Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Дагестанский государственный университет

Биологический факультет

Специальность 050102.65 - «Учитель биологии»

Дипломная работа

Тема:

Процессы перекисного окисления липидов эритроцитов сусликов при зимней спячке и искусственной гипотермии

Выполнила Асадуллаева А.Р.

Студентка 6 курса з.о.

Научный руководитель: д.б.н.,

профессор Кличханов Н.К.

Махачкала - 2014

Содержание

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Активные формы кислорода и антиокислительная активность тканей

1.2 Свободно-радикальные процессы в крови при зимней спячке

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования

2.2 Условия зимней спячки и искусственной гипотермии

2.3 Биохимические методы исследования

2.3.1 Определение содержания малонового диальдегида в эритроцитах

2.3.2 Определение содержания диеновых конъюгатов в эритроцитах

2.3.3 Определение антиокислительной активности гидрофильных компонентов плазмы крови

2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1 Свободнорадикальные процессы в крови сусликов при зимней спячке

3.2 Свободнорадикальные процессы в крови сусликов при искусственной гипотермии

Выводы

Список литературы

Список сокращений

АОС - антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

МДА - малоновый диальдегид

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТХУ - трихлоpуксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

GSH - восстановленный глутатион

Введение

Актуальность проблемы. В ходе эволюции у ряда животных умеренных широт возникло приспособление к перенесению зимней бескормицы, выражающееся в значительном снижении температуры тела и минимализацией метаболизма. Зимняя спячка наблюдается у представителей ряда классов (амфибий, рептилий, около 200 видов млекопитающих, некоторых птиц) и является одним из примеров широко распространенного в животном мире явления торпидности (Кличханов, Мейланов, 2011). Было подсчитано (Wang, Lee, 1996), что в течение зимней спячки сусликов экономится более 90% энергии, которая могла бы быть потрачена на поддержание обычного уровня метаболизма.

Установлено, что зимняя спячка прерывается периодическими пробуждениями через каждые 10-15 дней, во время которых восстанавливается нормальная температура тела и тратится значительное количество энергии (Carey et al., 2003). Длительность периодов непрерывной спячки (баутов) изменяется в динамике гибернации: в начале и конце спячки она короче (5-6 дней), а в середине спячки - длиннее (12-15 дней). При спонтанном пробуждении, длящееся 2-2,5 ч., резко изменяются физиологические параметры животного: ускоряется частота дыхания, сердечных сокращений, скорость кровотока (Buck, Barnes, 2000). Это способствует возникновению состояния, похожего на гипоксию/реперфузию, с избыточной генерацией активных форм кислорода.

При зимней спячке существует определенная опасность свободно-радикального окисления липидов. Это связано с тем, что уже в ходе подготовки к спячке в резервных жирах и липидах мембран клеток (Лапинский, Невретдинова, 1991) накапливаются полиненасыщенные жирные кислоты. Известно, что именно полиненасыщенные жирные кислоты являются основными субстратами для радикалов кислорода в процессе перекисного окисления. Данные об интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков тканей сусликов при зимней спячке немногочисленны и противоречивы (Лапинский, Неврединова, 1991; Carey et al., 2003; Астаева, Кличханов, 2009). Кроме того, почти не исследовано влияние искусственной гипотермии на интенсивность процессов ПОЛ тканей сусликов в их активный летний период.

Цель и задачи исследования. Цель исследования состояла в выяснении характера изменения интенсивности процессов ПОЛ в эритроцитах сусликов при зимней спячке и искусственной гипотермии.

Были поставлены следующие задачи:

1. Определить содержание первичных (диеновые конъюгаты) и вторичных (кетотриены, малоновый диальдегид) продуктов ПОЛ в эритроцитах.

2. Изучить антиокислительную активность плазмы крови.

Научная новизна. Установлено, что при глубокой зимней спячке сусликов существенно снижается интенсивность перекисного окисления липидов эритроцитов. Это снижение свободнорадикальных процессов происходит на фоне повышения антиокислительной активности представленной гидрофильными компонентами плазмы крови. Выяснено, что искусственная гипотермия сусликов в летней активный период, также не стимулирует свободнорадикальные процессы в крови.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные об устойчивости клеток крови зимоспящих животных к свободнорадикальным процессам могут быть использованы для разработки методов и подходов профилактики и лечения заболеваний у человека, связанных с развитием окислительного стресса.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Активные формы кислорода и антиокислительная активность тканей

Для высших форм жизни очень важно наличие в среде обитания молекул кислорода, полное четырехвалентное восстановление которого до воды составляет основу биоэнергетики человека и животных. Вместе с тем, O₂ является чрезвычайно химически активным соединением, оказывающим при определенных условиях токсическое действие. Агрессивные свойства кислорода определяются строением его атома и молекулы. Наличие на внешнем энергетическом уровне двух неспаренных электронов и незавершенность орбиты являются причиной образования активных форм кислорода (АФК).

В норме основная масса потребляемого кислорода подвергается четырехвалентному восстановлению цитохромоксидазой с образованием молекулы воды, без высвобождения активных интермедиатов (Гривенникова, Виноградов, 2013). Наряду с этим, в клетке протекают реакции одно-, двух-, и трехэлектронного восстановления кислорода в результате само- и энзиматического окисления соединений с образованием АФК: супероксидного анион радикала (О₂), синглетного кислорода (О₂), гидроксильного радикала (ОНя), пероксидного радикала (НО₂я), пероксида водорода (Н₂О₂), нитрорадикала (NOя) (Костюк, Потапович, 2004).

