Современные методы геномного анализа в исследованиях генетики количе-ственных признаков у растений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Современные методы геномного анализа в исследованиях генетики количественных признаков у растений

Е.К. Потокина, Ю.В. Чесноков

На основе данных литературы рассматриваются современные принципы идентификации и картирования локусов количественных признаков (QTL) у растений. Дано краткое описание наиболее распространенных классов генетических молекулярных маркеров на уровне ДНК и принципов их использования для построения генетических карт. Изложена стратегия картирования QTL и клонирования генов, детерминирующих количественные хозяйственно ценные признаки у растений. Обсуждаются перспективы дальнейшего применения молекулярно-генетических методов исследования в практической генетике и селекции растений.

Modern methods of genomic analysis in investigations of quantitative determinants in plants (review)

E.K. Potokina, Yu.V. Chesnokov

S u m m a r y

On the basis of literature data the authors consider the modern principles of identification and mapping of loci of quantitative determinants (QTL) in plants. The short description of the most prevalence classes of genetic markers on the LNA level and their usage for genetic mapping were presented. The strategy of QTL mapping and gene cloning which are determined the quantitative economically valuable determinants in plants were considered. The ways of further usage of molecular-genetic methods in practice genetics and plants breeding were discussed. картирование генетический молекулярный маркер

Источником генетического разнообразия растений, как и других живых существ любого уровня организации, является полиморфизм нуклеотидной последовательности молекул ДНК, который уникален для любого индивидуума. Нуклеотидные вставки и делеции, а также точечные мутации определяют разнообразие аллелей большинства генов. К настоящему времени завершены несколько международных проектов по полному секвенированию геномов отдельных видов растений, в частности Arabidopsis thaliana, Oryza sativa (ssp. japonica и ssp. indica) (1-3). Поскольку эти исследования проводили с использованием нескольких генотипов для каждого секвенируемого вида, появилась возможность приблизительно оценить частоту нуклеотидных замен в пределах вида. При сравнении геномных последовательностей у двух экотипов Arabidopsis (Landsberg и Columbia) выявлено 56000 нуклеотидных замен (single nucleotide polymorphism, SNP) в последовательности ДНК (Cereon arabidopsis SNP collection; http//www.arabidopsis.org/cereon/). В результате анализа элитного генофонда кукурузы в США обнаружена примерно одна нуклеотидная замена на 48 пар нуклеотидов (п.н.) в некодирующих участках генома и на 131 п.н. в кодирующих локусах (4). В сложных геномах растений, таких, например, как кукуруза, 150 млн нуклеотидных сайтов являются полиморфными (5).

Накопленные факты позволяют судить не только об амплитуде изменчивости, выявляемой на уровне ДНК, но и об общих закономерностях ее проявления. Так, самоопыляющиеся виды характеризуются низкой степенью нуклеотидного полиморфизма (6-9). У видов культурных растений уровень полиморфизма ДНК значительно ниже, чем у их дикорастущих сородичей, так как при отборе определенных фенотипов культивируемые формы как бы проходят через «бутылочное горло» селекции (bottleneck-effect), что существенно снижает степень их изменчивости (10-11). Очевидно, что анализ и классификация огромного резерва изменчивости, выявляемого на уровне ДНК и определяющего генетическое разнообразие культивируемых видов растений, является исключительно актуальным как для прикладной генетики, так и для селекции, так как часть этих нуклеотидных изменений в итоге определяет фенотипическую изменчивость.

