Размещено на http://www.allbest.ru/

03.00.13 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

• Сомногенные, терморегуляторные и противосудорожные эффекты белков теплового шока 70 КДА
• Худик Кирилл Александрович
• Санкт-Петербург 2009
• Работа выполнена в лаборатории сравнительной термофизиологии Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН
• Научный руководитель: доктор биологических наук Пастухов Юрий Федотович
• Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Оганесян Генрих Амазаспович
• доктор биологических наук, профессор, Марков Александр Георгиевич
• Ведущее научное учреждение: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН
• Защита диссертации состоится "10" ноября 2009 года в 11 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.127.01) при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44
• С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44).
• Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор М.Н. Маслова
• Общая характеристика работы
• Актуальность проблемы
• Белки теплового шока семейства Heat Shock Proteins 70 kDa (HSP70) осуществляют протективную функцию во всех живых организмах - от археобактерий до человека. Аминокислотная последовательность Hsp70 человека и Escherichia coli идентична на 47%, что подтверждает мнение Е.М. Крепса об исключительно консервативной природе эволюционного процесса, сохраняющего наиболее удачные биохимические перестройки от древних жизненных форм до современных организмов [Крепс, 1972]. Реализация защитной и многих других функций Hsp70 зависит от шаперонной активности [Ellis, 1987]. Под шаперонной активностью понимается способность узнавать и складывать вновь синтезированные полипептидные цепи в активные молекулы белков и восстанавливать нарушенную структуру белков [Маргулис, Гужова, 2000, 2009].
• Экспрессия HSP70 выявлена у организмов, находящихся на разных ступенях эволюции, примерно при 100 видах повреждающих воздействий, в том числе после пролонгирования бодрствования или депривации сна [Маслова, 2005; Пастухов, Екимова, 2005]. В 2000-2009 гг показано, что депривация покоя или сна приводит к нарушению конформации белков и повышению экспрессии HSP70 и других шаперонов в мозге [Tononi, Cirelli 2001 - 2005; Naidoo et al., 2005, 2008; Cirelli, 2009 и др.]. Высказываемая рядом авторов гипотеза об участии шаперонов в биогенезе белка и восстановительной функции сна недостаточно обоснована [Terao et al., 2003, 2006], поскольку установлено, что проявления защитных эффектов шаперонов зависят не от их экспрессии, а от накопления их в клетках [Гужова, Маргулис, 2000]. Эти работы не позволяют сделать вывод, способны ли сами шапероны вызывать изменения основных характеристик сна (временных, спектральных, сомато-висцеральных). Чтобы ответить на этот вопрос, необходимо изучить изменения характеристик сна при повышении уровня HSP70 в мозге. Определенные основания для такого анализа имеются - показано, что Hsp70 в условиях in vitro способен проникать в клетки неврального происхождения [Guzhova et al., 1998, 2001], а после введения Hsp70 в ликвор крысам и голубям он проникает в паренхиму мозга и колокализуется с везикулярным белком синаптофизином в структурах мозга, ответственных за регуляцию сна и висцеральных функций [Екимова и др., 2008, 2009].
• Данные об эффектах умеренного теплового стресса (теплового прекондиционирования), вызывающего массивную экспрессию HSP70 в нейронах, глие и синаптических элементах [Chen, Brown, 2007], внесли весомый вклад в представление о высоком терапевтическом потенциале HSP70 при ишемии мозга, сердца, печени, трансплантации органов, тепловом ударе, сепсисе, язвенной болезни, инфекционных, злокачественных и нейродегенеративных заболеваниях [Pockley, 2001; Андреева, 2002; Lee et al., 2006; Holzer et al., 2007 и др.]. Основная задача, которая решалась в этих работах, - это реализация протективной функции HSP70 и получение данных о повышении устойчивости модельных клеточных систем и животных к повреждающим факторам. Изменения показателей терморегуляции остались не изученными.
• В приведенном перечне отсутствуют модели эпилепсии как одного из наиболее распространенных заболеваний центральной нервной системы. Только у 40-50% больных эпилепсией отмечаются положительные эффекты медикаментозного лечения, в связи с чем приоритетной задачей является поиск веществ, содержащихся в мозге и обладающих нейропротективными свойствами. Первые данные о противосудорожных эффектах были получены при центральных микроинъекциях Hsp70 и после теплового прекондиционирования у крыс линии Вистар в модели судорог, вызванных введением N-метил, D-аспарагиновой кислоты (NMDA); высказана гипотеза об усилении тормозных процессов при повышении уровня Hsp70 мозге [Пастухов, Екимова, 2005]. Большая социальная значимость эпилепсии определила разработку наследственных моделей этого заболевания у животных как наиболее перспективных для выяснения молекулярных и генетических механизмов эпилептогенеза у человека. Противосудорожное действие HSP70 на моделях наследственной эпилепсии не исследовалось.
• При исследовании центральных эффектов Hsp70, включающего два члена семейства HSP70, стресс-индуцибельный (Hsp70i) и конститутивный (Hsc70) белки, остается открытым вопрос о главном "виновнике" того или иного эффекта. Hsp70i и Hsc70 имеют сходные молекулярную структуру и биохимические функции [O'Malley et al., 1985]. Содержание Hsp70i при стрессе увеличивается в клетках глии, в нейронах, в пре- и пост-синаптических элементах, тогда как содержание Hsc70 в нервной ткани млекопитающих высокое в не стрессовых условиях и не возрастает после стресса [Chen, Brown, 2007]. Однако при стрессе Hsc70 перемещается в области, где много синаптических контактов и поэтому предполагается, что оба шаперона обладают протективным действием. Изучение сомногенных, терморегуляторных и противосудорожных эффектов Hsp70i и Hsc70 не проводилось. биогенез шаперон сон
