Разработка системы экспрессии генов на основе метилотрофных дрожжей

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

В настоящее время микробиологический синтез является основой для получения множества рекомбинантных белков и вакцин, используемых в медицине, ветеринарии и других отраслях промышленности.

Для получения рекомбинантных продуктов используются системы экспрессии, включающие реципиентный штамм, вектор для трансформации, несущий целевой ген, набор методик для работы с данным организмом.

Применяемые в настоящее время системы экспрессии можно подразделить на прокариотические - бактериальные, и эукариотические - на основе клеток дрожжей, мицелиальных грибов, насекомых или млекопитающих. Каждая из них имеет свои технологические достоинства и ограничения, в основе которых лежат различия биологических процессов в организмах. Использование бактериальных систем, например на основе штаммов Escherichia coli, часто сопровождается образованием нерастворимых телец включения и необходимостью рефолдинга целевых белков, что существенно ограничивает их применение.

Основным недостатком систем экспрессии на основе клеток насекомых или млекопитающих, способных производить все необходимые посттрансляционные модификации, считается увеличение стоимости конечных продуктов в связи с необходимостью использования в производственном процессе сложного и дорогостоящего оборудования и питательных сред.

Использование дрожжей в качестве продуцентов целевых рекомбинантных белков является компромиссным, и в ряде случаев оптимальным решением. Дрожжи являются представителями эукариотических организмов и обладают способностью поддерживать большинство посттрансляционных модификаций, а также обладают способностью к эффективной секреции белков в культуральную среду. При этом, культивирование дрожжей не требует дорогостоящего оборудования и сред, а выделение и очистка рекомбинантного белка существенно облегчена тем, что количество эндогенных секретируемых белков дрожжей сравнительно невелико. С начала 1980-х годов, дрожжи Saccharomyces cerevisiae успешно используются для биосинтеза рекомбинантных белков человеческого, животного и растительного происхождения. Однако, одним из существенных недостатков дрожжей S. cerevisiae является гипергликозилирование секретируемых гетерологичных белков, которое может обусловливать их нежелательную иммуногенность и ограничивать использование подобных рекомбинантных белков в фармацевтической промышленности.

С начала 1990-х годов получили развитие альтернативные дрожжевые системы на основе метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, которые зарекомендовали себя во многих случаях более эффективными и перспективными продуцентами рекомбинантных белков, чем S. cerevisiae. В 2009 году FDA (Food and Drugs Administration, США) присвоила метилотрофным дрожжам Komagataella phaffii (Pichia pastoris) статус GRAS (Generally Regarded as Safe), что сделало их еще более перспективными для применения в фармацевтике. Однако, широкое применение разработанных систем ограничивается необходимостью использования высокотоксичного и огнеопасного метанола для индукции наиболее мощного и часто используемого регулируемого промотора AOX1. Другим ограничивающим обстоятельством является коммерческий статус систем экспрессии, распространяемых компанией Invitrogen (США).

Цели и задачи работы.

Целью настоящей работы являлась разработка альтернативной отечественной системы экспрессии, на основе метилотрофных дрожжей штамма ВКПМ Y-727. В процессе решались следующие задачи:

- провести таксономические исследования штамма дрожжей ВКПМ Y-727 и определить его видовую принадлежность;

- исследовать особенности регуляции генов, отвечающих за метаболизм метанола в дрожжах штамма Y-727;

- разработать систему экспрессии на основе оригинальной элементной базы штамма ВКПМ Y-727;

- сконструировать на базе штамма ВКПМ Y-727 продуценты модельных внутриклеточных и секретируемых белков и оценить их экспрессионный потенциал.

- провести поиск альтернативного индуктора промотора алкоголь оксидазы, способного заменить высокотоксичный метанол;

Научная новизна и практическая значимость работы

На основе углубленных таксономических исследований установлен новый вид метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii ВКПМ Y-727, представляющих интерес с точки зрения биотехнологии.

Клонированы и секвенированы промоторные области генов AOX1, GAP дрожжей K.kurtzmanii Y-727 для регуляции гетерологичной экспрессии.

Получен набор мутантных производных базового штамма K. kurtzmanii Y-727, содержащих мутации в генах URA3, HIS4, ARG4 и ADE2.

Получены и охарактеризованы штаммы-продуценты модельных белков: галактозидазы E.coli, инулазы Klyuveromyces marxianus, сывороточного альбумина человека (HSA), сосудисто-эндотелиального фактора роста человека (VEGF111b), поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Доказана высокая эффективность индуцируемого AOX1 и конститутивного промотора GAP дрожжей K.kurtzmanii Y-727.

Показано, что по эффективности биосинтеза гетерологичных белков продуценты на основе штамма K. kurtzmanii Y-727 не уступают или превосходят продуценты на основе ближайшего аналога K.phaffii GS115 (Invitrogen).

Найден новый безопасный индуктор промотора АОХ1 - формиат. Показано, что уровень формиатной индукции промотора сравним с уровнем индукции метанолом.

Проведены исследования механизма индукции промотора АОХ1.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанная система экспрессии на основе метилотрофных дрожжей K.kurtzmanii Y-727 является эффективной и конкурентноспособной по отношению к имеющимся аналогам. Эффективность новой системы экспрессии показана на модельных штаммах-продуцентах как секретируемых так и внутриклеточных белков.

2. Новый найденный индуктор промотора алкоголь оксидазы - формиат обеспечивает сравнимый с метанолом уровень индукции.

3. Делеция гена FLD (формальдегид дегидрогеназы) увеличивает уровень индукции промотора алкоголь оксидазы в метилотрофных дрожжах в ответ на метанол и формиат.

Апробация работы.

Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 16 марта 2014 года. Материалы диссертации докладывались на 38-ом конгрессе Федерации европейских биохимических обществ «Механизмы в биологии» (38-th FEBS Congress) 6-11 июня 2013 г. и на 26-ой международной конференции «Генетика дрожжей и молекулярная биология» (26th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology) 29 августа - 3 сентября 2013 г.

Публикации.

По основным результатам диссертации опубликовано 7 работ, их них 2 статьи в рецензируемых зарубежных журналах, рекомендованных ВАК, 2 материала на зарубежных конференциях и 3 патента РФ.

Сокращения, принятые в тексте.

YPD - богатая среда состава, масс.% (1-дрожжевой экстракт, 2-пептон, 2-глюкоза, остальное - вода).

YP - богатая среда состава, масс.% (1-дрожжевой экстракт, 2-пептон, остальное - вода).

YPM - богатая среда состава, масс.% (1-дрожжевой экстракт, 2-пептон, 1-метанол, остальное - вода).

YPgM - богатая среда состава, масс.% (1-дрожжевой экстракт, 2-пептон, 0,1- глицерин, 0,5% метанол, остальное - вода).