АФК являются активными участниками большинства химических процессов, протекающих в клетке, играют важную роль в ферментативных реакциях. Поэтому процессы генерации АФК при достаточно низкой их интенсивности относятся к нормальным метаболическим процессам. Образуются они во всех клетках, которые используют кислород. Примерно 5% всего поступающего в клетку кислорода расходуется на образование АФК, а 95% - на биологическое окисление (Гривенникова, Виноградов, 2013). АФК образуются в электронно-транспортной цепи митохондрий и при микросомальном окислении.

Пути генерации АФК весьма разнообразны (Меньщикова и др., 2006). Один из возможных путей образования свободных радикалов состоит в одноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода ионами двухвалентного железа:

O₂ + Fe²⁺ + H⁺> Fe³⁺ + НО₂я

Одноэлектронное восстановление кислорода может приводить и к появлению другого свободного радикала - супероксидного анион-радикала:

O₂ + з > О₂

Супероксидный анион-радикал, так же, как и Н₂О₂, сам по себе малоактивен по отношению к молекулярным компонентам клетки. Однако в присутствии Fe²⁺ эти соединения вступают в реацию Хабера-Вейса с образованием гидроксильных радикалов (Губський и др., 2004):

Fe³⁺ + O₂ > Fe²⁺ + O₂

Fe²⁺ + H₂O₂ > Fe³⁺ + OH^- + OHя

O₂ + H₂O₂ > O₂ + OH^- + OHя

Образование радикала ОНя возможно также в результате реакции Фентона (Меньщикова и др., 2006):

Н₂О₂ + Fe²⁺ > Fe³⁺ + OHя + OH?

ROOH + Fe²⁺ > Fe³⁺ + ROя + OH?

В живых системах О₂ представляет собой промежуточный продукт многих биохимических реакций, таких как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, а также метаболизма ксенобиотиков. Однако основными источниками его образования являются ферментативные системы: НАДФ·H-оксидаза фагоцитирующих клеток, ксантиоксидаза, митохондриальная цитохром-c-оксидаза и микросомальные монооксигеназы (Меньщикова и др., 2008).

Перекись водорода (Н₂О₂) относится к окислителям средней силы. В отсутствии ферментов, разрушающих ее, она относительно стабильна и может мигрировать в клетки и ткани. В живых организмах основным источником Н₂О₂ являются ферментативные реакции с оксидазами: ксантиноксидазой, оксидазой L-аминокислот и другими. Н₂О₂ образуется также в результате реакции дисмутации, катализируемой супероксиддисмутазой (Хавинсон и др., 2003).

Гидроксильный радикал (OHя) является наиболее реакционноспособным из АФК, менее долгоживущим (по разным оценкам от 2·10^-9 до 8·10^-9 с) и наиболее токсичным для биологических систем: он может разрывать любую C-H- или C-C- связь (Беленичев и др., 2009).

OHя радикал образуется в реакциях окисления арахидоновой кислоты, в реакциях Хабера-Вейса, при микросомальном окислении, в реакциях с флавиновыми ферментами и CoQ. Однако основным источником OHя в биологических системах служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, главным образом Fe²⁺ (Хавинсон и др., 2003).

АФК инициируют цепные реакции окисления субстратов, среди которых наиболее известными являются липиды. Процессы ПОЛ протекают во всех клетках живых организмов.

Радикальные процессы ПОЛ протекают, главным образом, в липидных структурах мембран. Особенно легко перекисному окислению подвергается арахидоновая и линоленовая кислоты, дающие в начале перекиси липидов, а затем различные спирты, альдегиды, в том числе, малоновый диальдегид (МДА), изменение содержания которого служит основным показателем интенсивности ПОЛ (Guйraud et al., 2010).

Активирование ПОЛ приводит к образованию перекисных соединений органической и неорганической природы, которые в силу высокой электрофильности способствуют возникновению последовательных изменений физико-химических свойств мембран, начинающихся с перестройки липид-липидных и липид-белковых взаимодействий в бислое и завершающихся биохимической патологией клетки, нарушением процессов активного и пассивного транспорта, активацией лизосомальных гидролаз, снижение активности мембранных ферментов, появлением дефектов мембран и пр. (Дубинина, 2006).

В ходе эволюции в организме образовалась антиоксидантная система (АОС), которая препятствует накоплению АФК, регулирует их содержание в тканях. Действие АОС направлено, во-первых, на снижение уровня генерируемых АФК; во-вторых, на устранение пула металлов переменной валентности, в частности железа и меди (Барабой, 2006). Это обеспечивается за счет связывания их с белками (трансферрином, лактоферрином, церуллоплазмином).

АОС - сложная многокомпонентная система, препятствующая проявлению повреждающего действия АФК и перекисных соединений, обеспечивает связывание и модификацию радикалов, предупреждает образование или разрушение перекисей. В состав АОС входят гидрофильные и гидрофобные органические вещества с восстановительными свойствами; ферменты, поддерживающие гомеостаз этих веществ и антиперекисные ферменты (Дубинина, 2006).

К гидрофильным антиоксидантам относятся глутатион, низкомолекулярные SH-соединения, эрготионеин, аскорбиновая кислота и др. Эти органические вещества являются «ловушками» свободных радикалов, обезвреживают перекисные соединения (Донцов и др., 2006).

Гидрофобные антиоксиданты - эта группа веществ, взаимодействующих с радикалами, ведущими цепи окисления, обрывающие эти цепи и замедляющие цепной процесс. К этой группе антиоксидантов относятся: б-токоферол, тироксин, стероидные гормоны, убихинон, витамины К, А, каратиноиды (Барабой, 2006).

Другая часть системы антиоксидантной защиты организма представлена группой антиперекисных ферментов. К ним относятся: супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза и глутатионтрансфераза, которые последовательно восстанавливают O₂, Н₂О₂ и органические гидроперекиси; каталаза и пероксидаза, разрущающие Н₂О₂ (Кличханов и др., 2012).

