Сравнительная оценка биологических свойств штаммов ортохантавируса Amur на различных моделях in vivo

Размещено на http://www.allbest.ru/

Сравнительная оценка биологических свойств штаммов ортохантавируса Amur на различных моделях in vivo

А.Б. Потт, Г.Г. Компанец

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии

и микробиологии имени Г.П. Сомова»

Аннотация

Ортохантавирусы, РНК-содержащие вирусы, широко распространены во многих регионах мира благодаря основным носителям - мелким мышевидным грызунам и являются возбудителями таких природно-очаговых инфекций человека, как геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) и хантавирусный сердечно-легочный синдром (ХСЛС). В Приморском крае установлена циркуляция двух патогенных для человека геновариантов ортохантавируса Hantaan (Far East и Amur), вызывающих тяжелые формы инфекции, с показателем летальности в отдельные годы до 16%.

В данной работе представлен сравнительный анализ биологических свойств штаммов ортохантавируса Amur, выделенных от природных носителей в разных географических районах юга Дальнего Востока России, на модели лабораторных животных. Сравнивали вирулентность ортохантавирусов для двух видов лабораторных животных (крыс и мышей), а также способность вызывать выработку противовирусных антител. Экспериментальную инфекцию моделировали на животных разного возраста и при разных путях введения вируса. Результаты исследования показали разный диапазон вирулентности штаммов ортохантавируса Amur для новорожденных белых мышей в возрасте 24-36 часов, от высокой вирулентности (штамм 25776-2004), приводящей к показателю летальности 77.5% зараженных животных, до низкой вирулентности (штамм 25786-2004, показатель летальности 15.0%). Кроме того, штамм 27191-2004 был авирулентным для данного вида новорожденных животных. При увеличении возраста модельных животных показатели летальности соответственно уменьшались. У сосунков белых крыс только отдельные штаммы ортохантавируса Amur вызывали клиническую, но не летальную инфекцию, а остальные штаммы были авирулентными. Все исследованные штаммы ортохантавируса Amur были иммунногенными, вызывая процесс антителообразования при разных исходах инфекции, при этом, титр специфических антител был ниже у животных с летальной инфекцией. Полученные результаты показали значительную неоднородность биологических свойств группы исследованных штаммов ортохантавируса Amur, отражая фенотипическую гетерогенность изолятов, выделенных от восточноазиатской мыши, по всей видимости, обусловленную их генетическим разнообразием, а также необходимость в разработке более приемлемой биологической модели.

Ключевые слова: ортохантавирус, Amur, биологические свойства, вирулентность.

Abstract

COMPARATIVE EVALUATION OF AMUR ORTHOHANTAVIRUS STRAINS BIOLOGICAL PROPERTIES ON VARIOUS IN VIVO MODELS

A.B. Pott, G.G. Kompanets

Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Orthohantaviruses, RNA-containing viruses, are widely distributed in many regions of the world due to their main carriers - small mouse-like rodents and are the causative agents of such human infections as hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) and hantavirus cardiopulmonary syndrome (HPS). In the territory of Primorsky Krai circulation of two pathogenic orthohantavirus Hantaan genovariants (Far East and Amur) has been established with severe forms of infection and mortality rate up to 16%. This paper presents a comparative analysis of the biological properties of orthohantavirus Amur strains isolated from natural hosts in different geographic areas of the south of the Far East Russian, on the models of laboratory animals. We compared the virulence of orthohantaviruses for two types of laboratory animals (rats and mice), as well as the ability of viruses to induce the production of antiviral antibodies. Experimental infection was modeled on animals of different ages and by different routes of administration of the virus. The results of the study demonstrated a different range of virulence of Amur orthohantavirus for newborn white mice aged 24-36 hours, from high virulence (strain 25776-2004), resulting in a mortality rate of 77.5% of infected animals, to low virulence (strain 25786-2004, mortality rate 15.0%). In addition, strain 271912004 was avirulent for this species of newborn animals. With an increase in the age of model animals, the mortality rates decreased accordingly. In newborn white rats, only few strains of Amur orthohantavirus caused a clinical symptom, but not a lethal infection, and the other strains were virulent. All the studied strains of Amur orthohantavirus were immunogenic, causing the antibody-formation process at different infection outcomes, while the titer of specific antibodies was lower in animals with a lethal infection. The results showed a significant heterogeneity of the biological properties in the group of studied Amur orthohantavirus strains, reflecting the phenotypic heterogeneity of strains isolated from a forest mouse, apparently due to their genetic diversity, as well as the need to develop a more acceptable biological model.

Keywords: orthohantavirus, Amur, biological properties, virulence

Ортохантавирусы (род Orthohantavirus в семействе Hantaviridae, порядок Bunyavirales, ранее род Hantavirus, семейство Bunyaviridae) [1] это РНК-содержащие вирусы, широко распространенные во многих регионах мира, благодаря природным хозяевам - грызунам и насекомоядным, у которых вызывают бессимптомную хроническую инфекцию с выделением вируса в окружающую среду. В отличие от других буньявирусов ортохантавирусы не передаются человеку членистоногими, основной путь заражения человека - вдыхание аэрозолей, инфицированных выделениями грызунов-хозяев [2, 3]. В Евразии ортохантавирусы являются возбудителями такого заболевания людей, как геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС), ежегодно регистрируется до 110 000 случаев ГЛПС различной степени тяжести. К настоящему времени, в мире генетически охарактеризовано более 80 типов ортохантавирусов, роль некоторых из них в патологии человека до конца не установлена. [3, 4] В Приморском крае установлена циркуляция, по меньшей мере, двух патогенных для человека ортохантавирусов: вируса Hantaan, генетические варианты Far East и Amur (природные носители - полевая мышь Apodemus agrarius и восточноазиатская мышь A.pen- insulae, соответственно) и вируса Seoul, генетический вариант Vladivostok (резервуар - серая крыса Rattus norvegicus) [5, 6].