Г е н о м и к а и с т р а т е г и я м о л е к у л я р н о г о м а р к и р о в а н и я. Анализ резерва изменчивости, выявляемого на уровне ДНК в масштабе целого генома, начался в 1986 году после выявления полной нуклеотидной последовательности ДНК человека. В дальнейшем были секвенированы геномы дрожжей, дрозофилы, мыши и модельного объекта растений Arabidopsis thaliana. В результате успешного завершения этих исследовательских проектов сформировалась новая научная дисциплина -- геномика, призванная с помощью новейших технологий изучать геном живых организмов как единый целостный объект, опираясь на информацию о нуклеотидной последовательности всей геномной ДНК. Предполагалось, в частности, что успех геномики растений, заключавшийся в расшифровке всей последовательности ДНК у Arabidopsis, привнесет революционные изменения в биотехнологию и селекцию растений. На практике выяснилось, что огромные размеры растительного генома (десятки миллиардов пар нуклеотидов), экстраординарное количество повторяющихся последовательностей и аллополиплоидия (присутствие в ядре нескольких родственных, но не идентичных геномов) реально позволяют осуществить полное секвенирование геномов только нескольких «модельных» видов растений, например Arabidopsis (125 тыс. п.н.) и риса (430 тыс. п.н.). Геномы других видов растений, вероятнее всего, придется анализировать с помощью сравнительной геномики (12) или на основе альтернативной технологии молекулярного маркирования. Суть последней состоит в следующем: если технически не представляется возможным полностью просеквенировать геном любого изучаемого организма, то можно приблизительно охарактеризовать генотипическую изменчивость индивидуумов на молекулярном уровне. С этой целью в последние десятилетия применяется стратегия молекулярных маркеров, которые своим присутствием обозначают (маркируют) полиморфизм в структуре макромолекул белков или ДНК. Первые работы в этой области были проведены с использованием изоферментов и запасных белков семян (13, 14). В последние десятилетия основное внимание генетиков было направлено на выявление полиморфизма макромолекул ДНК как непосредственного носителя наследственной информации.

Для оценки полиморфизма последовательности ДНК применяют разнообразные технические способы, и вопрос о различиях между молекулярными маркерами сводится, преимущественно, к различиям используемых технологий. Кратко остановимся на нескольких наиболее распространенных классах генетических молекулярных маркеров на уровне ДНК.

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (restriction fragment length polymorphism, RFLP). Рестрикционные ферменты (эндонуклеазы) широко распространены среди прокариотов; их естественная функция заключается в разрушении инородных молекул ДНК посредством распознавания и разрезания специфических фрагментов нуклеотидной последовательности (длина рестрикционного сайта 4-6 п.н.) Каждый фермент имеет свой определенный сайт узнавания. Бактерии защищают собственную ДНК от воздействия эндонуклеаз посредством метилирования таких сайтов узнавания. Большое число разнообразных рестрикционных ферментов в настоящее время коммерчески доступно для использования при проведении лабораторного анализа. Разрезание молекулы ДНК рестрикционным ферментом позволяет получить набор ДНК-фрагментов различной, но строго определенной длины. Любые точечные мутации в сайте рестрикции, также как вставки или делеции, приводят к изменению длины рестрикционных фрагментов и фиксируются по изменению спектра последних при электрофорезе в ПААГ, что позволяет визуализировать ДНК-полиморфизм различных генотипов.

В связи с использованием рестрикционных фрагментов уместно упомянуть о создании библиотек фрагментов геномной и кодирующей ДНК. Фрагменты геномной ДНК, полученные в результате рестрикции ДНК изучаемого объекта эндонуклеазами, могут быть сохранены и размножены для дальнейшего изучения в биологических конструкциях, получивших название векторов. Например, с помощью существующих лабораторных методов клонирования нуклеиновых кислот фрагмент изучаемой ДНК может быть встроен в кольцевую цепь ДНК плазмиды бактериальной клетки. Далее быстрый рост бактериальной культуры обеспечит увеличение числа копий встроенных ДНК-фрагментов в тысячи раз в течение 1 сут. Использование бактериальных плазмид в качестве векторов позволяет размножать фрагменты ДНК длиной от 0,5 до 2 тыс. п.н. Другие типы векторов различаются по максимальным размерам встраиваемых фрагментов: космиды (cosmids, 40-50 тыс. п.н.), BACs (Bacterial Artificial Chromosome, несколько сотен тысяч пар нуклеотидов), YACs (Yeast Artificial Chromosomes, более 1 млн п.н.).

Коллекцию фрагментов геномной ДНК, размноженных с помощью специального вектора, называют геномной библиотекой. В принципе такая библиотека должна состоять из фрагментов всей ДНК, имеющейся в изучаемом объеме, включая кодирующие последовательности и «молчащие» (нетранскрибируемые) участки ДНК. Библиотеки, содержащие только кодирующие ДНК-последовательности (кДНК), создаются на основе выделенных из определенной ткани организма молекул информационной РНК (иРНК), которые ввиду нестабильности переводят в более устойчивую форму кДНК посредством обратной транскрипции. Последняя представляет собой синтез цепи ДНК на основе РНК-матрицы с помощью особого фермента вирусов -- обратной транскриптазы. Поскольку кДНК-библиотека создается на основе иРНК, реально выделенной из ткани изучаемого объекта, то содержит только фрагменты генов, функционирующих (экспрессируемых) в этой ткани и/или на определенной стадии развития организма.

