Хроматографические методы анализа веществ

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное агентство по здравоохранению

Государственное бюджетное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М.Сеченова

Фармацевтический факультет

Кафедра аналитической, физической и коллоидной химии

Реферат на тему: "Хроматографические методы анализа веществ"

Работу подготовила:

студентка фармацевтического факультета 2 курса

13 группы

Савинцева Дария

2014 год



Содержание

Введение

История открытия и развития хроматографии

Методы хроматографии

Сущность методов хроматографии

Классификации хроматографических методов анализа

Теории хроматографии

Газовая хроматография

Жидкостная хроматография

Жидкостно-жидкостная хроматография

Заключение

Задачи

Список литературы



Введение

хроматография газовый жидкостный разделение

Метод хроматографического разделения возник в начале прошлого века, после опубликования работ русского учёного Цвета, который обнаружил разную сорбируемость пигментов хлорофилла на оксиде алюминия, и как следствие разную скорость продвижения по колонке, заполненной им. Изначально метод позволял анализировать только окрашенные вещества, что и дало название методу.

В настоящее время этот метод используют не только для анализа веществ, имеющих окраску. Благодаря оснащению колонок специальными регистрирующими устройствами можно подвергать анализу и разделению самые разные вещества и классы соединений. Кроме того возможность разделять вещества очень близкого строения, природные соединения, белки, нуклеиновые кислоты, и даже некоторые биологические объекты -,делают этот метод очень применимым и зачастую единственным в настоящее время. Особенно это касается белков и нуклеиновых кислот - их разделение хроматографическим методом очень точно позволяет выделять и анализировать белки очень сложного строения. Выше перечисленные факты делают хроматографию очень популярной в научно--исследовательских биологических лабораториях, при получении и выделении новых белковых препаратов:- сывороток и вакцин. Современная модификация метода--высокоэффективная жидкостная хроматография , позволяет провести анализ, идентификацию и разделение очень малых количеств веществ ( ~0.000001 г.) за очень короткое время -15--20 минут.

Следует также сказать ,что современные хроматографы оснащены компьютерами, что позволяет ускорить анализ веществ (за счет создания библиотеки веществ в памяти),сделать анализ более достоверным и точным, а также простым в выполнении Перечисленные факты делают метод хроматографического анализа одним из самых применимых в современных экспертных лабораториях, так как метод позволяет быстро и качественно разделить и проанализировать смеси близких по свойствам веществ, в частности лекарственных препаратов, веществ природного происхождения. Наша работа посвящена препаративному хроматографическому разделению веществ, но чтобы разработать наиболее выгодные условия для хроматографического разделения веществ нужно сперва подобрать оптимальные условия для мелкомасштабных , аналитических разделений, затем провести масштабирование и перейти к препаративному разделению. Вообще, препаративная хроматография возникла сравнительно недавно (1940-годы), появление её было обусловлено необходимость разделения веществ, которые нельзя было разделить обычными способами, так чтобы они сохранили свои первоначальные свойства( выделение белков, нуклеиновых кислот, различных лекарственных веществ природного происхождения). Также нужно добавить , что наряду с эффективностью и практически универсальностью разделения у препаративной хроматографии есть ещё и ряд недостатков:- прежде всего это сравнительно высокая стоимость разделения , а также ещё и то что трудно предсказать возможность разделения веществ на данной хроматографической колонке в данных условиях , то есть необходимо проводить ряд опытов в более мелких масштабах для установления условий разделения , это и есть оптимизация.



История открытия и развития хроматографии

Первооткрывателем хроматографии был русский ученый, ботаник и физикохимик Михаил Семенович Цвет. Он родился 14 мая 1872 г. в небольшом итальянском городе Асти. Его мать - итальянка, отец - уроженец Чернигова, видный государственный служащий. Цвет окончил Женевский университет, в котором получил степень доктора ботаники (1896). Приехав в Россию, он был вынужден заново защитить сначала магистерскую диссертацию (1902), а затем и докторскую диссертацию (1910). Значительную часть своей жизни (1903 - 1916) Цвет провел в Варшаве, а последующие годы (1916 - 1918) - в Москве, Нижнем Новгороде, Тарту. Умер он в Воронеже в 1919 г.

Открытие хроматографии относится ко времени завершения Цветом работы над магистерской диссертацией в Петербурге (1900 - 1902) и первому периоду работы в Варшаве (1902 - 1903). Исследуя пигменты растений, Цвет пропустил раствор смеси очень мало различающихся по цвету пигментов через трубку, заполненную адсорбентом - порошкообразным карбонатом кальция, и промыл затем адсорбент чистым растворителем. Отдельные компоненты смеси при этом разделились и образовали цветные полосы. Согласно современной терминологии Цвет открыл проявительный вариант хроматографии (проявительную жидкостно-адсорбционную хроматографию). Основные итоги исследований по развитию созданного им варианта хроматографии Цвет изложил в книге “Хромофиллы в растительном и животном мире” (1910), которая является его докторской диссертацией.

