Вплив температури на амілолітичну активність

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кафедра біохімії та екологічного контролю

НАУКОВО-ДОСЛІДНА РОБОТА

на тему: «Вплив температури на амілолітичну активність»

Київ - 2014

Зміст

1. Характеристика крохмалю

2. Характеристика амілаз

3. Вплив температури на активність ферментів

4. Хід роботи

Висновок

Список літератури

1. Характеристика крохмалю

Крохмамль (лат.amylum), (С₆Н₁₀О₅)_n-- рослинний високомолекулярний полісахарид амілози і амілопектину, мономером яких є глюкоза. Резервний гомополісахарид рослин. Нагромаджується в результаті фотосинтезу у плодах, зерні, коренях і бульбах деяких рослин як запасна форма вуглеводів.

Види крохмалю: картопляний, кукурудзяний, амілопектиновий, пшеничний, рисовий, гороховий, тапіоковий, модифікований і ін.

Рис. 1

Фізичні властивості

Білий, хрусткий, аморфний і дуже гігроскопічний порошок без смаку і запаху. Зазвичай містить 10-20% зв'язаної води, яку можна видалити висушуванням при 100-110C. Під мікроскопом -- зернистий (гранули) порошок. Нерозчинний у холодній воді, ефірі, спирті; у гарячій воді набухає, утворює колоїдний розчин, при охолодженні якого утворюється стійкий гель -- крохмальний клейстер; із розчином йоду дає синє забарвлення (амілоза дає синє забарвлення, а амілопектин -- від червоного до фіолетового, амілодекстрин - фіолетового, еритродекстрин - червоно-бурого, ахродекстрин - жовтого). Реакція з йодом дає змогу виявити навіть мільйонну частину крохмалю в розчині. Молекули крохмалю неоднакові за розмірами.

Гранули крохмалю

Крохмаль міститься в рослинах у вигляді гранул. В зернових культурах і інших вищих рослинах гранули крохмалю утворюють пластиди. Пластиди, з яких складається крохмаль називають амілопластами. В зернових культурах (пшениця, кукурудза, жито, ячмінь, сорго і просо) крохмаль представлений простими гранулами -- кожен амілопласт складається з однієї гранули. У риса і вівса гранули складені-- кожен амілопласт містить багато гранул.

У жита, пшениці і ячменю розрізняють два типи гранул крохмалю: крупні -- двояковипуклі (лінзоподібні) гранули, та невеликі -- сферичної форми. В ячменю двояковипуклі гранули формуються в перід перших 15 днів після запилення, а з 18-го по 30-й день -- після запилення з'являються маленькі гранули, які складають 88% від загальної кількості гранул. У пшениці і ячменя кожен пластид спочатку формує велику двояковипуклу гранулу крохмалю. Після цього пластиди утворюють випуклості, в яких проходить формування маленьких гранул крохмалю. Ці значно більш менші амілопласти відділяються від материнського пластида перетяжкою-стриктурою. Крохмаль синтезується в пластидах.

Кристалічність

Про те, що крохмаль є напівкристалічним матеріалом відомо ще з 1930-х років. За формою рентгенограм цільних гранул крохмалю, вони підрозділяються на три типи, які позначають літерамиА,ВіС. Крохмаль більшості зернових культур відноситься до типуА, крохмаль картоплі і інших коренеплодів, а також ретроградуйований крохмаль-- до типуВ, а крохмаль гороху і бобів-- до типуС, який являє собою проміжну форму між типамиАіВ.Під дією тепла картопляний крохмаль типуВперетворюється в типА.Більш короткі декстрини (12-15 глюкозних одиниць) можуть належати до будь-якого із цих трьох типів в залежності від характеру їхкристалізації. Одним із інструментальних способів дослідження крохмалю ефективно використовується метод дифракціїрентгенівських променів.

Подвійне заломлення світла

При розгляданні крохмалю в поляризованому світлі спостерігається подвійне заломлення променів, яке має характерну форму «мальтійського хреста». Причиною такого заломлення є високоорганізована структура гранул крохмалю, яку не треба плутати з кристалічністю. Навіть дуже добре організовані молекулярні структури можуть не бути кристалічними, але вони володіють властивістю подвійного заломлення променів -- целюлоза в аркуші паперу є напівкристалічною, а кристали самі по собі є двоякопереломляючими (впорядкованими), але в силу того, що кристали орієнтовані невпорядкованим чином, папір властивістю подвійного променезаломлювання не володіє.

