Ключевые моменты гематологии рептилий: особенности оценки лейкоцитарной части крови

Размещено на http://www.allbest.ru/

КЛЮЧЕВЫЕ МОМЕНТЫ ГЕМАТОЛОГИИ РЕПТИЛИЙ: ОСОБЕННОСТИ ОЦЕНКИ ЛЕЙКОЦИТАРНОЙ ЧАСТИ КРОВИ

А.В. Павлов

Аннотация

Актуальность и цели. В герпетологии гематологические показатели широко используются в ветеринарной практике, в эколого-биологических исследованиях и в качестве комплексного биоиндикатора. Разночтения в интерпретации результатов разных исследований обусловлены особенностями гемопоэза рептилий и вариабельностью морфологии лейкоцитов, что ведет к искажениям реальной картины. Цель работы - обобщение критически значимых многовариантных моментов в гематологии рептилий, имеющих существенную значимость для теории и практики.

Материалы и методы. В работе использованы материалы автора по морфологии лейкоцитов девяти видов рептилий. Обобщены собственные и литературные данные. Рассмотрены наиболее дискуссионные особенности лейкоцитарной части крови и ее интерпретации.

Результаты. Выделены три типа ошибок в морфологии клеток белой крови: сходство тромбоцитов и лимфоцитов, нейтрофильно/гетерофильной и моноцитарно/азурофильной группы лейкоцитов. Тромбоциты и лимфоциты четко диагностируются по комплексу: цитоплазма, ядро. Наиболее надежна структура хроматина ядра. Считается, что у рептилий отсутствуют нейтрофилы, их функции выполняют гетерофилы. По морфологическим признакам у ряда видов выделены нейтрофилы, подобные таковым млекопитающих. Природа моноцитов и азурофилов остается дискуссионной: вероятно, у змей они имеют нейтрофильное происхождение, у ящериц - близки к моноцитам. Спорные моменты также связаны с терминологическими трудностями и разнообразием токсически измененных лейкоцитов. Количественные показатели позволяют выявлять природу лейкоцитов. Пристальное внимание необходимо уделять объему выборочных данных на всех уровнях исследования. Абсолютные и относительные показатели содержания лейкоцитов крови могут быть интерпретированы двояко.

Заключение. На сегодняшний день затруднения в гематологии рептилий окончательно не преодолены. Для оценки качества исследований и их интерпретации предложен методический перечень признаков, позволяющий определять допустимый круг решаемых задач: 1) время и место получения гематологического материала; 2) пол, возраст животных, размер выборки каждой группы; 3) клинический статус особей (как минимум, размерные и весовые показатели); 4) количество мазков от каждой особи; 5) описание техники приготовления, фиксации и окраски мазков; 6) количество исследованных мазков и объем выборки клеток; 7) ссылки на источник описания морфологии клеток и используемую терминологию; 8) при первичном исследовании вида - приведение изображения и описание клеток; 9) численные показатели в абсолютных (мкл) и удельных (%) значениях.

Ключевые слова: гематология рептилий, методика исследования, тромбоциты, лимфоциты, нейтрофилы, гетерофилы, моноциты, азурофилы, референтный интервал.

Abstract

V. Pavlov

KEY POINTS OF REPTILES HEMATOLOGY: PECULIARITIES OF ESTIMATION OF THE LEUKOCYTIC BLOOD

Background. In herpetology, hematological indicators are widely used in veterinary practice, in ecological and biological studies, and as a complex bioindicator. Differences in interpreting the results of various studies are due to the peculiarities of reptilian hemopoiesis and the variability of leukocyte morphology, which leads to distortions of the real picture. The aim of the work - a synthesis of critical multivariate moments in reptile hematology, which are essential for theory and practice.

Materials and methods. The author's materials on leukocyte morphology of 9 reptile's species are used. Generalized own and literary data. The most controversial features of the leukocyte blood and its interpretation are considered.

Results. Three types of errors in the study of morphology of the elements of white blood were identified: similarity of platelets and lymphocytes, neutrophil/ heterophil, and monocyte/azurophil leukocytes. Platelets and lymphocytes are clearly diagnosed by the complex: cytoplasm, nucleus. The most reliable is structure of the chromatin of the nucleus. Reptiles are believed to have no neutrophils, their functions are performed by heterophiles. According to morphological features, a number of species have been defined neutrophils, similar to those of mammals. The nature of monocytes and azurophil remains controversial: it is likely that they have a neutrophilic origin in snakes, and lizards are close to monocytes. Controversial issues are also associated with terminological difficulties and a variety of toxicly modified leukocytes. Quantitative indicators allow us to identify the nature of leukocytes. Careful attention must be paid to the amount of sample data at all levels of research. Absolute and relative indicators of the leukocytes content can be interpreted dually.