• Цель исследования - выяснить, какой из белков теплового шока семейства HSP70 (стресс-индуцибельный Hsp70i и/или конститутивный Hsc70) обладает центральным действием на характеристики состояний сна и бодрствования и терморегуляции у голубей и крыс, а также на поведенческие показатели судорожной активности у крыс с наследственной формой аудиогенной эпилепсии.
• Задачи исследования:
• 1. Сравнить изменения характеристик сна и бодрствования и показателей терморегуляции у голубей и крыс при центральном действии Hsp70, состоящего из двух членов семейства HSP70 (Hsp70i и Hsc70).
• 2. Выяснить, с каким из членов семейства HSP70 - Hsp70i и/или Hsc70 связаны сомногенные и терморегуляторные эффекты Hsp70.
• 3. Сопоставить изменения поведенческих показателей аудиогенного судорожного припадка у крыс линии Крушинского-Молодкиной
• 4. с наследственной эпилепсией при центральном действии Hsp70
• 5. и входящего в его состав Hsp70i.
• 6. Определить влияние кратковременного теплового прекондиционирования на содержание Hsp70i в структурах головного мозга, а также на поведенческие показатели аудиогенного судорожного припадка у крыс
• 7. с наследственной эпилепсией.
• Научная новизна
• Впервые установлено, что Hsp70 вызывает у голубей и крыс увеличение общего времени медленного сна за счет прироста длительности эпизодов, для которых характерно отсутствие изменений мощности спектра электроэнцефалограммы и значительное снижение температуры мозга. Впервые выяснено, что стресс-индуцибельный белок Hsp70i вызывает увеличение медленного сна и снижение температуры мозга и сократительной активности мышц, идентичные эффектам Hsp70, состоящего из двух членов семейства HSP70, Hsp70i и конститутивного Hsc70; Hsc70 не влияет на изученные показатели. Впервые выявлено, что Hsp70i вызывает уменьшение длительности аудиогенных тонических судорог у крыс линии Крушинского-Молодкиной, сходное с действием Hsp70. Впервые показано, что тепловое прекондиционирование не влияет на тонические судороги, но значительно увеличивает латентный период судорог у крыс с наследственной эпилепсией, что совпадает по срокам с повышением содержания Hsp70i в структурах головного мозга, участвующих в инициации аудиогенных судорог.
• Основные положения, выносимые на защиту
• 1. Белок теплового шока Hsp70 обладает сомногенным и терморегуляторным действием: увеличение его содержания в головном мозге (путем микроинъекций в ликвор) у голубей и крыс приводит к увеличению "естественного" медленного сна и характерному для него снижению мышечной активности и температуры мозга.
• 2. Белок теплового шока Hsp70 обладает противосудорожным действием
• 3. у крыс линии Крушинского-Молодкиной с наследственной формой аудиогенной эпилепсии, для которой характерно преобладание возбуждающих процессов в ЦНС: повышение содержания Hsp70 в мозге вызывает уменьшение опасных для жизни тонических судорог (после его микроинъекций в ликвор) или увеличение в 3 раза латентного периода аудиогенного судорожного припадка (после теплового прекондиционирования).
• 4. В реализацию сомногенных, терморегуляторных и противосудорожных эффектов Hsp70 и противосудорожных эффектов теплового прекондиционирования вовлечен преимущественно стресс-индуцибельный член семейства HSP70.
• Теоретическая и практическая значимость
• Исследование имеет фундаментальное значение для понимания роли белков теплового шока семейства 70 кДа в модуляции жизненно важных функций организма теплокровных животных. Выявленное в исследовании увеличение естественного медленного сна и сопряженного с ним физиологического снижения активности мышц и температуры мозга, свидетельствует о роли молекулярных шаперонов в усилении тормозных процессов в ЦНС; эти данные могут служить основанием для апробации в клинике различных физических способов прекондиционирования (лечебных тепловых, гипоксических воздействий, мышечных нагрузок) и лекарственных средств, увеличивающих экспрессию и содержание в мозге и других тканях шаперонов, при лечении инсомний и нарушений сна, вызванных стрессом или сопровождающих другие заболевания. При изучении наследственной эпилепсии у крыс линии Крушинского-Молодкиной получены данные о значительном уменьшении наиболее опасных для жизни тонических судорог при увеличении содержания в мозге экзогенного стресс-индуцибельного белка Hsp70i и об увеличении в 3 раза латентного периода начала аудиогенного судорожного припадка после кратковременного теплового воздействия, совпадающем по срокам с увеличением содержания эндогенного Hsp70i в структурах головного мозга, участвующих в инициации судорог. Данные свидетельствуют о вовлечении шаперона Hsp70i в механизмы развития судорог при наследственной эпилепсии, рассматриваемой в качестве перспективной модели для выяснения эндогенных молекулярных и генетических механизмов эпилептогенеза у человека. Эти результаты могут найти применение при разработке методов коррекции судорожной активности путем повышения экспрессии и содержания в мозге шаперонов. Полученные в работе данные могут быть использованы в курсах лекций по физиологии для студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских институтов.
• Апробация работы
• Результаты исследования доложены и обсуждены на 6-й и 10-й Всероссийских конференциях молодых ученых "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2004, 2008), Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" (Санкт-Петербург, 2005), 4-й и 6-й Всероссийских конференциях "Актуальные проблемы сомнологии" (Москва, 2004, Санкт-Петербург, 2008), на 3-й и 4-й Всероссийских школах-конференциях