Случайно амплифицированные полиморфные фрагменты ДНК (random amplified polymorphic DNAs, RAPDs). Использование полимеразной цепной реакции (предложена в 1985 году K. Mullis, получившим в 1993 году за это открытие Нобелевскую премию по химии) позволяет амплифицировать и проанализировать полиморфизм нуклеотидной последовательности любого представляющего интерес участка генома. Две группы ученых независимо друг от друга пришли к заключению, что воспроизводимые и наследуемые фрагменты ДНК могут быть амплифицированы с использованием одного короткого (обычно 10 нуклеотидов) праймера произвольного сиквенса (15, 16). Продукты амплификации разделяются в агарозном геле в соответствии с размером амплифицированных фрагментов, образуя специфический спектр. Полиморфизм фрагментов ДНК, амплифицированных неспецифическими праймерами, может быть обусловлен нуклеотидной заменой в цепи ДНК в участке «посадки» праймера, а также вставками или делециями внутри амплифицируемого участка полинуклеотидной цепи. Используя один и тот же праймер для анализа ДНК разных биологических видов, можно получить уникальный для каждого вида спектр ДНК-фрагментов, который практически всегда почти идентичен у всех особей одного вида, за исключением нескольких фрагментов, присутствующих у одного индивидуума и отсутствующих у другого. Показано, что такой полиморфизм наследуется и может быть использован как новый класс генетических молекулярных маркеров. Установлено также, что RAPD-маркеры можно с успехом использовать для построения генетических карт (17, 18).

CAPS-маркеры (cleavage amplified polymorphic segments). Одиночные нуклеотидные замены (SNPs) в цепи нуклеиновых кислот являются наиболее распространенной формой полиморфизма геномной ДНК (19). Прямым способом выявления точечных мутаций в цепи ДНК служит секвенирование определенного участка генома у некоторого числа индивидуумов. При этом необходимое условие -- это создание соответствующих праймеров на базе уже известных последовательностей прилежащих участков ДНК, информацию о которых можно получить из доступной базы данных интернета (например, GenBank Database; http://www.psc.edu/general/software/packages/genbank/genbank.html). С помощью праймеров амплифицируется фрагмент ДНК длиной обычно 400-700 п.н. Продукт ПЦР-реакции секвенируется для некоторой совокупности индивидуумов; таким образом выявляются участки цепи ДНК, где происходят нуклеотидные замены. Однако прочтение последовательности ДНК требует специального дорогостоящего оборудования и реактивов, поэтому для рутинного анализа большого числа проб обычно не используется. CAPS-маркеры позволяют отчасти решить эту техническую проблему, так как сочетают амплификацию изучаемого фрагмента ДНК и последующую обработку полученного ПЦР-продукта рестрикционным ферментом, который имеет в ДНК-фрагменте соответствующий сайт рестрикции, совпадающий с локусом нуклеотидных замен. Любая замена нуклеотида в участке рестрикции будет зафиксирована, так как этот фрагмент ДНК уже не может быть «разрезан» у индивидуумов с модифицированным рестрикционным сайтом.

Полиморфизм длин избирательно амплифицированных рестрикционных фрагментов (amplified fragments length polymorphism, AFLPs). Принцип метода заключается в следующем: исследуемую цепочку ДНК разрезают рестрикционными ферментами, затем короткие олигонуклеотидные фрагменты (адаптеры) присоединяют к концам рестрикционных фрагментов и проводят избирательную амплификацию последних с помощью праймеров, комплементарных к адапторам (20). Праймеры помимо последовательности, комплементарной к адапторной цепи, обычно несут на своем 3-конце один-три дополнительных селективных нуклеотида, что позволяет проводить избирательную амплификацию фрагментов, полностью комплементарных к последовательности праймера. При анализе сложного генома растительных организмов обычно применяют два цикла амплификации: в первом цикле (преамплификация) праймеры не содержат селективных нуклеотидов; во втором цикле продукт преамплификации используют в качестве матрицы для селективных праймеров. Продукты амплификации разделяют электрофорезом в ПААГ. Один из праймеров обычно метят радиоактивной или флюоресцирующей меткой, что повышает точность анализа.

