Ультраструктура ЕР-тілець у статоцитах і клітинах дистальної зони розтягу кореневих апексів arabidopsisthaliana (l.) Heynh. Під дією Х-опромінення

Вступ. Рослини виступають головним компонентом автотрофної ланки біорегенеративних систем життєзабезпечення космонавтів [22], тому актуальними є дослідження впливу на рослини двох основних факторів космічного польоту - мікрогравітації та іонізуючої радіації. Біологічні ефекти впливу космічної радіації на ріст та розвиток рослин досліджуються як у космічному польоті, так і в наземних експериментах [5, 7]. Космічне випромінювання за рахунок високої енергії глибоко проникає у матерію. У залежності від зовнішньої та внутрішньої обшивки космічного корабля, а також обладнання, яке встановлено на борту, товщина захисного шару від радіаційних променів становить 1-30 см [8]. Згідно з даними НАСА (США) дози в кабіні космічного корабля, які впливають на живі організми, коливаються в діапазоні від 5 до 12 мкГр за годину [9]. Відповідь різних видів рослин на іонізуюче випромінювання залежить від його природи, дози та тривалості дії, а також видової належності рослини та її фізіологічного стану [3]. Серед видів рослин, які використовувались у космічних і наземних експериментах, найбільш стійкими до радіаційного випромінювання вважаються представники родини Brassicaceae, до якої належить Arabidopsisthaliana[4, 7].

Види Brassicaceaeхарактеризуються наявністю в клітинах похідних гранулярного ендоплазматичного ретикулуму (ГЕР) - ЕР-тілець, які вперше були описані в клітинах коренів Raphanussativus[2] і пізніше названі "бонет- ками" на честь науковця, який їх відкрив. Надалі більш детально ЕР-тільця, які звичайно мали розміри менше 1 мкм та були оточені рибосомами, описані у клітинах коренів Arabis alpina, Brassica oleracea, Capparis spinosa та Cleome spinosa,їх називали "таємничими органела- ми", тому що їхня функція залишалася невідомою. На сьогодні відомо, що ЕР-тільця в клітинах A. thaliana[6] вибірково накопичують фермент Я-глюкозидазу (PYK 10) з сигналом утримання в компартментах Ер [14]. Я-глюкозидаза (глюкозидглюкогідролаза, КФ 3.2.1.21) належить до класу глікозилгідролаз та гідролізує арил- та алкіл- Я-D-глюкозиди, а також такі глюкозиди, як целобіоза та інші Я-зв'язані олігосахариди [11]. Показано, що ЕР-тільця в клітинах A. thalianaхарактеризуються високою лабільністю і чутливістю до таких зовнішніх впливів, як симульована мікрогравітація (кліностатування) [20], механічне пошкодження поверхневих тканин рослини [15, 18], дія гормонів [15, 16], колонізація коренів рослини ендофітними грибами та бактеріями [17, 21]. Внаслідок дії вказаних чинників кількість та розмір ЕР-тілець у клітинах збільшувалися порівняно з контролем.

У дослідженнях структурно-функціонального стану клітин кореня в умовах реальної мікрогравітації в космічному польоті та кліностатування основна увага приділялася клітинам кореневого чохлика як гравірецепторному апарату кореня [24]. Встановлено, що клітини дистальної зони розтягу (ДЗР), які є неспеціалізованими до сприйняття гравітації, реагують на зміни сили тяжіння змінами ультраструктури і метаболізму [12]. Також показано чутливість клітин ДЗР до зовнішніх стимулів, таких як механічний вплив, дія іонів металів, кисню і ауксину [10, 13]. Оскільки раніше нами показано чутливість ЕР-тілець до кліностатування [20], метою даної роботи було дослідити ультраструктуру та топографію ГЕР і ЕР-тілець у стато- цитах і клітинах ДЗР кореневих апексів проростків thalianaв контролі та при Х-опроміненні.