YPF - богатая среда состава, масс.% (1-дрожжевой экстракт, 2-пептон, 1,5-формиат калия, остальное - вода).

YNB - минимальная среда состава, масс.% (0.17-yeast nitrogen base, 0,5-сульфат аммония, 0,4- глюкоза).

1. Выбор штамма

метилотрофный микробиологический рекомбинантный формальдегид

Штамм метилотрофных дрожжей дикого типа Y-727 для разработки новой системы экспрессии был получен из коллекции ВКПМ. Согласно описанию, данный штамм был депонирован как штамм P.pastoris, родственный штамму NRRL-11430 или NRRL-48124 (GS115). Штамм находился в коллекции ВКПМ в открытом доступе с 1998 г. и в этой связи мог быть использован для разработки новой системы экспрессии.

Несмотря на наличие описания, видовая принадлежность штамма не была формально определена. С генетической и биотехнологической точки зрения штамм был не изучен. В частности, не была охарактеризована активность и регуляция гена алкогольоксидазы АОХ, промотор которого предполагалось использовать в качестве ключевого элемента новой системы экспрессии.

С целью первичного исследования регуляции промотора AOX1 в клетках штамма ВКПМ Y-727 был проведен следующий качественный эксперимент. В качестве контрольного штамма сравнения использовали штамм K. pfaffii GS115.

Клетки анализируемых штаммов выращивали до экспоненциальной фазы роста на жидких средах: YPD - с глюкозой; YPM - с метанолом, YP - без источника углерода.

Таким образом, условия роста на среде YPD обеспечивали катаболитную репрессию генов АОХ в клетках обоих штаммов; на среде YPM - индукцию АОХ1,а на среде YP - имитировали условия истощения репрессирующего источника углерода.

Образцы полученных клеточных лизатов анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих восстанавливающих условиях в 12% полиакриламидном. Известно, что в условиях индукции синтез алкоголь оксидазы (AOX), имеющей молекулярную массу 72кДа, может достигать 30% суммарного клеточного белка. Это позволяло, анализируя данные электрофореграммы, оценить активность промотора АОХ в соответствующих условиях культивирования клеток по интенсивности сигнала на уровне 72кДа.

Из данных электрофореграммы, представленной на рис.1, видно, что в клетках обоих штаммов не происходит синтеза алкоголь оксидазы в условиях роста на среде с глюкозой (YPD), в результате катаболитной репрессиии. При росте клеток на среде с метанолом (YPM) присутствует мажорный сигнал, соответствующий массе алкоголь оксидазы. В то же время в условиях роста, имитировавших истощение углеродного субстрата (на среде YP), ясно различимый сигнал АОХ наблюдался только в образце штамма ВКПМ Y-727, и отсутствовал у штамма GS115.

Согласно известным данным, в условиях дерепрессии уровень активности АОХ1 в клетках штамма GS115 не превышает 2% от индуцированного уровня, что не позволяло зафиксировать сигнал алкоголь оксидазы в клетках штамма GS115 в виде различимого сигнала в условиях анализа и коррелировало с полученными данными (рис.1). В то же время согласно полученным данным и в тех же условиях интенсивность сигнала АОХ в образце штамма ВКПМ Y-727 достигала 15-20% относительно метанол-индуцированного уровня (сравнить дорожки №№1 и 5).

Рисунок 1. Электрофореграмма клеточных лизатов штамма ВКПМ Y-727 и K.pfaffii GS115. Стрелками указан сигнал, которому соответствует фермент алкоголь оксидаза. Дорожки с №№ 1-6 соответствуют: (1) Среда YP, штамм ВКПМ Y-727; (2) Среда YP, штамм K.pfaffii GS115; (3) Среда YPD, штамм ВКПМ Y-727; (4) Среда YPD, штамм K.pfaffii GS115; (5) Среда YPM, штамм ВКПМ Y-727; (6) Среда YPM, штамм K.pfaffii GS115

Таким образом, экспериментальные данные указали на то, что особенностью штамма ВКПМ Y-727 является способность к автоиндукции промотора AOX в условиях истощения репрессирующего углеродного субстрата. Данный эффект послужил одним из факторов, усиливших интерес к штамму Y-727, поскольку мог быть использован для решения одной из задач работы - разработки безметанольного способа индукции гетерологичных генов.

2. Таксономическая характеристика штамма ВКПМ Y-727

Принадлежность штамма ВКПМ Y-727 к метилотрофным дрожжам рода Komagataella была подтверждена в результате ростовых тестов на соответствующих субстратах - метаноле, глицерине, олеате, и др. Кроме ростовых тестов, проведено молекулярно-генетическое исследование по следующим маркерам - нуклеотидным последовательностям домена D1/D2 26S субъединицы рибосомальной РНК; ITS1-5.8S-ITS2 - локуса рибосомальной РНК; фактору элонгации трансляции EF-1бета; субъединицы RPB1 РНК полимеразы II; митохондриальной малой субъединицы рибосомальной РНК Mito SSU rRNA. Проведенный анализ соответствующих нуклеотидных последовательностей полученных ПЦР-фрагментов ДНК показал, что по уровню гомологии анализируемый штамм ВКПМ Y-727 был наиболее близок штамму K. pfaffii (NRRL Y-7556) (рис.2), который в свою очередь является наиболее близким запатентованному штамму Y-11430 и его производным, в частности широко используемому GS115 (Invitrogen, США).



Рисунок 2. Филогенетическое дерево видов рода Komagataell. Условные обозначения: шкала «0.02» графически отображает 20 различающихся нуклеотидов в анализируемой последовательсти из 1000 нуклеотидов на горизонтальных ветвях графика. Тем самым, показана степень родства между анализируемыми видами

Результаты молекулярно-генетического анализа в совокупности с результатами ростовых тестов, подтвердили принадлежность штамма дрожжей ВКПМ Y-727 к роду Komagataella, и в то же время, позволили отнести его к новому виду. По согласованию с выдающимся исследователем в области генетики и молекулярной биологии метилотрофных дрожжей Клетусом Пауль Курцманом, данному виду было присвоено наименование Komagataella kurtzmanii.

Таким образом, в результате проведенных исследований штамм ВКПМ Y-727 был отнесен к новому виду и определен как штамм Komagataella kurtzmanii Y-727.

3. Морфологические, физиологические и ростовые характеристики

Для оценки ростовых характеристик штамма K. kurtzmanii Y-727 в сравнении с наиболее близким ему штаммом K.phaffii GS115 (Invitrogen) был проведен опыт по кинетики роста на двух средах, обычно используемых при ферментации: YPG (с глицерином, как источником углерода) и YPM (с метанолом, как источником углерода).



