Диференціація генотипів сосни звичайної за поліморфізмом довжини інтронів генів дефензинів

В.А. Ковальова

Сосна звичайна, завдяки своїй здатності рости в різних лісорослинних умовах, займає значний ареал на євразійському континенті, що є наслідком високого поліморфізму цього виду, який виражається в утворенні форм, пристосованих до конкретної амплітуди коливань чинників довкілля. Інтенсивне лісокористування, глобальні кліматичні зміни, забруднення навколишнього середовища призвели до скорочення природних деревостанів Pinus sylvestris L., до зниження біотичного потенціалу популяцій, збіднення їх генофонду, втрати продуктивності та стійкості соснових лісів. В останні десятиріччя спостерігають ослаблення та всихання соснових лісів у Західному та Малому Поліссі та в інших регіонах Європи (Bigler et al., 2006; Siitonen, 2014; Andreieva et al., 2018). Дієвим підходом до підвищення біологічної стійкості лісів є селекція резистентних до стресів форм рослин, яка базується на широкому діапазоні їх природної мінливості за ступенем сприйнятливості до стресових чинників довкілля. Для генетичного супроводу селекційних програм дедалі частіше використовують молекулярні маркери на підстаі ДНК поліморфізму.

У лісовій генетиці традиційно використовують декілька систем молекулярних маркерів RFLP, AFLP, SSR, RAPD, SNP та інші (Dzialuk et al., 2014; Eveno et al., 2007; Lucic et al., 2011; Williams & Neale, 1992). Порівняно новим є метод генетичного маркування на підстаі поліморфізму довжини інтронів генів (intron length polymorphism - ILP), які в геномах представлені родинами, зокрема генів Д-тубуліну (Choi et al., 2004). Маркери ILP є унікальними, оскільки вони є геноспеци- фічними, ко-домінантними, гіперваріабельними, нейтральними, зручними та надійними. Поліморфізм можна виявити за допомогою ПЛР із праймерами, які розроблено на підстаі послідовностей екзонів, що фланкують цільовий інтрон. Ці маркери, незважаючи на те, що вони походять від послідовностей конкретних генів, показали вищий, за інші види маркерів, внутрішньовидовий поліморфізм у рослин. За допомогою методу ILP побудовано філогенетичне дерево для 9 видів хвойних рослин, але для дослідження внутрішньовидового поліморфізму сосни звичайної ці маркери досі не використовували (Chen et al., 2011).

Дефензини в геномах рослин представлені мульти- генними родинами. Ці захисні протеїни мають однотипну будову: один інтрон, який розташований у фіксованому локусі в межах двох екзонів. Клоновані нами кДНК генів дефензинів PsDefl (Pinus sylvestris дефензин 1), PsDef2, PsDef3 та PsDef4 (GenBank Acc.No EF455616.1, EF455617.1, JN980401.1 і KJ 601732.1, відповідно) є високогомологічними (Kovalyova et al., 2007, 2008; Kovaleva et al., 2009), і тому можна припустити, що гени дефензинів можна використати для генетичного маркування на підстаі поліморфізму довжини інтро- нів їх генів.

Метою дослідження є з'ясування інформативності маркерів на підстаі поліморфізму довжини інтронів генів дефензинів і перспективності їх використання для оцінки потенційної стійкості генотипів сосни звичайної до біоушкодження.

Матеріали й методи дослідження. Для проведення генетичних і фітопатологічних досліджень у сосновому деревостані, який розташований у кварталі 67 Соснівсь- кого лісництва ДП "Жовківське лісове господарство", заклали тимчасову пробну площу (30*60 м2) згідно з СОУ 02.02-37-476:2006. Тип лісу - свіжий дубовий субір. Деревостан двоярусний, перший ярус утворений сосною звичайною І-ІІ класу бонітету, у другому ярусі - дуб звичайний. Склад насадження 6С4Д. Підлісок відсутній. Ґрунт супіщаний. Санітарний стан дерев визначали згідно з "Санітарними правилами у лісах України", затвердженими наказом № 136 Міністерства аграрної політики та продовольства України від 21.03.2012 р. Зразки деревини (керни) відбирали віковим буравом Преслера.