Матеріали і методи. Проростки Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., екотипColumbia (СоІ-0) вирощувализнасінняустерильнихумовах. Стерилізаціюнасінняздійснювали 70 % розчинометиловогоспиртута 12 % розчиномгіпохлоритунатріюзп'ятиразовимпромиваннямстерильноюдистильованоюводою. Перед посівом на живильне середовище Мурасіге та Скуга насіння стратифікували при температурі +4 ⁰С протягом 3 діб. Після чого висівали у чашки Петрі діаметром 120 мм по 100-120 насінин у кожну. Проростки росли за освітлення 93 мкмоль-м^-2-с^-1 із фотоперіодом 16/8 год (світло/темрява) при температурі 22-24 ⁰С та вологості 67± 1 % протягом трьох та 13-ти діб з моменту проростання насіння. Тридобові проростки, що росли в окремих чашках Петрі, опромінювали рентгенівськими променями на приладі РУМ-17 (потужність дози 0,43 сГр/с) у дозах 0,5 Гр, 1 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр, 10 Гр та 12 Гр. У експериментах досліджували проростки через 2 год та 10 діб після Х-опромінення. Для контролю використовували тридобові та 13-тидобові проростки, які не були опромінені.

Апекси коренів довжиною 3-10 мм фіксували в 2,5 % розчині глютарового альдегіду на 0,1 М кокодилатному буфері (pH=7,2) при кімнатній температурі протягом 3 год, двічі промивали тим самим буфером для видалення надлишку фіксатора. Постфіксацію проводили 1 % розчином OsO4 на кокодилатному буфері (pH=7,2) при температурі 4 ⁰С протягом 4 год. Після цього апекси коренів промивали дистильованою водою та зневоднювали у серії спиртів висхідної концентрації та ацетоні, заливали в суміш смол епон-аралдит за стандартним методом [23]. Тонкі поздовжні зрізи кореневих апексів завтовшки 50-70 нм отримували на ультрамікротомі MT-XL (RMR Instruments, США), поміщали на бленди з підкладкою із формвара та контрастували ураніл ацетатом і цитратом свинцю [19]. Зрізи досліджували на трансмісійному електронному мікроскопі JEM-1230 EX (Jeol, Японія) та фотографували на фототехнічну плівку Agfa (Agfa, Бельгія). Отримані негативи мікрофотографій зі збільшенням 3000-25000 сканували за допомогою програми HP Precisionscan Pro 3.1 (HewlettPackard, США). Отримані цифрові зображення аналізували за допомогою програмногозабезпечення UTHSCSa ImageTool v. 3.0.

Всі дослідження проводили не менше ніж у трьох біологічних і трьох аналітичних повторах. Обробку даних було проведено за допомогою програми Excel пакету MicrosoftOffice 2010. Всі отримані числові значення тестували на нормальність розподілу значень у вибірці. Визначення достовірності різниці отриманих даних здійснювали за критерієм Стьюдента (T-test) (р<5 %) для незалежних вибірок з нормальним розподілом і критерієм Манна-Уітні (U-test) (р<5 %) для незалежних вибірок з розподілом, що відрізнявся від нормального [1].

Размещено на http://www.allbest.ru/

Результати та обговорення. У контролі в апексах коренів три- та 13-тидобових проростків A. thaliana морфологічно виділялися кореневий чохлик, зона ме- ристеми, ДЗР, центральна зона розтягу (ЦЗР) (рис. 1) та зона кореневих волосків.