Рисунок 3. Кинетика роста штаммов K.kurtzmanii Y-727 и K.phaffii GS115. А. На среде c глицерином (YPG) в качестве источника углерода; В. На среде c метанолом (YPM) в качестве источника углерода

Как показали полученные данные (рис. 3), оба штамма продемонстрировали сходную скорость роста на среде с глицерином, обычно используемой для получения высокоплотных культур. В то же время штамм K. kurtzmanii Y727 утилизировал метанол практически в 2 раза медленнее, чем штамм K.phaffii GS115, что коррелировало с относительным уровнем экспрессии алкоголь оксидазы в клетках этих штаммов (рис.1, дор. 5 и 6).

4. Сравнительное исследование регуляции промоторов AOX1 в клетках штаммов K. kurtzmanii Y-727 и K.phaffii GS115

Для организации экспрессии гетерологичных генов в дрожжах K. kurtzmanii Y727 были выбраны строго регулируемый промотор AOX1 и конститутивный промотор GAP, зарекомендовавшие себя в качестве наиболее эффективных промоторов в клетках K.phaffii GS115.

Данные секвенирования и выравнивания нуклеотидных последовательностей промоторов АОХ1, клонированных из штаммов K.kurtzmanii Y-727 и K.phaffii GS115 выявили наличие нуклеотидных замен в промоторе АОХ1 штамма Y-727, локализованных в двух из шести областей связывания активатора транскрипции Mxr1p. Присутствие данных мутаций могло обуславливать различие в регуляции промоторов АОХ1 в клетках штаммов Y-727 и GS115.

С целью количественного определения сравнительных характеристик активности промоторов АОХ1 были сконструированы репортерные штаммы K. kurtzmanii Y727 и K.phaffii GS115, несущие репортерные кассеты AOX1-lacZ, содержащие ген альфа-галактозидазы под контролем промоторов AOX1. При этом для каждого из штаммов использовали эндогенный промотор.

Клетки репортерных штаммов выращивали до середины логарифмической фазы роста в пробирках со средой трех видов YPD - с репрессирующим AOX1 источником углерода - глюкозой, YPM - с индуцирующим AOX1 источником углерода - метанолом, YP - без источника углерода. Активности промоторов в клетках анализируемых штаммов оценивали по уровню активности галактозидазы, содержащейся в соответствующих клеточных лизатах.

Из полученных данных, представленных в табл. 1 и на рис. 4 видно, что промоторы АОХ1 в клетках обоих штаммов обладали одинаковой активностью в присутствии индуктора - метанола, и были полностью репрессированы на среде с глюкозой. Однако, в условиях истощения углеродного субстрата (на среде YP) активность промотора АОХ1 в клетках штамма Y-727 более чем в 2 раза превышала активность в клетках штамма GS115.

Таблица 1. Активность альфа-галактозидазы продуцируемой клетками штамма K.kurtzmanii Y-727 и штамма K.pfaffii GS115 (в Миллеровых ед.)

Штамм / Среда	YP	YPM	YPD
K.kurtzmanii Y-727	Среднее	1698,5	2396,0	0,0
	Ср. кв. откл.	120,9	384,7	0,0
K.pfaffii GS115	Среднее	804,5	2373,0	0,0
	Ср. кв. откл.	259,5	237,6	0,0



Рисунок 4. Уровень активности бета-галактозидазы, продуцируемой клетками штамма K.kurtzmanii ВКПМ Y-727 и штамма K.pfaffii GS115. По вертикальной оси - шкала активности в Миллеровых единицах. Голубые столбцы соответствуют активности фермента в лизате клеток штамма K.kurtzmanii Y-727, розовые столбцы соответствуют активности фермента в лизате клеток штамма K.pfaffii GS115. На диаграмме планками отображено стандартное отклонение, рассчитанное по результатам измерения активности у двух клонов.

Таким образом, полученные данные подтвердили, что в клетках K.kurtzmanii Y-727 активность промотора АОХ1 при автоиндукции значительно выше чем в клетках K.pfaffii GS115.

5. Сравнительное исследование регуляции промоторов GAP в клетках штаммов Y-727 и K.phaffii GS115

Данные секвенирования и выравнивания нуклеотидных последовательностей клонированных промоторов GAP из штаммов K.kurtzmanii Y-727 и K.phaffii GS115 выявили наличие десяти замен и делеций в промоторе штамма Y-727. Для изучения влияния данных мутаций на регуляцию и активность промотора GAP штамма Y-727 был проведен опыт по измерению активности репортерного секретируемого белка - инулазы дрожжей дрожжей Klyuveromyces marxianus. Выбор этого репортерного белка определялся наличием у инулазы легко измеряемой инвертазной активности, а также тем, что клетки штамма K. kurtzmanii Y727 и штамма K.pfaffii GS115 не усваивают сахарозу и инулин, т.е. не продуцируют собственную инвертазу, что значительно упрощало интерпретацию результатов измерений.

При этом, было получено 4 варианта продуцентов: 2 из которых - на основе штамма Y-727, в которых ген инулазы находился под контролем эндогенных промоторов AOX1 и GAP; и 2 - на основе штамма GS115, в которых ген инулазы также находился под контролем эндогенных промоторов AOX1 и GAP. Для обеспечения секреции инулазы в культуральную жидкость лидерный пептид бета-фактора (бета-MF) клонировали в одну ранку считывания с геном инулазы.

Клетки штаммов-продуцентов, в которых экспрессия инулазы регулировалась промотором GAP инокулировали в среду YPD (с глюкозой). Клетки штаммов-продуцентов, в которых экспрессия инулазы регулировалась промотором АОХ1 инокулировали в среду YPM (с метанолом). Клетки выращивали до середины логарифмической фазы роста, после чего оценивали активность промоторов в клетках анализируемых штаммов по уровню активности инулазы, содержащейся в соответствующих осветленных культуральных жидкостях.

Из полученных данных, представленных в табл. 2 и на рис.5, видно, что в случае экспрессии под контролем промотора AOX1 активность инулазы в штамме K. kurtzmanii Y727 выше более, чем в 2 раза, по сравнению с контрольным штаммом K. pfaffii GS115. И наоборот, в случае регуляции гетерологичной экспрессии промотором GAP, активность продуцируемой инулазы больше у штамма K. pfaffii GS115, по сравнению с K.kurtzmanii Y727.

Таблица 2. Активность инулазы, ед/мл/1 о.е.

	Промотор GAP	Промотор AOX1
Y727	Среднее	0,46	0,39
	Ст.откл.	0,0	0,1
GS115	Среднее	1,04	0,17
	Ст. откл.	0,1	0,0

Рисунок 5. А. Активность инулазы, в случае экспрессии гена под контролем промотора АОХ1. В. Активность инулазы, в случае экспрессии гена под контролем промотора GAP. Планками отображено стандартное отклонение по измерениям активности двух клонов

Таким образом, использование промотора AOX1 в клетках штамма Y-727 обеспечивало уровень продукции данного репортерного белка более, чем в 2 раза превышающий уровень продукции в клетках GS115. Подобное различие в уровне продукции не проявлялось в отношении внутриклеточно продуцируемой альфа-галактозидазы (глава 4, табл. 1), что демонстрирует влияние промотора, регулирующего экспрессию целевого гена, на продукцию, а также возможные различия секреторных аппаратов клеток штаммов.