Минисателлиты (variable number of tandem repeats, VNTR) и микросателлиты (simple sequence repeats, SSRs). В 1985 году впервые были открыты короткие повторы нуклеотидных пар (от 9 до 24 п.н.) в определенных участках генома человека, позднее названные минисателлитами (minisattelite repeats). В отличие, например, от маркеров RFLP, идентифицирующих нуклеотидные замены, полиморфизм минисателлитных маркеров основан на вставках или делециях в цепи ДНК. Этот класс молекулярных маркеров позволял идентифицировать геном отдельного индивидуума с беспрецедентной точностью. На основе использования минисателлитов была предложена стратегия ДНК-фингерпринтинга (DNA-fingerprinting), которая получила широкое применение в криминалистике, идентификации клеточных клонов и популяционной генетике (21). В дальнейшем методы выявления ДНК-полиморфизма совершенствовались, появлялись новые классы маркеров, однако термин «ДНК-фингерпринтинг» закрепился в научной литературе, хотя в настоящее время под ним могут подразумеваться и молекулярные маркеры, не являющиеся эффективными для идентификации отдельных особей (22).

Микросателлиты представляют собой тандемно повторяющиеся последовательности ДНК, но более короткие, чем минисателлиты: двух-, трех-, четырехнуклеотидные. Число таких повторов настолько вариабельно, что позволяет выявлять изменчивость последовательности ДНК у таких облигатных самоопылителей, как, например, соя, в то время как RAPD-маркерами такой полиморфизм выявить не удается (23). Столь высокий полиморфизм длины микросателлитных повторов обусловливают неполная репликация или неравный кроссинговер (24).

Использование молекулярных маркеров позволяет фиксировать между индивидуумами многочисленные генетические различия, которые не проявляются в фенотипе. В этой связи целый ряд ДНК-маркеров из перечисленных выше широко применяют для построения генетических карт у растений различных видов. Ранее возможности по картированию генов зависели исключительно от синтетических популяций, насыщенных морфологическими маркерами, которые обычно представляют собой макромутации (например короткие крылья или красная окраска глаз у дрозофилы) и в естественных популяциях встречаются редко. Полиморфизм, обнаруживаемый на уровне ДНК, предоставляет практически неограниченное число ДНК-маркеров, которые могут быть проанализированы в любой картируемой популяции.

П о с т р о е н и е г е н е т и ч е с к и х к а р т н а о с н о в е м о л е к у л я р н ы х м а р к е р о в. Первая генетическая карта, основанная на полиморфизме молекулярных RFLP-маркеров, была сконструирована в 1980 году; ее использовали для локализации генов, кодирующих преимущественно качественные признаки (как и карты, полученные с помощью методов классической генетики) (25). В дальнейшем генетические карты на базе молекулярных маркеров стали широко применять и для анализа изменчивости фенотипических количественных признаков (26). Генетические карты конструируются на основе анализа частоты рекомбинации аллелей молекулярных маркеров в потомстве от скрещивания двух родительских генотипов, между которыми выявлен полиморфизм нуклеотидной последовательности ДНК. Маркеры, которые маркируют полиморфные генетические локусы, могут располагаться на разных хромосомах или в разных позициях на одной и той же хромосоме (в непосредственной близости друг от друга или на разных ее концах). От взаимного расположения двух маркеров относительно друг друга зависит вероятность рекомбинации между ними в процессе кроссинговера, которая прямо пропорциональна дистанции между ними.

На рисунке 1 представлена схема картирования генетического локуса на примере гена Cxp 1 в расщепляющейся популяции от скрещивания двух элитных североамериканских сортов ячменя -- Steptoe (высокобелковый сорт, используемый в пищевой промышленности) и Morex (один из наиболее востребованных в пивоварении). Ген Cxp1 кодирует протеолитический фермент карбоксипептидазу, имеющий важное значение в технологии пивоварения (27). Этот фермент расщепляет запасные белки в прорастающем семени ячменя, то есть обусловливает формирование солода.