• (с международным участием) "Sleep as a window to the world of wakefulness" (Ростов-на-Дону, 2005, Москва, 2007), на 8-й, 9-й, 10-й, 11-й и 12-й Международных конференциях "Stress and behavior" (Санкт-Петербург, 2004, 2005, 2007, 2008 и 2009), 3-й и 4-й Всероссийских конференциях
• (с международным участием) "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Санкт-Петербург, 2003, 2005), на XIX и ХХ Съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004, Москва, 2007).
• Публикации
• По теме диссертации опубликовано 22 работы, из которых статьи в рецензируемых журналах - 2, статьи в сборниках научных работ - 2, тезисы докладов - 18.
• Структура и объем диссертации
• Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав, содержащих результаты исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 39 отечественных и 149 зарубежных источников. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 таблицами и 35 рисунками.
• Основное содержание работы
• Материалы и методы исследования
• Электрофизиологические опыты выполнены на 22 взрослых голубях (Columba livia) обоего пола, 15 крысах-самцах линии Вистар и 7 крысах-самцах линии Крушинского-Молодкиной (КМ). Поведенческие эксперименты по изучению судорожной активности проводились на 52 крысах линии КМ
• с наследственной формой аудиогенной эпилепсии. Операции проводили на животных под общим нембуталовым наркозом (30 мг/кг для голубей, 50 мг/кг для крыс, внутрибрюшинно) за 7-10 дней до начала экспериментов. Для введения фармакологических препаратов, вживляли проводящие канюли в 3-й желудочек мозга крысам (P0.8; L0; H6.5 в мм согласно атласу Paxinos, Watson, 1998) и голубям (A6.5; L0; H11 в мм согласно атласу Karten, Hodos, 1967).
• Для идентификации состояний сна и бодрствования регистрировали электроэнцефалограмму (ЭЭГ), электроокулограмму, электромиограмму. Измерения мозговой и периферической температур проводились с помощью предварительно откалиброванных минитермисторов (model BetaTherm cat 2K7 MCD1, США). Для изучения сократительной активности мышц проводилась регистрация интегрированной электромиограммы. Для регистрации и анализа электрофизиологических параметров использовали компьютерные системы SASR 8800 (США) и Sagura (Германия). У голубей все провода от термисторов и электродов проводились подкожно к "рюкзачку" (15 г) на спине птицы, который закреплялся проволокой под каждым крылом. У крыс все провода шли к разъему, который размещался на голове и фиксировался самотвердеющей пластмассой Протакрил-М. Через подвижный коммутатор осуществлялось переключение сигналов на кабель, идущий к предварительному усилителю. Далее сигналы через блок аналоговой обработки и оцифровки поступали в компьютер для архивирования данных. Измерения температуры мозга и мощности спектра ЭЭГ рассчитывали отдельно для каждого состояния (бодрствование, дремота, медленный и быстрый сон) за каждый час регистрации. Точность измерения температуры мозга составляла 0.01 єС.
• Для экспериментов использовался препарат Hsp70, состоящий из смеси Hsp70i и Hsc70 в соотношении 3:2, полученный в лаборатории защитных механизмов клетки Института цитологии РАН. Hsp70 был выделен из тканевых лизатов красных (медленных) волокон тазобедренной мышцы быка, с использованием комбинации хроматографических процедур [Margulis, Welsh, 1991]. Степень очистки препаратов проверялась с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и составляла не менее 99%. Hsc70 выделялся нами на базе Института Цитологии РАН из смеси Hsp70i и Hsc70, полученной из мозга быка. Рекомбинантный Hsp70i человека был получен в бакуловирусной системе экспрессии в Институте молекулярной биологии РАН. Hsp70, Hsc70, Hsp70i вводились в третий желудочек мозга в дозах 1.5, 6 и 10 мкг. Все препараты и контрольные растворы - физиологический раствор, фосфатный буфер и термоденатурированные (нагретые до 100оС в течение 2 мин) Hsp70, Hsc70 и Hsp70i вводились в объемах не более 1 мкл.
• Судорожная активность у крыс линии КМ вызывалась звуком (интенсивность 50 дБ, частота 10 кГц), подаваемым с генератора и тестировалась по следующим характеристикам: латентный период, длительность гиперлокомоторной активности, называемой фазой дикого бега, тонических и клонических судорог. Тяжесть судорожного припадка оценивалась в баллах (от 0 до 5) по модифицированной шкале Крушинского [Крушинский, 1960]. После судорожного припадка у крыс линии КМ оценивались длительность и тяжесть атаксии и каталепсии. Для записи и анализа судорожной активности применялась система видеонаблюдения и компьютерной регистрации фирмы Logitech (Швейцария). Тепловое прекондиционирование достигалось путем нагревания наркотизированных крыс (200 мг/кг оксибутирата и 25 мг/кг нембутала) в термостатируемой камере до ректальной температуры 41 oС в течение 5 мин. Судорожная активность крыс по описанным ранее параметрам тестировалась через 1-14 дней после теплового воздействия. Определение содержания Hsp70i в плазме крови проводилось с помощью модифицированного иммуноферментного анализа, а в структурах мозга - по методу Western-blotting с использованием моноклональных антител к Hsp70.
• Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 6. При сравнении средних значений анализируемых показателей применялся дисперсионный анализ ANOVA (LSD тест) и непараметрический критерий Вилкоксона. Различия полученных результатов считались статистически достоверными при уровне значимости p<0.05.
• Результаты исследования и их обсуждение