СОД является единственным среди известных антиоксидантных ферментов, непосредственно обеспечивающих обрыв цепей кислородзависимых реакций в клетках аэробных организмов. СОД осуществляет рекомбинацию радикалов O₂с образованием перекиси водорода и триплетного кислорода:

2O₂^- + 2Н⁺ > Н₂О₂ + О₂

Существует несколько изоферментных форм СОД с широким диапазоном действия рН от 4,8 до 10,2. Медь-цинковая форма СОД (Cu, Zn-СОД), чувствительная к цианиду, локализована, в основном, в цитозоле, в межмембранном пространстве митохондрий эукариот (Дубинина, 2006). В цитоплазме эукариот этот фермент присутствует в виде димеров с молекулярным весом 31300. Каждая субъединица содержит один атом меди и атом цинка. Предполагается, что медь связана с тремя атомами имидазольной группы. Причем, главное значение здесь имеют атомы меди, в то время как атомы цинка играют стабилизирующую роль. Кроме того, каждая субъединица внутри белковой цепи содержит дисульфидный мостик и одну SH-группу. Эти составные элементы СОД играют определенную роль и в противоокислительном действии. С одной стороны, свободная SH-группа, являясь донором водорода может непосредственно восстанавливать токсические интермедиаты кислорода, а с другой стороны - дисульфид, восстанавливаясь, может сам стать источником двух активных SH-групп.

Марганцевая форма СОД (Mn-СОД), цианидрезистентная, содержится в митохондриях и бактериях (Зенков и др., 2001). Этот фермент с молекулярным весом 40000 содержит два атома Mn (III). Аналогичные ферменты были выделены из митохондрий куриной печени и из дрожжей.

СОД обнаружена также во внеклеточном пространстве. Внеклеточная, экстрацеллюлярная СОД обнаружена в плазме, лимфе, синовиальной жидкости, моче, в пищеварительных секретах (соке поджелудочной железы, двенадцатиперстной кишке, желчи) (Донцов и др., 2006).

Синергистом СОД в клетке является каталаза, препятствующая накоплению продукта супероксиддисмутазной реакции - перекиси водорода, ингибитора СОД. Каталаза - гемсодержащий фермент, локализованный преимущественно в клетках, богатых пероксисомами (Меньшикова и др., 2006). Около 40% общего количества белка пероксисом из печени крысы составляет каталаза. Она катализирует следующую реакцию:

2Н₂О₂ > 2 Н₂О + О₂

Каталазы, полученные из различных биологических объектов, обладают близкими значениями молекулярного веса (225000 до 270000) и большинство из них имеют оптимум действия ~ 7,6. Содержание каталазы у млекопитающих особенно велико в эритроцитах, печени, почках (Барабой, 2006). Очень низкий уровень фермента в мозге, щитовидной железе, половых железах. Возможно, это зависит от того, насколько те или иные клетки подвержены вредному влиянию избытка Н₂О₂.

К антиоксидантным ферментам относят также глутатионпероксидазу, которая катализирует реакцию между восстановленным глутатионом (GSH) и гидроперекисями жирных кислот, обезвреживая последние путем их превращения в жирные оксикислоты и глутатионтрансферазу:

2GSH + ROOH > GS-SG + R-ОН + Н₂О

Глутатионпероксидаза, наряду с каталазой, участвует в восстановлении Н₂О₂, однако, в целом роль глутатионпероксидазы значительно важнее для клетки (Кличханов и др., 2012). Это связано с тем, что:

1) каталаза сосредоточена в основном в пероксисомах, а глутатионпероксидаза обезвреживает Н₂О₂ в цитозоле и митохондриях;

2) сродство глутатионпероксидазы к Н₂О₂ выше, поэтому именно глутатионпероксидаза защищает от чаще возникающих низких концентраций Н₂О₂;

3) недостаточность или ингибирование глутатионпероксидазы (но не каталазы) приводит к увеличению пероксидации и к повреждению клеток;

4) в некоторых тканях (сердце) каталаза почти отсутствует и тогда глутатионпероксидаза играет важную роль в метаболизме Н₂О₂.

Общая сумма биоантиоксидантов создает в тканях «буферную антиокидантную систему», обладающую определенной «емкостью». Отмечено (Барабой, 2006), что у многоклеточных животных имеются тканевые отличия в степени развития этой системы, т.е. разные ткани имеют неодинаковую антиокислительную «емкость». Соотношение прооксидантных и антиоксидантных систем в тканях определяет, так называемый, «антиоксидантный статус организма».

1.2 Свободно-радикальные процессы в крови при зимней спячке

Уникальной моделью физиологического снижения температуры тела теплокровных организмов является зимняя спячка. В период зимней спячки температура тела животного снижается, как правило, до уровня температуры окружающей среды, лишь на доли градусов превышая ее. Другим не менее характерным проявлением зимней спячки является резкое снижение обмена веществ (в десять и более раз) по сравнению с бодрствованием (Кличханов, Мейланов, 2011).

Во время глубокой зимней спячки наблюдается резкое замедление частоты дыхания. Так, например, у суслика частота дыхания в бодрствующем состоянии составляет 100-360 дыхательных движений в минуту, а при впадении в спячку падает до 15 и даже до 1 в минуту (Игнатьев и др., 2001).

Сильно изменяется во время зимней спячки кровообращение. Частота сердечных сокращений падает у ежа с 230 до 24 в минуту. У суслика частота пульса урежается в 8-10 раз. Минутный объем сердца у суслика может снижаться 65 раз. Резко замедляется во время спячки кровоток (Carey et al., 2003). Однако несмотря на то, что кровоток резко замедлен, кровь между различными органами распределяется сходно с тем, как это происходит у активных животных.