8

Рис. 1. Схема построения генетической карты с использованием полиморфизма молекулярных маркеров на примере 3Н-хромосомы ячменя: а -- полиморфизм нуклеотидной последовательности гена

Cxp1, выявленный с помощью CAPS-маркера у растений 19 (из 150) линий двойных гаплоидов, полученных от скрещивания сортов Steptoe (аллель А) и Morex (аллель В); б -- расщепление аллелей 32 маркеров у тех же линий (цит. по 28); в -- расположение молекулярных маркеров с помощью компьютерной программы MAPMAKER V. 2.0 в наиболее вероятном линейном порядке (относительно друг друга) на расстоянии, пропорциональном наблюдаемой частоте рекомбинации между ними. картирование генетический молекулярный маркер

На основе гибридов F₁ от скрещивания сортов Steptoe и Morex биотехнологическими методами in vitro было создано 150 линий двойных гаплоидов, каждая из которых несла в любом полиморфном локусе одной из родительских форм аллель, который легко идентифицировать. В изучаемом гене была также обнаружена нуклеотидная замена, визуализированная с помощью CAPS-маркера (рис. 1, а). Обозначив родительские аллели сортов Steptoe и Morex соответственно как А и В, можно записать полученные данные в доступном для математического анализа виде (см. рис. 1, б). Учитывая, что не один, а как минимум 295 генных локусов, выявленных преимущественно с помощью RFLP-маркеров, оказываются полиморфными при сравнении родительских генотипов (28), можно полагать, что в рассматриваемом примере представлены весьма репрезентативные данные о том, насколько сцепленно наследуется полиморфизм маркерных локусов в 150 линиях двойных гаплоидов. В дальнейшем задача компьютерных программ состоит в подсчете частоты рекомбинаций между всеми возможными парами маркеров и выявлении групп сцепления, внутри которых маркеры должны быть расположены в наиболее вероятном линейном порядке: на расстоянии друг от друга, пропорциональном наблюдаемой частоте рекомбинаций между ними (см. рис. 1, в).

Молекулярное маркирование как инструмент для анализа изменчивости количественных признаков. Большинство фенотипических признаков, представляющих интерес для селекции, является количественными и контролируется алеллями нескольких генетических локусов. Согласно теории эколого-генетической организации сложных полигенных признаков растений, частота встречаемости генов, детерминирующих средние показатели и генетическую дисперсию количественного признака, зависит от лимитирующих факторов внешней среды (29). Смена лимитирующих факторов влечет за собой также смену спектра генетических локусов, определяющих фенотипическую изменчивость признака. Тем не менее предполагается существование отдельных ключевых генов, которые при любых условиях привносят свой вклад в формирование конкретного количественного признака, хотя доля этого вклада регламентируется внешней средой (30). Такие генетические локусы обозначены термином QTL (quantitative trait loci); они представляют основной интерес при использовании молекулярного подхода к селекции полигенных признаков, в том числе так называемого «marker assisted selection» (MAS) -- маркерной помощи отбору. Одна из задач этого научного направления состоит в идентификации, изучении, картировании и клонировании QTL, оказывающих влияние на варьирование фенотипических признаков (31).

П р и н ц и п ы и д е н т и ф и к а ц и и и к а р т и р о в а - н и я QTL. Поиск методов, с помощью которых удалось бы каким-либо образом идентифицировать QTL или обнаружить закономерность их проявления, имеет давнюю историю. В 1923 году Sax опубликовал результаты исследования, свидетельствующего о достоверной корреляции между размерами семени фасоли (количественный полигенный признак) и типом пигментации семенной кожуры (дискретный моногенный признак) (32). Данные были интерпретированы как сцепленное наследование гена, ответственного за окраску семени, с одним или несколькими генами, определяющими изменчивость количественного признака -- размера семени. Идея использовать в качестве маркеров дискретные моногенные морфологические признаки для систематического выявления генов, контролирующих изменчивость количественного признака, была окончательно сформулирована Thoday (33). Осуществить это на практике оказалось затруднительным, так как для большинства организмов известны лишь немногие моногенно расщепляющиеся морфологические признаки. Даже если таковые и были описаны, то в очень редких случаях они наследовались сцепленно с изучаемым количественным признаком.