Conclusions. Nowadays, difficulties in reptile hematology have not been completely overcome. To assess the quality of researches and their interpretation, a methodical list of features has been proposed, allowing to determine the permissible range of tasks to be solved: 1) the time and place of obtaining hematological material; 2) gender, age of animals, sample size of each group; 3) clinical status of individuals (at a minimum, size and weight indicators); 4) the number of smears from each individual; 5) description of the technique of preparation, fixation and staining of smears; 6) the number of smears examined and the cells count sample; 7) links to the source of description cell morphology and terminology used; 8) images and cell descriptions in pioneer study of the species; 9) absolute indices (pL), and specific values (%).

Keywords: reptile hematology, research methodology, platelets, lymphocytes, neutrophils, heterophiles, monocytes, azurophils, reference interval.

Введение

Исследования гематологического характера как самостоятельное научное направление, а так же как методический прием для оценки состояния животных носят определенную ценность и часто незаменимы. Для рептилий гематологические показатели относительно широко используются в ветеринарной практике [1-5] и в меньшей степени в экологических и биологических исследованиях [6-10]. В рассматриваемой группе комплекс гематологических параметров служит своеобразным вектором и часто единственной возможностью для оценки физиологического состояния, статуса здоровья и индикатором детерминантов окружающей среды. Наиболее оперативными и показательными являются состав и показатели лейкоцитарной части крови. Именно эта группа иммунокомпетентных клеток среди исследованных видов пресмыкающихся является наиболее вариабельной и не имеет окончательной интерпретации. Очевидно, что это накладывает ограничения, нарушение которых ведет к ошибкам, искажающим реальную картину.

Целью исследования является обобщение критически значимых многовариантных моментов в гематологии рептилий, имеющих существенную значимость для теории и практики.

Материалы и методы

В работе использованы собственные данные (на основе собранного автором и предоставленного коллегами материала) по морфологии клеток крови девяти видов рептилий: Anguis fragilis, Zootoca vivipara, Lacerta agilis; Eremias arguta, Phrynocephalus guttatus, Natrix natrix, Coronella austriaca, Vipera berus, V. renardi. В анализ включены литературные источники, связанные с темой исследования и описывающие особенности крови представителей класса, относимых к пяти таксономическим группам: клювоголовые, черепахи, крокодилы, ящерицы и змеи. Обобщены результаты работ с описанием методов и результатов исследований по лейкоцитарной части крови с определением количественного и качественного состава по мазкам крови. В ряде моментов для сравнения использованы сведения по гематологии высших животных и человека. В обзоре затрагиваются только наиболее дискуссионные особенности картины крови и ее интерпретации.

Первичный материал

Техника взятия крови обусловлена не только удобством и эффективностью процедуры, но и варьированием показателей. Классическая гематология предполагает использование единого места забора проб. В крови, взятой из различных участков сосудистой системы, находится далеко не одинаковое количество кровяных телец, особенно лейкоцитов [11-13]. При этом значительно колеблется и соотношение отдельных форм белой крови. Правильная подготовка предполагает также исключение различных загрязнений (лимфой, внутритканевой жидкостью, внешними веществами). Требования к процедуре описаны в разнообразных руководствах и публикациях [4, 11, 14] и полностью справедливы для рептилий.

Особенности работы с рептилиями (сложности в доступе к сосудам, мелкие размеры ряда видов, работа вне лаборатории) создают трудности при получении первичного материала и изготовлении мазков. Для достоверного определения клеток в мазке и объективизации их содержания препарат должен отвечать следующим требованиям: он тонок, равномерен, т.е. форменные элементы лежат в нем в один слой и большей частью не повреждены. Качественный мазок имеет форму широкой линии без прерываний, не касающейся краев стекла с окончанием «метелка».

Деформация кровяных телец и артефакты, присутствующие в мазках с нарушением этих правил, ведут к неверной интерпретации и выявлению несуществующих типов клеток. Показателен пример описания «випроцитов» [15, 16].

Лейкоциты в силу разновеликости распределяются в мазке неравномерно: крупные клетки многочисленнее в более толстой части и по краям. Точные результаты невозможны при подсчете только в одной части мазка. Необходим множественный подсчет в нескольких полях разного качества. Существуют несколько подходов [11, 17]: 2-, 4-польные методы подсчета, 5-10-, 20-польные. В последнем случае точность достигается разными подходами: усреднением, пропуском полей с высоким варьированием значений. При подсчете не учитывают дегенерирующие и трудно классифицируемые клетки.