Поразительная особенность зимней спячки состоит в том, что, хотя она сопровождается очень резким изменением ряда функций, эти изменения оказываются достаточно хорошо уравновешенными. Например, при значительном понижении поглощения животными кислорода его содержание в крови снижается относительно незначительно, а артериовенозная разница по кислороду остается неизменной (Buck, Barnes, 2000). Объясняется это тем, что понижение потребления кислорода сочетается с соответствующим замедлением ритма сердца и уменьшением минутного объема.

Достаточно четкая скоррелированность функций различных органов и систем как при подготовке, так и при глубокой спячке давала основание полагать, что центральная нервная система занимает ведущее место в развитии зимней спячки (Buck, Barnes, 2000).

Хотя зимняя спячка длится 6-8 месяцев, установлено, что в течение этого периода они неоднократно пробуждаются на очень короткий срок (Пастухов, Невретдинова, 1991). При этом температура тела животных повышается до 31-35°С, после чего они снова через несколько часов впадают в спячку. Длительность периодов непрерывной спячки (баутов) суслика с осени до января возрастает, а затем снова убывает.

Биохимические изменения, происходящие в органах и тканях при подготовке к спячке, в ходе длительной спячки и ее спонтанных перерывах существенным образом отражается на состав и свойства клеточных и субклеточных мембран.

Уже осенью перед погружением в спячку липиды мембран обогащаются ненасыщенными жирными кислотами. Существенно повышается содержание полиненасыщенных жирных кислот, особенно арахидоновой кислоты, в фосфолипидах мембран эритроцитов в начале гибернационного периода (Лапинский, Невретдинова, 1987).

Увеличение потребления и запасания полиненасыщенных жирных кислот может увеличивать уязвимость гибернирующих животных к перекисному окислению липидов (Drew et al., 1999).

По данным А.Г. Лапинского и З.Г. Невретдиновой (1987, 1991) содержание продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов в липидной фракции мембран эритроцитов сусликов увеличивается до начала гибернационного периода и остается на высоком уровне в течение всего периода гибернации. Кери с сотр. (Carey et al., 2003) установили, что уровень диеновых конъюгатов в клетках эпителия кишечника 13-ти полосных сусликов, входящих в оцепенение выше, по сравнению с летними сусликами. Их содержание выше также в коротком бауте оцепенения.

Интенсивность ПОЛ в тканях при гибернации зависит от активности ряда ферментных систем, в том числе защищающих ее от избыточной пероксидации. У гибернирующих животных отмечено снижение активности каталазы в эритроцитах, но существенно повышается активность пероксидазы (Лапинский, Невретдинова, 1987). В исследованиях Дрю и соавторов (Drew et al., 1999) обнаружено, что во время гибернации у европейских сусликов уровень GSH в мозговой ткани стабильно или незначительно повышается. В отличие от GSH концентрация аскорбата во время спячки увеличивается в печени на 40%, в плазме крови в 2-4 раза. Содержание б-токоферола понижается в печени, но увеличивается в бурой жировой ткани (Buzadzic et al., 1990). Концентрация аскорбата после пробуждения падает до гибернационного уровня, а концентрация GSH остается относительно стабильной (Drew et al., 1999).

При пробуждении наблюдается быстрое самосогревание с нормализацией температуры тела и функций. Частота сердечных сокращений в период повышенного термогенеза в 2 раза превышает этот показатель для бодрствующих животных (Игнатьев и др., 2001) и составляет 360-420 ударов в минуту (Buck, Barnes, 2000). Гибернирующие суслики переживают более чем пятидесятикратное увеличение в потреблении кислорода во время выхода из оцепенения (Drew et. al., 1999).

Драматические изменения в токе крови, происходящие во время цикла оцепенения-пробуждения, увеличивают риск оксидативного стресса в тканях (Carey et al., 2003). Исследования показали, что в ходе пробуждения животных в плазме крови интенсифицируются процессы образования АФК и окислительной модификации белков (Астаева, Кличханов, 2009). По мере повышения температуры тела существенно возрастает активность СОД эритроцитов. Активность каталазы эритроцитов на всех этапах пробуждения достоверно выше, чем в контроле.

Гибернирующие животные защищаются от оксидативного стресса также, увеличивая концентрацию аскорбата в плазме и цереброспинальной жидкости (Toien et al., 2001). Перераспределение аскорбата во время потребления О₂ в процессе пробуждения может доставить эти водорастворимые молекулы в ткани с высокой терморегулируемой продукцией тепла, где они действуют как антиоксиданты и удаляют свободные радикалы кислорода. Интересно, что пик образования мочевой кислоты и ее поступления в плазму крови сусликов при пробуждении совпадает с пиком потребления кислорода. Это свидетельствует об увеличении продукции АФК. Во время этой фазы пробуждения и необходимо увеличение антиоксидантной защиты для поддержания редокс-равновесия (Drew et al., 1999).

Способность гибернирующих животных противостоять глубокому снижению сердечного ритма, кровяного давления и тока крови, наводит на мысль, что эти виды представляют природную генетическую модель устойчивости к драматическим изменениям в токе крови и потреблении кислорода (Toien et al., 2001).

антиокислительный свободнорадикальный эритроцит суслик гипотеремия

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования

Опыты проведены на малых кавказских сусликах (Spermophilus pigmaeus Pall) массой 250-300 грамм. Половозрелые самцы в активный период жизни были отловлены в районе Буйнакского перевала. Суслики являются типичными зимоспящими животными, длительность периода гибернации у которых составляет 6-8 месяцев (Кличханов, Мейланов, 2011).

2.2 Условия зимней спячки и искусственной гипотермии

Для спячки сусликов переносили в холодную темную комнату, одновременно животные перестали получать пищу. Затем их помещали в индивидуальные клетки, в которых они находились в течение всего периода спячки в условиях вивария.