Началом эры использования молекулярных маркеров в генетических исследованиях послужили первые работы по оценке полиморфизма изоферментов и запасных белков семян (34, 35). Аллельные формы ферментов (изоферменты) могут быть разделены электрофорезом в ПААГ. При этом можно оценить аллели генов, кодирующие ферменты в естественных популяциях, и локализовать их на генетических картах независимо от того, насколько явно полиморфизм этих аллелей отражался на фенотипе (36). В начале 80-х годов прошлого столетия изоферментные маркеры были главным инструментом для картирования полигенных признаков и являлись гораздо более эффективными, чем морфологические маркеры, которые также использовали для этой цели (37). Тот факт, что изменчивость количественных фенотипических признаков может быть ассоциирована со специфическим молекулярным маркером, впоследствии был подтвержден в многочисленных экспериментальных исследованиях (38, 39).

К основным преимуществам ДНК-маркеров по сравнению с морфологическими и изоферментными маркерами относятся следующие: фенотипическая нейтральность, так как большинство ДНК-маркеров локализовано в некодирующих участках генома; высокий уровень полиморфизма за счет отсутствия естественного отбора в популяции (в связи с фенотипической нейтральностью) и высокой частоты мутирования; кодоминантный характер наследования, что позволяет с уверенностью распознать не только гомозиготные рецессивные генотипы, но также и гетерозиготные; отсутствие эпистатического эффекта (31).

Картирование локусов количественных признаков (QTL) с использованием любого типа маркеров проводят на основе следующих принципов: если расщепление по маркерному признаку достоверно коррелирует с изменением изучаемого количественного признака, то предполагается, что локус маркерного гена сцепленно наследуется с одним (или несколькими) QTLs количественного признака, как правило, благодаря близкому расположению гена-маркера и гена (генов) QTL на хромосоме. Следовательно, картируя ген-маркер, можно приблизительно локализовать прилежащий к нему QTL-локус. Если количество маркеров, сцепленных с полигенным признаком, велико и они более или менее равномерно распределены по геному, то реально выявить практически все участки генома, где локализованы QTLs, привносящие вклад в детерминацию оцениваемого фенотипического признака.

С т р а т е г и я к а р т и р о в а н и я QTL. Для построения генетической карты и идентификации QTL необходимо искусственно создать популяцию, представляющую собой потомство от возвратного скрещивания, скрещивания гибридов F₂ и F₃, удвоенно-гаплоидное потомство F₁ или рекомбинантные имбредные линии (40). Цель создания такой популяции -- получить возможно большее число гомозиготных линий для определения частоты рекомбинаций между отдельными генетическими локусами в расщепляющейся популяции. В качестве исходной родительской пары подбирают генотипы, наиболее контрастные по изучаемому фенотипическому признаку. Экспериментальную популяцию насыщают возможно бульшим числом молекулярных маркеров, образующих группы сцепления, картируемые на хромосомах. Далее экспериментальную популяцию разделяют на два генотипических класса (гомозиготные линии одного класса несут аллель материнской, другого класса -- отцовской формы) и затем оценивают различия между средними показателями фенотипического признака у представителей этих классов. Если разница достоверна, делается заключение, что ген, влияющий на проявление конкретного фенотипа, сцеплен с молекулярным маркером, использовавшимся для подразделения популяции на два упомянутых класса. Процедуру повторяют поочередно с каждым маркером, картированным для исследуемой популяции, с тем чтобы выявить все возможные маркеры, ассоциированные с QTL.

Одним из классических примеров QTL-анализа является картирование генетических локусов, детерминирующих пивоваренные свойства у ячменя (41). Эта работа была выполнена на основе уже упомянутой экспериментальной популяции, полученной от скрещивания двух сортов ячменя (Steptoe и Morex), контрастных по пивоваренным качествам. При этом 295 полиморфных RFLP-маркеров были картированы на семи хромосомах, в результате чего общая длина хромосом составляла около 1250 сМ и на них располагались RFLP-маркеры, отстоящие друг от друга в среднем на 4,2 сМ. Эту генетическую карту использовали для картирования QTL-локусов, контролирующих важнейшие агрономические и пивоваренные признаки растений ячменя. На рисунке 2 продемонстрирован пример картирования генетических локусов растений ячменя (QTL), которые достоверно влияют на активность ферментов, необходимых для солодования (Diastatic Power). Достоверность такой корреляции оценивают на основе порогового значения так называемого LOD-score (logarithm of odds), который в упрощенном варианте представляет собой десятичный логарифм вероятности того, что неверна нуль-гипотеза, по которой между двумя классами рекомбинантных линий, несущих отцовский (АА) и материнский (аа) аллель, нет достоверных фенотипических различий (42, 43). Так, LOD = 2, LOD = 3 (и т.д.) означает, что гипотеза, альтернативная нулевой, является в 10²-10³ раз (и т.д.) более вероятной. В большинстве исследований пороговым значением принято считать LOD = 3 (42). Как следует из рисунка 2, в геноме ячменя можно выявить три наиболее вероятных участка хромосом 1Н, 4Н и 7Н, где, предположительно, локализованы гены, контролирующие активность ферментов, необходимых для солодования.