Цвет широко использовал хроматографический метод не только для разделения смеси и установления ее многокомпонентности, но и для количественного анализа, с этой целью он разбивал стеклянную колонку и разрезал столбик адсорбента на слои. Цвет разработал аппаратуру для жидкостной хроматографии, впервые осуществил хроматографические процессы при пониженном давлении (откачке) и при некотором избыточном давлении, разработал рекомендации по приготовлению эффективных колонок. Кроме того, он ввел многие основные понятия и термины нового метода, такие как “хроматография”, “проявление”, “вытеснение”, “хроматограмма” и др.

Хроматографию сначала использовали очень редко, ее скрытый период длился около 20 лет, в течение которых появилось лишь очень небольшое число сообщений о различных применениях метода. И только в 1931 г. Р. Куну (Германия)(Кун Рихард (1900 - 1967) - немецкий химик и биохимик; основные работы посвящены исследованию каротиноидов и витаминов. Совместно с сотрудниками разделил (1931) каротиноиды хроматографическим методом, возродив способ, предложенный М.С. Цветом. Лауреат Нобелевской премии по химии (1938).), А. Винтерштейну (Германия) и Э. Ледереру (Франция), работавшим в химической лаборатории (руководимой Р. Куном) Института императора Вильгельма по медицинским исследованиям в Гейдельберге, удалось выделить этим методом a- и b-каротин из сырого каротина и тем самым продемонстрировать ценность открытия Цвета.

Важным этапом в развитии хроматографии стало открытие советскими учеными Н.А. Измайловым (Измайлов Николай Аркадьевич (1907 - 1961) - советский физикохимик, чл.-кор. АН УССР (с 1957). Основные исследования относятся к электрохимии растворов. Первые работы были посвящены изучению адсорбции на твердых адсорбентах. Разработал (1938) метод тонкослойной хроматографии.) и М.С. Шрайбер метода хроматографии в тонком слое (1938), позволяющего проводить анализ с микроколичеством вещества.

Следующим важным шагом явилось открытие А. Мартином и Р. Сингом (Англия) варианта жидкостной распределительной хроматографии на примере разделения ацетильных производных аминокислот на колонке, заполненной силикагелем, насыщенным водой, с использованием хлороформа в качестве растворителя (1940). Тогда же было отмечено, что в качестве подвижной фазы может быть использована не только жидкость, но и газ. Несколькими годами позднее эти ученые предложили осуществлять разделение производных аминокислот на смоченной водой бумаге с бутанолом в качестве подвижной фазы. Они же осуществили первую двумерную систему разделения. За открытие распределительного варианта хроматографии Мартин и Синг получили Нобелевскую премию по химии. (1952). Далее Мартин и А. Джеймс осуществили вариант газовой распределительной хроматографии, разделив смеси на смешанном сорбенте из силикона ДС-550 и стеариновой кислоты (1952 - 1953). С этого времени наиболее интенсивное развитие получил метод газовой хроматографии.

Одним из вариантов газовой хроматографии является хроматермография, при которой для улучшения разделения смеси газов одновременно с движением подвижной фазы - газа, воздействуют на сорбент и разделяемую смесь движущимся температурным полем, имеющим определенный градиент по длине (А.А. Жуховицкий и сотр., 1951).

Заметный вклад в развитие хроматографического метода внес Г. Шваб (Германия), явившийся основателем ионообменной хроматографии (1937 - 1940). Дальнейшее развитие она получила в работах советских ученых Е.Н. Гапона и Т.Б. Гапона, которые провели хроматографическое разделение смеси ионов в растворе (совместно с Ф.М. Шемякиным, 1947), а также осуществили высказанную еще Цветом идею о возможности хроматографического разделения смеси веществ на основе различия в растворимости труднорастворимых осадков (осадочная хроматография, 1948).

Современный этап в развитии ионообменной хроматографии начался в 1975 г. после работы Г. Смолла, Т. Стивенса и У. Баумана (США), в которой они предложили новый аналитический метод, названный ионной хроматографией (вариант высокоэффективной ионообменной хроматографии с кондуктометрическим детектированием).

Исключительное значение имело создание сотрудником фирмы "Перкин-Эльмер" М. Голеем (США) капиллярного варианта хроматографии (1956), при котором сорбент наносится на внутренние стенки капиллярной трубки, что позволяет анализировать микроколичества многокомпонентных смесей.

В конце 60-х гг. резко возрос интерес к жидкостной хроматографии. Появилась высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Этому способствовало создание высокочувствительных детекторов, новых селективных полимерных сорбентов, новой аппаратуры, позволяющей работать при высоких давлениях. В настоящее время ВЭЖХ занимает ведущие позиции среди других методов хроматографии и реализована в различных вариантах.

Методы хроматографии

В основу той или иной классификации хроматографических методов могут быть положены различные характерные признаки процесса. Рассмотрим эти способы классификации и определим место различных вариантов газовой хроматографии в общем ряду хроматографических процессов. При этом следует учитывать, что в каждом случае существуют промежуточные методы и варианты, не укладывающиеся в рамки строгой классификации.

Более того, именно такие промежуточные варианты часто оказываются весьма перспективными и даже единственно возможными для решения самых сложных задач анализа и определения физико-химических свойств веществ.

В зависимости от способа перемещения сорбатов вдоль слоя сорбента различают проявительный (элюционный), фронтальный, вытеснительный методы и электрохроматографию.

