Проведение лабораторных биохимических исследований

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Краевое государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение

Барнаульский базовый медицинский колледж

Дневник

производственной практики

ПМ 03 Проведение лабораторных биохимических исследований

г. Барнаул



График прохождения практики (3 курс, 5 семестр)

№	Раздел практики	Количество дней	Сроки прохождения практики	Общий руководитель
1.	Клинико-диагностическая лаборатория	18
2.



1 день. Подготовительный этап. Организационная работа

1. Проведение инструктажа по технике безопасности

Приказ Минтруда РФ от 18.12.2020 N928Н:

Требования охраны труда в клинико-диагностических лабораториях медицинских организаций:

1. Пробы биологического материала, поступающие в клинико-диагностическую лабораторию, считаются потенциально инфицированными, что требует соблюдения мер безопасности, направленных на защиту персонала.

Оборудование клинико-диагностической лаборатории должно эксплуатироваться в соответствии с инструкцией производителя и предусмотренных в ней мер безопасности.

2. При транспортировке биоматериал должен помещаться в пробирки, закрывающиеся резиновыми или полимерными пробками, а сопроводительная документация - в упаковку, исключающую возможность ее загрязнения биоматериалом. Не допускается помещать бланки направлений в пробирки с кровью или контейнеры с иными биологическими материалами.

3. Транспортировка биоматериала должна осуществляться в закрытых контейнерах, регулярно подвергающихся дезинфекционной обработке.

4. Исследование проб биоматериала следует проводить в ламинарных боксах, в боксах биологической безопасности и на автоматических анализаторах.

5. При работе с кровью, сывороткой или другими биологическими жидкостями запрещается:

а) пипетировать ртом,

б) переливать кровь, сыворотку через край пробирки.

Следует пользоваться автоматическими и полуавтоматическими устройствами дозирования проб, механическими и электронными пипетками, пипеточными дозаторами.

6. При открывании пробок бутылок, пробирок с кровью или другими биологическими материалами следует не допускать разбрызгивания их содержимого.

7. Порядок работы должен свести к минимуму риск заражения. Порядок работы в загрязненных зонах должен способствовать предотвращению заражения персонала. С этой целью на преаналитическом и аналитическом этапах следует использовать системы для перемещения лабораторных контейнеров, автоматические анализаторы, автоматизированные и роботизированные системы, мультимодальные комплексы.

8. Потенциально инфицированные или токсичные стандартные образцы и контрольные материалы следует хранить, обрабатывать и использовать с той же степенью предосторожности, которая соответствует пробам с неизвестным риском.

9. Если пробы при поступлении в лабораторию находятся в поврежденном или протекающем контейнере, то эти контейнеры должен открывать в боксах биологической безопасности обученный персонал, одетый в соответствующие защитные средства, чтобы избежать протечки или образования аэрозолей. Если загрязнение значительное или если проба расценена как неприемлемо испорченная, ее следует, не открывая, удалить с соблюдением условий безопасности.

10. При хранении потенциально инфицированных материалов в холодильнике необходимо помещать их в прочный полиэтиленовый пакет.

11. В тех случаях, когда персонал лаборатории работает с пробами низших групп риска, рециркуляция воздуха из биологических безопасных боксов разрешается при условии пропускания воздуха через высокоэффективные фильтры перед выбросом в окружающую среду. При работе лаборатории с культурами, содержащими микроорганизмы групп высшего риска, рециркуляция воздуха запрещена.

12. На дверях лаборатории должны быть вывешены соответствующие предупредительные и запрещающие знаки (надписи).

13. Растворы для нейтрализации концентрированных кислот и щелочей должны находиться на стеллаже (полке) в течение всего рабочего времени.

14. Следует следить за целостностью стеклянных приборов, оборудования и посуды и не допускать использование в работе предметов, имеющих трещины и сколы.

15. В случае, если разбилась лабораторная посуда, не собирать ее осколки незащищенными руками, а использовать для этой цели щетку и совок.

16. Рабочие места для проведения исследований мочи и кала должны быть оборудованы вытяжными шкафами с механическим побуждением.

Биохимические, гематологические, иммунологические, коагулологические и иные исследования биомаркеров могут проводиться на автоматических анализаторах (отдельно стоящих либо интегрированных в мультимодальные комплексы) или на полуавтоматических анализаторах.

17. Створки (дверцы) вытяжного шкафа во время работы следует держать максимально закрытыми (опущенными с небольшим зазором внизу для тяги). Открывать их можно только на время обслуживания приборов и установок. Приподнятые створки должны прочно укрепляться приспособлениями, исключающими неожиданное падение этих створок. Газовые и водяные краны вытяжных шкафов должны быть расположены у передних бортов (краев) и установлены с учетом невозможности случайного открытия крана.

18. При эксплуатации центрифуг необходимо соблюдать следующие требования:

а) при загрузке центрифуг стаканами или пробирками соблюдать правила попарного уравновешивания;

б) перед включением центрифуг в электрическую сеть необходимо проверить прочность крепления крышки к корпусу;

в) включать центрифугу в электрическую сеть следует плавно при помощи реостата, после отключения необходимо дать возможность ротору остановиться, тормозить ротор рукой запрещается;

19. При эксплуатации воздушных или жидкостных термостатов запрещается ставить в них легковоспламеняющиеся вещества. Очистку и дезинфекцию термостата следует проводить только после отключения его от электросети.

20. При эксплуатации рефрижераторов (холодильников) не допускается закрывать вентиляционные отверстия и затруднять охлаждение конденсаторного блока. Перестановка и перемещение холодильников должны проводиться при участии специалиста лаборатории.

21. Лабораторные столы для микроскопических и других точных исследований должны располагаться у окон.

22. Для предотвращения переутомления и вредного воздействия на органы зрения при работе с микроскопом и пользовании другими оптическими приборами необходимо обеспечить освещение поля зрения, предусмотренное для данного микроскопа или прибора. При работе не следует закрывать неработающий глаз, работать необходимо попеременно то одним, то другим глазом. Следует делать регламентированные перерывы в работе продолжительностью 7% и более рабочего времени. Работа с оптическими приборами (в том числе микроскопы, лупы) должна занимать не более 50% рабочего времени.

23. В случае отсутствия централизованной подачи газов не допускается расположение групповых баллонных установок и хранение баллонов с горючими газами в помещении, где осуществляется технологический процесс использования находящегося в них горючего газа.

24. Выпуск газа из баллона должен осуществляться через редуктор, предназначенный исключительно для данного газа. Вентиль редуктора следует открывать медленно.

На входе в редуктор должен быть установлен манометр со шкалой, обеспечивающей возможность измерения максимального рабочего давления в баллоне.