Изложенная стратегия картирования QTL имеет свои ограничения: идентифицируют преимущественно QTL-локусы, определяющие наибольшую долю фенотипической изменчивости; гены, привносящие меньший вклад в детерминирование фенотипической изменчивости, распознаются только в редких случаях, при условии, что экспериментальная популяция достаточно велика (более 500 особей) (31). Доля изменчивости количественного признака, которая может быть объяснена обнаруженным QTL, в разных исследованиях варьирует от 5 до 74 % (44). Остается неизвестным, каким образом трактовать оставшуюся долю фенотипической изменчивости: необнаруженными малыми QTL или воздействием внешней среды (45). Наиболее существенным недостатком метода является его низкое разрешение.

Длина фрагмента хромосомы, где локализован статистически рассчитанный QTL, в большинстве случаев составляет 5-10 сМ, что в случае, например, генома кукурузы эквивалентно 10-20 млн п.н. (несколько сотен возможных генов) (5). Тем не менее для селекции эти недостатки могут не иметь большого значения. Исследователей, как правило, интересуют QTL с наибольшим влиянием на фенотип, и знание точной локализации QTL на коротком участке хромосомы не является обязательным с практической точки зрения.

Рис. 2. Схема картирования генетических локусов (QTL) линий двойных гаплоидов ячменя, контролирующих активность ферментов, необходимых для солодования (цит. по 41) на основе интервального метода: 1Н-7Н -- семь хромосом ячменя; пунктиром обозначено пороговое значение LOD = 3 (локусы, соответствующие пикам кривых над пороговым значением LOD, рассматриваются как достоверно вовлеченные в формирование фенотипического признака); девять кривых в пределах каждой хромосомы соответствуют девяти независимым замерам фенотипического признака в экспериментальной популяции растений ячменя, выращенных в разных географических пунктах. Максимальное значение LOD для хромосом 1Н, 2Н, 3Н, 4Н, 5Н, 6Н и 7Н составляет соответственно 6,43; 4,51; 1,20; 6,27; 3,11; 1,92 и 4,23.

Если селекционер заинтересован в улучшении некоторого признака в элитных линиях, с которыми он работает, то соответствующий участок хромосомы с аллелями QTL, обусловливающими желательный фенотипический эффект, может быть интрогрессирован от донора, несущего эти аллели. Как только с помощью ДНК-маркеров такой донор будет выявлен, появляется возможность скрестить его с элитной линией и осуществить серию возвратных скрещиваний, отбирая каждый раз потомков, которые несут в своем геноме нужный аллель QTL во внедряемом хромосомном сегменте (46). Каждый раз присутствие желаемого аллеля будет фиксироваться с помощью близлежащих сцепленно наследуемых ДНК-маркеров. Создание таких улучшенных инбредных линий с использованием информации о картированных QTL для двух элитных расщепляющихся популяций сахарной кукурузы был описан Edwards с соавт. (47). Эти линии были усовершенствованы по 34 фенотипическим признакам только на основе данных молекулярного маркирования.