6. Получение ауксотрофных мутантов

В основе выбранного способа получения ауксотрофных производных штамма K.kurtzmanii Y-727 лежала селекция базового ura3 мутанта этого штамма, который был отобран на среде, содержавшей фтороротовую кислоту (5'-FOA), обеспечивавшей подавление роста клеток, содержавших ген URA3 дикого типа.

Получение других ауксотрофных мутаций в клетках реципиентного штамма (уже имеющего ura3 генотип) производилось путем замещения нативного гена трансформирующим клетки фрагментом ДНК, который заключал ген URA3 штамма K.pfaffii GS115 и фланкирующие этот ген дуплицированные последовательности гетерологичной ДНК (в натоящей работе использовались последовательности структурного гена TyA ретротранспозона Ty1), с последующим отбором на соответствующей селективной среде без урацила.

Далее, отбор ura3 мутантов производился таким образом, чтобы в удалении гена URA3 был задействован механизм рекомбинации между дуплицированными последовательностями гетерологичной ДНК. Таким образом, в результате рекомбинационного удаления селективного маркера сконструированная ауксотрофная мутация оказывалась маркированной специфическим фрагментом гетерологичной ДНК. Тем самым предусматривалось, что впоследствии данные фрагменты гетерологичной ДНК могут быть использованы в качестве мишеней для направления интеграции целевых экспрессионных кассет (рис. 6).

Рисунок 6. Схематическое изображение структуры кассет замещения и этапов получения ауксотрофных мутантов. Кассеты замещения содержали: 1) 5' и 3' фланкирующие области, направлявшие интеграцию в локус искомого гена; 2) последовательности Ty, обеспечивавшие рекомбинационное удаление селективного маркера и конструирование нового сайта интеграции; 3) селективный маркерный ген URA3

Реализация данной схемы позволила многократно использовать ген URA3 в качестве селективного маркера для отбора мутантных штаммов. В частности, так были получены реципиентные штаммы, маркированные множественными ауксотрофными мутациями. В качестве мишеней для получения ауксотрофных мутантов были выбраны следующие гены: URA3, HIS4, ARG4 и ADE2.

Получение штамма K.kurtzmanii Y-727ura3mut.

Для получения мутантов K.kurtzmanii Y727ura3mut была проведена трансформация штамма дикого типа кассетой, которая обеспечивала делецию нативного гена URA3 за счет сайт-специфической рекомбинации. Кассета представляла собой ПЦР-фрагмент локуса URA3 геномной ДНК штамма Y-727, в составе которого была произведена протяженная делеция в области структурного гена URA3 и замена удаленной области гена на гетерологичную последовательность элемента Ty1 дрожжей S.cerevisiae (рис. 7).

Рисунок 7. Схема делеции гена URA3 кассетой pURA3del. URA3-prom, URA3-term - плечи, направляющие интеграцию в локус URA3; Ty - фрагмент ретротранспозона Ty1 дрожжей S.cerevisiae; URA3 - ген оротидин-5-фосфат декарбоксилазы геномной ДНК

Исходный штамм K.kurtzmanii Y727 трансформировали полученным фрагментом плазмиды pURA3del с целью получения мутантных клонов по гену URA3. Отбор мутантных клонов проводили на селективных чашках YPD, содержащих 5-фтороротидиновую кислоту (5'-FOA), в концентрации 500 мкг/мл агаризованной среды. В результате селекции было отобрано около 200 клонов, обладавших способностью расти в присутствие 5'-FOA.

С целью подтверждения фенотипа ura- отобранные клоны были проверены на способность роста на синтетической агаризованной среде YNB в зависимости от добавления в среду урацила в концентрации 50 мкг/мл среды. Было показано, что среди отобранных клонов только 8 имели фенотип ura-.

С помощью ПЦР было исследовано состояние локуса URA3 отобранных восьми клонов Y-727ura3 с фенотипом ura-. Было установлено, что ни один из отобранных клонов не являлся истинным трансформантом, т.е. не содержал кассету pURA3del. Таким образом, во всех случаях были отобраны спонтанные мутанты. По всем другим фенотипическим и морфологическим признакам полученные мутанты не отличались от клонов исходного штамма. У отобранных восьми клонов Y-727ura3 было проведено исследование частоты реверсий. С этой целью полученные мутанты культивировали на среде YPD с добавлением урацила в течение 48 часов. Культуру отмывали от среды и ~108 клеток высевали на чашки с минимальной средой (YNB) без урацила. Ни для одного из анализируемых трансформантов не было зафиксировано появление ревертантов. Соответственно, частота спонтанных реверсий составляла <1/108. Для дальнейшей работы был отобран один клон. Полученный мутантный штамм Y727 ura3mut был использован для получения ауксотрофных мутантов путем трансформации кассетами, включающими ген URA3 в качестве селективного маркера. Получение штамма K.kurtzmanii Y-727ura3muthis4.

С целью получения штамма - двойного ауксотрофного мутанта по генам URA3 и HIS , был сконструирован вектор pHIS4del. Фрагмент данного вектора обеспечивал делецию нативного гена HIS4 (кодирующего фермент гистидинолдегидрогеназу, участвующую в синтезе гистидина) при трансформации штамма Y727 ura3mut (рис. 8).



Рисунок 8. Схема делеции гена HIS4 кассетой pHIS4del. HIS4-5',HIS4-3' - плечи, направляющие интеграцию в локус HIS4; URA3 -ген URA3 штамма K. Phaffii GS115; Ty - фрагменты ретротранспозона Ty1 дрожжей S.cerevisiae; HIS4 - ген гистидинолдегидрогеназы геномной ДНК

Фрагмент вектора pHIS4del (рис.8) был использован для трансформации клеток штамма Y727 ura3mut. Трансформанты, в геном которых была интегрирована кассета pHIS4del, отбирали по способности к росту на синтетической среде YNB с добавкой гистидина, после чего проверяли у них наличие фенотипа his-.

У десяти клонов, продемонстрировавших искомый фенотип, было исследовано состояние локуса HIS4 при помощи ПЦР, с целью проверки корректности интеграции фрагмента вектора pHIS4del и замещения нативного гена HIS4. Проверка подтвердила правильную интеграцию с замещением у всех десяти клонов (данные не приведены). Один из отобранных клонов был назван Y727 his4-Ty и был использован далее для получения штамма Y727 ura3muthis4.