Рис. 1. Електрофоретичний аналіз продуктів ампліфікації ДНК сосни звичайної зі специфічними до генів дефензинів прайме¬рами:

а) амлікони, отримані з використанням праймерів до ге¬нів PsDef1-4 (доріжки D1-D4); б) спектри ампліконів зі специ¬фічними до PsDef2 праймерами. Позначення: M - 100 bp+1 Kbp DNA markers (Thermo Fisher Scientific); 1-5 - різні екземпляри сосни звичайної; М, Р - мономорфні та поліморфний фрагмен¬ти, відповідно

Сумарну ДНК із рослинного матеріалу виділяли за допомогою броміду цетилтриамонію (Chang et. al., 1993). Якість та кількість ізольованої ДНК визначали електрофорезом у 1 % агарозному гелі у трис-боратній буферній системі та спектрофотометрично ("Biotech Photometer UV1101/1101T"). Зразки ДНК зберігали за - 70 °С до їхнього використання. Діагностику взірців деревини на присутність ДНК кореневої губки Heterobasi- dion annosum s.s. визначали за описаною раніше методикою (Yusypovych et al., 2012). Для проведення генетичного маркування дерев сосни за локусами генів де- фензинів здійснили підбір праймерів із використанням мережевого ресурсу Primer3-BLAST (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), послідовності яких наведено в таблиця.

Таблиця. Праймери, які використані для ампліфікації

ПЛР здійснювали за допомогою ампліфікатора Thermal Cycler TC020A (Labnet International Inc., США). Кожну ПЛР проводили у двох повторностях. Реакційна суміш містила 2,5 мМ MgCl2; 0,2 мМ дНТФ (Fermentas); по 0,2 мкМ обох праймерів, 100 нг ДНК та 1 U TaqPol ДНК-полімерази (Fermentas). Умови ПЛР: початкова денатурація 95 °С, 5 хв та 40 циклів: денатурація 95 °С, 30 с; віджиг 54 °С, 30 с; елонгація 72 °С, 2хв і після останнього циклу ще 7 хв елонгації за температури 72 °С. Продукти ПЛР розділяли в 6 % поліакрила- мідному гелі у 1xTBE буфері, рН 8,3 і забарвлювали 0,1 % нітратом срібла (Benbouza et al., 2006). Цифрові фотографіі аналізували з використанням програми GelProAnalyzer. Довжину ампліфікованих фрагментів визначали за допомогою маркерів Gene Ruler 1Kb and 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific).

У випадку незбігання профілів амліконів у паралельних зразках, проводили додаткову ампліфікацію і під час аналізу використовували тільки загальні смуги для двох послідовних ПЛР. на підстаі виявлених амплі- конів створили бінарну матрицю для проведення статистичного аналізу за допомогою пакету комп'ютерних програм GenAlEx 6.053, Statistica 10. Значення коефіцієнтів подібності Нея та Лі використовували для кластерного аналізу і побудови філогенетичних дерев методом UPGMA. Результати кластеризації оцінювали на підстаі 1000 бутстрепів. Рівень поліморфізму маркерів оцінювали за середнім значенням PIC (Polymorphism Information Content), яке розраховували, як описали Hongtrakul et al. (1997).

Результати дослідження та їх обговорення. В останні два десятиліття стрімко розвивається новий напрям у селекції рослин на стійкість до фітопатогенних організмів - це селекція із застосуванням молекулярних маркерів, найбільш ефективними з яких є ті, що базуються на структурних особливостях генів, які визначають цінну ознаку. Одними з селекційно-перспективних генів стійкості сосни звичайної можуть бути гени де- фензинів, продукти яких показали високу активність проти широкого кола фітопатогенів грибної і бактеріальної етіології (Kovaleva et al., 2009; Khairutdinov et al., 2017). Встановлено, що генетичний поліморфізм по локусам генів дефензинів у людини пов'язаний із індивідуальною стійкістю до захворювань (Vankeerberghen et al., 2005). Ми припустили, що подібна залежність може існувати і в сосни звичайної (рис. 1).