Диференціювання меристематичних клітин відбувалося в двох протилежних напрямах: до апікальної частини кореня (кореневого чохлика) та до його базальної частини (ростових зон власне кореня). Колумела кореневого чохлика зазвичай складалася із шести рядів клітин: перші два ряди від центра спокою в апікальному напрямі - меристематичні клітини, третій ряд - стато- цити, які диференціюються, четвертий ряд - зрілі статоцити, п'ятий та шостий ряди - секреторні клітини. Зона розтягу власне кореня до центрального циліндра складалася з трьох шарів клітин - епідермісу, одного шару кори та ендодерми. У тридобових проростків ДЗР починалася приблизно на відстані 145,18±1,66 мкм від верхівки кореня. У шарі кори ДЗР до центральної зони розтягу налічувалося чотири клітини. Кореневі апекси 13-тидобових проростків контролю морфологічно були подібні до таких у тридобових. Звичайно з ростом проростків збільшувалася довжина кореневих апексів, при цьому ДЗР починалася приблизно на відстані 214,26±4,38 мкм від верхівки кореня. У кореневих апексах тридобових проростків статоцити мали середню довжину 13,98±5,06 мкмтасередню ширину 34,69±8,43 мкм,у13-тидобовихпроростків-

19,18±4,87 мкм і 43,05±6,74 мкм, відповідно. Середня довжина та середня ширина клітин ДЗР була такою: у тридобових проростків-13,53±1,05 мкм і 14,02±0,98 мкму13-тидобовихпроростків-16,98±2,43 мкм і 17,56±2,57 мкм, відповідно. опромінення ендоплазматичний ретикулум thaliana

Морфологія апексів коренів проростків А. thalianaчерез 2 год та через 10 діб після Х-опромінення в дозах 0,5 Гр, 1 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр, 10 Гр та 12 Гр достовірно не відрізнялася від такої контрольних проростків. Порушень у диференціюванні клітин кореневих апексів не відмічали. У тридобових проростків ДЗР починалася приблизно на відстані 143,78±3,16 мкм від верхівки кореня, у 13-тидобових - на відстані 214,32±5,17 мкм. Через 2 год та через 10 діб після Х-опромінення достовірної різниці в розмірах статоцитів та клітин ДЗР не спостерігали. Середні розміри статоцитів у кореневих апексах тридобових проростків були такими: довжина - 14,27±4,43 мкм, ширина -34,17±8,85 мкм, у

13-тидобових проростків - 19,54±4,62 мкм і 42,68 ±6,12 мкм, відповідно. Клітини ДЗР кореневих апексів тридобових проростків мали такі середні розміри: довжина - 13,97±0,72 мкм, ширина - 14,06±1,04 мкм, 13-тидобових проростків -16,95±2,47 ,мкм і 17,52±2,61 мкм відповідно.

Размещено на http://www.allbest.ru/

У три- та 13-тидобових проростків A. thalianaв контролі статоцити кореневого чохлика мали видовжену форму та характеризувалися полярністю: ядро, яке мало лопатоподібну форму, рідше округлу або овальну, знаходилося в проксимальній частині клітини, а амілопласти із щільно упакованими крохмальними зернами - в дистальній. Кількість крохмальних зерен округлої, овальної або неправильної форми варіювала в амілопластаху залежності від їхнього розміру. Гіалоплазма відрізнялася високою електронною щільністю за рахунок великої кількості вільних рибосом, місцями спостерігалися невеликі електронно прозорі ділянки. Дрібні вакуолі переважно округлої форми з електронно прозорим або гранулярним вмістом середньої електронної щільності у незначній кількості переважно локалізувалися біля ядра. Мітохондрії мали здебільшого овальну, округлу або видовжену форму, розвинену систему крист та електронно щільний матрикс, у якому спостерігалися електронно прозорі ділянки. Поодинокі диктіосоми складалися із 4-5 цистерн. Мітохондрії та диктіосоми розміщувалися відносно рівномірно по всій цитоплазмі. Агранулярний ЕР (АЕР) був слабко розвинений та представлений на зрізах статоцитів поодинокими профілями. Невеликі канали ГЕР головним чином розміщувались вздовж клітинної стінки та біля амілопластів- статолітів, найбільші його скупчення містилися в дистальній та проксимальній частинах статоцитів. Вміст ка- нальців та цистерн ГЕР був заповнений електронно щільною тонкофібрилярною речовиною. Візуально нараховували 1-3 профілей ГЕР на зріз статоцита кореневого апекса тридобових проростків та 3-5 профілей ГЕР на зріз статоцита 13-тидобових проростків. У тридобових проростків у зоні профілей ГЕР розміщувалися ЕР-тільця, округлі за формою, з електронно щільним тонкофібрилярним вмістом, мембрана яких була вкрита рибосомами (рис. 2). Кількість ЕР-тілець на зріз статоцита була 1-2 у тридобових проростків, при цьому середні розміри органел становили 0,0098±0,007 мкм². У 13-ти добових проростків на зрізах статоцитів ЕР- тілець не спостерігали.