В состав фрагмента вектора pHIS4del, использованного при получении штамма Y727 his4-Ty входили дуплицированные фрагменты ДНК - Ty, фланкировавшие ген селективного маркера URA3. Организация этих фрагментов ДНК в виде прямых повторов допускала возможность их участия в спонтанной гомологичной рекомбинации, которая должна была сопровождаться выщеплением селективного маркера (рис. 9).



Рисунок 9. Схема выщепления селективного маркера URA3. HIS4-5',HIS4-3' - плечи, направлявшие интеграцию в локус HIS4; URA3 -ген URA3 штамма K. Phaffii GS115; Ty - фрагменты ретротранспозона Ty1 дрожжей S.cerevisiae

С целью поиска клеток, в которых произошла указанная рекомбинация, клетки исходного штамма Y727 his4-Ty несколько раз пассировали в богатой среде YPD, выращивая культуры после каждого пересева в течение 24 часов. После проведения трех пассажей 109 клеток высеяли на чашки с агаризованной средой YPD, содержащей 5'-FOA в концентрации 500 мкг/мл среды, для отбора клонов с искомым фенотипом his-ura-.

В результате последующего ПЦР анализа было найдено 2 клона, в геноме которых в результате рекомбинации произошла делеция гена URA3 в локусе HIS4 (данные не приведены). В результате делеции полученный штамм приобрел генотип ura3, и вместе с тем значительная часть структурного гена HIS4 оказалась замещена фрагментом гетерологичной ДНК (Ty).

Один из найденных клонов был назван штаммом K. kurtzmanii Y-727 ura3muthis4.

Полученный штамм пригоден для трансформации векторами, содержащими в качестве селективных маркеров гены URA3 или HIS4, с последующим отбором трансформантов на соответствующих селективных средах. Эти штаммы пригодны для трансформации векторами, содержащими в качестве селективных маркеров гены ARG4 и ADE2, с последующим отбором трансформантов на соответствующих селективных средах.



Рисунок 10. А. Схема делеции гена ARG4 кассетой pARG4del. ARG4-5', ARG4-3' - плечи, направляюшие интеграцию в локус ARG4; URA3 - ген URA3; ARG4 - ген аргининсукцинатлиазы геномной ДНК. B. Схема делеции гена ADE2 кассетой pADE2del. ADE2-5', ADE2-3' - плечи, направляюшие интеграцию в локус ADE2; URA3 - ген URA3; ADE2 - ген фосфорибозиламиноимидазол карбоксилазы геномной ДНК

Таким образом, в результате генно-инженерных работ были сконструированы 5 ауксотрофных производных базового штамма K.kurtzmanii Y727 (табл.3). Некоторые из этих штаммов были использованы для конструирования штаммов-продуцентов модельных белков и определения экспрессионных возможностей новой системы экспрессии.

Таблица 3. Генотипы и фенотипы ауксотрофных производных штамма Y727

Штамм	Генотип	Фенотип
Y727ura3mut	ura3	Ura-
Y727ura3muthis4	his4, ura3	Ura-, His-
Y727his4	his4	His-
Y727arg4his4	arg4, his4	Arg-, His-
Y727ade2his4	ade2, his4	Ade-, His-

7. Разработка оригинальных базовых векторов экспрессии

С учетом генетической близости штаммов K. kurtzmanii и K. pfaffii, для трансформации клеток обоих организмов пригодны одни и те же вектора. Это свойство было использовано ранее при изучении активности промоторов. Тем не менее, для биотехнологического применения новой системы экспрессии требовалось создать новые базовые вектора на собственной элементной базе.

В результате выполненных генно-инженерных работ было получено несколько базовых векторов, основные из которых - содержавшие гены URA3 и HIS4 в качестве селективных маркеров, представлены на рис. 11 A,B.

Рисунок 11. А. Карта плазмиды Ty-URA3-AOX1. Ty - фрагменты структурного гена ретротранспозона Ty из дрожжей S.cerevisia - плечи, направляющие интеграцию; ADH1p - промотор алкогольдегидрогеназы 1 из дрожжей S.cerevisia; URA3sc - ген оротидин декарбоксилазы из дрожжей S.cerevisia; AOX1 - промотор алкогольоксидазы 1 из дрожжей Y-727; matF - сигнальный пептид бета-MF. AOXterm - терминатор гена алкогольоксидазы из дрожжей Y-727. ApR - ген альфа-лактамазы. Карта плазмиды pPH93-HIS4-AOX1. HIS4 - ген гистидинол дегидрогеназы с собственной регуляторной областью из штамма Y-727. AOX1 - промотор алкогольоксидазы 1 из дрожжей Y-727; AOX1term - терминатор гена AOX1 из дрожжей Y-727. ApR - ген альфа-лактамазы

Оба указанных вектора предполагают возможность замены промоторных элементов и клонирования целевого гена в одно действие. Особенностью вектора Ty-URA3-AOX1 является упрощенная селекция и повышенный выход многокопийных интегрантов.

8. Оптимизация протокола трансформации

Исходя из известных данных, наиболее эффективным методом трансформации метилотрофных дрожжей является метод электропорации. В ходе проделанной работы для проведения трансформации штамма K. kurtzmanii успешно использовались протоколы, разработанные для штаммов K. pfaffii. Для получения более высокого выхода трансформантов, была проведена оптимизация протокола электропорации для штамма Y-727.

С этой целью были выбраны ключевые вариабельные параметры: плотность культуры, буфер для инкубации клеток, напряжение импульса электрического разряда (табл. 4). В результате сочетания данных параметров было испытано 18 вариантов протоколов.

Таблица 4. Вариабельные параметры электропорации

OD600	Буферы для инкубации	Напряжение импульса
1,0	A: [YPD; 0,2M HEPES; 25mM DTT ; pH 8.0]	1.5 kV
1,5	B: [10mM bicine-NaOH, 3% (v/v) ethylene glycol, 5% (v/v) DMSO, 1M Sorbitol, 100mM DTT, pH 8.3]	2.0 kV
2,5	C: [10 mM Tris-HCl, 100mM LiOAc, 0,6M Sorbitol, 10 mM DTT, pH7.5]

Штамм Y-727his4 использовали в качестве модельного штамма для трансформации линеаризованным фрагментом базового вектора pPH93-HIS4-AOX1. Отбор трансформантов проводили на чашках с минимальной агаризованной средой YNB. Учитывая, что для каждого протокола было использовано одинаковое количестви клеток и равное количество трансформирующей ДНК, по количеству колоний на чашке можно было оценивать эффективность каждого протокола.

В результате проведенного эксперимента было установлено, что самый высокий выход трансформантов - 3х102/(1 мкг ДНК) получили при оптической плотности культуры до OD600=1,5, использовании для инкубации буфера С и напряжении импульса 1,5 кВ.