Проявительный (элюционный) метод заключается в том, что сорбаты переносятся через сорбционный слой потоком вещества (элюента), сорбирующегося хуже любого из сорбатов. Вообще говоря, это условие не является обязательным. Если через сорбционный слой пропускается поток сорбирующейся подвижной фазы и в какой-то момент вводится проба разделяемой смеси, то каждый компонент этой смеси будет перемещаться по слою со скоростью, зависящей от коэффициента распределения его между подвижной фазой и неподвижной фазой, включающей сорбент и сорбированное количество элюента.

Основные преимущества проявительного метода заключаются в следующем: 1) при выборе соответствующих условий компоненты могут быть практически полностью изолированы друг от друга и будут находиться лишь в смеси с элюентом; 2) сорбент непрерывно регенерируется элюентом, поэтому после выхода наиболее сильно сорбирующегося компонента пробы может быть немедленно начато разделение следующей смеси; 3) если концентрация исследуемого компонента соответствует линейному участку изотермы сорбции, то время элюирования компонента при заданных условиях является постоянной величиной, которая может быть использована для целей идентификации.

К недостаткам метода относится необходимость использования значительных количеств элюента.

Проявительный анализ можно проводить как при постоянной температуре (изотермическая хроматография), так и при изменении температуры сорбента в процессе анализа по заданной программе (хроматография с программированием температуры). В последнем случае изменяется сорбционная емкость сорбента. Если в ходе разделения температура увеличивается, то высококипящие компоненты элюируются при более высоких температурах, чем низкокипящие, и, следовательно, будут удалены быстрее, чем при изотермическом режиме (так как коэффициент Генри, как правило, уменьшается при нагревании). Фронтальный метод заключается в непрерывном пропусканий исследуемой смеси через слой сорбента. При этом на сорбенте образуются зоны, содержащие последовательно увеличивающееся число компонентов, а из колонки вначале выходит порция наименее сорбирующегося вещества, а в конце анализа -- порция, состав которой соответствует составу исходной смеси.

Достоинствами метода являются простота проведения опыта и отсутствие необходимости в элюенте. К недостаткам фронтального метода относятся: необходимость регенерации сорбента после каждого разделения; возможность получения в чистом виде лишь части первого компонента. Вытеснительный метод заключается в переносе разделяемой смеси потоком вещества (вытеснителя), сорбирующегося лучше любого из компонентов смеси. В ходе вытеснительного анализа образуются отдельные примыкающие друг к другу зоны компонентов, которые располагаются в порядке увеличения их сорбируемости.

Недостатком вытеснительного метода является необходимость регенерации сорбента, а также то, что зоны отдельных компонентов вплотную примыкают друг к другу.

Метод термической десорбции является частным случаем вытеснительного метода, когда компоненты смеси движутся под влиянием перемещения температурного поля. Разделение происходит вследствие многократного повторения процессов вытеснения одних компонентов другими при движении смеси вдоль сорбционного слоя. При вытеснительном анализе все компоненты движутся по слою сорбента с одинаковой скоростью.

Электрохроматография -- хроматографический процесс, при котором движение заряженных частиц осуществляется под действием приложенного напряжения. Скорость движения частиц определяется их массой и зарядом.

Существуют промежуточные методы, к которым относят градиентную хроматографию, хроматермографию и хроматографию без газа-носителя.

При градиентной хроматографии компоненты перемещаются при одновременном воздействии потока элюента и движущейся концентрационной волны вытеснителя (происходит непрерывное изменение состава подвижной фазы).

В процессе хроматермографии компонентов смеси перемещаются при одновременном воздействии потока элюента и изменяющегося во времени и пространстве температурного поля. Так, для стационарной хроматермографии (основной вариант) движение температурной волны и элюента направлено в одну сторону, а градиент температуры -- в противоположную. Все компоненты перемещаются со скоростью движения температурной волны. Температуру, при которой перемещаются компоненты вдоль сорбционного слоя, называют характеристической температурой компонента.

Колоночная хроматография отличается тем, что процесс проводят в насадочной или капиллярной хроматографической колонке. В последнем случае метод называют капиллярной хроматографией. Насадочную колонку заполняют сорбентом (насадкой); внутреннюю стенку капиллярной колонки покрывают слоем жидкости или пылью адсорбента (либо пылью адсорбента или носителя, пропитанной жидкостью).

Плоскостная хроматография осуществляется на плоскости. Она включает хроматографию на бумаге и тонкослойную хроматографию; в последнем случае на стеклянную пластинку или пластинку из какого-либо другого материала наносят тонкий слой адсорбента, который затем пропитывается жидкостью. Если метод используют для препаративного разделения значительных количеств веществ, то слой сорбента, естественно, не должен быть тонким: здесь речь идет о препаративно-слойной хроматографии.

Сущность методов хроматографии

В различных вариантах хроматографии без газа-носителя также предусмотрено непрерывное движение анализируемой смеси вдоль сорбционного слоя. В случае вакантохроматографии в колонку периодически вводят небольшие порции практически несорбирующегося газа, что вызывает движение по колонке «вакансий» -- зон, в которых отсутствуют по одному из компонентов анализируемой смеси. При этом скорость «вакансии» соответствует скорости отсутствующего в этой зоне вещества.