К л о н и р о в а н и е г е н о в, д е т е р м и н и р у ю щ и х ф е н о т и п и ч е с к и й п р и з н а к. Как показано выше, положение QTL на карте сцепленного наследования представляет собой лишь приблизительную оценку физической локализации на хромосоме генов (гена), вовлеченных в детерминирование фенотипического признака. В этой связи исследователей, работающих над проблемами селекции, не удовлетворяет простая идентификация хромосомного сегмента, заключающего в себе QTL; они пытаются осуществить физическое клонирование QTL-локуса, что определяет необходимость изолировать и прочитать нуклеотидную последовательность, содержащую искомый ген, размером максимум в несколько тысяч пар нуклеотидов. Для этого QTL должен быть локализован на хромосоме возможно более точно с помощью генетической карты высокого разрешения (high-resolution linkage map), которая создается на основе скрещивания двух почти изогенных линий, имеющих практически идентичный геном за исключением фрагмента хромосомы, содержащего анализируемый QTL. Таким образом размер искомого участка QTL может быть сведен к 1-2 сМ, который, однако, по-прежнему может вмещать несколько сотен генов (48). Для того чтобы перейти от шкалы генетических расстояний, измеряемых в сМ, к физической ДНК-последовательности длиной несколько тысяч пар нуклеотидов, необходимо осуществить широкомасштабный анализ библиотеки фрагментов геномной ДНК с помощью молекулярных маркеров, прилежащих к QTL, и выявить клон, содержащий искомую ДНК-последовательность. Расшифровка нуклеотидной последовательности такого клона и выявление в ней возможных рамок считывания позволят наметить несколько вероятных генов-кандидатов. Окончательным доказательством того факта, что ген-кандидат определяет изучаемую фенотипическую изменчивость, является процедура генетической трансформации модифицированной ДНК-последовательности выявленного и клонированного гена-кандидата в реципиентный организм, сопровождающаяся статистически достоверным изменением фенотипа (complementation test).

Описанный подход получил название «клонирования на основе генетической карты» (map-based cloning) и его классическим примером служит идентификация генетического локуса, определяющего размер плода у растений томата (49). Это исследование представляет собой первый опыт клонирования гена, детерминирующего количественный хозяйственно ценный признак у возделываемого вида растений, и стратегия этого исследования заслуживает специального краткого изложения.

Участок хромосомы, содержащий ген, вовлеченный в формирование признака «размер плода» у растений томата, был идентифицирован посредством QTL-анализа расщепляющейся популяции, полученной от скрещивания культивируемого томата Lycopersicon esculentum (крупные плоды) и родственного дикорастущего вида L. penellii (мелкие плоды). В результате проведенных исследований был обнаружен QTL, названный fw2.2. Полиморфизм аллелей в этом QTL-локусе хромосомы объяснял до 30 % изменчивости изучаемого фенотипического признака. С помощью близлежащих молекулярных маркеров из имеющейся YAC-библиотеки (Yeast Artificial Chromosomes) был идентифицирован физический клон ДНК длиной около 300 тыс. п.н., содержащий искомый QTL (50).

Для того чтобы получить представление о возможном числе функционирующих генов, содержащихся в идентифицированной ДНК-последовательности, YAC-клон был использован для гибридизации с клонами библиотеки кДНК, которая была создана на базе генома родительской формы с мелкими плодами и состояла только из фрагментов нуклеотидной последовательности генов, экспрессируемых в этом геноме. Выяснилось, что идентифицированный YAC-клон включает четыре транскрибируемые кДНК-последовательности, соответствующие четырем возможным генам-кандидатам. Линейный порядок расположения последних на хромосоме был определен с помощью все той же генетической карты высокого разрешения. Параллельно из библиотеки фрагментов геномной ДНК, сохраняемых в космидном векторе, были идентифицированы и секвенированы четыре фрагмента геномной ДНК (длиной до 50 тыс. п.н.), соответствующие генам-кандидатам. Каждый из этих ДНК-клонов с помощью методов генетической трансформации был перенесен в геном культивируемых растений двух разновидностей томата с крупными плодами. В результате у одного из четырех полученных классов трансформированных растений, содержащих встроенный геномный клон с доминантным аллелем «мелкоплодности», размер плода достоверно уменьшился по сравнению с контролем. Таким образом был идентифицирован ген, названный авторами ORFX, контролирующий размер плода у растений томата. При этом было показано, что полиморфизм аллелей этого гена определяет скорость деления и число клеток в тканях завязи цветка.

В настоящее время клонировано всего восемь генов, детерминирующих QTL у растений (табл.) (51). За исключением гена tb1 у кукурузы, все они были идентифицированы с помощью описанной выше процедуры клонирования на основе генетических карт. Некоторые из этих генов кодируют факторы транскрипции, другие отвечают за структуру белков, непосредственно вовлеченных в биохимические процессы метаболизма. Два из трех генов, детерминирующих сроки цветения растений риса, оказались гомологичны аналогичным генам у растений Arabidopsis. Следовательно, методы сравнительной геномики можно использовать для молекулярного анализа проявления фенотипических признаков у различных видов растений.

Заключение