Морфология элементов белой крови

кровь рептилия гематология лейкоцитарный

В отличие от высших животных и человека все клетки рептилий обладают ядрами. Так, тромбоциты на разных стадиях развития или при неудовлетворительных условиях фиксации и окрашивания могут приниматься за малые или голоядерные лимфоциты, что ведет к недоучету или завышению доли содержания лимфоцитов [4, 18]. Вероятность ошибки увеличивается при образовании смешанных агрегаций клеток. Различия элементов связаны с комплексом признаков (табл. 1). Наиболее надежны характеристики ядра.

Таблица 1

Сравнительные признаки тромбоцитов и лимфоцитов рептилий

Один из спорных вопросов заключается в разделении и номенклатуре лейкоцитов, особенно гранулоцитов. В значительной степени классификация зрелых клеток затруднена отсутствием барьеров костного мозга у рептилий, следствием чего является наличие в кровотоке многих незрелых форм, которые часто трудно идентифицировать [19].

У рептилий отсутствуют нейтрофильные лейкоциты, морфологически подобные таковым высших млекопитающих. Функционально их замещают гетерофилы (рис. 1). В противоположность нейтрофилам - крупным клеткам с пылевидной нейтрально окрашиваемой зернистостью - у гетерофилов наряду с пылеобразными гранулами в цитоплазме имеются множественные крупнозернистые включения от овальной до вытянутой конфигурации и имеющие сродство к красителям различного типа. Гетерофилы - крупные (10-23 цш) [20] округлые клетки с эксцентрично расположенным ядром от круглой, овальной до сегментоядерной формы. Цитохимически и ультраструктурно они аналогичны нейтрофилам млекопитающих [4, 21, 22].

Расхождения в интерпретации часто обусловлены терминологическими проблемами, так как использование термина «нейтрофил» к клеткам с включениями иного характера формально считается некорректным. Однако во многих случаях морфологические признаки дают основание считать наличие нейтрофилов у ряда видов. Эти элементы выделены у бокошейных черепах, клювоголовых, ящериц, змей [1, 20, 23-27]. Наибольшее сходство с человеческими имеют нейтрофилы гаттерии, что подтверждается цитохимическими тестами [23]. Собственные данные [16] свидетельствуют о наличии светооптически сходных элементов у ряда видов (см. рис. 1,c-f).

Источником ошибок могут служить токсически измененные гетерофилы/нейтрофилы у животных с инфекционными или воспалительными процессами, что проявляется в интенсивной базофилии цитоплазмы и ее вакуолизации, анормальной грануляции (исчезновение, увеличение изменения окраски и формы гранул) и сегментации ядра (см. рис. 1,k,p) [4]. В зависимости от стадии реактивности так же, как и у нейтрофилов человека, эти признаки могут обнаруживаться в различной степени: на рис. 1,a нейтрофил человека с токсической грануляцией, рис. 1,b - нормальный нейтрофил человека.

Моноциты у рептилий разнообразны в размерах (8-25 цш) с варьирующей формой ядра (круглое, овальное или бобовидное), цитоплазма отличается нежной комковатой структурой, часто с азурофильными гранулами, цветом от серо-голубого до синего.

Рис. 1 Нейтрофильно-гетерофильные гранулоциты: a, b - нейтрофилы человека [28]; c - нейтрофил Sphenodonpunctatus [23]; d - гетерофил Е. arguta (собственные данные); e - гетерофил A. fragilis (собственные данные); f - гетерофил Ph. guttatus (собственные данные); g - гетерофил Tiliqua rugosa [29]; h - гетерофил V. berus [16]; i - гетерофил Boa constrictor [3]; j - гетерофил Lampropeltis sp. [5]; k - гетерофил T. rugosa [29]; l - гетерофил V. berus (собственные данные); m - гетерофил V. ammodytes [30]; n - гетерофил Z. vivipara (собственные данные); o - гетерофил Terrapene carolina triunguis [3]; p - гетерофил Chameleo fischeri [4]. Названия клеток и видов приведены в соответствии с указанием авторов. Приведенные шкалы из первоисточников. Окраска по: a-c, m - May-Grunwald-Giemsa; d--f h, l, n - Романовский-Гимза; g - Romanowsky-type rapid stain; i-k, o, p - Wright-Giemsa stain