При хромадистилляции роль неподвижной фазы играют компоненты разделяемой смеси, которую (в виде жидкости) наносят на твердый носитель. В потоке газа-носителя создаются условия для многократного испарения и конденсации, что обеспечивает разделение компонентов.

В зависимости от природы исследуемых объектов можно рассматривать молекулярную хроматографию, ионообменную (ионную) хроматографию и хроматографию надмолекулярных структур.

В зависимости от природы процесса, обусловливающего рас- пределение сорбатов между подвижной и неподвижной фазами, различают адсорбционную, распределительную, ионообменную,, осадочную, аффинную и эксклюзионную хроматографию.

В адсорбционной хроматографии элементарным актом является адсорбция и разделение основано на различии в адсорбируемости компонентов смеси на данном адсорбенте.

В распределительной хроматографии элементарным актом: является растворение; разделение основано на различии в растворимости сорбатов в подвижной и неподвижной фазах или на различии в стабильности образующихся комплексов.

В ионообменной хроматографии разделение основано на различии констант ионообменного равновесия.

В осадочной хроматографии разделение основано на различной растворимости осадков в подвижной фазе.

Аффинная хроматография основана на биоспецифическом взаимодействии компонентов с аффинным лигандом.

В эксклюзионной хроматографии разделение основано на различии в проницаемости молекул разделяемых веществ в неподвижную (в случае гель-хроматографии неподвижной фазой служит гель) и обусловлено размерами этих молекул. Компоненты элюируются в порядке уменьшения их молекулярной массы.

В зависимости от агрегатного состояния подвижной и неподвижной фаз "различают варианты газовой и жидкостной хроматографии.

Газовой хроматографией называют хроматографический процесс, в котором подвижной фазой является газ (или пар). Варианты газовой хроматографии -- газо-адсорбционная и газожидкостная хроматография, а также промежуточные методы.

В газо-адсорбционной (точнее -- газо-твердофазной) хроматографии неподвижной фазой служит твердый адсорбент, а подвижной-- газ.

В газожидкостной хроматографии неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на инертный носитель, а подвижной -- газ.

К промежуточным методам относится хроматография на модифицированном сорбенте (газо-жидко-твердофазная), основанная на том, что неподвижной фазой служит твердый адсорбент, модифицированный небольшим количеством жидкости. В этом случае играют роль как адсорбция на поверхности" газ -- твердое тело (и в определенной степени -- на поверхности жидкость -- твердое тело), так и растворимость в жидкости. Существуют и другие промежуточные варианты.

Жидкостной хроматографией называют хроматографический процесс, в котором подвижной фазой является жидкость. В жидкостно-жидкостной хроматографии и подвижной, и неподвижной фазами служат жидкости. В жидкостно-адсорбционной хроматографии неподвижной фазой служит твердый адсорбент, а подвижной -- жидкость. В жидкостной хроматографии также имеются промежуточные варианты. Следует указать на некоторую условность термина «неподвижная фаза», поскольку адсорбент или абсорбирующая жидкость не всегда остаются неподвижными. Они могут перемещаться в том же направлении, что и подвижная фаза (но с другой скоростью), или в противоположном. Более того, можно говорить о распределении вещества между двумя областями одной фазы, движущимися с различными скоростями (гидродинамическая хроматография, являющаяся методом разделения коллоидных частиц).

Промежуточным между газовой и жидкостной хроматографией является вариант, когда подвижной фазой служит сжатый газ. Если подвижной фазой служит сверхкритический флюид, то этот вариант называется флюидной хроматографией.

Классификация методов хроматографии

В зависимости, от цели проведения хроматографического процесса различают аналитическую, неаналитическую, препаративную и промышленную хроматографию.

Аналитическая хроматография предназначена для определения качественного и количественного состава исследуемых смесей. Существуют два основных метода хроматографического определения состава смесей: 1) метод выходной кривой, основанный на непрерывном определении свойства выходящего из колонки потока как функции времени или объема пропущенного вещества; 2) метод слоя, заключающийся в определении изменения свойства смеси по длине сорбционного слоя.

Неаналитическая хроматография -- метод исследования физико-химических характеристик веществ при использовании хроматографической аппаратуры и на основании параметров хроматографических зон.

Имеются методики, осуществляемые с использованием хроматографической аппаратуры, но лишенные существенных элементов, присущих хроматографии (например, определение коэффициентов диффузии газов в полой хроматографической колонке, когда отсутствует процесс сорбции).

Препаративную хроматографию применяют для выделения небольших количеств чистых компонентов (или смесей) в лабораторных условиях.

Промышленную хроматографию используют для получения чистых веществ в значительных количествах.

Теории хроматографии

В задачу теории хроматографии входит установление законов движения и размытия хроматографических зон. Основными факторами, положенными в основу классификации теорий хроматографии, являются характер изотермы сорбции и скорость установления равновесия. В зависимости от характера изотермы сорбции различают теории линейной и нелинейной хроматографии. В теории линейной хроматографии рассматриваются процессы, которые описываются линейной изотермой сорбции. Практическое осуществление такого процесса позволяет получать симметричные (относительно точки с максимальной концентрацией) полосы компонентов. В теории нелинейной хроматографии описываются процессы, которые характеризуются выпуклой или вогнутой изотермой и приводят к образованию асимметричных зон. В зависимости от того, учитывается или нет скорость установления равновесия, различают теории идеальной и неидеальной хроматографии. Теория идеальной (равновесной) хромато- ^J графии основана на допущении мгновенного установления равновесия между фазами, т. е. на предположении, что скорости внешней и внутренней диффузии весьма значительны. Ценность такого допущения заключается в том, что оказывается возможным определить законы движения центра хроматографической полосы. В теории неидеальной хроматографии рассматривается реальный процесс и учитывается скорость установления равновесия.