1. Влияние белка теплового шока 70 кДа на характеристики состояний сна и бодрствования у голубей и крыс.

При анализе влияния Hsp70, состоящего из смеси Hsp70i и Hsс 70, на состояния сна, бодрствования и дремоты, мы выявили сходные изменения у голубей и крыс линии Вистар. Отчетливое увеличение медленного сна при действии Hsp70 наблюдалось с первого часа после микроинъекции. В первой стадии темной фазы суток (первые 3 часа), характеризующейся быстрым снижением температуры мозга, прирост общего времени медленного сна у голубей составляет в среднем 16% (p<0.05); эти изменения наблюдались и в стадии ночного плато температуры мозга (в 6-7 часы) (Рис. 1). За первые 4 часа после введения Hsp70 длительность медленного сна увеличилась на 36.5 мин (p<0.05), а за 8 часов регистрации - на 61 мин (p<0.05). При действии Hsp70 у голубей наблюдалось достоверное уменьшение общего времени быстрого сна и тенденция к снижению бодрствования и дремоты. За первые 4 часа после введения Hsp70 суммарная длительность бодрствования уменьшилась на 21 мин (p>0.05), а длительность дремоты - на 13 мин (p>0.05).

После микроинъекций Hsp70 у крыс линии Вистар (Рис. 2) в первые 3 часа регистрации прирост медленного сна составил 20 % (р<0.05). За первые 3 часа после введения Hsp70 суммарная длительность медленного сна увеличилась на 34.7 мин (p<0.05), а за 8 часов регистрации - на 76 мин (p<0.05). У крыс отмечена тенденция к уменьшению общего времени бодрствования, дремоты и быстрого сна. Введение контрольных растворов (физиологического раствора и фосфатного буфера), а также термоденатурированного Hsp70 у голубей и крыс не вызывало изменений временных характеристик состояний сна и бодрствования.

И у крыс, и у голубей после введения Hsp70 отмечалось увеличение длительности эпизодов медленного сна (в среднем на 35% (p>0.05) у голубей и 45% (p>0.05) у крыс), тогда как число эпизодов этого состояния либо не изменялось, либо уменьшалось. Это может означать, что в увеличение медленного сна значительный вклад вносит активация механизмов поддержания этого состояния. Быстрый сон у голубей уменьшался преимущественно за счет снижения числа эпизодов, что может свидетельствовать о подавлении механизмов запуска этого состояния.

Анализ спектральных характеристик ЭЭГ показал, что при введении Hsp70 крысам и голубям, несмотря на значительное увеличение медленного сна, не наблюдалось значимых изменений мощности спектра ЭЭГ в диапазоне 1-30 Гц по сравнению с результатами, полученными в контрольных опытах. По изменению мощности спектра ЭЭГ в дельта-диапазоне (0.75-4 Гц) можно судить

о медленноволновой активности и, в определенной степени, об интенсивности сна [Franken et al., 1992]. Депривация сна и фармакологические препараты вызывают увеличение медленно-волновой активности ЭЭГ в дельта-диапазоне, которое рассматривается как последствие стресса или проявление токсического эффекта химических веществ [Deboer et al., 1994; Tobler et al., 2001]. Отсутствие изменений мощности спектра ЭЭГ в эпизодах медленного сна после микроинъекций Hsp70 свидетельствуют о проявлении физиологического сомногенного эффекта Hsp70.

Поскольку увеличение медленного сна у голубей и крыс наблюдалось при действии Hsp70, состоящего из смеси Hsp70i и Hsc70, встал вопрос, с каким из белков семейства HSP70 связано это сомногенное действие. Анализ временных характеристик состояний сна и бодрствования показал, что при действии Hsp70i

в дозе 1.5 мкг наблюдался значительный прирост общего времени медленного сна у голубей и крыс линии КМ. За первые 3 часа после введения Hsp70i время медленного сна увеличилось на 20% (р<0.05) у голубей и 16% (р<0.05) у крыс по сравнению с контрольными значениями (Рис. 3). Прирост медленного сна происходил за счет увеличения длительности его эпизодов (в среднем на 45% (р<0.05) у голубей и 40% (р<0.05) у крыс). Со второго часа после микроинъекций Hsp70i у голубей отмечено уменьшение времени бодрствования; снижение количества быстрого сна происходило с третьего часа регистрации. Выявлено уменьшение количества эпизодов бодрствования и быстрого сна, тогда как длительность эпизодов не изменялась. Микроинъекции Hsc70 не вызвали изменений исследуемых временных характеристик бодрствования, медленного и быстрого сна. Поскольку Hsp70i вызывает изменения характеристик состояний сна и бодрствования у голубей и крыс, в целом сходные по направлению и величине с действием Hsp70, состоящего из Hsp70i и Hsс 70, предполагается, что именно со стресс-индуцибельным членом семейства HSP70 связано сомногенное действие Hsp70.

Выявленные в наших опытах быстрое развитие и направленность эффектов Hsp70 после его введения в 3-й желудочек мозга позволяют предполагать, что ответственными за сомногенное действие Hsp70 могут быть структуры, тесно прилегающие к стенкам желудочка, а именно, один из "центров" регуляции медленного сна и его сомато-висцеральных компонентов - преоптическая область гипоталамуса. Блокада ГАМК(А)-рецепторов бикукуллином в вентролатеральной преоптической области гипоталамуса предотвращает увеличение медленного сна у голубей после введения Hsp70 [Пастухов, Екимова, 2005; Ekimova, 2007]. По мнению авторов, эти данные свидетельствуют о возможном участии тормозных ГАМК(А)-ергических механизмов вентролатеральной преоптической области гипоталамуса в реализации сомногенных эффектов Hsp70.