Таким образом, в результате проведенных исследований был получен набор ауксотрофных производных штамма K. kurtzmanii Y727, для которых были оптимизированы условия трансформации, а также набор оригинальных базовых векторов, содержавших регуляторные элементы и селективные маркерные гены, комплементировавшие соответствующие ауксотрофные мутации реципиентных штаммов. В совокупности указанные элементы образовали оригинальную систему экспрессии на базе метилотрофных дрожжей K.kurtzmanii.

8. Получение и оценка эффективности штамма K.kurtzmanii Y-727his4/pPH93-AOX1Y-727-HSA - продуцента человеческого сывороточного альбумина

Для оценки секреторных возможностей штамма новой системы экспрессии были сконструированы 2 штамма-продуцента рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина: на основе штамма K.kurtzmanii Y-727 и K.phaffii GS115, в качестве контрольного. Были созданы 2 идентичные генетические конструкции, на основе базового вектора pPH93-HIS4-AOX1, включающие ген HSA, находящийся под контролем эндогенного для каждого штамма промотора АОХ1. Для обеспечения секреции альбумина в культуральную среду, ген искусственного лидерного пептида (аминокислотный состав: MRLLLLLLLLLPAALG) и ген альбумина клонировали в одну рамку считывания.

Для качественной оценки продукции альбумина использовали электрофорез в полиакриамидном геле культуральных жидкостей штаммов продуцентов в денатурирующих условиях. Для количественной оценки продуцируемого белка использовали метод иммуноферментного анализа (ИФА) на твердой подложке.

Клетки штаммов-продуцентов выращивали в течение 68 часов на богатой среде YPgM, с метанольной индукцией (0,5% v/v), после чего анализировали уровень продукции HSA в культуральной жидкости.

Рисунок 12. Электрофореграмма образцов культуральных жидкостей каждого из продуцентов альбумина на основе K.kurtzmanii Y-727his4 и K.pfaffii GS115. Стрелкой указан сигнал, соответствующий молекулярной массе человеческого сывороточного альбумина (~67 кДа). (1,2) - K.kurtzmanii Y-727his4-HSA; (3,4) - K.pfaffii GS115-HSA

Для ИФА использовали стандартный набор Albumin, Human, BioAssay ELISA Kit (производства United States Biological, США).

Выход целевого белка составил 41,12 +/-0,8 мг/л культуральной жидкости или 1,93 +/-0,2 мг/ое для штамма K. kurtzmanii Y-727his4, и 41,19 +/-1,4 мг/л культуральной жидкости или 1,38 +/-0,1 мг/ое для контрольного штамма K.pfaffii GS115 (рис. 13, табл. 5).



Рисунок 13. А. Продукция сывороточного альбумина (HSA), нормированная на объем культуральной жидкости. По вертикальной оси - количество HSA в мг на 1 л культуральной жидкости. B. Продукция сывороточного альбумина HSA, нормированная на единицу оптической плотности. По вертикальной оси - количество HSA в мг на единицу оптической плотности культуры (OD=1 при 600нм). Планками отображено стандартное отклонение, рассчитанное по результатам измерений продукции у двух клонов.

Таблица 5. Продуктивность штаммов

Штаммы	Продуктивность HSA
Y-727his4		мг / л	мг / 1 о.е.
	Среднее	41,105	1,925
	Ст.откл.	0,8	0,2
GS115	Среднее	41,185	1,375
	Ст. откл.	1,4	0,1

Данные, представленные в таблице 5 и на рис.13 (A,B), свидетельствуют об одинаковой продуктивности обоих штаммов. Однако, учитывая замедленный рост штамма Y-727 в условиях метанольной индукции (рис. 3), его удельные показатели продуктивности оказались выше.

Таким образом использование в качестве модельного белка рекомбинантного сывороточного альбумина позволило показать, что абсолютная и удельная продуктивность продуцентов на основе штамма K. kurtzmanii Y727 не уступает продуктивности штаммов сравнения, сконструированных на основе K.pfaffii GS115.

Для оценки эффективности системы экспрессии в условиях ферментации при повышенной плотности было проведено культивирование сконструированных штаммов в биореакторе. В качестве модельных были выбраны условия культивирования, разработанные ранее во ФГУП «ГосНИИгенетика» для обеспечения биосинтеза спидроина в клетках штамма K.pfaffii GS115 (В.Г. Богуш и А.В. Глазунов, неопубл. рез). Ферментация обоих штаммов проводилась параллельно с использованием одинаковых параметров. Накопление биомассы на первой стадии проводили на среде с глицерином (54 часа), затем включали подпитку метанолом для индукции промотора АОХ1. Результаты анализа образцов культуральной жидкости обоих штаммов приведены на рис. 14.

Рисунок 14. Электрофореграмма образцов культуральной жидкости штаммов K. kurtzmanii Y727 (с двумя копиями гена HSA) и K. pfaffii GS115 (с одной копией гена HSA) - продуцентов HSA. Нечетные дор. - образцы штамма GS115, четные - Y727. Продолжительность культивирования (ч): 54,5 (1 и 2); 71,5 (3 и 4); 78,5 (5 и 6); 95,5 (7 и 8); 102,5 (9 и 10); 121,5 (11 и 12) 142,5 (13 и 14) 168,5 (15 и 16). На дорожки наносили 5 мкл (1-8) и 1 мкл (9-16) культуральной жидкости. Время начала индукции метанолом - 54,5 ч с начала ферментации

Полученные данные показали, что биосинтез альбумина в клетках штамма K. kurtzmanii Y727 начинался раньше, чем в клетках контрольного штамма (сигналы на дорожке №2,4 более интенсивные по сравнению с сигналами на дорожках №1,3), однако достигнутый уровень продукции оказался сопоставим. Согласно данным денситометрического анализа содержание альбумина в образцах культуральной жидкости обоих штаммов достигало 2 - 2,2 г/л. Плотности культур в ходе эксперимента достигали величин OD600~300-400.

9. Получение и оценка эффективности продуцента внутриклеточного белка поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg)

Известно, что штамм K. pfaffii GS115 использовался как реципиент для создания продуцента внутриклеточного HBsAg. Поэтому, аналогично, для оценки штамма K. kurtzmanii Y-727 в качестве продуцента внутриклеточного рекомбинантного белка, было решено создать 2 продуцента поверхностного антигена вируса гепатита - на основе K. kurtzmanii Y-727his4 и, в качестве контроля, на основе штамма K. pfaffii GS115.

Для создание продуцентов HBsAg были сконструированы 2 плазмиды, в которых ген HbsAg находился под контролем эндогенных промоторов AOX1 из штаммов K. kurtzmanii Y-727 и K. pfaffii GS115 соответственно. В результате трансформации и отбора трансформантов получили 2 штамма-продуцента HBsAg на основе K. kurtzmanii Y-727his4 и K. pfaffii GS115.