Линейная хроматография. Остановимся подробнее на теории линейной хроматографии, поскольку обычно хроматографический процесс стремятся проводить в условиях, соответствующих линейной области изотермы сорбции. Следует различать три основных способа описания хроматографического процесса. В первом способе слой сорбента рассматривают как макроскопически однородную среду, причем в основе расчета лежит изучение процессов, происходящих с большим числом молекул. Это так называемый метод материального баланса, или метод макроскопических постоянных. Если основное внимание уделяют процессам, происходящим с одной отдельно взятой молекулой, и изучают скорость ее перемещения из одной фазы в другую и вдоль слоя, то мы имеем дело со стохастической теорией. Метод материального баланса и стохастическая теория весьма близки, поэтому их часто объединяют под названием теории скоростей. Наконец, слой сорбента можно рассматривать как последовательность элементарных ступеней, на каждой из которых устанавливается равновесие между фазами. В этом случае имеют дело с теорией тарелок.

Теория тарелок формальна и основана на сравнении хроматографического процесса со ступенчатым разделением, каким является, например, дистилляция. Значение высоты, эквивалентичной теоретической тарелке, и число тарелок не могут служить характеристикой четкости хроматографического разделения веществ, как это предлагалось многими исследователями. Указанные величины являются лишь мерой расширения полосы и не учитывают того, что основа хроматографического разделения -- разность скоростей движения различных компонентов пробы вдоль колонки, обусловленная выбором сорбента. Естественно, что две колонки с одинаковым числом теоретических тарелок могут обеспечить различное качество разделения компонентов в зависимости от того, насколько удачно выбран сорбент.

Газовая хроматография

Газовая хроматография - процесс разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении компонентов между двумя фазами -- газом-носителем (подвижная фаза) и либо твердой фазой, либо жидкостью, нанесенной в виде тонкой пленки на поверхность твердого носителя или стенки хроматографической колонки (жидкая неподвижная, жидкая стационарная фаза). В первом случае метод называется газоадсорбционной хроматографией, во втором -- газожидкостной (распределительной) хроматографией. Из этих двух вариантов газовой хроматографии наиболее распространена распределительная газожидкостная хроматография (ГЖХ), которая и рассматривается далее.

Сущность метода ГЖХ состоит в следующем. Анализируемая смесь (обычно -- раствор) летучих компонентов переводится в парообразное состояние и смешивается с потоком инертного газа-носителя, образуя с ним подвижную фазу -- ПФ. Эта смесь проталкивается далее новой порцией непрерывно подаваемого газа-носителя и попадает в хроматографическую колонку, заполненную неподвижной (стационарной) жидкой фазой -- НФ. Разделяемые компоненты распределяются между ПФ и НФ в соответствии с их коэффициентами распределения К, определяемыми формулой:

где с(НФ) и с(ПФ) -- соответственно содержание (в г/мл) данного компонента в неподвижной и подвижной фазах, находящихся в динамическом равновесии. Равновесный обмен хроматографируемого вещества между НФ и ПФ осуществляется в результате многократного повторения актов сорбция-десорбция по мере движения ПФ вдоль НФ внутри хроматографической колонки.

Поток газа-носителя увлекает с собой разделяемую парообразную смесь вдоль хроматографической колонки, так что процессы сорбция-десорбция разделяемых компонентов повторяется многократно, причем каждый раз в системе устанавливается динамическое равновесие разделяемых веществ между ПФ и НФ. Эти многократные переходы разделяемых веществ из ПФ в НФ и обратно совершаются по всей длине хроматографической колонки до тех пор, пока пары разделяемых веществ не покинут колонку вместе с газом-носителем.

Поскольку сродство различных разделяемых веществ к НФ различно, то в процессе сорбционных -- десорбционных переходов они задерживаются в НФ неодинаковое время. Чем выше температура кипения и относительная растворимость вещества в НФ, т.е. чем больше его коэффициент распределения, тем дольше оно находится в НФ, тем позже покидает хроматографическую колонку. В конце концов из хроматографической колонки вместе с газом-носителем выходят зоны (объемы) парообразных хроматографируемых веществ, разделенных полностью или частично.

Если для двух компонентов смеси коэффициенты распределения одинаковы, то они не разделяются. Если же их коэффициенты распределения различны, то разделение происходит, причем первым покидает колонку тот компонент, у которого коэффициент распределения наименьший.

Пары разделенных компонентов вместе с газом-носителем поступают в детектор хроматографа, генерирующий электрический сигнал -- тем больший, чем выше концентрация компонента в парогазовой смеси. Электрический сигнал усиливается и фиксируется регистратором хроматографа в виде хроматограммы, записываемой на диаграммной ленте или на мониторе компьютера (если таковым снабжен хроматограф). Эти хроматограммы и используются для качественной и количественной обработки результатов анализа разделяемой смеси компонентов.

Жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография, или жидкостная хроматография высокого давления, основана на тех же принципах, что и ГЖХ, только вместо газа-носителя в качестве ПФ применяется поток жидкости, не смешивающейся с жидкой НФ хроматографической колонки. Таким образом, в ВЭЖХ обе контактирующие фазы -- НФ и ПФ -- жидкости. Разделение компонентов основано на различии их коэффициентов распределения между НФ и ПФ.

Температура хроматографической колонки может быть комнатной, что позволяет хроматографировать белки, аминокислоты и другие термически нестойкие соединения. Молярная масса разделяемых веществ может достигать ~2000. На рисунке показана принципиальная блок-схема жидкостного хроматографа:

Резервуар 1 для растворителя из нержавеющей стали или другого материала можег иметь в аналитическом варианте обьем около 1 л. Насос 2 служит для подачи жидкой фазы из резервуара 1 под повышенным давлением. Он обеспечивает подачу жидкости со скоростью до 10 мл/мин при высоком давлении на входе в колонку -- до 100--500 атм. Между насосом и колонкой устанавливается фильтр с диаметром пор около -10 мкм.

В микроколоночных жидкостных хроматографах применяют насос низкого давления -- до 10--20 атм.

Для ввода анализируемой пробы служит устройство 3. При давлении жидкости, превышающем ~120 атм, ввод пробы шприцем затруднителен, полому используют специальные многоходовые краны. Объем вводимой пробы может составлять 0,05--50 мкг.

Аналитическую хроматографическую колонку 4 обычно делают из нержавеющей стали или стекла толстостенной, длиной ~10--25 см (может быть и больше), с внутренним диаметром 3-8 мм. Предпочтительны прямые колонки.

В микроколоночных жидкостных хроматографах применяют колонки меньшей длины с внутренним диаметром 1--2 мм и даже меньше.

Устройство для ввода пробы и хроматографическая колонка находятся в воздушном или водяном термостате 5, который поддерживает заданную температуру с точностью ±0,1 °С.

Рабочая температура термостатирования лежит между температурами замерзания и кипения жидкой ПФ, чаще всего -- в диапазоне от 20 до 50 °С.

Система б включает детектор специального типа. Применяют спектрофотометрические (с постоянной или переменной длиной волны), рефрактометрические, адсорбционно-термометрические, флуориметрические детекторы и некоторые другие.

Детекторы бывают двух типов. Детекторы первого типа реагируют на изменение свойств растворителя (например, показателя преломления). Детекторы второго типа реагируют на свойства растворенного вещества, например, спектрофотометр и чес кие детекторы, обладающие высокой чувствительностью и селективностью.

Сигнал от детектора преобразуется, усиливается и регистрируется самописцем на бумаге в виде хроматограммы, аналогичной хроматограмме в ГЖХ.

Используют наполненные хроматографические колонки, которые заполняют частицами твердого носителя с нанесенной на их поверхность тонкой пленкой жидкой ПФ. Размер зерен твердого носителя составляет 5--10 мкм. Твердый носитель готовят из поверхностно-пористых материалов -- силикагеля с гидроксилированной поверхностью или с привитыми на поверхности различными функциональными группами; алюмогель, пористые стекла, полимерные сорбенты.

Заполнение колонок проводится пол высоким давлением, поэтому упаковка частиц внутри колонки получается плотной, что способствует высокоэффективному разделению компонентов смеси.

Жидкая НФ, наносимая на поверхность частиц твердого носителя, составляет 0,75--1,5% от массы твердого носителя.

Обычно для разделения полярных веществ используют полярные же НФ и относительно малополярные ПФ. Неполярные вещества разделяют на неполярных же НФ -- применением полярных ПФ.

В качестве жидких НФ используют различные вещества, например:

в,в'-оксипропионитрил -- для разделения фенолов, пероксидов, ароматических аминов, спиртов, а также углеводов, алкалоидов, стероидов; ПФ -- циклопентан, гексан, гептан, хлороформ;

триэтиленгликоль -- селективен по отношению к разделению спиртов, пероксидов, соединений с ОН-группами; ПФ -- та же;

цианоэтилсиликон -- для разделения сульфамидных производных, замещенных аминов и др.; ПФ -- тетрагидрофуран, изопропанол.

Жидкие НФ несколько, хотя и незначительно, растворяются в ПФ и частично уносятся с ней. При повышенных скоростях движения ПФ механический унос жидкой НФ может стать заметным. Поэтому применяют ПФ, химически связанные с поверхностью частиц твердого носителя, например, твердые носители с химически связанными кремнийорганическими полимерами.

В ВЭЖХ используют как нормально-фазовый, так и обращенно-фазовый варианты. В первом случае полярность НФ больше полярности ПФ, во втором, наоборот, полярность НФ меньше полярности ПФ.

В обращенно-фазовом варианте применяют твердый носитель из силикагеля с привитыми гидрофобными группами. В этих случаях в качестве ПФ используют смесь воды с низкомолекулярными спиртами или с ацетонитрилом.