2. Влияние белка теплового шока 70 кДа на терморегуляторные показатели у голубей и крыс

В контрольных условиях у голубей были выявлены более контрастные по сравнению с крысами изменения температуры мозга в суточном цикле; эти результаты согласуются с данными других исследователей [Rashotte et al., 1998; Пастухов и др., 2001]. Снижение температуры мозга в темную фазу суток

у голубей достигало 2 °С. У крыс в светлую фазу снижение температуры мозга составляло 0.5 °С. Микроинъекции Hsp70 в ликворную систему мозга усиливали естественное снижение температуры мозга и вызывали дополнительное ее уменьшение в среднем на 0.50.1оС (p<0.05) у голубей и 0.4±0.1єС (p<0.05) у крыс (Рис. 4), последнее мало зависело от различий в абсолютном уровне температуры мозга у крыс и голубей, скорости ее снижения и направления ее изменений в начале (снижение), в середине (нижнее плато) и в конце (повышение) темной фазы суток. Отмечены некоторые различия в эффектах Hsp70. У голубей наблюдалось достоверное уменьшение сократительной активности мышц и одновременно значимое снижение температуры мозга уже в первые часы после введения Hsp70. У крыс уменьшение уровня сократительной активности мышц происходило с первого часа после введения Hsp70, а снижение температуры мозга отмечалось с третьего часа регистрации. Судя по отсутствию существенных изменений температур кожи неоперенной части ноги у голубей и кожи хвоста у крыс, снижение температуры мозга при действии Hsp70 не связано, по-видимому, с усилением периферической вазодилатации и увеличением теплопотерь. Показано, что введение контрольных растворов (физиологического раствора и фосфатного буфера), а также термоденатурированного Hsp70 не вызывало изменений исследованных терморегуляторных показателей.

Ранее было установлено, что температура мозга у голубей и крыс повышается в большинстве эпизодов бодрствования и быстрого сна и отчетливо снижается в эпизодах медленного сна [Franken et al., 1992; Пастухов и др., 2001]. В данном исследовании показано, что микроинъекции Hsp70 у крыс вызывали дополнительное снижение температуры мозга в эпизодах медленного сна (в среднем на 0.5±0.03 єС (р<0.05)) в течение 1-го, 4-го, 6-го и 7-го часов по сравнению с контрольными значениями. Этот температурный эффект Hsp70 не соответствовал динамике увеличения средней длительности эпизодов и общего времени медленного сна, совпадение изменений этих показателей было обнаружено только в первый час после введения Hsp70. У голубей найдено более выраженное соответствие динамики снижения температуры мозга (на 0.4±0.07 єС (р<0.05)) в эпизодах медленного сна с динамикой возрастания длительности эпизодов и общего времени этого состояния при действии Hsp70. В эпизодах быстрого сна увеличение температуры мозга у крыс под влиянием Hsp70 было более значительным, чем у голубей. Этот факт может быть связан с тем, что при уменьшении общего времени быстрого сна, длительность эпизодов при действии Hsp70 у крыс остается в 51 раз больше, чем у голубей (в среднем за 8 часов).

Следовательно, уменьшение температуры мозга при действии Hsp70 у крыс и голубей проявляется в основном в эпизодах медленного сна, однако, согласование динамики снижения температуры мозга в первой половине темной фазы суток с инициируемым Hsp70 увеличением длительности эпизодов и общего времени медленного сна и уменьшением сократительной мышечной активности наиболее отчетливо определяется у голубей. Возможно, это связано с тем, что суточная динамика показателей терморегуляции и сна у голубей более контрастна по сравнению с крысами [Сазонов, Пастухов, 1985; Rashotte et al., 1998; Пастухов и др., 2001]. На фоне действия Hsp70 эти видовые различия сохраняются: снижение температуры мозга (на 2°С) в первой половине темной фазы суток у голубей значительно больше, чем в той же части светлой фазы суток у крыс (на 0.5°С), что согласуется с большей пропорцией медленного сна у голубей.

После введения Hsp70i голубям выявлено снижение сократительной мышечной активности и температуры мозга (Рис. 5). Снижение температуры кожи неоперенной части ноги свидетельствует о развитии периферической вазоконстрикции, направленной на компенсацию уменьшения уровня температуры мозга. Микроинъекции Hsc70 в 3-й желудочек мозга не вызывали значимых изменений температуры мозга, сократительной мышечной активности и периферической вазомоторной реакции по сравнению с контролем. Полученные данные свидетельствуют о том, что в терморегуляторные эффекты Hsp70, состоящего из смеси Hsp70i и Hsс 70, основной вклад вносит стресс-индуцибельный член семейства HSP70.

3. Влияние белка теплового шока 70 кДа и теплового прекондиционирования на показатели судорожной активности у крыс линии КМ с наследственной аудиогенной эпилепсией.

Известно, что при химически индуцированных судорогах у крыс и мышей возрастает экспрессия Hsp70, которая, однако, оказывается недостаточной для купирования последующих судорожных припадков [Ferrer et al, 2002; Ayala, Tapia, 2008]. Выявленное в нашем исследовании отчетливое увеличение медленного сна и снижение терморегуляторных показателей у голубей и крыс при действии Hsp70, а также полученные ранее данные об участии ГАМК-ергических механизмов в регуляции сна и висцеральных функций [Екимова, Пастухов, 2005; Пастухов, Екимова, 2005] и противосудорожные эффекты теплового прекондиционирования и Hsp70 при гиперактивации глутаматных рецепторов у крыс линии Вистар, не предрасположенных к наследственной эпилепсии, позволили предположить, что Hsp70 способен усиливать тормозные процессы в мозге не только в "норме", но и при повышении активности возбуждающих систем. Оставалось неизвестным, способен ли Hsp70 снизить тяжесть гиперлокомоторного возбуждения на модели наследственной аудиогенной эпилепсии, для которой характерно преобладание возбуждающих процессов в центральной нервной системе.