Гипотермию сусликов вызывали в холодовой камере, в рубашке которой циркулировала вода с температурой 4-5°С. Ректальную температуру сусликов снижали до 10°С в течение 2 часов. Контролем служили летние бодрствующие суслики.

2.3 Биохимические методы исследования

2.3.1 Определение содержания малонового диальдегида в эритроцитах

Содержание МДА в эритроцитах определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Кличханов и др., 2012). К 0,2 мл суспензии эритроцитов прибавили 0,2 мл 30% ТХУ и 0,2 мл 0,68% раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Содержимое пробирки встряхивали до появления белого творожистого осадка. Затем пробы кипятили 15 минут на водяной бане. После охлаждения пробы центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Оптическую плотность надосадочной жидкости измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм. Количество ТБК-активных продуктов в мкмоль/л эритроцитов вычисляли по формуле:

,

где Е - экстинкция пробы;

е - 1,56·10⁵ см^-1 моль^-1 - молярный коэффициент экстинкции;

L - толщина кюветы; v - объем суспензии эритроцитов.

2.3.2 Определение содержания диеновых конъюгатов в эритроцитах

Содержание диеновых конъюгатов определяли по методу И.А. Волчегорского и др. (1989). После декапитации животного собирали кровь. В качестве антикоагулянта использовали этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) в конечной концентрации 1 мг/мл. ЭДТА необходим также для ингибирования процессов ПОЛ. Собранную кровь тотчас же использовать для анализа. К 5 мл смеси гептан-изопропанол (1:1 по объему) добавляли 0,5 мл суспензии эритроцитов и экстрагировали липиды, встряхивая на качалке, в течение 15 минут. Затем после центрифугирования проб при 5000 об/мин в течение 10 минут липидные экстракты сливали в мерные пробирки с притертой пробкой и разбавляли 5 мл смеси гептан-изопропанол (3:7 по объему). Последнюю процедуру выполняли с целью достижения оптимальных значений оптической плотности в обеих фазах экстракта. К разбавленным липидным вытяжкам добавляли 2 мл 1 н соляной кислоты для разделения и отмывки от нелипидных примесей. После интенсивного встряхивания пробы оставляли на 15 минут при 4°С для разделения фаз. По истечении времени гептановую фазу отбирали в отдельную сухую пробирку, а к водно-спиртовой фазе добавляли 1 г хлорида натрия для обезвоживания изопропанольного экстракта. Пробы встряхивали и оставляли на 10 минут для разделения фаз. После отделения водной фазы изопропанол переносили в отдельную пробирку. Оптические контроли готовили путем экстракции по схеме, описанной выше, но вместо суспензии эритроцитов берут 0,5 мл 0,1% раствора ЭДТА на 0,9% растворе NaCl. Измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 каждой фазы против соответствующего контроля при 220, 232 и 278 нм. Расчет содержания диеновых конъюгатов производили, соотнося величины соответствующих экстинкций к 1 мл исследуемой суспензии эритроцитов по формуле:

(для гептановой фазы: (ЕЧ4)/0,5 = ЕЧ8; для изопропанольной фазы: (ЕЧ6)/0,5 = ЕЧ12).

2.3.3 Определение антиокислительной активности гидрофильных компонентов плазмы крови

Антиокислительную активность плазмы крови определяли по кинетике окисления восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола кислородом воздуха (Кличханов и др., 2012). Перед анализом плазму крови разводили физиологическим раствором. В термостатированную при 37°С кювету фотометра (толщиной кюветы 1 см) помещают 1,5 мл 0,25 М фосфатного буфера, 0,5 мл 0,8 мМ раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола в окисленной форме, 0,5 мл 3,2 мМ раствора сульфата железа (II) и 2,0 мл разведенной плазмы (опыт) или воды (контроль). Предварительно все растворы термостатировали при указанной выше температуре. Содержимое кюветы постоянно перемешивали. После добавления биоматериала или воды через каждые 30 с на протяжении 5-7 мин измеряли оптическую плотность содержимого кюветы (Д _ф) при длине волны 600 нм. Кроме того, определяли значение оптической плотности реакционной среды, в которой 2,6-дихлорфенолиндофенол полностью окислен (Д_?). Затем находили ?Д_ф из уравнения:

?Д_ф = Д_? - Д_ф.

Значения констант скоростей окисления восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола в опыте и в контроле определяли, построив график зависимости натуральных логарифмов ?Д_ф от времени. Тангенс угла наклона прямой на графике дает численное значение константы скорости окисления субстрата. Антиокислительную активность выраженная в процентах вычисляли по следующей формуле:

где К_оп и К_к - константы скорости ингибирования окисления субстрата в присутствии и отсутствии плазмы крови соответственно.

2.4 Статистическая обработка экспериментальных данных

Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи пакетов программ «Statistica» для Windows. Данные представлены на гистограммах и в таблицах в виде средних значений ± стандартная ошибка. Достоверность отличий средних величин оценивали при помощи t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при значениях р<0,05.

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1 Свободнорадикальные процессы в крови сусликов при зимней спячке

Первичными продуктами ПОЛ являются гидроперекиси липидов, при образовании которых в молекуле жирной кислоты формируются сопряженные двойные связи - диеновые конъюгаты (Guйraud et al., 2010) (рис. 1).

Рис. 1. Схематическое изображение формирования диеновых конъюгатов в ходе перекисного окисления липидов

Возможно также образование конъюгированных триенов. Липидные экстракты, содержащие гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот с такими группировками в своей структуре, обладают поглощением в УФ-области спектра: для диеновых конъюгатов при л = 232 нм и для конъюгированных триенов при л = 275 нм.