ВЭЖХ очень широко применяется для идентификации, разделения и определения самых различных веществ: оптически активных соединений, белков, нуклеиновых и аминокислот, полисахаридов, красителей, взрывчатых веществ, биологических сред, лекарственных препаратов и т.д. Метод используют для проведения профильного хроматографического анализа медицинско-биологических объектов в случаях патологических отклонений от нормы -- так называемый «метод распознавания образов».

При технологическом и фармакопейном контроле качества лекарственных субстанций и лекарственных форм ВЭЖХ стала одним из основных методов определения как самих фармакологически активных веществ, так и вспомогательных компонентов и посторонних примесей.

Так, например, методом ВЭЖХ анализируют лекарственные препараты альдактон, амизол, вальпроат натрия, глиборал, диклофенак натрия, козаар, кофеин, лидокаина гидрохлорид, мелоксикам, месалазик, парацетамол, пилокарпина гидрохлорид, пирацетам, соталола и цетилпиридина гидрохлориды, флуконазол и многие другие.

Жидкостно-жидкостная хроматография

Специфика метода жидкостно-жидкостной хроматографии

Жидкостно-жидкостная хроматография (ЖЖХ) по сути, близка к газожидкостной хроматографии. На твердый носитель также наносится пленка жидкой фазы и через колонку, наполненную таким сорбентом, пропускают жидкий раствор. Жидкость, нанесенную на носитель, называют неподвижной жидкой фазой, а растворитель, передвигающийся через носитель, - подвижной жидкой фазой. ЖЖХ может проводиться в колонке (колоночный вариант) и на бумаге (бумажная хроматография, или хроматография на бумаге).

Аппаратура для жидкостной хроматографии

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами.

На рис.1. представлена блок-схема жидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.

Рис. 1 Блок-схема жидкостного хроматографа: 2 - насос предназначен для создания постоянного потока растворителя. Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используются насосы плунжерного (шприцевого), либо пистонного типов. Недостатком первых является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом, а вторых - большая сложность конструкции и, как следствие, высокая цена. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа с успехом применяют недорогие перистальтические насосы, но так как при этом трудно добиться постоянства давления и скорости потока, их использование ограничено препаративными задачами.

3 - инжектор обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью. Простые системы ввода пробы - "stop-flow" требуют остановки насоса и, поэтому, менее удобны, чем петлевые дозаторы, разработанные фирмой Reodyne.

4 - колонки для ВЭЖХ представляют собой толстостенные трубки из нержавеющей стали, способные выдержать высокое давление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Для жидкостной хроматографии низкого давления с успехом используют толстостенные стеклянные колонки.

5 - термостат обеспечивает постоянноство температуры.

6 - детекторы для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента

7 - регистрирующая система в простейшем случае состоит из дифференциального усилителя и самописца. Желательно также наличие интегратора, позволяющего рассчитывать относительные площади получаемых пиков. В сложных хроматографических системах используется блок интерфейса, соединяющий хроматограф с персональным компьютером (8), который осуществляет не только сбор и обработку информации, но и управляет прибором.

Колоночный вариант

Разделение смеси веществ в жидкостно-жидкостной хроматографии основываются на различии коэффициентов распределения вещества между несмешивающимися растворителями. Коэффициент распределения вещества равен:

Кп,н =сп /сн

где сп и сн -- концентрация вещества в подвижной и неподвижной фазах.

Для членов одного гомологического ряда установлены некоторые закономерности в величинах Кп.н . Известна, например, зависимость Кп.н в данном гомологическом ряду от числа атомов углерода.

Поиск несмешивающихся фаз, обеспечивающих разделение, обычно производится эмпирически на основе экспериментальных данных. Широкое применение в жидкостно-жидкостной хроматографии получили тройные системы, состоящие из двух несмешивающихся растворителей и третьего, растворимого в обеих фазах. Такие системы позволяют получать набор несмешивающихся фаз различной селективности. В качестве примера можно привести систему из несмешивающихся между собой гептана и воды, в которую введен этанол, растворяющийся в обоих растворителях.

Хотя в качестве подвижной и неподвижной фаз выбираются растворители, не смешивающиеся между собой, все же во многих системах наблюдается некоторая взаимная растворимость. Чтобы предотвратить процессы взаимного растворения жидкостей в ходе хроматографирования, подвижную жидкую фазу предварительно насыщают неподвижной. Для сохранения неизменного состава фаз применяют также метод химического закрепления неподвижной фазы на сорбенте. При этом используют взаимодействие растворителя с группами ОН- на поверхности носителя. Адсорбенты с закрепленной на их поверхности жидкой фазой выпускаются промышленностью.

Эффективность колонки связана с вязкостью, коэффициентом диффузии и другими физическими свойствами жидкостей. С уменьшением вязкости подвижной фазы сокращается продолжительность анализа, но с увеличением вязкости несколько возрастает эффективность. В практике обычно используют маловязкие растворители, так как возрастание эффективности колонок при увеличении вязкости не очень велико.

Носитель неподвижной фазы должен обладать достаточно развитой поверхностью, быть химически инертным, прочно удерживать на своей поверхности жидкую фазу и не растворяться в применяемых растворителях. В качестве носителей используют вещества различной химической природы: гидрофильные носители - силикагель, целлюлоза и др. и гидрофобные -- фторопласт, тефлон и другие полимеры.