У контролі перші від меристеми дві клітини ДЗР у три- та 13-тидобових проростків A. thalianaмістили по одному ядру округлої форми, яке було розташоване в центрі клітини, у третій та четвертій клітинах ядро набувало лопатоподібної форми та поступово зміщувалося до периферії клітини. Діаметр ядерця становив більше половини ядра. Іноді в ядрі спостерігалася "вакуоль". Щільність гіалоплазми знижувалася за рахунок зменшення кількості вільних рибосом. Нечисленні та гетерогенні за формою пластиди розташовувалися навколо ядра, деякі з них містили крохмальні зерна. Апарат Гольджі (АГ) перебував в активному стані, про що свідчило продукування диктіосомами численних везикул. Диктіосоми характеризувалися полярністю. Дрібні вакуолі, похідні АГ та ЕР, поступово збільшувалися в об'ємі та зливалися, утворюючи центральну вакуоль. Мітохондрії варіювали за формою та розмірами, а також за кількістю та топографією крист. АЕР на зрізах клітин ДЗР був представлений різними за формою та розмірами розширеними цистернами і везикулами. Значно розгалужені та видовжені цистерни ГЕР простягалися вздовж клітинної стінки та тонопласта. Вміст цистерн та каналів ГЕР був заповнений електронно щільною тонкофібрилярною речовиною. Між клітинною стінкою та тонопластом також знаходилися ЕР-тільця (рис. 2). Візуально на зріз клітини ДЗР тридобових проростків спостерігали 9-12 профілей ГЕР, на зріз клітини ДЗР 13-тидобових проростків 13-19 профілей ГЕР.

ЕР-тільця розміщувалися в безпосередній близькості біля профілей гЕр. На поверхні ЕР-тілець звичайно були наявні рибосоми, їх вміст був заповнений електронно щільною тонкофібрилярною речовиною. ЕР-тільця на зрізах клітин ДЗР тридобових та 13-тидобових проростків мали округлу та овальну форму. На зріз клітини ДЗР тридобових проростків спостерігали від 8 до 11 ЕР-тілець, розміри яких становили в середньому від 0,011±0,002 мкм² до 0,021±0,005 мкм². На зрізах клітин ДЗР 13-тидобових проростків спостерігали від 15 до 20 ЕР-тілець середніми розмірами від 0,009±0,001 мкм² до 0,028±0,007 мкм².

Через 2 год після Х-опромінення в дозах 0,5 Гр, 1 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр, 10 Гр та 12 Гр ультраструктура статоцитів кореневого чохлика тридобових проростків A. thalianaу загальних рисах залишалася такою, як у контролі, проте нами виявлено і певні відмінності, особливо в кількості профілей ГЕР та кількості і розмірах ЕР-тілець. Невеликі цистерни та канали ГЕР розміщувались у дистальній та проксимальній частинах статоцита вздовж клітинної стінки та амілопластів- статолітів. Візуально спостерігали збільшення кількості профілей ГЕР на зріз статоцита через 2 год після Х-опромінення в різних дозах щодо неопроміненого контролю в середньому в два рази (табл. 1), тобто за різних доз Х-опромінення збільшення профілей ГЕР на зріз статоцита було майже однаковим.