Хімічний склад крохмалю

Крохмаль містить полісахариду 97-99%, білкових речовин 0,3-1,5%, клітковини 0,2-0,7%, зольних речовин (фосфати, силікатні кислоти) 0,3-0,6%.

В складі товарного крохмалю можуть бути наявними другорядні компоненти, але вони присутні в настільки малих кількостях, що не зовсім ясно, чи є вони складовими крохмалю, представленими в ньому дуже малих кількостях, чи домішками, недостатньо ретельно видаленими в процесі виділення. Тим не менш, такі другорядні компоненти, незважаючи на їх надзвичайно малу кількість, можуть суттєво впливати на якості крохмалю.

В крохмалі знайдено 0,6% жирних кислот (пальмітинову, стеаринову і ін.). В крохмалях, які випускаються промисловим способом із зернових культур, міститься мала кількістьліпідів, які, як правило, є полярними. Для їх виділення необхідні полярні розчинники, водний розчин метилового спирту. Зазвичай, вміст ліпідів в крохмалі із зернових культур складає 0,5-1%, а виготовлених із незернової сировини -- майже не містить.

Крім того, в склад крохмалю входять в незначних кількостях фосфор і азот. В зернових культурах основна маса фосфору представлена у вигляді фосфоліпідів. Відомо, що картопляний крохмаль етерифікується до глюкозних залишків, тоді як з крохмалями зернових культур цього не відбувається. У всіх видах крохмалів міститься дуже невелика кількість азоту (менше 0,05%), частина якого входить в склад ліпідів, частина -- в склад білків і, можливо, в склад залишківферментів, які беруть участь в синтезі крохмалю.

Крохмаль в основному являє собою полімери б-D-глюкози, які з хімічної точки зору можна розділити як мінімум на два типи: амілозу (в цілому лінійний полімер) і амілопектин(сильно розгалужений полімер). Тобто, молекула крохмалю складається з двох хімічно-незалежних частин (полісахариди): амілози (20-30%) і амілопектину (70-80%), співвідношення яких залежить від природи рослин:

-- у кукурудзяному крохмалі амілоза становить 25% всієї маси речовини, а амілопектин-- 75%. У восковидній кукурудзі -- більш 95% амілопектину. Вирощують кукурудзу і з 75% амілози.

-- у картопляному крохмалі амілози -- 20%, а амілопектину -- 80%, що надає йому специфічних властивостей.

-- крохмаль яблук -- із 100% амілози.

Рис. 2 Глікозидні зв'язки в молекулі крохмалю

Амілоза та амілопектин різняться між собою хімічною будовою. Проте, обидва полісахариди складаються із глюкозних залишків, з'єднаних між собою утворюючи лінійні або розгалужені ланцюги. У зернах крохмалю молекули амілози та амілопектину утворюють прошарки із кристалічною та аморфною будовою. Енергія взаємодії окремих груп атомів у зерні крохмалю залежить від розташування амілози та амілопектину та їх співвідношення.

У гарячій воді крохмаль набрякає. При цьому амілоза переходить у розчин, а амілопектин утворює колоїдний розчин (клейстер). Амілоза розчиняється у гарячій воді, не утворює клейстеру; з йодом дає синій колір. Амілопектин не розчиняється у воді, а набухає та утворює клейстер. При забарвлюванні амілопектину йодом він приймає від червоного до фіолетового колір. Молекули цих двох полісахаридів складаються з залишків глюкози, які з'єднані в довгі ланцюжки. Чим довші ланцюжки амілози, тим гірше вона розчиняється. В молекулі амілози таких залишків у середньому більше 1000, у молекулі амілопектину -- набагато більше.

Під дією ферментів або нагрівання з кислотами -- піддається гідролізу.

В якості розчинників крохмалю використовують холодну соляну, надхлорну, трихлороцтову, сульфосаліцилову кислоти, розчини CaCl₂, ZnCl₂, MgCl₂, луги, гліцерин, формамід і ін..

При повному гідролізі у промисловості одержують глюкозу, а проміжними продуктами можуть бути олігосахариди,мальтоза:

Під дією амілаз у травному каналі людини і тварин крохмаль піддається гідролізу та розщеплюється з утворенням глюкози та мальтози, що розщеплюється мальтозою до глюкози, яка засвоюється організмом.

Отримання крохмалю

Крохмаль одержують з картоплі і рису, рідше -- з інших зернових. Саго -- крохмалистий продукт з деревини сагової пальми, а також деяких саговників.