Для изучения механизмов эпилепсии выведено несколько линий крыс, генетически предрасположенных к аудиогенным судорогам: линии GEPR-3, GEPR-9, WAR [Ross, Coleman, 2000] и линия КМ, созданная в Московском Государственном Университете [Крушинский, 1960]. Крысы линии КМ с наследственной формой эпилепсии обладают высокой чувствительностью к аудиогенной стимуляции. Звуковая стимуляция (частотой 9 кГц, интенсивностью 50 дБ) вызывает у них интенсивный "одноволновой" судорожный припадок в 99% случаев. В исследовании установлено, что аудиогенные судороги у крыс линии КМ начинались с коротким латентным периодом (2 1 с) и состояли из фазы дикого бега (длительностью 3.5 1 с) и фазы клонико-тонических судорог (длительностью 17 1 с) с наиболее выраженным тоническим компонентом (12 1 с). По завершении судорожного припадка у крыс линии КМ наблюдалась атаксия (2 мин), характеризующаяся полной обездвиженностью и неспособностью к самостоятельной двигательной активности, и каталепсия (8-10 мин), сопровождающаяся замиранием животного в любой, даже неудобной для себя позе, и отсутствием реакции на внешние тактильные стимулы. Введение в 3-й желудочек мозга контрольных растворов (физиологический раствор, фосфатный буфер), а также термоденатурированного Hsp70 не изменяли характеристики судорожной активности и не влияли на тяжесть судорожного припадка и послесудорожных моторных изменений.

Через 2.5 часа после микроинъекций Hsp70 в 3-й желудочек мозга в дозе 6 мкг у крыс линии КМ не отмечалось изменений длительности латентного периода инициации аудиогенного судорожного припадка. Наблюдалось значимое снижение длительности дикого бега и клонико-тонических судорог по сравнению с контролем (Рис. 6А). Уменьшение длительности последнего компонента судорожного припадка происходило за счет снижения длительности тонических судорог (на 28%, p<0.01). Через 5 часов после введения Hsp70 в 3-й желудочек мозга в той же дозе были выявлены сходные по направлению и значению изменения компонентов аудиогенного судорожного припадка, как и через 2.5 часа после микроинъекций Hsp70. Микроинъекции Hsp70 в 3-й желудочек мозга в дозе 10 мкг через 2.5 и 5 часов вызывали значительное снижение длительности тонических судорог (на 37%, p<0.001 и 54%, p<0.001 соответственно) и общей длительности аудиогенного припадка (на 40%, p<0.001), по сравнению с контролем (Рис. 6Б). Отмечено уменьшение тяжести аудиогенных судорог на 1 балл (с 5 до 4 баллов) спустя 5 часов после введения Hsp70. Изменений длительности латентного периода судорожного припадка, атаксии и каталепсии не выявлено.

Считается, что доминантный очаг генерации аудиогенных судорог локализован в ядрах нижних бугров четверохолмия. После микроинъекции NMDA в нижние бугры четверохолмия крысам линии Sprague-Dawley, они становились предрасположенными к аудиогенным судорогам [Faingold, Anderson, 1991]. В данном исследовании введение Hsp70 в 3-й желудочек мозга крысам линии КМ не влияло на длительность латентного периода судорожного припадка и, следовательно, на механизмы его инициации, однако снижало длительность и тяжесть тонических судорог. Предполагается, что в интенсивный судорожный припадок у крыс линии КМ могут быть вовлечены не только нижние бугры четверохолмия, но и другие структуры мозга, отвечающие за развитие клонических и тонических судорог [Семьянов, Годухин, 2001; Семиохина и др., 2006].

Микроинъекции Hsp70i (в дозе 6 мкг) в 3-й желудочек мозга крысам линии КМ вызывали изменения судорожной активности, аналогичные действию Hsp70, состоящего из Hsp70i и Hsс 70 (Рис. 7). Hsp70i инициировал достоверное снижение длительности и тяжести тонической фазы (p<0.05), но не влиял на латентный период судорожного припадка. Hsc70 не оказывал значимого действия на компоненты аудиогенного судорожного припадка у крыс линии КМ. Мы предполагаем, что противосудорожные эффекты Hsp70 связаны с действием только Hsp70i.

Применение щадящего теплового прекондиционирования (нагревание наркотизированного животного до ректальной температуры 40.5-41 єС в течение 5 мин) у крыс линии КМ вызывало значимое увеличение латентного периода судорог (в 2.2 раза, p<0.05) через 2-7 дней с максимумом эффекта на 4-й день (в 2.8 раза, p<0.05) после теплового воздействия (Рис. 8). Достоверные изменения длительности фаз дикого бега и клонико-тонических судорог не обнаружены.

Рис. 8. Изменение длительности стадий судорожного припадка, вызванного аудиогенной стимуляцией у крыс линии Крушинского-Молодкиной после теплового прекондиционирования (ТП).

После теплового воздействия у крыс линии КМ не наблюдалось изменение длительности атаксии и каталепсии, однако, снижалось количество животных с симптомами каталепсии (на 50% через 1-2 дня и на 70% через 4-7 дней после теплового прекондиционирования).

