Перспективы использования новых гетероциклических соединений, обладающих антимикробной активностью / Н.Ф. Пермякова, Ю.А. Алексеева, О.В Нечаева // Молодежь и наука: итоги и перспективы: Материалы межрегиональной научно практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием YSRP. - Изд-во СГМУ, 2008. - №6. - С. 58-59.

2. * Пермякова, Н.Ф. Изучение антимикробной активности некоторых карбо- и гетероциклических соединений / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева Ю.А. Алексеева, В.В. Сорокин, В.С. Субботин // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2009. - Т. 11. - №2. - С. 30.

3. * Пермякова, Н.Ф. Антимикробная активность некоторых новых карбо- и гетероциклических соединений / Н.Ф Пермякова, О.В. Нечаева, Е.И. Тихомирова // Естественные и технические науки. - 2009. - №5. - С. 93-97.

4. Пермякова, Н.Ф. Проявление антимикробной активности новых гетероциклических соединений в зависимости от особенностей их химического строения / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева // Современные проблемы науки и образования. - 2009. - №6. - С. 20-23.

5. Пермякова, Н.Ф. Нечаева О.В., Тихомирова Е.И. Перспективные гетероциклические соединения с антимикробной активностью / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева, Е.И. Тихомирова // Инновационные медицинские технологии: Материалы общероссийской научной конференции РАЕ с международным участием (г. Москва, 2009) // Успехи современного естествознания. - 2009. - №10. - С. 5-7.

Размещено на Allbest.ru