25. Для использования разрешаются только баллоны, имеющие надписи и окраску, установленную требованиями для данного газа, снабженные защитными колпаками.

26. В помещении лаборатории запрещается:

а) оставлять без присмотра зажженные горелки и другие нагревательные приборы, держать вблизи горящих горелок вату, марлю, спирт и другие воспламеняющиеся вещества и предметы;

б) убирать случайно пролитые огнеопасные жидкости при зажженных горелках и включенных электронагревательных приборах;

в) зажигать огонь и включать электроосвещение, электрооборудование (приборы, аппараты), если в лаборатории пахнет газом. Предварительно необходимо определить и ликвидировать утечку газа и проветрить помещение. Место утечки газа определяется с помощью мыльной эмульсии;

г) наливать в горящую спиртовку горючее, пользоваться спиртовкой, имеющей металлическую трубку и шайбу для сжатия фитиля, проводить работы, связанные с перегонкой, экстрагированием, растиранием вредных веществ при неработающей или неисправной вентиляции;

д) при работе в вытяжном шкафу держать голову под тягой, пробовать на вкус и вдыхать неизвестные вещества, наклонять голову над сосудом, в котором кипит какая-либо жидкость;

е) хранить на рабочих столах и стеллажах запасы токсических, огне- и взрывоопасных веществ, хранить и применять реактивы без этикеток, а также какие-либо вещества неизвестного происхождения;

ж) выполнять работы, не связанные с заданием и не предусмотренные методиками проведения исследований;

27. Во время работы необходимо соблюдать требования асептики и антисептики, правила личной гигиены. Перед и после каждого контакта с материалом необходимо мыть руки с последующей их обработкой одним из бактерицидных препаратов.

28. Дезинфицировать и мыть руки с мылом необходимо всякий раз при выходе из помещений, перед едой и после работы (использовать дезинфицирующие растворы и кожные антисептики, разрешенные к применению).

29. При загрязнении кровью спецодежды или рабочего места надо снять спецодежду и замочить ее в емкости с дезинфицирующим раствором или поместить в специальный пакет для последующей транспортировки к месту обеззараживания и стирки, рабочее место залить дезинфицирующим раствором с определенной экспозиционной выдержкой.

30. Для дезинфекции различных лабораторных объектов в работе пользоваться дезинфицирующими средствами, обеспечивающими гибель бактерий и вирусов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. Для дезинфекции лабораторной посуды, расходных материалов разрешается применение физических и химических методов дезинфекции. Текущую уборку помещений клинико-диагностической лаборатории необходимо проводить с применением дезинфицирующих растворов.

31. Воздух в помещении лаборатории и боксов периодически должен подвергаться дезинфекции с помощью бактерицидных ламп, согласно установленному режиму.

32. Места хранения опасных жидкостей, в том числе кислот и щелочей, должны находиться ниже уровня глаз. Большие контейнеры следует хранить ближе к уровню пола, но на такой высоте, чтобы с ними было безопасно и эргономично обращаться.

33. Для предотвращения нежелательных перемещений газовых баллонов, реагентов и стеклянной посуды должны быть установлены надежные приспособления (например, цепи и захваты).

34.В лабораториях, где существует опасность поражения глаз, вызванного химическим загрязнением, должны быть оборудованы устройства для промывания глаз.

35. Если характер химической опасности создает риск загрязнения всего туловища, должны быть оборудованы ливневые души.

2. Знакомство с устройством и оснащением рабочих мест

1. Аппараты и устройства:

* Холодильник для хранения проб

* Приборы для проведения биохимического анализа крови (Sysmex CA 1500, Beckman Coulter AU480, HumaStar 600)

* Центрифуги, встряхиватели

* Термостаты

* pH-метрр

* глюкометр

*фотометр

2. Лабораторная посуда:

* Пробирки

* Флаконы

* Колбы

* Пипетки

* Кюветы

* Мензурки

* Химические стаканы

3. Расходные материалы:

* Реактивы

* Средства защиты персонала

* Одноразовые наборы для взятия образцов

* Вата, марля и прочее.

4. Лабораторная мебель:

* Вытяжные шкафы

* Лабораторные столы

* Столы-мойки

* Лабораторные шкафы

* Тумба

3. Подготовка биологического материала для лабораторных исследований

Подготовка к проведению лабораторных исследований содержит два основных момента: необходимость соблюдения стандартных условий взятия биологического материала и предотвращение деградации биологически активного вещества в образцах.

Перед получением образца крови медицинскому работнику необходимо знать следующее:

1) некоторые биологические вещества, например, гормоны, после приема пищи могут иметь повышенную концентрацию;

2) содержание ряда веществ подвержено влиянию циркадных (суточных) колебаний;

3) множество лекарственных веществ способны влиять на определяемые вещества, повышая или понижая их уровень в крови;

4) взятие исследуемого образца у пациентов в горизонтальном, в вертикальном положении или после физической нагрузки изменяет уровень биологически активных веществ иногда более чем на 10%.

При несоблюдении требований полученная сыворотка или плазма крови пациента может содержать большое количество жировых частиц, хиломикронов. Гиперлипидемичная (содержащая жировые включения) сыворотка или плазма крови будет непрозрачной, мутной (хилезной); выраженным проявлением гиперлипидемиисыворотки или плазмы является ее «молочный» вид. Присутствие большого числа частиц жира, как правило, влияет на течение проводимых биохимических реакций, приводя к искаженным результатам.

Показатели крови могут существенно меняться в течение дня, поэтому рекомендуется все анализы сдавать в утренние часы (9.00-11.00). Именно для утренних показателей рассчитаны все референсные пределы лабораторных тестов.

За один день до сдачи крови желательно избегать физических нагрузок, приема алкоголя и существенных изменений в питании и режиме дня. Не рекомендуется употреблять пищу с высоким содержанием жиров.

За два часа до сдачи крови на исследование необходимо воздержаться от курения. Непосредственно перед сдачей крови рекомендуется спокойно посидеть в течение 10-20 минут. Кровь для исследований нужно сдавать до начала приема лекарственных препаратов или не ранее, чем через 10-14 дней после их отмены. При приеме лекарственных препаратов следует проконсультироваться с лечащим врачом по поводу целесообразности проведения исследования на фоне приёма препаратов или возможности отмены приёма препарата перед исследованием. Исключение составляют специальные исследования концентрации лекарства в крови.

Процедуры первичной (до лабораторной) обработки образцов биологических материалов.