Азурофилы - уникальные для рептилий клетки, обнаруживающие совместное проявление признаков гранулоцитов и моноцитов [31-33]. Их природа остается дискуссионной. Разные исследователи относят их к моноци- тарному или гранулоцитарному росткам, определяя как разные стадии этих линий, либо выделяют в самостоятельную [20, 31, 32]. Обычно азурофилы наблюдаются у чешуйчатых и крокодилов и реже у черепах. Это округлые клетки с серо-голубой цитоплазмой, содержащей гранулы от азурофильного до пурпурного цвета; ядро округлое или овальное со структурой хроматина, подобной у моноцитов. Цитохимически азурофилы змей сходны с нейтрофилами млекопитающих (положительная реакция на бензидиновую перокси- дазу, черный судан B и ШИК-тест) [18, 32], в то время как азурофилы ящериц дают положительную реакцию на кислую фосфатазу, отрицательную на бен- зидиновую пероксидазу и черный судан B, показывая сходство с моноцитами млекопитающих, т.е. при морфологическом сходстве у разных видов они, вероятно, имеют различное происхождение. Такое объяснение наиболее полно соответствует картине, имеющейся в разнообразных публикациях, и согласуется с количественными данными у животных разного статуса.

Доля этих клеток увеличивается при бактериальных инфекциях [18]. У V. berus при поражениях, вызываемых Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans, количество элементов с содержанием азурофильной зернистости значительно возрастает [34]. У этого вида такие клетки рассматриваются как гетерофилы азурофильного типа (рис. 2f) [16].

В некоторых случаях критика верификации лейкоцитов связывается с их изменением в ходе изготовления препаратов крови и использования различных методик. Так, в случае с L. agilis (рис. 2,ij) отличия двух клеток можно отнести к разнице в условиях фиксации, окрашивания и (или) освещения при фотосъемке. Окрашивание зависит от pH раствора, а также обусловлено обилием свободных гликопротеидов плазмы крови на поверхности мазка, затрудняющих окрашивание.

Следует добавить, что функциональная природа нейтро/гетерофилов и моноцито/азурофильных лейкоцитов также может быть источником ошибок. Иммунологическая реактивность отражается на их «облике». На рис. 2,n показан лейкоцит V. Ьєгш, определяемый как азурофил. Однако явственной азурофильной грануляции не наблюдается, контур цитоплазмы неровный, хроматин ядра однороден с просматриваемыми ядрышками. Такое сочетание отражает одно из двух состояний: либо это реактивная клетка, либо распадающийся лейкоцит.

Рис. 2 Моноциты и клетки азурофильного типа: a - моноцит человека [28]; b - моноцит T. rugosa [29]; c - азурофил T. rugosa [29]; d - моноцит Е. arguta (собственные данные); e - моноцит V. berus [16]; f - азурофильный гетерофил V. berus [16]; g - азурофил Gallotia simonyi [35]; h - азурофильный моноцит I. iguana [4]; i - моноцит L. agilis [36]; j - азурофил L. agilis [36]; k - азурофил V. ammodytes [30]; l - моноцит P. najadum [26]; m - моноцит V. berus [9]; n - азурофил V. berus [9]; o - азурофил Varanus sp. [5]; p - моноцит Gopherus agassizii [4]. Названия клеток и видов приведены в соответствии с указанием авторов. Шкалы даны из оригинальных первоисточников и равны 10 pm. Окраска по: a, g - May-Grunwald-Giemsa; b, с, k - Wright-Giemsa stain; d-f, i, j, m, n - Романовский-Гимза; h, o,p - Wright-Giemsa stain, l - Wright's stain

Таким образом, особое внимание следует уделять материалу, полученному от больных рептилий, у которых широко проявляются реактивные свойства большинства лейкоцитов. В таких случаях возможна неправильная идентификация моноцитов, азурофильных моноцитов, гетерофилов и эозинофилов. Вместе с тем воздействие антигенов провоцирует реактивные свойства лейкоцитов, давая возможность выявлять их функциональную значимость.

Количественные показатели

С одной стороны, количественные показатели дают возможность оценивать состояние животных, с другой - позволяют понять природу лейкоцитов. У здоровых животных доля моноцитов, за некоторым исключением, колеблется в пределах 0-10 %. Их количество возрастает при хроническом антигенном воздействии, воспалительных реакциях, бактериальных или паразитарных заболеваниях [22]. В ряде публикаций [6, 37, 38] значение этого показателя при значимой выборке превышает 25-30 %, что свидетельствует о допущении одной или нескольких ошибок, обсуждавшихся выше.

Содержание азурофильных лейкоцитов у змей часто выше 10 %, вплоть до 35 % [10, 22, 39, 40], что может служить косвенным подтверждением в пользу их гетерофильного происхождения. В других группах рептилий их доля минимальна или они вовсе отсутствуют [5, 22].