Цель настоящей работы - сравнить вирулентность штаммов генетического варианта Amur, выделенных в разные годы на территории Приморского края, для лабораторных животных разных видов.

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

биологический штамм ортохантавирус amur

В эксперименте использовали вируссодержащий супернатант, полученный при инфицировании линии клеток Vero E-6 штаммами ортохантавируса Amur из рабочей коллекции лаборатории экспериментальной вирусологии НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г. П. Сомова (таблица 1).

Титр вируса определяли согласно методике Lee P.W. et al. [7], в нашем эксперименте он составлял не менее 4.0 lg ФОЕ/1.0 мл.

В эксперименте проводили заражение сосунков белых лабораторных мышей в возрасте 24-48 часов, и белых лабораторных крыс в возрасте 24 часа, 3 дня и 14 дней. Животных (1 самка и новорожденное потомство в отдельной клетке) содержали в стандартных условиях вивария: в пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой, стандартный рацион и питьевой режим предоставлен в соответствии с нормами, утвержденными приказом Министра здравоохранения СССР от 10 марта 1966 г. № 163 и приказом Минздрава СССР от 10.10.83 № 1179 (пункт 4.1). Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. Уход за инфицированными животными и работу с ними, осуществляли в условиях вивария с уровнем безопасности Р-3 (BSL-3).

Вирулентность выбранных штаммов ортохантавируса изучали, заражая однократно интрацеребрально (сосунков мышей и крыс в возрасте 24 часа) и внутрибрюшинно (крыс в возрасте 3 дня и 14 дней). Доза вируса составила 2 lg ФОЕ/0.01 мл для мышей, для сосунков крыс дозу вируса увеличивали в три раза. Для белых крыс при внутрибрюшинном пути введения вируса доза составила 2.3 lg ФОЕ/0.04 мл. Группы животных, зараженных разными штаммами ортохантавируса, содержали в отдельных помещениях, для исключения возможности перекрестной аэрогенной контаминации.

Начиная с 13-14 дня после заражения (p.i.) дважды в день наблюдали за общим состоянием животных, отмечая признаки инфекции, и при выраженных клинических симптомах, свидетельствующих о терминальной фазе инфекции, проводили вскрытие под общим наркозом эфиром. Для исследования на наличие специфических антител отбирали образцы крови. При отсутствии симптомов заболевания животных обескровливали под общим наркозом на 35-40 день после заражения и также отбирали образцы для исследований

Для выявления титра антител в сыворотках крови экспериментально инфицированных животных использовали НМФА, постановка которого осуществлялась согласно методическим рекомендациям с помощью тест-системы «Диагностикам геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) культуральный поливалентный» (ФГБНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунологических препаратов имени М.П. Чумакова», РАН).

Для статистической оценки полученных в ходе работы данных использовалась программа BioStat.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ вирулентности штаммов, выделенных от A.peninsulae, показал следующие результаты: все штаммы кроме 27191-2004, были вирулентными для новорожденных белых мышей в возрасте 24 часа, вызывая типичные клинические признаки ортохантавирусной инфекции у животных (вялость, потягивание конечностей и т.д.), начиная, в среднем с 15 дня от инфицирования (p.i) (таблица 2).

Однако выявлены существенные различия исследованных штаммов по степени вирулентности. Наиболее вирулентным оказался штамм 25776-2004, показатель летальности при заражении которым составил 77.5%, что статистически достоверно выше (t=1.991, p<0.05), чем для низковирулентных штаммов 19788-2000, 25786-2004 (t=1.998, p<0.05), 25795-2004 (t=2, p<0.05), при введении которых показатели летальности составили 43.3 %, 15% и 38%, соответственно, а разница с показателями летальности других штаммов (со средней вирулентностью) была статистически не достоверна. Однако при увеличении возраста инфицируемых животных до 48 часов вирулентность штамма 19788-2000 уменьшилась, животные не болели. Средняя продолжительность жизни инфицированных животных с клиническими симптомами составила 20 дней.

Вирулентность исследованных штаммов для новорожденных белых крыс в возрасте от 24 часов была значительно ниже: при заражении штаммами 19788-2000, 25795-2004 и 25786-2004 клинических признаков заболевания не выявлено, все животные были здоровы до 35-40 дня, показатель летальности составил 0%. Тогда как у сосунков крыс, инфицированных штаммом 257762004, начиная с 19 дня p.i., отмечали признаки и симптомы, характерные для экспериментальной ортохантавирусной инфекции, однако состояние животных далее не ухудшилось в течение периода наблюдения до 40 дня.

Таблица 1

Сведения о штаммах ортохантавирусов использованных в исследовании