Правила оформления направления на лабораторные исследования

Заявки на анализы должны быть согласованы со всеми врачами-специалистами, участвующими в лечении больного, чтобы при венепункции взять материал для всех необходимых исследований и не повторять процедуру. В направлении на лабораторные исследования (заявке) должны быть отображены следующие данные: дата и время назначения; дата и время взятия крови (сбора биологического материала); фамилия и инициалы пациента; отделение, номер истории болезни, номер палаты, возраст, пол, диагноз, время приема последней дозы препаратов, способных повлиять на результат анализа, фамилия и инициалы лечащего врача, назначившего исследование; перечень необходимых исследований; подпись специалиста, проводившего взятие крови или другого биологического материала.

Правила первичной обработки образца биоматериала

Важнейшей процедурой первичной обработки образцов биоматериалов после взятия их у пациентов является их кодирование с целью последующей надежной их идентификации. Кодирование видов образцов по характеру внесенных в них добавок закреплено с помощью разного цвета крышек пробирок, содержащих соответствующие добавки: красный/белый - без добавок, для сыворотки, клинико-химические исследования, серология; зеленый - гепарин, для плазмы, клинико-химические исследования; фиолетовый - ЭДТА, для плазмы, гематологические исследования; голубой - цитрат натрия, для коагулологических исследований; серый - фторид натрия, для исследования глюкозы, лактата. Идентификация образцов от определенных пациентов наиболее рациональна с помощью штрих-кодов, в которых отражены идентификационные признаки пациентов: фамилия, клиническое отделение, фамилия лечащего врача и т.п. Штрих-коды изготавливают в месте взятия образца (при доставке проб из другой лаборатории маркировку допускается проводить в лаборатории, выполняющей анализ) и считывают с помощью специального устройства в клинической лаборатории. В небольших учреждениях возможно ручное кодирование пробирок нанесением на них карандашом по стеклу или фломастером условных знаков, цифр.

Другие процедуры первичной обработки образцов биоматериалов по месту их взятия зависят от общей организации лабораторного обеспечения в данном учреждении. Если процедурные кабинеты расположены в том же здании, что и лаборатория, то контейнеры с образцами следует как можно скорее доставлять в лабораторию, где и будут осуществляться все дальнейшие действия. Пробы, содержащие инфекционные агенты, следует обрабатывать иначе, чем пробы с относительно небольшим риском инфицирования (подобно большинству проб крови, сыворотки, мочи, кала, тампонам, мазкам и фильтровальным-бумажкам).



Транспортировка биоматериала

Транспортировка образцов крови должна осуществляться при комнатной температуре (18-25 град. C) производится сразу после забора крови.

Хранение: Для определения большинства биологического материала считается возможным хранение его при комнатной температуре не более 6-8 часов.

Некоторые образцы разрешается хранить в течение недели при + 4°С. При необходимости хранения сыворотки (плазмы) более суток, образец рекомендуется замораживать при -20°С, что позволяет проводить исследования, например, спустя несколько месяцев - раковые маркеры, мочевину, холестерин, большинство гормонов и т.д.

4. Приготовление рабочих растворов

Рабочие растворы средства готовят в ёмкостях из любого материала, путём растворения средства в холодной водопроводной воде в соответствии с расчетами. Рабочие растворы, приготовленные для хранения, должны храниться в ёмкостях плотно закрывающимися крышками. Поверхности в помещениях (пол, стены и др.), предметы обстановки, поверхности аппаратов, приборов, оборудования, протирают ветошью, смоченной в растворе средства, при норме расхода 100 мл/поверхности.

Например:

0,03% «ДезХлор» (2 таблетки до 10 л воды) -протирание поверхностей.

0,5% «Гексакварт форте» (50 мл+9950 мл воды).

Все приготовленные рабочие растворы должны иметь этикетку с обозначением и датой приготовления.



2 день. Исследование активности ферментов

1. Определение активности фосфатаз, б-амилазы, аминотрансфераз

1. Определение активности фосфатаз:

А. Щелочная фосфатаза-ВИТАЛ:

ПРИНЦИП МЕТОДА:

n-нитрофенилфосфат + вода> n-нитрофенол + фосфат

Количество образовавшегося в единицу времени n-нитрофенолапропорционально активности фермента и определяется по оптической плотности образца при 405 нм.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ): Сыворотка или плазма крови (без цитрата, оксалата, фторида, ЭДТА).

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РЕАГЕНТОВ РАБОЧИЙ РЕАГЕНТ №1. Смешать необходимые количества реагента №1 и реагента №3 в соотношении 4 + 1. Рабочий реагент стабилен 10 суток при 2-8°С или 3 месяца при 20°С, в плотно закрытой посуде в темноте.

РАБОЧИЙ РЕАГЕНТ №2. Необходимое количество реагента №2 развести бидистиллированной водой в 10 раз (например, 1 мл реагента №2 + 9 мл бидистиллированной воды). Концентрация NaOH в рабочем реагенте №2 - 0,02 моль/л. Срок хранения - 3 мес в плотно закрытой полиэтиленовой посуде при 18-25 °С.

Проведение анализа:

Опытная проба Холостая проба

Рабочий реагент №10,5 мл 0,5 мл

Образец 0,05 мл-

Инкубировать точно 30 мин при 37 °С (желательно на водяной бане). Затем пробы охладить.

Добавить в пробирки:

Опытная проба Холостая проба

Рабочий реагент №25 мл 5 мл

Образец-0,05 мл

Пробы перемешать и фотометрировать.

Стабильность окраски - не менее 8 часов.

РАСЧЕТЫ

Расчет активности щелочной фосфатазы в сыворотке и плазме крови производят по калибровочному графику.

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ

278-830 нмоль/(с*л)

Клинико-диагностическое значение определения щелочной фосфатазы:

Причины повышения активности щелочной фосфатазы:

1. Поражение печени и желчевыводящих путей:

- Механическая желтуха, связанная с непроходимостью желчевыводящих протоков.

- Камни желчных протоков, рубцы желчных протоков после хирургических вмешательств.

- Опухоли желчных протоков.

- Рак головки поджелудочной железы, рак желудка при механическом сдавливании общего желчного протока, через который желчь попадает в 12-перстную кишку.

- Рак печени, метастазы опухолей других органов в печень.

- Гепатит любого происхождения (обычно ЩФ из-за него становится в 3 раза больше нормы).

- Инфекционный мононуклеоз.

2. Поражение костей

Особенно высокая активность ЩФ (15-20 норм) отмечается при болезни Педжета. Это заболевание, которое сопровождается патологическим ростом костей и нарушением их структуры в определенных местах.

Остеосаркома

Метастазы других опухолей в кости

Остеомаляция - размягчение костей, вызванное недостатком кальция

3. Другие причины

- Гиперпаратиреоз - гормональное заболевание, связанное с избыточным образованием паратгормона околощитовидными железами, что приводит к вымыванию кальция из костей.