Таблиця1. Кількість профілей гранулярного ендоплазматичного ретикулума на зріз статоцита кореневого чохлика A. thalianaв контролі та при Х-опроміненні в різних дозах, шт

M±m; n=95; Р=0,05; t-критерій

Примітка: * - позначено статистично достовірні відмінності між відповідними значеннями.

Таблиця2. Параметри ЕР-тілець на зріз статоцита кореневого чохлика A. thalianaв контролі та при Х-опроміненні в різних дозах

M±m; n=95; Р=0,05; t-критерій

Примітка: * - позначено статистично достовірні відмінності між відповідними значеннями.

Поряд з профілями ГЕР спостерігали ЕР-тільця. Як і в контролі, на мембранах ЕР-тілець розміщувалися рибосоми, а їх вміст був заповнений електронно щільною тонкофібрилярною речовиною. Характеристики ЕР-тілець у статоцитах кореневих апексів тридобових проростків через 2 год після Х-опромінення в різних дозах були однаковими. ЕР-тільця в кількості 3-4 на зріз

статоцита були округлої та овальної форми. Середні розміри ЕР-тілець на зріз статоцита не відрізнялися при різних дозах Х-опромінення та становили в середньому 0,0099±0,006 мкм². Площа ЕР-тілець на зріз статоцита через 2 год після Х-опромінення в різних дозах щодо контролю зростала, за рахунок збільшення їхньої кількості (табл. 2).

Через 10 діб після Х-опромінення тридобових проростків A. thalianaв дозах 0,5 Гр, 1 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр, 10 Гр та 12 Гр ультраструктура статоцитів кореневого чохлика у загальних рисах була подібною до такої у тридобових проростків через 2 год після Х-опромінення в таких самих дозах. Так само було виявлено певні відмінності щодо контролю в кількості профілей ГЕР та кількості і розмірах ЕР-тілець. Візуально спостерігали збільшення кількості профілей ГЕР на зріз клітини від 4-5 у контролі до 8-13 через 10 діб після Х-опромінення. Середня кількість профілей ГЕР на зріз статоцита за різних доз Х-опромінення була подібною (табл. 1). Профілі ГЕР були більш довшими та ширшими порівняно з контролем. Поряд із зростанням кількості профілей ГЕР відмічали появу значної кількості ЕР-тілець (табл. 2), здебільшого округлої, рідше овальної форми. Середні розміри ЕР-тілець на зрізі статоцита становили в середньому 0,013±0,04 мкм² та достовірно не відрізнялися при різних дозах Х-опромінення.

Через 2 год після Х-опромінення в дозах 0,5 Гр, 1 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр, 10 Гр та 12 Гр ультраструктура клітин ДЗР кореневих апексів тридобових проростків A. thalianaбула близько подібною до контролю. Поряд з цим спостерігали значне збільшення кількості профілей ГЕР та площі ЕР-тілець на зріз клітини ДЗР порівняно з контролем, які не залежали від дози Х-опромінення (табл. 3, 4). ГЕР на зрізах клітин ДЗР був представлений довгими каналами, які мали здатність до галуження. Вміст ЕР-тілець та каналів ГЕР, як і в контролі, був заповнений електронно щільною тонкофі- брилярною речовиною. На зовнішній поверхні мембран ГЕР та ЕР-тілець щільно розміщувалися рибосоми (рис. 2). На зрізах клітин ДЗР ЕР-тільця мали округлу, овальну та видовжену форму, розміри яких варіювали в середньому від 0,008±0,002 мкм² до 0,032±0,006 мкм².

Таблиця3. Кількість профілей гранулярного ендоплазматичного ретикулума на зріз клітини дистальної зони розтягу кореневого апекса A. thalianaв контролі та при Х-опроміненні, шт