Рис. 3. Молекулярна діагностика ДНК кореневої губки в дере¬вині сосен із використанням видоспецифічних праймерів:

М - маркери 100 bp DNA LadderPlus (Thermo Fisher Scientific); К - позитивний контроль (архівна ДНК кореневої губки), П - ДНК із плодового тіла H. алшмит, знайденого на досліджуваній ді¬лянці. Нумерація доріжок відповідає номерам дерев на рис. 2. Стрілкою зазначено специфічний для H. апж«ит s.s. амплікон

Для дослідження поліморфізму генів дефензинів у сосни звичайної ми використали ILP маркери, які сконструйовані на підстаі нуклеотидних послідовностей екзонів генів PsDef1-4 (див. таблиця). Аналіз продуктів ампліфікації кожної пари праймерів із геномною ДНК сосни звичайної показав, що тільки одна пара праймерів, яка специфічна до дефензину 2 (IPL- PsDef2), утворює широкий спектр ампліфікованих продуктів, що свідчить про перспективність використання їх для дослідження поліморфізму генотипів сосни звичайної (рис. 1,а). Така поліморфність, очевидно, є результатом присутності в геномі сосни високогомологіч- них до дефензину 2 генів, про що свідчать результати аналізу бази даних UniGene транскриптів Pinus taeda (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene), в якій виявлено ідентичні до PsDef2 послідовності, які транскрибуються із різних локусів Pta.5572, Pta.5438, Pta.188 та Pta.432, і, ймовірно, мають інтрони різної довжини, подібно як у Medicago truncatula (Hanks et al., 2005).

Для того, щоб з'ясувати інформативність IPL-PsDef2 маркерів для дослідження генетичного поліморфізму ми проаналізували 196 дерев сосни звичайної і виявили 38 фрагментів у діапазоні від 218 до 1780 пар нуклеоти- дів (п.н.), серед яких 15 були мономорфними (рис. 1,б). Середнє значення PIC становило 0,287, що є достатньо високим і свідчить про високу внутрішньовидову дифе- ренціювальну здатність маркерів (Breviario et al., 2007). генотип сосна молекулярний інтрон

Для виявлення можливого зв'язку IPL поліморфізму за генами дефензинів зі стійкістю сосни до фітозахво- рювань ми провели генетичні дослідження в сосновому насадженні з візуальними ознаками поширення кореневої губки. Зокрема на пробній площі спостерігали зону активного всихання дерев ("вікно"), на пеньках - плодові тіла, за морфологічними ознаками характерні для кореневої губки, значна кількість дерев ІІІ-VI категорії санітарного стану. Ми вибрали 30 модельних дерев різного санітарного стану для їхнього генотипування за допомогою IPL-методу та молекулярної діагностики Heterobasidion annosum s.s. (рис. 2).

Рис. 2. Схема розміщення модельних дерев на ділянці поширення кореневої губки в сосновому деревостані:

¦ - всохла сосна; - сосни, у деревині яких виявлено ДНК кореневої губки; * - дерева, у яких не виявлено ДНК патогену; ? - пеньки; - лінія схилу; стрілка вказує на місце виявлення плодового тіла Н. апж«ит s.s.

Високоякісну ДНК використали у ПЛР зі специфічними до Heterobasidion annosum s.s. праймерами. Специфічний продукт ампліфікації довжиною 100 пар нук- леотидів визначили в пеньку, на якому знайшли плодове тіло кореневої губки, та в керні зі свіжого сухостою (дерево 16), що підтвердило причину його всихання (рис. 3). ДНК кореневої губки виявили також у деревах 11, 12, 13, 14, 17, 18 і 29, які знаходяться у зоні активного всихання (див. рис. 2). За результатами молекулярної діагностики дерева 1, 2, 3, 8, 9 і 10 також уражені цим патогеном, що свідчить про його поширення вогнища у східному напрямку.

ДНК кореневої губки не виявлено в кореневій шийці дерев 6, 15, 19, 27, 28, які ростуть на вершині пагорба. Можна припустити, що стійкими до кореневої губки є здорові дерева 4, 20, 22, 23, 24, 25 і 26, які ростуть у таких же лісорослинних умовах, що й уражені дерева.

Серед селекційних методів оцінки стійких до ураження кореневою губкою дерев найчастіше використовують екземпляри, які вижили в осередках поширення патогена. Такі дерева вважають імунними, а насіннєвий матеріал з них використовують для створення стійких до ураження кореневою губкою культур сосни звичайної. Для створення ефективних лісонасіннєвих плантацій та штучних хвойних деревостанів доцільно визначити генетичні маркери, за якими стійкі до кореневої губки рослини відрізняються від сприйнятливих. За даними Коршикова та Демковича, такими маркерами можуть бути окремі, характерні для стійких дерев, ізофер- ментні локуси (Korshikov & Demkovich, 2008). Для молекулярного маркування модельних дерев сосни ми використали IPL-метод на підстаі генів дефензинів, протеїнові продукти яких безпосередньо залучені до пригнічення росту міцелію фітопатогенних грибів. Продукти ампліфікації ДНК сосни із праймерами, які фланкують інтрон гена PsDef2, фракціонували у 6 % поліакрила- мідному гелі за неденатуруючих умов (рис. 4,а).