- Инфаркт миокарда.

- Язвенный колит, перфорация кишечника (так как щелочная фосфатаза содержится в том числе и в клетках кишечника).

Причины понижения активности щелочной фосфатазы:

- Тяжелая анемия.

- Массивные переливания крови.

- Гипотиреоз - состояние, при котором снижена функция щитовидной железы.

- Недостаток магния и цинка.

- Гипофосфатазия - редкое врождённое заболевание, приводящее к размягчению костей.

Выраженное снижение щелочной фосфатазы у беременных - признак недостаточности плаценты.

Б. Кислая фосфатаза-ВИТАЛ:

ПРИНЦИП МЕТОДА:

n-нитрофенилфосфат + вода > n-нитрофенол + фосфат

Количество образовавшегося в единицу времени n-нитрофенола, пропорциональное активности фермента, определяется по оптической плотности образца. Активность простатической фракции фермента блокируется тартратом.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ): Сыворотка или плазма крови.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РЕАГЕНТОВ РАБОЧИЙ РЕАГЕНТ №1. Смешать необходимые количества реагента №1 и реагента №3 в соотношении 4 + 1. Рабочий реагент стабилен 20 суток при 2-8°С в темноте. РАБОЧИЙ РЕАГЕНТ №2. Смешать необходимые количества реагента №2 и реагента №3 в соотношении 4 + 1. Рабочий реагент стабилен 20 суток при 2-8°С в темноте. РАБОЧИЙ РЕАГЕНТ №3. Необходимое количество реагента №5 развести дистилированной водой в 10 раз (например, 1 мл реагента №5 + 9 мл дистиллированной воды). Концентрация NaOH в рабочем реагенте №3 - 0,1 моль/л. Срок хранения - 3 мес в плотно закрытой полиэтиленовой посуде при 18-25°С.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

Внести в пробирки:

Опытная проба А Опытная проба Б Холостая проба

Рабочий реагент №10,5 мл-0,5 мл

Рабочий реагент №2-0,5 мл-

Образец0,1 мл0,1 мл-

Инкубировать точно 30 мин при 37°С (желательно на водяной бане).

Добавить в пробирки:

Опытная проба А Опытная проба Б Холостая проба

Рабочий реагент №32,0 мл 2,0 мл 2,0 мл

Образец-0,1 мл

Пробы перемешать и фотометрировать.

Фотометрирование при длине волны 405 нм.

Стабильность окраски - не менее 8 часов.

РАСЧЕТЫ:

Расчет активности кислой фосфатазы в сыворотке и плазме крови производят по калибровочному графику.

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ:

Общая активность: 67-167 нмоль/(с х л).

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

Причины повышения уровня активности кислой фосфатазы:

- Злокачественная опухоль простаты и ее метастазы (карцинома);

- Аденома простаты;

- Лечебно-диагностические манипуляции, связанные с предстательной железой;

- Простатит;

Инфаркт предстательной железы;

Хирургические вмешательства на простатической железе;

- Болезнь Гоше, болезнь Нимана - Пика;

- Опухоли с метастазами в костную ткань;

- Остеопороз;

- Тромбоэмболии;

- Некоторые наследственные нарушения развития нервной системы.

Понижение:

Фториды, фосфаты и оксалаты могут быть причиной заниженных значений активности фермента.

2. Определение активности б-амилазы

ПРИНЦИП МЕТОДА:

Под действием б-амилазы крахмал гидролизуется с образованием продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Интенсивность уменьшения окраски йод-крахмального комплекса в единицу времени пропорциональна активности фермента.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ):

Сыворотка (плазма) крови (без ЭДТА), моча. Перед проведением анализа мочу развести развести в 10 раз физраствором.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РЕАГЕНТОВ:

РАБОЧИЙ РЕАГЕНТ №1.

Смешать необходимые количества реагента №1 и реагента №2 в соотношении 24 + 1.

Рабочий реагент стабилен 5 суток при температуре хранения 2-8 °С.



РАБОЧИЙ РЕАГЕНТ №2

Смешать в указанном порядке необходимые количества дистиллированной воды, реагента №4 и реагента №3 в соотношении 7:2:1.

Рабочий реагент стабилен 30 суток при температуре хранения 18-25°С в темноте.

РАБОЧИЙ РЕАГЕНТ №3.

Необходимое количество реагента №5 развести дистиллированной водой в 16 раз (например, 1 мл реагента №5 + 15 мл дистиллированной воды).

Концентрация соляной кислоты в полученном реагенте - 0,1 моль/л.

Хранить в плотно закрытой посуде при 18-25°С.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:

Внести в пробирки:

Опытная пробаХолостая проба

Рабочий реагент №10,5 мл 0,5 мл

Инкубировать 5 мин при 37°С.

Добавить в пробирки:

Опытная проба Холостая проба

Образец0,01 мл-

Инкубировать точно 5 минут при 37 °С

Добавить в пробирки:

Опытная пробаХолостая проба

Рабочий реагент №24,0 мл4,0 мл

Рабочий реагент №30,3 мл0,3 мл

Образец-0,01 мл

Пробы охладить, перемешать и немедленно фотометрировать.

Длина волны: 630-690 нм

Стабильность окраски - не более 10 минут.

РАСЧЕТЫ:

Расчет активности б-амилазы. в сыворотке (плазме): Активность = [(Ехол - Еоп)/Ехол] х 66,6 (мг/(с х л);

в моче: Активность = [(Ехол - Еоп)/ Ехол)] х 66,6 х 10 (мг/(с х л); где:

Еоп -оптическая плотность опытной пробы,

Ехол - оптическая плотность холостой пробы,

10 - фактор разведения мочи,

66,6 - коэффициент пересчета.

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ:

В сыворотке (плазме): 3,3-8,9 мг/(с х л).

В моче: до 44 мг/(с х л).

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

Причины повышения активности общей амилазы в сыворотке, моче:

- Острый панкреатит.

- Хронический панкреатит.

- Травма поджелудочной железы.

- Рак поджелудочной железы.

- Закупорка (камнем, рубцом) панкреатического протока.

- Острый аппендицит, перитонит.

- Операции на органах брюшной полости.

- Острый холецистит - воспаление желчного пузыря.

- Кишечная непроходимость.

- Прерванная трубная беременность.

- Разрыв аневризмы аорты.

Причины понижения активности общей амилазы в сыворотке

- Снижение функции поджелудочной железы.

- Тяжелый гепатит.

Муковисцидоз (кистозный фиброз) поджелудочной железы - тяжелое наследственное заболевание, связанное с поражением желез внешней секреции (легких, желудочно-кишечного тракта).

- удаление поджелудочной железы.