Как видно из таблицы 1, у бодрствующих в летний период сусликов в эритроцитах имеется определенный уровень диеновых конъюгатов, что свидетельствует о протекании процессов пероксидации липидов у контрольных животных. При гибернации в полярных липидах мембран эритроцитов более чем в два раза снижается содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов. При зимней спячке в липидах эритроцитов значительно снижается (на 54%) и содержание таких вторичных продуктов ПОЛ, как кетотриены (табл. 1).

Таблица 1

Содержание продуктов перекисного окисления липидов в полярных липидах эритроцитов сусликов при зимней спячке (M±m; n = 6)

№	Группа животных	Диеновые конъюгаты, E232/мл	Кетотриены, E270/мл
1	Контроль	6,90±0,13	2,05±0,02
2	Зимняя спячка	3,04±0,14, p<0,001	0,98±0,02, p<0,001

Пероксидация липидов осуществляется в присутствии металлов переменной валентности и сопровождается образованием группы радикальных продуктов - Rя, RO, ROO (где R - липидный радикал), цитотоксических альдегидов типа 4-гидрокси-2,3-транс-ноненаля или менее токсических, как МДА. МДА образуется лишь при окислении жирных кислот С18:3 и С20:4. Негативные последствия перекисного окисления липидов связаны с тем, что продукты пероксидации обладают способностью непосредственно увеличивать ионную проницаемость липидного бислоя. Свободные радикалы липидов способствуют окислительной модификации мембранных белков, ферментов, рецепторов (Дубинина, Пустыгина, 2008). Наиболее важный результат пероксидации - это уменьшение стабильности липидного слоя (Владимиров, 1998). Образование в результате ПОЛ в ненасыщенных жирнокислотных остатках фосфолипидов гидроперекисных группировок повышает гидрофильность липидных молекул, что приводит к взаимной переориентации жирнокислотных остатков и объединению их в перекисные кластеры (Ланкин и др., 2002). Появление последних приводит к возникновению новых каналов проводимости, снижению текучести и повышению жесткости мембран, нарушению белок-липидных взаимодействий, что соответственно ограничивает конформационную подвижность ферментов в ригидном матриксе и приводит чаще всего к снижению их активности.

Установлено, что в клетках МДА взаимодействует с макромолекулами, содержащими первичные аминогруппы, например, белками, фосфолипидами и нуклеиновыми кислотами. В результате этой реакции образуются поперечные сшивки между макромолекулами, что уменьшает их конформационную подвижность, делает их токсичными, а также наделяет свойствами мутагенов и канцерогенов. В настоящее время МДА считается маркером пероксидации липидов (Дубинина, 2006).

Поэтому для оценки интенсивности процессов пероксидации липидов наряду с определение начальных продуктов ПОЛ было измерено содержание МДА в эритроцитах. Как видно из табл. 2, через 1 месяц после начала гибернации в эритроцитах существенно (на 33%) снижается содержание МДА.

Таблица 2

Содержание МДА (мкмоль/л) в эритроцитах сусликов при зимней спячке M±m; n = 6)

№	Группа животных	Содержание МДА
1	Контроль	37,7±0,3
2	Зимняя спячка	25,4±0,6. p<0,001

Таким образом, эритроциты при зимней спячке характеризуются низкой интенсивностью процессов ПОЛ. При спячке обнаружена низкая интенсивность окислительной модификации и белков мембран эритроцитов крыс (Кличханов, Мейланов, 2011). Подавление процессов ПОЛ в крови, по-видимому, связано с несколькими причинами. Во-первых, при низкой температуре тела резко тормозятся процессы, в которых генерируются радикалы кислорода. Во-вторых, структурные перестройки плазматических мембран при зимней спячке делают малодоступными жирно-кислотные радикалы фосфолипидов для прооксидантов.

Возможно, что низкая интенсивность ПОЛ в эритроцитах обусловлена высокой антиоксидантной активностью крови. Для подтверждения этого предположения мы изучили антиокислительную активность гидрофильных компонентов плазмы крови. Анализ антиокислительной активности гидрофильных антиоксидантов в плазме крови сусликов при зимней спячке выявил повышение их активности на 92,3% относительно контроля (табл. 3).

Таблица 3

Антиокислительная активность гидрофильных антиоксидантов плазмы крови сусликов при зимней спячке (M±m; n = 6)

№	Группа животных	Антиокислительная активность, в %
1	Контроль	13,0±0,7
2	Зимняя спячка	25,0±1,4, p<0,001

Высокая антиокислительная активность при зимней спячке обеспечивается, по-видимому, за счет накопления в крови и тканях таких антиоксидантов, как аскорбиновая кислота, GSH, б-токоферол (Buzadzic et al., 1990; Drew et al., 1999). Из всех низкомолекулярных антиоксидантов при гибернации в плазме крови существенно увеличивается содержание аскорбиновой кислоты. В зависимости от вида суслика при гибернации содержание плазменного аскорбата возрастает от 2-х до 4-х раз (Drew et al., 1999). Повышенный уровень аскорбата в плазме крови по мнению авторов обеспечивают защиту эндотелиальных клеток, клеток окружающих тканей и крови от оксидантов (О₂, OHя), образующихся в эндотелиальных клетках сосудов при гибернации и спонтанном пробуждении.

В отличие от аскорбата содержание GSH в плазме крови при зимней спячке либо не изменяется, либо имеет тенденцию к снижению (Drew et al., 1999). GSH играет важнейшую роль как клеточный антиоксидант. Он способен прямо элиминировать неферментативным путем кислородные радикалы. Кроме того, GSH как субстрат участвует в ферментативном восстановлении Н₂О₂ и гидроперекисей липидов при участии глутатионпероксидазы. Снижение внутриклеточной концентрации GSH на 10-15% приводит к возрастанию липидных перекисей, потере внутриклеточных ферментов и, в конечном счете, к смерти клеток (Van Remmen et al., 1999). Поскольку этого не наблюдается при гибернации, то можно предположить, что снижение содержания GSH в эритроцитах означает снижение концентрации оксидантов при этом.