Клетки штаммов выращивали на среде YPgM в течение 72 часов с метанольной индукцией, после чего анализировали содержание рекомбинантного HBsAg в клеточных лизатах культур.

Для определения уровня продукции использовали метод иммуноферментного анализа на твердой подложке. Из данных, приведенных на рис.15 видно, что продукция поверхностного антигена вируса гепатита В одинакова у обоих сравниваемых штаммах в пределах погрешности измерения.



Рисунок 15. Продукции HBsAg, нормированная на 100 оптических единиц (OD600)

Из полученных данных видно, что штамм K. kurtzmanii Y-727his4 может обеспечивать сравнимый со штаммом K. pfaffii GS115 уровень синтеза и внутриклеточного накопления рекомбинантного HBsAg.

10. Получение и оценка эффективности продуцента рекомбинантного эндотелиального фактора роста (VEGF)

Для того чтобы исследовать возможность использования новой системы экспресиии для получения биологически активных белков сложной природы в качестве модели был выбран эндотелиальный фактор роста человека (VEGF), представляющий собой дисульфид-связанный гомодимерный белок.

Для создания продуцента VEGF на основе штамма Y-727 был синтезирован искусственный ген VEGF111b, с одной аминокислотной заменой (Asn75->Gln), т.к. в 77-ом положении следует треонин, что явилось бы сигналом нежелательного N-гликозилирования Asn75. Лидерный пептид бета-MF был клонирован в одну рамку считывания с геном VEGF111b, что обеспечивало секрецию рекомбинантного ростового фактора в культуральную жидкость. Для регуляции экспрессии целевого гена использовали эндогенный промотор АОХ1.

В результате трансформации штамма Y-727ura3muthis4 получили штамм-продуцент VEGF111b: K. kurtzmanii Y-727/pINT-AOX1Y-727-VEGF111b.

Клетки штаммов-продуцентов выращивали в колбах со средой YPgM с метанольной индукцией, после чего анализировали уровень продукции VEGF в культуральной жидкости.

Для подтверждения экспрессии гена VEGF111b в клетках K.kurtzmanii Y-727 и секреции продукта в культуральную жидкость - образцы культуральной жидкости анализировали с помощью электрофореза, в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, а также с помощью вестерн блота (рис. 14 А,Б,В,Г). При этом, судя по сигналу на электрофореграмме, секретируемый VEGF111b образовывал гомодимер в невосстанавливающих условиях (рис.14 Б,Г).

Рисунок 16 А. Электрофореграмма культуральной жидкости K. kurtzmanii Y-727/pINT-AOX1Y-727-VEGF111b в восстанавливающих условиях. Б. Электрофореграмма культуральной жидкости K. kurtzmanii Y-727/pINT-AOX1Y-727-VEGF111b в невосстанавливающих условиях. В. Вестерн блот образцов культуральной жидкости двух клонов K. kurtzmanii Y-727/pINT-AOX1Y-727-VEGF111b в невосстанавливающих условиях. Г. Вестерн блот образцов культуральной жидкости двух клонов K. kurtzmanii Y-727/pINT-AOX1Y-727-VEGF111b в восстанавливающих условиях

Данные, представленные на рис. 16 подтверждают димеризацию секретируемого VEGF111b.

На основе опубликованных данных была разработана методика очистки, основанная на двухстадийной хроматографии. Первая стадия представляла собой афинную хроматографию осветленной культуральной жидкости на сорбенте Ni-NTA, и основана на специфическом связывании рекомбинантного VEGF111b с матрицей за счет наличия в самой структуре белка двух следующих друг за другом аминокислотных остатков гистидина, в 11-ом и 12-ом положении. Вторая стадия очистки состояла в обесоливании препарата на сорбенте Sephadex 25 (колонка CD-10), полученного после первой стадии. На электрофореграмме (рис. 17) представлены результаты данной методики очистки.

Рисунок 17. Электрофореграмма образцов VEGF111b после выделения. 1. Образец VEGF111b после очистки на Ni-NTA агарозе. 2. Образец VEGF111b после обессоливания, с буфере PBS

Для проверки биологической активности выделенного белка, образцы VEGF111b были протестированы в институте Общей Генетики РАН (под руководством С.Л. Киселева) на формирование капилляроподобных структур. Опыт проводился на клеточной линии HUVEC (человеческие эндотелиальные клетки), на матригеле.

В качестве положительного контроля использовался препарат VEGF165a (Invitrogen).

Было показано, что исследуемый образец поддерживает формирование сосудов с чуть большей эффективностью в сравнении с контрольным образцом.

Таким образом, можно сделать вывод, что в данной модельной системе выделенный VEGF111b обладает биологической активностью. При этом, продукция данного ростового фактора составляет приблизительно 45 мг на 1 литр культуральной жидкости, при культивировании в колбах на богатой среде.

11. Альтернативная индукция формиатом

Как уже было сказано во введении, одним из существенных недостатков экспрессионной системы, основанной на метилотрофных дрожжах, является необходимость использования токсичного и огнеопасного метанола для индукции промотора AOX1. Данное обстоятельство особенно важно в условиях биотехнологического производства, где при соблюдении норм Российского законодательства, использование метанола практически становится невозможным.

В свете данной проблемы были проведены поиски альтернативного индуктора, способного заменить метанол. Одним из таких индукторов оказалась соль муравьиной кислоты. Было сделано предположение, что являясь последним интермедиатом в метаболическом пути диссимиляции метанола, часть данного субстрата может быть восстановлена до метанола ферментами FLD и AOX, по аналогии с процессом метаногенеза, и вызвать индукцию промотора АОХ1.

Для проверки гипотезы провели опыт с использованием двух штаммов K. kurtzmanii Y-727/pINT-AOX1Y-727-LacZ и K.pfaffii GS115/pINT-AOX1GS115-LacZ с интегрированным репортерным геном lacZ, находящимся под контролем промотора AOX1. Клетки штаммов были выращены до середины логарифмической фазы на средах: YP - без добавления субстрата; YPKOForm - содержащей 1,5% (m/v) формиата калия; YPM - содержащей 1% (v/v) метанол. Была измерена активность альфа-галактозидазы в клеточных лизатах культур (рис.18).