3. Определение активности аминотрансфераз

А. Определение аланинаминотрансферазы (АЛТ)МЕТОДОМ РАЙТМАНА-ФРЕНКЕЛЯ:

ПРИНЦИП МЕТОДА:

1. L-аланин + б-кетоглутарат < АЛТ > пировиноградная кислота + L-глутамат.

2. фотометрическое определение содержания пирувата в пробе на основе реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ): Свежая сыворотка или плазма крови без следов гемолиза.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕГО РЕАГЕНТА: Необходимое количество реагента №4 развести дистиллированной водой, свободной от карбонатов, в 10 раз (например, 1 мл реагента №4 + 9 мл дистиллированной воды). Концентрация NaOH в рабочем реагенте - 0,4 моль/л. Срок хранения - 3 месяца в плотно закрытой полиэтиленовой посуде при 18-25 °С.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:

Внести в пробирки:

Опытная проба Холостая проба

Реагент №10,25 мл 0,25 мл

Образец0.05 мл-

Пробы перемешать и инкубировать 30 мин при 37 °С.

Опытная проба Холостая проба

Реагент №20, 25 мл 0,25 мл

Образец - 0,05 мл

Пробы перемешать и инкубировать 20 мин при 18-25°С. Далее внести в пробирки по 2,5 мл рабочего реагента, перемешать.

Фотометрировать через 5-10 мин.

Длина волны: 500-560 нм (лopt = 537нм).

Стабильность окраски - не менее 30 мин.

РАСЧЕТ:

Расчет активности фермента в сыворотке и плазме крови производят по калибровочному графику.

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ: 0,1-0,68 ммоль/(ч х л).

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

Причины повышенной активности АЛТ:

- вирусные инфекции (чрезмерно высокая активность АЛТ - более чем в 10 раз больше нормы - наблюдается, например, при острых гепатитах; при хроническом гепатите оно обычно превышает норму не более чем в 4 раза);

- прием лекарств или иных веществ, которые являются токсичными для печени;

- болезни, замедляющие приток крови к печени (ишемии);

- непроходимость желчных путей, цирроз (обычно в результате хронического гепатита или закупорки желчных путей) и опухоль печени (умеренное повышение АЛТ).

Б. Определение активности аспартатаминотрансфераза (АСТ):

ПРИНЦИП МЕТОДА:

L-аспартат + б-кетоглутарат <АСТ> оксалоацетат + + L-глутамат

2. фотометрическое определение содержания оксалоацетата в пробе на основе реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ): Свежая сыворотка или плазма крови без следов гемолиза.

СОСТАВ НАБОРА:

РЕАГЕНТ №1 - СУБСТРАТНАЯ СМЕСЬ

L-аспарагиновая кислота - 0,1 моль/л

Б-кетоглутаровая кислота-2,0 ммоль/л

фосфатный буфер, рН 7,4-0,1 моль/л

РЕАГЕНТ №2 - РАСТВОР 2,4-ДНФГ

2,4-динитрофенилгидразин-1,0 ммоль/л соляная кислота-1,0 моль/л

КАЛИБРАТОР пируват натрия-1,0 ммоль/л

РЕАГЕНТ №4 - ГИДРООКИСЬ НАТРИЯ NaOH-4,0 моль/л

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕГО РЕАГЕНТА: Необходимое количество реагента №4 развести бидистиллированной или дистиллированной водой, свободной от карбонатов, в 10 раз (например, 1 мл реагента №4 + 9 мл бидистиллированной воды). Концентрация NaOH в рабочем реагенте - 0,4 моль/л. Срок хранения - 3 мес в плотно закрытой полиэтиленовой посуде при 18-25°С.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:

1. Внести в пробирки:

Опытная проба Холостая проба

Реагент №10, 25 мл 0,25 мл

Образец0.05 мл-

Пробы перемешать и инкубировать 60 мин при 37 °С.

2. Добавить в пробирки:

Опытная проба Холостая проба

Реагент №2 0,25 мл 0,25 мл

Образец - 0,05 мл

Пробы перемешать и инкубировать 20 мин при 18-25°С. Далее внести в пробирки по 2,5 мл рабочего реагента, перемешать. Фотометрировать через 5-10 мин. Длина волны: 500-560 нм

Стабильность окраски - не менее 30 мин.

РАСЧЕТЫ:

Расчет активности фермента в сыворотке и плазме крови производят по калибровочному графику.

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ: 0,028-0,190 мкмоль/(с х л).

КЛИНИКО-ДАИГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

В норме активность АСТ в крови низкая.

Чрезмерно высокая активность АСТ (более чем в 10 раз больше нормы) обычно вызвана вирусными инфекциями. Также она может значительно увеличиваться в результате приема лекарств или иных веществ, которые являются токсичными для печени, а также из-за болезней, замедляющих приток крови к печени (ишемии).

При хроническом гепатите активность АСТ обычно превышает норму не более чем в 4 раза. Она колеблется между нормальной и несколько повышенной, поэтому часто для выяснения степени заболевания и назначается анализ. Такие заболевания, как непроходимость желчных путей, цирроз и некоторые виды рака печени способствуют умеренному повышению АСТ. После перенесенного инфаркта и при повреждении мышц активность АСТ также может повышаться, обычно намного больше АЛТ.

При большинстве заболеваний печени активность АЛТ в крови выше активности АСТ, так что соотношение АСТ/АЛТ будет низким. Однако существует несколько исключений: алкогольный гепатит, цирроз и повреждение мышц.

В. Определение активности гамма-глуматилтрансферазы (УНИФИЦИРОВАННЫМ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ):

ПРИНЦИП МЕТОДА: L-г-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид + глицилглицин -ггт> п-нитроанилин + L-глутамилглицин + 5-амино-2-нитробензоат

Количество образовавшегося в единицу времени п-нитроанилина пропорционально активности фермента и определяется по оптической плотности образца при 405 нм.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ): Сыворотка или плазма крови.

СОСТАВ НАБОРА:

РЕАГЕНТ №1 - БУФЕР

конечная концентрация в рабочем реагенте трис/HCl, рН 8,25 - 200 ммоль/л, глицилглицин - 70 ммоль/л

РЕАГЕНТ №2 - УКСУСНАЯ КИСЛОТА

уксусная кислота-350 г/л

РЕАГЕНТ №3 - L-г-глутамил-3-карбокси-п-нитроанилид L-Glupa-C-3,5 ммоль/л

КАЛИБРАТОР

п-нитроанилин-518 мг/л.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕГО РЕАГЕНТА:

Смешать необходимые количества реагента №1 и реагента №3 в соотношении 4 + 1. Рабочий реагент стабилен 30 суток при температуре хранения 2-8°С в темноте.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:

1. Внести в пробирки:

Опытная пробаХолостая проба

Рабочий реагент0,5 мл0,5 мл

Образец0,05 мл-

Инкубировать точно 15 мин при 37 °С.