Важная роль в ограничении процессов ПОЛ при гибернации принадлежит антиоксидантным ферментам. У зимоспящих сусликов в эритроцитах обнаружена довольно высокая активность каталазы (Астаева, Кличханов, 2009; Кличханов, Мейланов, 2011).

Таким образом, полученные нами результаты позволяют заключить, что низкая интенсивность процессов ПОЛ в крови сусликов при зимней спячке в определенной мере связана с высокой активностью компонентов антиоксидантной защиты.

В связи с полученными данными интерес представляет исследование интенсивности ПОЛ и антиоксидантной активности крови сусликов при искусственной гипотермии в их активный летний период.

3.2 Свободнорадикальные процессы в крови сусликов при искусственной гипотермии

Снижение температуры тела бодрствующих летом сусликов до значений, характерных для зимоспящих животных (10°С), существенно не изменяет содержание диеновых конъюгатов в мембранах эритроцитов (табл. 4). Не изменяется в эритроцитах при этом и содержание таких промежуточных продуктов ПОЛ, как кетотриены.

Диеновые конъюгаты образуются в структуре полиненасыщенных жирных кислот на начальных этапах ПОЛ и их количество стехиометрически соответствует радикалам кислорода (Костюк, Патапович, 2004).

Таблица 4

Содержание продуктов перекисного окисления липидов эритроцитов и антиокислительная активность гидрофильных антиоксидантов плазмы крови сусликов при искусственной гипотермии (M±m; n = 4)

Группа животных	Диеновые конъюгаты, E232/мл	Кетотриены, E270/мл	МДА, мкмоль/л	Антиокислительная активность, %
Контроль	6,90±0,13	2,05±0,02	37,7 ±0,3	13,0±0,7
Гипотермия	7,28±0,13	1,93±0,04	28,6±0,5, p<0,001	30,1±2,5, p<0,001

Относительно высокий уровень диеновых конъюгатов в липидах мембран эритроцитов при столь низкой температуре тела означает, что на этапах снижения температуры (возможно в начальный период гипотермии) имеет место генерации радикалов кислорода. Не исключено, что при низких температурах могут происходить и кумулятивные повреждения клеточных липидов активными формами кислорода, когда системы антиоксидантных ферментов подавлены гипотермией (Carey et al., 2003; Астаева, Кличханов, 2009).

Несмотря на относительно высокий уровень диеновых конъюгатов содержание МДА в эритроцитах при гипотермии снижено (табл. 4). Это означает, что при искусственной глубокой гипотермии дальнейшая пероксидация мембранных липидов заторможена. Важная роль в ингибировании процессов ПОЛ в эритроцитах при этом играет, по-видимому, неферментативная антиоксидантная система. Об этом свидетельствуют наши данные представленные в таблице 4. Как видно при гипотермии на 132% возрастает активность гидрофильных антиоксидантов в плазме крови.

Установлено, что важнейшую роль в антиоксидантной системе плазмы крови играет аскорбиновая кислота, которая синтезируется в печени (Drew et al., 1999). Возможно, что и при гипотермии повышение активности гидрофильных антиоксидантов плазмы происходит за счет аскорбата.

Таким образом, и при искусственной гипотермии интенсивность процессов ПОЛ в эритроцитах снижена. Важная роль в поддержании низкой активности процессов ПОЛ в крови сусликов при гибернации и искусственной гипотермии, по-видимому, принадлежат гидрофильным антиоксидантам.

Полученные данные свидетельствуют о том, что адаптивные защитные реакции у сусликов могут быть запущены снижением температуры тела.

Выводы

1. Зимняя спячка существенно снижает содержание диеновых конъюгатов и кетотриенов в полярных липидах мембран эритроцитов сусликов. Искусственная глубокая гипотермия (10°С) летних бодрствующих сусликов не влияет на уровень диеновых конъюгатов и кетотриенов в мембранных липидах.

2. Как зимняя спячка, так и искусственная гипотермия достоверно снижает содержание конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида в эритроцитах сусликов.

3. Зимняя спячка и особенно гипотермия существенно повышает активность гидрофильных антиоксидантов в плазме крови

Список литературы

1. Астаева, М.Д. Окислительная модификация белков и антиокислительная активность крови сусликов в ходе индуцированного пробуждения от зимней спячки / М.Д. Астаева, Н.К. Кличханов // Известия РАН. Сер. биол.- 2009, №6. - С. 662-668.

2. Барабой, В.А. Биоантиоксиданты / В.А. Барабой. - Киев: Книга плюс, 2006. - 462 с

3. Беленичев, И.Ф. Рациональная нейропротекция / И.Ф. Беленичев, В.И. Черний, Ю.М. Колесник, С.В. Павлов, И.А. Андронова, А.В. Абрамов, Т.В. Островая, Н.В. Бухтиярова, Л.И. Кучеренко. - Донецк: издатель Заславский А.Ю., 2009. - 262 с.

4. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю.А. Владимиров // Вестник РАМН. - 1998. - №7 - С. 43-51.

5. Волчегорский, И.А. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови / И.А. Волчегорский, А.Г. Налимов, Б.Г. Яровинский, Р.И. Лившиц // Вопр. мед. химии. - 1989. - Т. 35. - № 1. - С. 127-131.

6. Гривенникова, В.Г. Генерация активных форм кислорода митохондриями / В.Г. Гривенникова, А.Д. Виноградов // Успехи биологической химии. - 2013. - Т. 53. - С. 245-296.