Дані електрофоретичного аналізу ампліконів кожного дерева були переведені в бінарну систему (1 - наявність ампліфікованого фрагменту, 0 - його відсутність) і використані для визначення коефіцієнтів подібності Нея і Лі для побудови матриці подібностей між генотипами. Отриману матрицю було використано під час кластерного аналізу методом UPGMA та побудові ден- дрограми (рис. 4,б).

Із дендрограми видно, що проаналізовані дерева диференціюються на два кластери із 100 % бутстреп підтримкою. До І кластеру увійшли переважно дерева І категорії санітарного стану. Дерева 20, 23, 24, 25, 26 перебувають на межі осередку ураження кореневою губкою і, ймовірно, вони локалізували поширення інфекції у західному напрямку. І хоча в кореневій шийці дерева 21 виявлено ДНК H. annosum, санітарний стан дерева свідчить про високу опірність його захисної системи до інвазії. Окрему гілку в цьому кластері утворюють дерева 6, 8, 14 і 15 із бутстреп підтримкою 63 %. Дерева 8 і 14, які ростуть у зоні очевидного поширення кореневої губки, є менш стійкими до цього патогенна, ніж інші представники цього кластеру, про що свідчить їхній санітарний стан (ІІ категорія) та присутність ДНК H. annosum у деревині.

Рис. 4. Аналіз поліморфізму довжини інтронів генів дефензинів у сосни звичайної:

а) електрофореграма продуктів ампліфікації геномної ДНК сосни звичайної зі специфічними до PsDef2 праймерами. Позначення: М - маркери 100 bp + 1kb DNA Lad- derPlus (Thermo Fisher Scientific). Зверху зазначено номери дерев; б) дендрограма, яку побудовано методом UPGMA на підстаі значень коефіцієнтів подібності Нея та Лі. У дужках вказано категорію санітарного стану дерева. Зірочкою позначено інфіковані кореневою губкою

Ймовірно, що дерева 6 і 15, які ростуть на вершині пагорба поза осередком інфекції, можуть бути сприйнятливими до кореневої губки. Виходячи із отриманих результатів, можна припустити, що стійкість до цього кореневого патогена контролюється групою генів, і дефензини є тільки одними з них.Кластер ІІ утворюють дерева ІІ-IV категорій санітарного стану, в деревині яких діагностовано кореневу губку. Не виявлено ДНК патогена в дереві 30, але його санітарний стан свідчить, що це дерево піддається впливу стресових чинників. До цього кластеру увійшло також здорове дерево 7 (І категорії санітарного стану), яке росте поза зоною очевидного поширення кореневої губки. На дендрограмі воно утворює гілку із сильно ослабленим деревом 9, що вказує на потенційну сприйнятливість цього генотипу до Н. annosum.

Аналіз ієрархічних кластерів методом К-середніх визначив значущість кожного з ампліконів для диференціації генотипів сосни на дві групи. Найбільш значущу різницю між кластерами (p<0,05) показали фрагменти довжиною 705, 670, 660, 605, 565, 555, 545, 465 та 455 п.н. Так, ам- плікони довжиною 705, 695, 660, 605 та 455 п.н. присутні в електрофоретичному спектрі тільки тих дерев, які належать кластеру І. Натомість продукти довжиною 755, 735, 670, 545, 465 є характерними для представників кластеру ІІ. Отже, зазначені вище амплікони можуть бути генетичними маркерами для оцінки потенційної стійкості сосни звичайної до кореневої губки.

Висновок. Кластерний аналіз даних генотипування дерев із використанням методу поліморфізму довжини інтронів генів дефензинів показав, що стійкі та сприйнятливі до патогенів генотипи сосни звичайної об'єднуються в окремі групи, що свідчить про адекватність такого підходу для оцінки потенційної стійкості дерев до біотичного стресу. Генетичне маркування за локусами генів дефензинів селекційного матеріалу сосни звичайної можна використати для розробки екологічно чистих технологій підвищення стійкості покращеного генетичного матеріалу сосни звичайної до біотичного стресу.

Перелік використаних джерел