2. Внести в пробирки:

Опытная проба Холостая проба

Реагент №21,0 мл 1,0 мл

Бидистилированная вода 2,0 мл 2,0 мл

Образец - 0,05 мл

Пробы перемешать и фотометрировать. Стабильность окраски - не менее 8 часов.

РАСЧЕТЫ:

Расчет активности г-глутамилтрансферазы в сыворотке и плазме крови производят по калибровочному графику.

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ:

Мужчины 250-1767 нмоль/(с х л)

Женщины 167-1100 нмоль/(с х л)

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

1. Превышение верхнего предела нормы более чем в 10 раз:

- холестаз

- алкогольное поражение печени.

2. Превышение верхнего предела нормы более чем в 5-10 раз:

- гепатит (острый и хронический)

- цирроз

- др. заболевания печени

- панкреатит

3. Превышение верхнего предела нормы менее чем в 5 раз:

- злоупотребление алкоголем

- лекарства, вызывающие индукцию фермента

- застойная сердечная недостаточность.

Г. Определение активности гамма-глуматилтрансферазы (оптимизированным кинетическим методом):

ПРИНЦИП МЕТОДА:

L-г-глутамил-3-карбокси-п-нитроанилид + глицилглицин -ггт> п-нитроанилин + L-глутамилглицин + 5-амино-2-нитробензоат.

Скорость образования п-нитроанилина пропорциональна активности фермента и определяется по увеличению оптической плотности образца при 405 нм.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ): Сыворотка или плазма крови.

СОСТАВ НАБОРА:

РЕАГЕНТ №1 - БУФЕР трис/HCl, рН 8,25-100 ммоль/л

Глицилглицин-120 ммоль/л

РЕАГЕНТ №2 - L-г-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид

L-Glupa-C-9 ммоль/л.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕГО РЕАГЕНТА: Смешать необходимые количества реагента №1 и реагента №2 в соотношении 4 + 1. Рабочий реагент стабилен 20 суток при температуре хранения 2-8°С в темноте.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:

Длина волны: 405 нм.

Длина оптического пути: 1 см.

Температура инкубации: 37°С (30°С, 25°С). Фотометрирование: против воздуха или против рабочего реагента, разведенного водой в соотношении = 10/1.

Соотношение рабочий реагент/образец = 10/1 (например, 1 мл рабочего реагента + 0,1 мл образца)

Внести образец в рабочий реагент. Перемешать, инкубировать при выбранной температуре 1 минуту. Затем считывать изменения адсорбции с интервалом 1 минута (или через другие равные промежутки времени) в течение 3 минут.

Вычислить среднее изменение адсорбции за 1 минуту (ДА/мин).

РАСЧЕТЫ:

Расчет активности г-глутамилтрансферазы (U/л): Активность = 1158 х ДА/мин.

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ:

У женщин-10-35 Е/л

У мужчин-18-49 Е/л.

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

1. Превышение верхнего предела нормы более чем в 10 раз:

- холестаз

- алкогольное поражение печени.

2. Превышение верхнего предела нормы более чем в 5-10 раз:

- гепатит (острый и хронический)

- цирроз

- др. заболевания печени

- панкреатит

3. Превышение верхнего предела нормы менее чем в 5 раз:

- злоупотребление алкоголем

- лекарства, вызывающие индукцию фермента

- застойная сердечная недостаточность.



2. Участие в контроле качества

Точность техники анализа можно контролировать, исследуя пробы специального контрольного материала. Контрольный материал может быть изготовлен в относительно больших количествах, что позволяет применять его сразу во многих лабораториях, обеспечивая в течение длительного времени единство измерения. Образцы контрольного материала готовятся идентичными определяемым веществам, что уменьшает погрешности, обусловленные несоответствием образцов и анализируемых проб.

Виды контрольных материалов

Водные стандарты.

Слитая сыворотка, приготовленная в лаборатории.

Сыворотка, приготовленная промышленным путем с неисследованным и исследованным содержанием компонентов.

Для контроля сходимости и воспроизводимости не нужно знать номинальные величины компонентов в контрольном материале. Поэтому используют сыворотку с неисследованным содержанием компонентов. Это может быть сыворотка, изготовленная промышленным путем или слитая сыворотка, приготовленная в лаборатории.

Под контролем качества работы клинико-диагностических лабораторий понимают систему мер, направленных на количественную оценку точности, воспроизводимости, правильности определений параметров метаболизма в организме. Сущность контроля качества лабораторных исследований состоит в сопоставлении результатов диагностических исследований проб биологических жидкостей, производимых в лаборатории, с результатами исследований контрольных материалов и в измерении величины отклонения.

Цель контроля качества работы лабораторий

Устранение систематических ошибок и сведении до минимума случайных ошибок внутри лаборатории.

Достижение оптимальных стандартных условий исследования биологических жидкостей во всех лабораториях.

Для этого контроль качества должен:

Быть систематическим (по единым правилам, повседневным, объективным).

Охватывать все области измерения (норма, патология).

Производиться в реальных условиях работы клинико-диагностических лабораторий.

Критерии контроля качества измерений:

Воспроизводимость - качество измерения, отражающее близость друг к другу результатов измерений, выполненных в различных условиях (в разное время, в разных местах).

Точность - качество измерения, отражающее близость результатов к истинному значению измеренной величины.

Правильность - качество измерения, отражающее близость к нулю систематических погрешностей в их результатах, т.е. соответствие среднего значения результатов измерений истинной величине измеряемого компонента.

Сходимость - качество измерения, отражающее близость друг к другу результатов измерений, выполняемых в одинаковых условиях (параллельные пробы).

3. Утилизация отработанного материала

Отходы класса Б (опасные) подвергают обязательной дезинфекции на месте их образования в соответствии с действующими нормативными документами (СП I. 3.1285-03). Обеззараженные отходы собирают в одноразовую герметичную упаковку желтого цвета. Для твердых отходов, имеющих острые края (битая стеклянная посуда, пипетки и т.п.), используют твердую упаковку, для игл от шприцов используют специальные одноразовые контейнеры. Одноразовые емкости желтого цвета с отходами класса Б маркируют надписью: «Опасные отходы - «Класс Б» с указанием названия лаборатории, кода учреждения, даты, фамилии ответственного за сбор отходов лица. Заполненные емкости помещают во влагонепроницаемые баки желтого цвета с той же маркировкой, герметично закрывают крышкой и переносят к металлическим контейнерам, которые размещены на специальной площадке хозяйственного двора учреждения (лаборатории). Дальнейшую утилизацию отходов проводят централизовано специальным автотранспортом на полигон ТБО или децентрализовано к месту кремации, если учреждение имеет крематорий для сжигания отходов.