7. Губський, Ю.І. Основні шляхи утворення активних форм кисню в нормі та при ішемічних патологіях / Ю.І. Губський, І.Ф. Бєленічев, С.І. Коваленко, Є.Л. Левицький, О.М. Марченко // Сучасні проблеми токсикології. - 2004. - №2. - С. 8-15.

8. Донцов, В.И. Активные формы кислорода как система: значение в физиологии, патологии и естественном старении / В.И. Донцов, В.Н. Крутько, Б.М. Мрикаев, С.В. Уханов // Труды ИСА РАН. - 2006. - Т. 19. - С. 50-69.

9. Дубинина, Е.Е. Окислительная модификация протеинов, ее роль при патологических состояниях / Е.Е. Дубинина, А.В. Пустыгина // Укр. биoxим. журнал. - 2008. - Т. 80, № 6. - C. 5-18.

10. Дубинина, Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. Жизнь и смерть, созидание и разрушение / Е.Е. Дубинина. - СПб, 2006. - 400 с.

11. Зенков, Н.К. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты / Н.К. Зенков, В.З. Ланкин, Е.Б. Меньщикова. - М.: Наука/Интерпериодика, 2001. - 343 с.

12. Игнатьев, Д.А. Анализ изменений частоты сердцебиений и температуры суслика Citellus undulatus в различных физиологических состояниях / Д.А. Игнатьев, Г.С. Сухова, В.П. Сухов // Общая биология. - 2001. - Т. 62, № 1. - С. 66-77.

13. Кличханов, Н.К. Свободнорадикальные процессы в биологических системах. Учебное пособие / Н.К. Кличханов, Ж.Г. Исмаилова, М.Д. Астаева. - Махачкала: Издательство ДГУ, 2012. - 188 с.

14. Кличханов, Н.К. Свободнорадикальные процессы в мозге и крови сусликов при зимней спячке и искусственной гипотермии: Монография / Н.К. Кличханов, И.С. Мейланов. - Махачкала: Изд-во ДГУ, 2011. - 169 с.

15. Костюк, В.А., Потапович А.И. Биорадикалы и биоантиоксиданты / В.А. Костюк, А.И. Потапович. - Мн.: БГУ, 2004. - 179 с.

16. Ланкин, В.З. Моделирование каскада ферментативных реакций в липосомах, включающих последовательное свободнорадикальное окисление, восстановление и гидролиз полиеновых ацилов фосфолипидов для исследования влияния этих процессов на структурно-динамические параметры мембраны / В.З. Ланкин, А.К. Тихадзе, Ю.Г. Осис // Биохимия. - 2002. - Т. 67, вып. 5. - С. 679-689.

17. Лапинский, А.Г. О роли неспецифической модификации липидов мембран эритроцитов при гибернации у суслика Citellus parryi / А.Г. Лапинский, З.Г. Невретдинова // Журн. эвол. биохим. и физиол. - 1987. - Т. 23, № 6. - С. 711-716.

18. Лапинский, А.Г. Тиреоидный статус и обмен липидов у сусликов Citellus parryi при гибернации / А.Г. Лапинский, З.Г. Невретдинова // Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1991. - № 3. - С. 398-409.

19. Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. - Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.

20. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - М.: Фирма «Слово», 2006. - 556 с.

21. Пастухов Ю.Ф., Невретдинова З.Г. Изменение терморегуляции сна и концентрации в крови тиреоидных гормонов в «критический» период вхождения в спячку суслика Citellus Parrye // Журн. эвол. биохим. и физиол. - 1991. - Т.27, № 2. - С. 211-217.

22. Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Арутюнян А.В., Малинин В.В. Свободнорадикальное окисление и старение. - СПб.: Наука, 2003. - 327 с.

23. Buck C.L., Barnes B.M. Effects of ambient temperature on metabolic rate, respiratory quotient, and torpor in an arctic hibernator // Am. J. Physol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 2000. - V. 279. - P. 255-262.

24. Buzadzic B., Spasic M., Saisic Z. S., Radojicic R., Petrovic V.M., Halliwell B. Antioxidant defenses in the ground squirrel Citellus citellus: 2 The effect of hibernation // Free radical Biol. Med. - 1990, № 9. - P. 407-413.

25. Carey H.V., Andrews M.T., Martin S.L. Mammalian hibernation: cellular and molecular responses to depressed metabolism and low temperature // Physiol. Rev. - 2003. - V. 83. - P. 1153-1181.

26. Drew K.L., Osborne R.G., Frederics K.U., Hu Y. Koren R.E., Hallenbeck J.H., Rice M.E. Ascorbate and glutation regulation in hibernating ground squirrels // Brain Research - 1999. -V.851. - P. 1-8.

27. Guйraud F., Atalay M., Bresgen N., Cipak A., Eckl P. M., Huc L., Jouanin I., Siems W., Uchida K. Chemistry and biochemistry of lipid peroxidation products // Free Radical Research. - 2010. - Vol. 44(10). - P. 1098-1124.

28. Toien O., Drew K.L., Chao M.L., Rice M.E. Ascorbat dynamics ana oxygen consumption during arousal from hibernation in arctic ground squirrels // Am. J. Physiol. - 2001. - V. 281. - P. R572-R583.

29. Van Remmen H. Salvador C., Yang H. Huang T.T., Epstein C.J., Richardson A. Characterization of the antioxidant status of the heterozygous manganese superoxide dismutase knockout mouse // Arch. Biochem and Biophys. - 1999. - V. 363, № 1. - P. 91-97.

30. Wang L.C.H., Lee T.F. Torpor and hibernation in mammals: metabolic, physiological, and biochemical adaptations // Handbook of physiology: Oxford univer. Press., 1996, №4. - P. 507-53

Размещено на allbest.ru

...