Анализ изменения содержания Hsp70i в плазме крови и структурах мозга после кратковременного теплового прекондиционирования показал, что через 30 мин после теплового воздействия у крыс линии КМ происходит увеличение содержания Hsp70i в 6.6 (p<0.05) раза по сравнению с контролем, что связано, вероятно, с выходом белка из клеток крови. По-видимому, эта быстрая реакция направлена на защиту организма от неблагоприятных условий среды [Guzhova et al., 2001; Johnson, Fleshner, 2006]. Выявлено, что содержание Hsp70i повышается в гипоталамусе, гиппокампе, среднем мозге и нижних буграх четверохолмия в 1-й и 4-й дни после теплового прекондиционирования. Наиболее выраженное увеличение содержания Hsp70i отмечено в гиппокампе и нижних буграх четверохолмия. В таламусе, пириформной коре, мозолистом теле, сенсомоторной коре и мозжечке изменения содержания Hsp70i не обнаружены. Изменение содержания Hsc70 в структурах мозга после теплового прекондиционирования не происходит. Наблюдается определенная связь между максимумом увеличения содержания Hsp70i в нижних буграх четверохолмия и увеличением латентного периода судорожного припадка у крыс линии КМ, поскольку нижние бугры четверохолмия считают ответственными за инициацию аудиогенных судорог [Faingold, Anderson, 1991; Faingold, 1999]. Известно, что при тепловом прекондиционировании увеличение экспрессии HSPs происходит в течение 12-24 часов [Chen et al., 1999; King et al., 2002]. Вместе с этим отмечается связь протективных свойств HSP70 не с увеличением его экспрессии, а с повышением содержания в клетках [Маргулис, Гужова, 2000]. Предполагается, что длительное влияние теплового прекондиционирования на судорожную активность у крыс линии КМ до 4-7 дня связаны с увеличением содержания Hsp70i в структурах мозга, ответственных за инициацию аудиогенных судорог.

Таким образом, в ходе работы получены данные о том, что Hsp70, состоящий из двух членов семейства HSP70, обладает сомногенным, терморегуляторным и противосудорожным действием. Введение Hsp70 в 3-й желудочек мозга голубям и крысам вызывает отчетливое увеличение "естественного" медленного сна в период его суточного максимума. При действии Hsp70 увеличение длительности медленного сна сопровождается типичным для этого состояния снижением сократительной активности мышц и температуры мозга. Механизмы изменений характеристик состояний сна и бодрствования и показателей терморегуляции при действии Hsp70 оказались сходными у голубей и крыс; выявленные некоторые различия в эффектах Hsp70 могут быть связаны с видовыми особенностями животных. Hsp70i вызывает изменения изученных характеристик, идентичные по направлению и величине к эффектам Hsp70, состоящего из Hsp70i и Hsс 70. Предполагается, что именно со стресс-индуцибельным членом семейства HSP70 связано сомногенное и терморегуляторное действие Hsp70. Проведенное исследование у крыс линии КМ с наследственной эпилепсией показало, что Hsp70 и Hsp70i снижают тяжесть и длительность тонических судорог, а тепловое прекондиционирование, повышающее уровень Hsp70i в структурах головного мозга, способствует значительной задержке начала судорожного припадка. Эти данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что индуцибельный Hsp70i способен усиливать тормозные процессы в мозге как в "нормальных" условиях, так и при преобладании возбуждающих процессов у крыс с наследственной формой аудиогенной эпилепсии.

Выводы

1. Микроинъекции Hsp70, состоящего из двух членов семейства HSP70 (стресс-индуцибельного Hsp70i и конститутивного Hsc70), в 3-й желудочек мозга голубей и крыс вызывают увеличение общего времени медленного сна (в течение первых 7 часов у голубей и первых 3 часов у крыс); это увеличение реализуется путем активации механизмов поддержания более длительных эпизодов медленного сна и не сопровождается изменением мощности спектра электроэнцефалограммы, что указывает на сохранение "естественного" медленного сна. У голубей отмечено более позднее (с 4-го по 8-й час после микроинъекции) достоверное снижение времени быстрого сна, обусловленное уменьшением числа его эпизодов.

2. Микроинъекции Hsp70 приводят к снижению сократительной активности мышц и температуры мозга у голубей и крыс; при этом не выявлено достоверных изменений периферической температуры. Вызываемое Hsp70 снижение температуры мозга в эпизодах медленного сна у голубей,

3. в отличие от крыс, согласуется с увеличением длительности эпизодов

4. и уменьшением сократительной активности мышц.

5. При микроинъекциях индуцибельного Hsp70i выявлены изменения временных характеристик сна и бодрствования и показателей терморегуляции, идентичные эффектам Hsp70. Конститутивный Hsc70 не оказывает влияния на исследованные показатели.

6. Микроинъекции Hsp70 и Hsp70i в 3-й желудочек мозга вызывают близкое по величине уменьшение длительности тонических судорог у крыс линии Крушинского-Молодкиной с наследственной формой аудиогенной эпилепсии; Hsc70 не влияет на судорожную активность.

7. Кратковременное (в течение 5 мин) тепловое прекондиционирование крыс линии Крушинского-Молодкиной приводит к увеличению латентного периода судорог (в 2.8 раза), совпадающему по срокам (через 4 дня) с повышением содержания Hsp70i в гиппокампе, гипоталамусе, миндалине, среднем мозге и, наиболее значительно, в нижних буграх четверохолмия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах

1. Пастухов Ю.Ф., Екимова И.В., Худик К.А., Гужова И.В. Белок теплового шока 70 кДа, свободный от липополисахарида, обладает гипотермическим и сомногенным действием // ДАН. - 2005. - Т. 402. - N. 2. - С. 275-278.

2. Пастухов Ю.Ф., Екимова И.В., Худика К.А., Гужова И.В. Белок 70кДа в контроле сна и терморегуляции // Ж. эвол. биохим. и физиол. - 2008. - T. 44. - N 1. - С. 65-71.

Статьи в сборниках научных работ

1. Пастухов Ю.Ф., Екимова И.В., Гужова И.В., Худик К.А. Интегративные механизмы реализации пирогенного и сомногенного эффектов белка теплового шока 70 кДа: гипотеза // Проблемы интеграции функций в физиологии и медицине. - Минск, ПЧУП "Бизнесофсет". - 2004. - С. 291-298.