Рисунок 18. Активность бета-галактозидазы, измеренная лизате клеткок K. kurtzmanii Y-727/pINT-AOX1Y-727-LacZ и K.pfaffii GS115/pINT-AOX1GS115-LacZ. По вертикальной оси - шкала активности в Миллеровых единицах. На диаграмме планками отображено стандартное отклонение по результатам измерения активности у двух клонов

Полученные данные свидетельствуют о том, что формиат может является индуктором промотора АОХ1, причем уровень индукции составляет примерно 80-100% от уровня метанольной индукции. Формиат окисляется на последнем этапе диссимиляции метанола, NAD-зависимой формиатдегидрогеназой, с образованием углекислого газа и 1 эквивалента NADH. Таким образом, можно предположить, что формиат не является выгодным источником энергиии, при этом, по имеющимся на сегодняшний день данным, формиат вряд ли может быть непосредственным источником углерода, поскольку является конечным метаболитом в цепочке диссимиляции метанола. Однако, проведенный опыт по росту клеток K.kurtzmanii Y-727 а также K.pfaffii GS115 на минимальной агаризованной среде с формиатом калия, как единственным источником углерода (энергии), показал возможность поддержания медленного роста.

12. Изучение механизма индукции промотора AOX1

Полученные данные об индукции промотора АОХ1 формиатом дают основания предполагать, что какое-то количество метанола может образовываться в клетке из формиата, который затем индуцирует промотор AOX1; либо, присутствие какого-то промежуточного метаболита, являющегося непосредственным индуктором промотора AOX1. Для подтверждения гипотезы о том, что сам метанол является индуктором промотора AOX1 было предложено делетировать ген FLD (формальдегид дегидрогеназы). Таким образом, метаболический путь утилизации метанола должен прерваться, исключая возможность синтеза метанола в клетке из добавленного формиата. Соответственно, при добавлении формиата промотор AOX1 должен быть в неиндуцированном состоянии, а при добавлении метанола промотор АОХ1 должен быть индуцирован.

Для получения более достоверных данных опыт проводили на клетках двух штаммов K.kurtzmanii Y-727 а также K.pfaffii GS115. Чтобы получить мутантные штаммы, были сконструированы 2 плазмиды: pINT-fld-AOX1Y-727-LacZ и pINT-fld-AOX1Y-727-LacZ, содержащие репортерный ген lacZ, линеаризованные фрагменты которых замещали ген FLD при трансформации штаммов реципиентов K.kurtzmanii Y-727 и K.pfaffii GS115.

В результате трансформации штаммов-реципиентов K.kurtzmanii Y-727his4 и K.pfaffii GS115 линеаризованными фрагментами плазмид получили модифицированные штаммы K. kurtzmanii Y-727/fld-AOX1Y-727-LacZ и K.pfaffii GS115/fld-AOX1GS115-LacZ, в которых ген FLD делетирован и замещен линеаризованным фрагментом плазмиды pINT-fld-AOX1Y-727 / GS115-lacZ.

В полученных модифицированных штаммах экспрессия гена lacZ регулируется промотором АОХ1. Для проверки активности промотора АОХ1 в данных штаммах с делетированным FLD, клетки штаммов были выращены на средах: YP - без добавления субстрата; YPM - содержащей 1% (v/v) метанол; YPKOForm - содержащей 1,5% (m/v) формиата калия.

Ожидалось, что при росте на формиате промотор AOX1 не будет активирован.

Была измерена активность бета-галактозидазы в клеточных лизатах культур (рис. 19).

Рисунок 19. Активность бета-галактозидазы, измеренная лизате клеткок K. kurtzmanii Y-727fld-AOX1Y-727-LacZ и K.pfaffii GS115/fld-AOX1GS115-LacZ. По вертикальной оси - шкала активности в Миллеровых единицах. На диаграмме планками отображено стандартное отклонение по результатам измерения активности у двух клонов

Выяснилось, что делеция гена FLD в дрожжах вида K.kurtzmanii Y-727 и K.pfaffii (GS115) оказывает влияние на регуляцию ферментов метаболического пути метанола. Как видно из данных, представленных на рис.18 и 19, существенно возрастает уровень индукции промотора AOX, как при метанольной, так и при формиатной индукции. При этом, в случае добавления формиата, уровень индукции AOX промотора возрастает примерно в 2 раза от уровня индукции в штамме с нативным FLD. Данные результаты дают основание полагать, что в клетках метилотрофных дрожжей существует альтернативный, неспецифический путь восстановления формиата до метанола, кроме уже известного. Либо существует промежуточный метаболит, который является непосредственным индуктором промотора AOX1.

Заключение

1. Классифицирован и изучен новый вид метилотрофных дрожжей K. kurtzmanii ВКПМ Y-727.

2. Разработана новая система экспрессии на основе нового вида метилотрофных дрожжей K. kurtzmanii ВКПМ Y-727, включающая ауксотрофные штаммы производные Y-727, оригинальные экспрессионные вектора с элементной базой из штамма Y-727.

3. Показана эффективность данной системы на модельных штаммах-продуцентах: альфа-галактозидазы, инулазы; человеческого сывороточного альбумина, поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), человеческого сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF111b).

4. Найден альтернативный метанолу безопасный и дешевый индуктор промотора АОХ1 - соль муравьиной кислоты. Показано, что в клетках дрожжей K.kurtzmanii Y-727 и K.pfaffii GS115 формиат калия обеспечивает практически такой же уровень активации промотора АОХ1, как и метанол.

5. Показано влияние делеции гена FLD на регуляцию ферментов метаболического пути метанола.

Литература

1. Патент РФ №2489481 от 10.08.2013. Способ получения белка медицинского назначения E7-HSP70 и штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для его осуществления. Козлов Д.Г., Чеперегин С.Э., Губайдуллин И.И., Ефремов Б.Д., Тюрин О.В., Залунин И.А.

2. Патент РФ № 2502805 от 27.12.2013. Способ микробиологического синтеза целевого секретируемого белка в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Козлов Д.Г., Молчанова Д.В., Губайдуллин И.И., Чеперегин С.Э., Ефремов Б.Д., Тюрин О.В.

3. Tyurin O.V., Gubaydullin I.I., Cheperegin S.E., Efremov B.D., Kozlov D.G. (2013). Amplification of leader proregions as a mean to increase the secretion of antibody fragments in the Pichia pastoris yeast. Applied Biochemistry and Microbiology, 49(7): pp 656-659.

4. Патент РФ №2522479 от 20.05.2014. Применение штамма дрожжей Кomagataella pastoris в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевого белка. Тюрин О.В., Козлов Д.Г., Чеперегин С.Э., Губайдуллин И.И., Ефремов Б.Д., Клебанов Ф.А.

5. Gennadi I. Naumov, Elena S. Naumova, Oleg V. Tyurin, Dmitry G. Kozlov. (2013) Komagataella kurtzmanii sp. nov., a new sibling species of Komagataella (Pichia) pastoris based on multigene sequence analysis. Antonie van Leeuwenhoek (2013) 104:339-347.

6. Tyurin O, Gubaidullin I, Cheperegin S, Efremov B, Naumov G, Naumova E, Kozlov D (2013). The new expression system based on a novel yeast species of the genus Komagataella // 38-th FEBS Congress, 2013, p.256, Saint-Petersburg.

...