4. Оформление документации

В биохимической лаборатории обязательному заполнению подлежат:

1.Журнал приема биоматериала.

2. Журнал учета количества выполненных анализов в лаборатории

3. Журнал регистрации результатов исследования.

4. Журнал учета спирта.

5. Журнал учета сильнодействующих и ядовитых веществ.

6. Журнал учета проведения внутрилабораторного контроля качества.

5. Анализ результатов

В полученном анализе результатов должны быть указаны:

1. ФИО пациента

2. Дата рождения, возраст

3. Дата проведения анализа

4. Результаты исследования биохимического анализа крови, мочи, СМЖ.

5. ФИО и подпись МЛТ, печать.



3 день. Исследование активности ферментов

1. Определение активности общей креатинкиназы. лактатдегидрогеназы и холинэсиеразы

А. Определение активности общей креатинкиназы:

ПРИНЦИП МЕТОДА:

1. Фосфокреатин + АДФ <CK> креатин + АТФ

2. АТФ + глюкоза <НК> АДФ + глюкозо-6-фосфат

3. Глюкозо-6-фосфат + НАДФ <G-6-PDH> 6-фосфоглюконат + + НАДФ*H

Cкорость восстановления НАДФ в НАДФ*H пропорциональна активности креатинкиназы (СК) в пробе.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ): Сыворотка или плазма крови.

СОСТАВ НАБОРА РЕАГЕНТ:

№1 - БУФЕР имидазол-100 ммоль/л

Глюкоза-20 ммоль/л

ацетат магния-10 ммоль/л

РЕАГЕНТ №2 - ЛИОФИЛИЗАТ концентрация в рабочем реагенте:

Фосфокреатин-30 ммоль/л

N-ацетилцистеин-20 ммоль/л

ЭДТА-2 ммоль/л

АДФ-2 ммоль/л

НАДФ-2 ммоль/л

АМФ-5 ммоль/л

Диаденозинпентафосфат-10 мкмоль/л

G-6-PDH-1500 U/л

HK-2500 U/л.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕГО РЕАГЕНТА: Растворить содержимое одного флакона №2 в 10 мл реагента №1. Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать рабочий реагент после полного растворения лиофилизата при комнатной температуре 10-20 минут. Рабочий реагент стабилен 7 суток при температуре хранения 2-8°С.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:

Длина волны: 334, 340 или 365 нм. Соотношение рабочий реагент/образец = 25/1 (например, 0,5 мл рабочего реагента + 0,02 мл образца).

Внести образец в рабочий реагент. Перемешать, инкубировать при выбранной температуре 3 мин. Затем считывать изменения адсорбции с интервалом 1 минута (или через другие равные промежутки времени) в течение 3 минут. Вычислить среднее изменение адсорбции за 1 минуту (ДА/мин).

РАСЧЕТЫ:

Расчет активности креатинкиназы (U/л):

Активность = 7429 х ДА365 нм/мин

Активность = 4127 х ДА340 нм/мин,

Активность = 4207 х ДА334 нм/мин.

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ:

Женщины- до 165 U/л

Мужчины-до 190 U/л

Новорожденные-до 325 U/л

Дети-до 225 U/л.

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

Причины повышения активности креатинкиназы общей:

инфаркт миокарда,

миокардиты,

мышечные дистрофии,

травмы, ожоги,

гипотиреоз,

опухолевый процесс в организме,

распад опухоли,

интенсивная физическая нагрузка,

судороги, эпилептический статус,

оперативные вмешательства.

Причины понижения активности креатинкиназы общей:

снижение мышечной массы,

алкогольное поражение печени,

коллагенозы (например, ревматоидный артрит),

гипертиреоз,

прием аскорбиновой кислоты, амикацина, аспирина,

беременность.

Б. Определение лактатдегидрогеназы:

ПРИНЦИП МЕТОДА: пируват + NADH + H+ <ЛДГ> лактат + NAD+ Cкорость окисления NADH в NAD+ пропорциональна активности ЛДГ.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ): Свежая сыворотка или плазма крови без следов гемолиза.

СОСТАВ НАБОРА РЕАГЕНТ:

№1 - БУФЕР

Пируват-0,60 ммоль/л

фосфатный буфер, pH 7,5-50,0 ммоль/л

РЕАГЕНТ №2 - ЛИОФИЛИЗАТ концентрация в рабочем реагенте:

NADH-0,18 ммоль/л.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕГО РЕАГЕНТА: Растворить содержимое одного флакона №2 в 10 мл реагента №1. Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать рабочий реагент после полного растворения лиофилизата при комнатной температуре 5-10 минут. Рабочий реагент стабилен 24 часа при температуре хранения 2-8°С или 3 часа при 18-25°С.



ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

Длина волны: 334, 340 или 365 нм.

Температура инкубации: 37°С (30°С, 25°С). Соотношение рабочий реагент/образец:

1. при 37°С - 100/1, (например, 1 мл рабочего реагента + 0,01 мл образца);

2. при 30°С/25°С - 50/1, (например, 0,5 мл рабочего реагента + 0,01 мл образца).

Внести образец в рабочий реагент. Перемешать, инкубировать при выбранной температуре 1 мин. Затем считывать изменения адсорбции с интервалом 1 минута (или через другие равные промежутки времени) в течение 3 минут. Вычислить среднее изменение адсорбции за 1 минуту (ДА/мин).

РАСЧЕТЫ:

Расчет активности лактатдегидрогеназы (U/л). При 37 °С: Активность = 29705 х ДА365 нм/мин,

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ:

37 °С-225-450 U/л

30 °С-160-320 U/л

25 °С-120-240 U/л.

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

Причины повышения активности лактатдегидрогеназы общей: инфаркт миокарда, легочная эмболия и инфаркт легкого, заболевания крови, сопровождающиеся гемолизом (гемолитическая, пернициозная, мегалобластическая, серповидно-клеточная анемии, эритремия), злокачественные новообразования лейкозы, патология печени (вирусные и токсические гепатиты, цирроз печени, обтурационная желтуха, алкогольная болезнь печени), болезни почек (инфаркт почки, гломерулонефрит, пиелонефрит), патология мышц (мышечная дистрофия, травма, атрофия), переломы костей, инфаркт кишечника, острый панкреатит,инсульт, тяжелые состояния, сопровождающиеся гипоксией, гипер- и гипотермией, ожоговая болезнь, преждевременная отслойка плаценты, гипотиреоз.