2. Ницинская Л.Е., Худик К.А., Пастухов Ю.Ф. Влияние теплового прекондиционирования на судорожную активность на разных моделях экспериментальной эпилепсии у крыс // Медико-биологические аспекты действия физических факторов. - Мн:, 2006. - С. 181-184.

Тезисы докладов

1. Пастухов Ю.Ф., Екимова И.В., Худик К.А., Андреева Л.И., Гужова И.В. Участие белка теплового шока 70кДа в регуляции висцеральных функций // 3-я Всероссийская конференция (с международным участием) "Механизмы функционирования висцеральных систем". - Санкт-Петербург. - 2003. - С. 246-247.

2. Худик К.А. Физиологические эффекты БТШ 70 кДа. // VII Всероссийская медико-биологическая конференции молодых ученых "Человек и его здоровье". - Санкт-Петербург. - 2004. - С. 309-310.

3. Lapshina K.V., Mankovskaja T.N., Hudik K.A. Effect of HSP70 kDa on somato-visceral characteristics before and after the stress. // 8-th Multidisciplinary International Conference of biological psychiatry "Stress and Behavior". - Psihofarmocol. Biol. Narcol. - 2004. - T 4. - N. 2-3. - P. 699-700.

4. Худик К.А. Различия в параметрах терморегуляции при центральном действии препаратов белка теплового шока. // XIX съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Симпозиум "Метаболизм, энергообеспечение, терморегуляция". - Екатеринбург. - 2004. - Рос. Физиол. журн. (приложение) - Т 90. - N 8. - С. 53.

5. Екимова И.В., Лапшина К.В., Маньковская Т.Н., Худик К.А., Пастухов Ю.Ф. Сомногенное действие белка теплового шока 70 кДа и его значение для процесса реабилитации после стресса. // 4-ая Всероссийская конференция "Актуальные проблемы сомнологии". - Москва. - 2004. - С. 24.

6. Худик К.А., Эрам С.Ю. Изучение эффектов БТШ 70 кДа на временные и спектральные характеристики медленно-волнового сна у крыс. // Всероссийская конференция молодых исследователей "Физиология и медицина". - Вестник молодых ученых. - Санкт-Петербург. - 2005. - С. 132.

7. Маньковская Т.Н., Худик К.А. Эффекты БТШ 70 кДа до и после стресса. // Всероссийская конференция молодых исследователей "Физиология и медицина". - Вестник молодых ученых. - Санкт-Петербург. - 2005. - С. 73.

8. Hudic K.A., Lapshina K.V., Eram S. Yu., Mankovskaya T.N. Effects of Hsp70 kDa on spectral characteristics of Non-rapid-eye-movement sleep in rats and pigeons. // 9-th Multidisciplinary International Conference of biological psychiatry "Stress and Behavior". Symposium "Sleep and stress". - Psihofarmocol. Biol. Narcol. - 2005. - P. 699-700.

9. Mankovskaja T.N., Hudik K.A. Stress protein 70 kDa promotes earlier recovery of sleep after stress. // Abstr. of the 3rd International workshop "Sleep as a window to the world of wakefulness". - Rostov-on-Don. - 2005. - P.68.

10. Hudik K.A. Changes in temporal characteristics of sleep-wake cycle under central and peripheral microinjections of Hsp 70 kDa. // Abstr. of the 3rd International workshop "Sleep as a window to the world of wakefulness". - Rostov-on-Don. - 2005. - P.108.

11. Худик К.А., Ватаев С.И., Пастухов Ю.Ф. Влияние БТШ 70 на судорожные припадки, вызванные активацией NMDA-рецепторов и звуковой стимуляцией у крыс. // 4-я Всероссийская конференция (с международным участием) "Механизмы функционирования висцеральных систем". - Санкт-Петербург. - 2005. - С. 260.

12. Ницинская Л.Е., Худик К.А. Изучение противосудорожных эффектов Hsp70 у крыс линии Wistar и Крушинского-Молодкиной // Материалы 10-ой Всероссийской медико-биологической конференции "Человек и его здоровье". - Санкт-Петербург. - 2007. - С.309-310.

13. Hudik K.A., pastukhov Yu.f. Anticonvulsant effects of protein 70 kDa and thermal preconditioning in Krushinskii-Molodkina rats // Abstr. of the 10th Jubilee Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry "Stress and behavior". - St.-Petersburg. - 2007. - P. 24.

14. Hudik K.A. Effects of HSP70 on thermal, temporal and spectral characteristics of sleep and wakefulness states in rats and pigeons. // Abstr. of the 4th International workshop "Sleep as a window to the world of wakefulness". - Moscow. - 2007. - P. 113.

15. Худик К.А. Влияние белка теплового шока 70 кДа на судорожный припадок у крыс линии Крушинского-Молодкиной // Материалы XX Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - Москва. - 2007. - С. 467.

16. Khudik K.A., Nitsinskaya L.E., Guzhova I.V., Ekimova I.V., Pastukhov Yu.F. Role of chaperones 70 kDa in pathogenesis of seizures with different etiology // Abstr. of the 11th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference "Stress and behavior". - St.-Petersburg. - 2008. - P. 59-60.

17. Пастухов Ю.Ф., Екимова И.В., Худик К.А., Гусельникова Е.А. Центральные механизмы сомногенных эффектов HSP70 // Тез. докладов VI Всероссийской конференции с международным участием - "Актуальные проблемы сомнологии". - Санкт-Петербург. - 2008. - С. 70.

18. Khudik K. The role of inferior colliculus in audiogenic seizures in Krushinskii-Molodkina rats // Abstr. of the 12th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference "Stress and behavior". - St.-Petersburg. - 2009. - P. 39.

Размещено на Allbest.ru