У тропіках вирощують багато крохмалоносних рослин: батат, ямс, таро, маніок та інші.

Щоб добути крохмаль, потрібно зруйнувати клітинні стінки й добути сік. Для цього сировину подрібнюють на терках, отримуючи кашку. Щоб виділити вільний крохмаль, кашку багаторазово промивають на ситах в ситових апаратах. Ситові апарати в п'ять ступенів проводять розділення продукту на мезгу та крохмальну суспензію (крохмальне молоко) різної концентрації. Крохмальне молоко рафінують (очищують). Після цього виділений крохмаль багаторазово промивають чистою водою на спеціальних центрифугах-пурифікаторах або гідроциклонах.

У виробництві картопляного крохмалю застосовують процеси очищення картоплі від легких і важких домішок, мийки, подрібнення, виділення клітинного соку, ситування і промивання, центрифугування і сушки.

З картопляного крохмалю можна отримати окремо амілозу (суперлозу) і амілопектин (ромалін). Для цього на крохмаль діють розчинами солей MgSO₄, (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, які містять н-бутиловий спирт, при 120°С. Після цього амілозу осаджують при 70°С, а амілопектин-- при 20°С.

У виробництві кукурудзяного крохмалю існує два способи: сірчистокислотний і лужний. По першому способу кукурудзяне зерно замочують в 0,1-0,2% водному розчині сірчистої кислоти при 48-50°С протягом двох діб, зерно промивають, грубо подрібнюють, виділяють зародок, тонко подрібнюють, промивають крохмаль на ситових апаратах, відокремлюють від дрібної і крупної мезги, глютену (на сепараторах), промивають на вакуум-фільтрах, центрифугують, висушують або переробляють на крохмало-продукти. За другим способом кукурудзу замочують у водному розчині лугу, промивають, подрібнюють, крохмаль виділяють і проминають на ситових апаратах, центрифугують, висушують або направляють без висушування на переробку.

Застосування

Крохмаль сільськогосподарських культур є провідним компонентом раціону людини, важливою сировиною для харчової, фармацевтичної та технічних галузей промисловості: текстильній, нафтовій, паперовій і ін.

Крохмаль широко застосовується в харчовій галузі як згущувач (E1404), при виробництві патоки різного вуглеводного складу, для одержання декстринів, глюкози (кристалічної глюкози, глюкозного концентрату, глюкозно-фруктозного сиропу, етанолу, та інших продуктів бродіння. Крохмаль зі ступенем гідролізу (по глюкозі) менше 5% -- мальтодекстрин -- використовується в якості стабілізатора у виробництві майонезу. У виробництві цукрових кондитерських виробів крохмаль використовують як рецептурний компонент рахат-лукума, а також як формувальний компонент для цукерок і драже.

Комплексна переробка крохмалю: крохмаль гідролізується до глюкози, яка ізомеризується у фруктозу та гідруванням перетворюється у сорбіт, або йде на отримання інших продуктів -- етанолу, молочної кислоти, лимонної кислоти; гідролізат змішується з волокнами для кормів худобі.

Сировиною для виробництва кристалічної глюкози є крохмаль, отриманий з кукурудзи, чи пшениці, хоча може бути використаний і картопляний крохмаль. Однак картопляний крохмаль є незамінною сировиною в інших галузях промисловості і для виробництва глюкози не використовується. Основна сировина для виробництва кристалічної глюкози -- кукурудзяний крохмаль. Крохмаль використовують як клей, як мікробіологічне середовище при одержанні різних ензимів, антибіотиків, вітамінів, а також як основа штучних біодеградабельних біополімерів.

У лікарській практиці крохмаль дуже часто використовують як наповнювач і субстрат для виготовлення таблеток (як наповнювач у твердих лікарських формах) і облаток та у пастах, у присипках та мазях застосовують при хворобах шкіри, у вигляді відвару (клейстеру) -- при захворюваннях травного каналу як обволікаючий засіб. Крохмаль та декстрини (продукти неповного гідролізу лінійних полісахаридів) позитивно впливають на холестериновий обмін, поліпшують травлення. Він входить як важливий компонент практично до всіх дієт.

Основний об'єм крохмало - продуктів готують з кукурудзи, на частку якої припадає 45 млн. т., решту сировинної бази складає тапіока (5 млн. т.), пшениця (4 млн. т.) і картопля (2,5 млн. т.).