В качественно поставленных исследованиях от каждой особи готовится несколько препаратов (3-20) [10, 29, 30, 41], оценка лейкоцитарного профиля основывается на подсчете не менее 200-300 клеток. Поскольку у рептилий варьирование показателей крови зависит от множества факторов (возраст, пол, сезон, общее состояние животного, высокая географическая изменчивость и др.), для определения нормального (базового) референтного интервала параметров крови в естественной среде необходимы достаточные выборочные данные (количество особей) в каждой географической точке.

Получение и верификация референтных значений является ключевым моментом в популяционных исследованиях. Признаваемый в настоящее время протокол и принципы по установке и изменению референтного интервала [42, 43] предполагают значительный объем выборки: надежный порог более 40 особей (золотой стандарт - более 120) с учетом всего комплекса факторов, влияющих на гематологические параметры. В большинстве случаев для рептилий получение такого материала в силу различных причин достаточно сложно. В простейшем случае для установки верхних и нижних границ используется доверительный интервал на уровне 95 % значимости.

Предварительный референтный интервал лейкоцитарного профиля V. Ъегш на основе такого подхода приведен в табл. 2 [34]. Границы интервала практически для всех лейкоцитов составили половину и более от средних значений. Такой размах варьирования говорит о низкой чувствительности, что позволяет использовать его для решения ограниченного круга задач.

Интерпретация содержания лейкоцитов часто проводится на основе лейкоцитарной формулы (%). Поскольку у клинически здоровых рептилий варьирование показателей имеет крайне широкий размах, такой подход не всегда отражает особенности, которые можно выявить по абсолютным значениям. Это отчетливо проявляется при сравнении показателей из выборок животных разного иммунологического статуса [34]. На рис. 3 видно, в группе _)иуеш8 содержание нейтрофилов в процентах - самое высокое после доли лимфоцитов, а по абсолютным значениям содержание нейтрофилов и вакуо- лизированных клеток - примерно одинаковое. Учитывая то, что вакуолизи- рованные клетки являются производными гетерофилов, мы по абсолютным и относительным значениям получим разные выводы. Сравнение лейкоцитарной формулы больных и взрослых (а^Ьш) здоровых гадюк показывает, что доля лимфоцитов у здоровых выше, чем у заболевших. Сравнение абсолютных значений приведет нас к противоположному выводу. В большинстве объемных исследований приводятся именно абсолютные показатели. При оценке параметров у видов с ранее верифицированными данными, видимо, можно ограничиться лейкоцитарным профилем.

Таблица 2

Показатели периферической крови обыкновенной гадюки в естественных условиях в летний период (июнь - первая половина августа, Республика Татарстан), п = 15, тыс/мкл; = 2,145

а)

Рис. 3 Сравнительные данные по содержанию лейкоцитов V. Berus: а - лейкоцитаный профиль; b - лейкоцитарная формула; Н - нейтрофилы; ВК - вакуолизированные клетки; Г - гетерофилы; Э - эозинофилы; Б - базофилы; М - моноциты; Л - лейкоциты; ПК - плазматические клетки (начало)

б)

Рис. 3 Сравнительные данные по содержанию лейкоцитов V. Berus: а - лейкоцитаный профиль; b - лейкоцитарная формула; Н - нейтрофилы; ВК - вакуолизированные клетки; Г - гетерофилы; Э - эозинофилы; Б - базофилы; М - моноциты; Л - лейкоциты; ПК - плазматические клетки (окончание)

Заключение

Исследование качественного и количественного состава лейкоцитов крови рептилий связано с рядом трудностей, обусловленных как особенностями морфологии клеток, диффузностью кроветворения, так и внешними факторами. Повышение качества первичного материала связано с методологией и техниками исследования. На сегодняшний день все затруднения окончательно не преодолимы. Для оценки качества проведенных исследований и перспектив их интерпретации предлагается методический перечень признаков, позволяющий в дальнейшем определять допустимый круг решаемых задач: 1) время и место получения гематологического материала; 2) пол, возраст животных, размер выборки каждой группы; 3) клинический статус особей (как минимум, размерные и весовые показатели); 4) количество мазков от каждой особи; 5) описание техники приготовления, фиксации и окраски мазков; 6) количество исследованных мазков и объем выборки клеток; 7) ссылки на источник описания морфологии клеток и используемую терминологию; 8) при первичном исследовании вида - приведение изображения и описание клеток; 9) численные показатели приводятся в абсолютных (мкл) и удельных (%) значениях.

Библиографический список