В. Определение холинэстеразы:

ПРИНЦИП МЕТОДА:

Холинэстераза (ХЭ) катализирует гидролиз бутирилтиохолина до тиохолина и масляной кислоты. Тиохолин восстанавливает калий железосинеродистый (красная кровяная соль) до бесцветного железистосинеродистого калия (жёлтая кровяная соль). Скорость изменения оптической плотности при длине волны 405 нм пропорциональна активности холинэстеразы в образце.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ):

Свежая сыворотка или плазма крови (гепарин, ЭДТА). Активность фермента сохраняется в течение 7 дней при температуре хранения 2-8 °С. Не следует использовать для анализа гемолизированные или хилезные образцы. Не применять фторид натрия, так как он ингибирует активность холинэстеразы.

СОСТАВ НАБОРА:

Реагент №1. Буфер

Фосфатный буфер, pH 7,8-75 ммоль/л

Калий железосинеродистый -2,0 ммоль/л

Реагент №2. СУБСТРАТ

Бутирилтиохолин-15 ммоль/л.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:

Внести в пробирку Опытная проба Холостая проба

Реагент №1400 мкл 400 мкл

Образец 8 мкл-

Вода деионизованная -8 мкл

Перемешать, инкубировать 3 минуты при 37°С, а затем добавить:

Реагент №2100 мкл100 мкл

Пробу перемешать, инкубировать 2 минуты при 37°С, измерить оптическую плотность и повторить измерение 3 раза с интервалом 1 минута (или через другие равные промежутки времени) в течение 3 минут. Реакция идет с уменьшением оптической плотности.

РАСЧЕТЫ:

1. Вычислить среднее изменение оптической плотности за 1 минуту для опытной (ДЕоп/мин) пробы и для холостой (ДAЕол/мин) пробы.

2. Вычислить изменение оптической плотности за 1 минуту (ДЕ/ мин) для опытных проб по формуле: ДЕ/мин=ДЕоп /мин - ДЕхол /мин

3. Активность ХЭ в сыворотке (плазме) крови (А) в Ед/л определить по формуле:

4. А = ДЕ/мин Д F, где: ДЕ/мин - изменение оптической плотности пробы, ед. опт. плотности; F - фактор для расчета активности ХЭ в сыворотке/плазме крови, F=68500.

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ:

В сыворотке/плазме крови: 4499-9999 Ед/л.

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

При выявлении отравлений пестицидами:

После отравления фосфорорганическими веществами активность ацетилхолинэстеразы и псевдохолинэстеразы может стать на 80 % меньше нормы, а уже при падении больше чем на 40 % симптомы становятся тяжелыми.

Значительное снижение активности холинэстеразы обычно свидетельствует о чрезмерном поглощении фосфорорганических веществ организмом.

При анализе на чувствительность к сукцинилхолину:

У 3% людей активность псевдохолинэстеразы понижена из-за наследственности, и в случае введения миорелаксанта сукцинилхолина они будут испытывать на себе его эффект более продолжительное время, чем нужно. У таких пациентов низкая активность псевдохолинэстеразы указывает на повышенный риск продолжительного действия миорелаксанта.

Кроме того, активность холинэстеразы может снижаться при хронических болезнях печени и недоедании, беременности, почечной недостаточности, шоковом состоянии и некоторых типах рака.

2. Участие в контроле качества

Точность техники анализа можно контролировать, исследуя пробы специального контрольного материала. Контрольный материал может быть изготовлен в относительно больших количествах, что позволяет применять его сразу во многих лабораториях, обеспечивая в течение длительного времени единство измерения. Образцы контрольного материала готовятся идентичными определяемым веществам, что уменьшает погрешности, обусловленные несоответствием образцов и анализируемых проб.

Виды контрольных материалов

Водные стандарты.

Слитая сыворотка, приготовленная в лаборатории.

Сыворотка, приготовленная промышленным путем с неисследованным и исследованным содержанием компонентов.

Для контроля сходимости и воспроизводимости не нужно знать номинальные величины компонентов в контрольном материале. Поэтому используют сыворотку с неисследованным содержанием компонентов. Это может быть сыворотка, изготовленная промышленным путем или слитая сыворотка, приготовленная в лаборатории.

Под контролем качества работы клинико-диагностических лабораторий понимают систему мер, направленных на количественную оценку точности, воспроизводимости, правильности определений параметров метаболизма в организме. Сущность контроля качества лабораторных исследований состоит в сопоставлении результатов диагностических исследований проб биологических жидкостей, производимых в лаборатории, с результатами исследований контрольных материалов и в измерении величины отклонения.

Цель контроля качества работы лабораторий

Устранение систематических ошибок и сведении до минимума случайных ошибок внутри лаборатории.

Достижение оптимальных стандартных условий исследования биологических жидкостей во всех лабораториях.

Для этого контроль качества должен:

Быть систематическим (по единым правилам, повседневным, объективным).

Охватывать все области измерения (норма, патология).

Производиться в реальных условиях работы клинико-диагностических лабораторий.

Критерии контроля качества измерений:

Воспроизводимость - качество измерения, отражающее близость друг к другу результатов измерений, выполненных в различных условиях (в разное время, в разных местах).

Точность - качество измерения, отражающее близость результатов к истинному значению измеренной величины.

Правильность - качество измерения, отражающее близость к нулю систематических погрешностей в их результатах, т.е. соответствие среднего значения результатов измерений истинной величине измеряемого компонента.

Сходимость - качество измерения, отражающее близость друг к другу результатов измерений, выполняемых в одинаковых условиях (параллельные пробы).

3. Утилизация отработанного материала

Отходы класса Б (опасные) подвергают обязательной дезинфекции на месте их образования в соответствии с действующими нормативными документами (СП I. 3.1285-03). Обеззараженные отходы собирают в одноразовую герметичную упаковку желтого цвета. Для твердых отходов, имеющих острые края (битая стеклянная посуда, пипетки и т.п.), используют твердую упаковку, для игл от шприцов используют специальные одноразовые контейнеры. Одноразовые емкости желтого цвета с отходами класса Б маркируют надписью: «Опасные отходы - «Класс Б» с указанием названия лаборатории, кода учреждения, даты, фамилии ответственного за сбор отходов лица. Заполненные емкости помещают во влагонепроницаемые баки желтого цвета с той же маркировкой, герметично закрывают крышкой и переносят к металлическим контейнерам, которые размещены на специальной площадке хозяйственного двора учреждения (лаборатории). Дальнейшую утилизацию отходов проводят централизовано специальным автотранспортом на полигон ТБО или децентрализовано к месту кремации, если учреждение имеет крематорий для сжигания отходов.

...