Амілопектин придатний для виробництва плівок і упаковочного матеріалу, які можна після використання повністю компостувати.

2. Характеристика амілаз

Амілаза (від грец. amylon - крохмаль) - фермент, глікозил-гідролаза, що гідролітично розщеплює крохмаль і глікоген з утворенням декстринів, мальтози і глюкози. Саме амілаза призводить до появи солодкуватого смаку при тривалому пережовуванні крохмаловмісних продуктів (наприклад, з рису або картоплі), але без додавання цукру. У порожнині рота амілаза присутня в слині. Тут вона необхідна для розкладання крохмалю і глікогену. За субстратної специфічності амілази класифікують на альфа-, бета- і гамма-амілазу.

б-Амілаза

б - Амілаза (1,4 - б - D - глюкан глюканогідролаза, EC 3.2.1.1) -- один з амілолітичних ензимів, який здійснює невпорядковане розщеплення 1,4 - б - D - глікозидних зв'язків крохмалю та інших полісахаридів з утворенням суміші лінійних і розгалужених вуглеводів: декстринів, мальтози й глюкози в б - аномерній конфігурації.

Рис. 3 Мальтоза

Ці ензими застосовують у багатьох галузях народного господарства. Їх використовують для отримання цукру та спирту, виготовлення паперу й текстилю, утворення адгезивних речовин і оброблення стічних вод. Вони незамінні у хлібопекарстві, пивоварінні та виноробстві. б - Амілази застосовують у біотехнологічних процесах приготування кормів для тварин та харчових добавок для дітей і людей похилого віку. Віднедавна б - амілази почали використовувати як компоненти екологічно безпечних мийних засобів.

Оскільки більшість стадій біотехнологічних процесів проводять за підвищених температур, термостабільність б - амілаз є необхідною умовою для їх практичного застосування. Використання термостабільних б - амілаз має низку переваг порівняно із застосуванням термолабільних аналогів: дозволяє уникати забруднення мезофільною мікрофлорою, зменшувати витрати на охолодження промислових реакторів і збільшувати загальну швидкість процесів.

Стабільні за підвищених температур і лужних значень рН (> 8,0) б - амілази можуть застосовуватись як компоненти екологічно безпечних мийних засобів, оскільки вони легко утилізуються живими організмами в навколишньому середовищі.

б - Амілази містяться в організмах тварин, рослин, грибів і мікроорганізмів, проте тільки ензими мікробного походження використовують у промисловості, оскільки вони стабільніші, ніж рослинні та тваринні б - амілази, і можуть бути відносно легко отримані завдяки тому, що є позаклітинними ензимами, які секретуються бактеріями в порівняно дешеві середовища культивування. У харчовій промисловості зареєстрована як харчова добавка E1100.

в-Амілаза

в-Амілаза (б-1,4-глюкан-мальтогідролаза, К.Ф.3.2.1.2) - фермент екзо- типу, що каталізує послідовне відщеплення мальтози нередуцируючого кінця молекул амілози, амілопектину, амілодекстрінов. Фермент розщеплює в крохмалі тільки б-1,4-глікозидні зв'язки. Сирий крохмаль не гідролізує.

Рис. 4

Амілоза гідролізується повністю. Мінімальний розщеплюючий фрагмент - Г4. Від гілок амілопектину відщеплюється по 10-12 мальтозних залишків. Гідроліз амілопектину може йти до передостаннього зв'язку, що межує з точкою розгалуження. Нерозщеплені фрагменти амілопектину носять назву в-граничних декстринів. В результаті гідролізу крохмалю в-амілазою утворюється 54-58% мальтози і 42-46% граничних декстринів. Мальтоза при відщепленні переходить в в-форму, що пояснює назву ферменту.

в-амілаза-- типова для вищих рослин, каталізує утворення мальтози й високомолекулярних декстринів.

в-Амілаза присутня у бактерій, грибів і рослин, але відсутня у тварин. Вона відщеплює другий з кінця б-1,4-глікозидний зв'язок, утворюючи, таким чином, дисахарид мальтозу. При дозріванні фруктів в-амілаза розщеплює плодовий крохмаль на цукри, що призводить до солодкого смаку зрілих плодів. У насінні в-амілаза активна на стадії, що передує проростанню, тоді як б-амілаза важлива безпосередньо при проростанні насіння.

в-Амілаза пшениці є ключовим компонентом при утворенні солоду. Бактеріальна в-амілаза бере участь в розкладанні позаклітинного крохмалю.

г - Амілаза

г-Амілаза відщеплює останній б-1,4-глікозидний зв'язок, приводячи до утворення глюкози. Крім цього, г-амілаза здатна гідролізувати б-1,6-глікозидний зв'язок. На відміну від інших амілаз г-амілаза найбільш активна в кислих умовах при pH 3.

3. Вплив температури на активність ферментів

Ферменти, як білкові сполуки, є особливо чутливими до умов середовища кожен з ферментів характеризується певними чітко визначеними оптимумами температури. Температура може впливати по-різному на активність ферменту. При високих значеннях температури може відбуватися денатурація білкової частини ферменту, що негативно позначається на його активності. За певних (оптимальних) значеннях температура може впливати на швидкість утворення фермент-субстратного комплексу, викликаючи збільшення швидкості реакції. Температура, при якій каталітична активність ферменту максимальна, називається температурним оптимумом ферменту. Різні клітинні ферменти мають власні температурні оптимуми, які визначаються експериментально. Для ферментів тваринного походження температурний оптимум знаходиться в інтервалі 40 -- 50 С. Залежність активності ферменту від рН - середовища.

Залежність каталітичної активності ферменту від температури виражається типовою кривою. До деякого значення температури (загалом до 5О°С) каталітична активність зростає, причому на кожні 10°С приблизно 2 рази підвищується швидкість перетворення субстрату. При температурі вище 50 °С денатурація ферментного білка різко посилюється і швидкість реакцій перетворення субстрату продовжує зростати, активність ферменту, що виражається кількістю перетвореного субстрату, падає.

4. Хід роботи

У конічну колбу місткістю 50 - 100 мл вносять піпеткою 20мл 1,0 %-го розчину крохмалю і занурюють у водяну баню з температурою 30⁰ С (±0,2⁰ С). Загальний об'єм реакційної суміші завжди має дорівнювати 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, то об'єм, якого не достає, доповнюють дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.

Через 10 хв. витримування в бані у колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і точно за секундоміром відмічають час. За початок реакції беруть час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хвилину (або частіше) після початку реакції скляною паличкою відбирають краплину рідини і на білій порцеляновій пластинці з'єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду.

Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане давати зміну забарвлення при з'єднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 с).

Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв., але надійніші результати, отримують у межах від 5 до 15 хв.

Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв., то визначення повторюють з меншою кількістю розчину фермента, наприклад - 2 мл. У цьому разі в пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 8 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1 г в 200 або 500 мл).

Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв., то готують розчин більшої концентрації, наприклад 1:50 чи 3:100, а рідину можна не розбавляти зовсім.

У разі зникнення забарвлення в межах 3 - 5 хв. проби відбирають кожні 15 с; 5 -10 хв. - кожні 30 с; а понад 10 хв. - кожну хвилину.

Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим не крохмаленим рушником.

Таблиця 1 Опрацювання результатів

Розрахунок АЗ проводять за формулою:

де 0,2 - кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 - коефіцієнт перерахунку на 1 год.; а - кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш, грами повітряно-сухої речовини або мілілітри рідинних об'єктів; t - час, за який пройшло розщеплення крохмалю до нездатних забарвлюватися йодом продуктів, хв.; 1 - перерахунок на 1 г повітряно-сухого препарату або 1 мл розчину.

Розрахунки

При t=0⁰ C

При t=18⁰ C

При t=37⁰ C

При t=90⁰ C

Рис. 5

крохмаль амілаз фермент

Висновок

Оптимальна температура для даного ферменту становить 37⁰ С.

Список літератури

1. Старовойтова I.Ю. Усі уроки хімії 11 клас. Академічний рівень. - X.: Серія «Усі уроки», 2011. -- 351с.

2. Коровин Н.В. Курс общей химии: учебник -2-е изд. перераб. и доп. - М.: Высшая школа,1990.-446 с.

3. Чорна І.В., Висоцький І.Ю. Клінічна ензимологія. Навч. посіб. - Суми: Сумський державний університет, 2013. - 243 с.

4. Пашков М.К. Дія амілази // Відкритий урок. - 2011. - №1.- 44 - 45 с.

5. Кубрак О.І. Отримання та характеристика стабільної альфа-амілази з Bacillus sp.: Автореф. дис. канд. біол. наук. - Чернівці, 2010. - 20 с.

Размещено на Allbest.ru