Рис 3. Вид хроматограммы в зависимости от эффективности и селективности хроматографической системы:

а - нормальная селективность, пониженная эффективность;

б - нормальная эффективность и селективность;

в - повышенная селективность, нормальная эффективность.

Задачи

1. При разделение катионов Hg²⁺ и Cu²⁺ , содержащихся в анализируемом растворе ( HgCl₂ + CuCl₂ + вода ), методом бумажной хроматографии с использованием в качестве НФ w - бутанола, насыщенного НCl, получены следующие данные: расстояние от линии старта до линии фронта растворителя l = 100 мм, расстояние от линии старта до центров пятен разделяемых компонентов l (Hg²⁺) = 72 мм, l(Cu²⁺) = 7 мм. Рассчитайте коэффициенты подвижности Rf и коэффициент разделения а. Ответ: Rf(Hg²⁺) = 0,72; Rf(Cu²⁺) = 0,07; а(Нg²⁺/Сu²⁺) = 10,3.

2. В результате хроматографирования на бумаге анализируемого раствора, содержащего смесь трех катионов X^2-, Y²⁺ и Z²⁺ , c использованием в качестве ПФ смеси коллидин - вода и в качестве стандарта - раствор, содержащий катионы Sr²⁺, получено: L = 100 мм, l(X²⁺) = 52 мм, l(Y²⁺) = 26, l(Z²⁺) = 65 мм, l(Sr²⁺) = 40 мм. Рассчитайте значения относительных коэффициентов подвижности Rf всех трех катионов и установить их природу, если известно, что для данных условий Rs(Ba²⁺) = 0,25, Rs(Ca²⁺) = 1,31, Rs(Mg²⁺) = 1,62.

3. При разделении смеси катионов Cu²⁺, Mn²⁺ и Fe³⁺, содержащихся в анализируемом растворе, методом хроматографии на бумаге с использованием в качестве ПФ ацетона, насыщенного НCl, получены следующие значения коэффициентов подвижности: Rf(Cu²⁺) = 0,74, Rf(Mn²⁺) = 0,32, Rf(Fe³⁺) = 0,97. Для катионов Со²⁺, используемого в качестве стандарта в тех же условиях, получено: Rf(ст) - Rf(Co²⁺) = 0,54. Вычислите относительные коэффициенты подвижности для указанных трех катионов.

4. После хроматографирования на бумаге с анализируемого раствора, содержащего смесь двух катионов Х^- и Y^-,c применением в качестве ПФ смеси пиридина и воды (90:10 по объему) и в качестве стандарта - раствора, содержащего бромид - ионы Вr^-, получено: Rf(Br^-) = 0,47, Rf(X^-) =0,21, Rf(Y^-) = 0,70.Определите относительные коэффициенты подвижности аниона X^-, Y^- и установите их природу.

5. При хроматографировании (с целью выбора внутреннего стандарта для определения витамина Е) методом капиллярной ГЖК смеси витамина Е, сквалана, себацината и цетилпальмитата с использованием стеклянной хроматографической колонки длиной L = 20 м получены следующие характеристики пиков на хроматограмме ( l - расстояние удерживания, h - и a Ѕ - высота и полуширина пика):

Компонент смеси	l, мм	h, мм	бЅ, мм
Сквалан	19	177	1
Себацинат	26	179	1
Витамин Е	62	185	1,8
Цетилпальмитат	93	160	2,4

Рассчитайте степень разделения Rs сквалана, себацината и цетилпальмитата с витамином Е и массовую долю W (в процентах) каждого компонента в смеси (методом внутренней нормализации).

6.Провели ГЖХ-анализ смеси, состоящей из ацетона, бензола и гексана, с использованием накопленной колонки длиной L = 1000 мм, на полученной хроматограмме определили характеристики пиков всех трех компонентов - расстояние удерживания l, высоту h, полуширину бЅ пика и нашли:

Компонент смеси	l, мм	h, мм	бЅ, мм
Ацетон	35	87	4
Гексан	48	104	4
Бензол	58	164	6

Рассчитайте параметры, характеризующие эффективность хроматографической колонки, - число теоретических тарелок n, величину ВЭТТ. Вычислите степень разделения Rs двух пар компонентов: ацетон - гексан и гексан - бензол.Определите массовую долю W (в процентах) каждого компонента в смеси методом внутренней нормализации.

7. Провели разделение смеси, включающей б - токоферилацетат и изофитол, на капиллярной хроматографической колонке длиной L = 20.Полученные пики б - токоферилацетата и изофитола на хроматограмме характеризуются следующими параметрами (l- расстояние удерживания, бЅ - полуширина пика, выраженные в одинаковых единицах измерения): б - токоферилацетат: l = 153, бЅ = 2,5; изофтол: l = 61; бЅ = 1.Охарактеризуйте эффективность капиллярной колонки, рассчитав число теоретических тарелок n и величину, эквивалентную теоретической тарелке, - ВЭТТ.



Заключение

Хроматография - это прежде всего мощный метод разделения. Сегодня она заняла ведущее место среди методов анализа сложных смесей, и трудно найти область естественных наук, в которой бы не использовались достижения хроматографии. Однако следует учесть, что в хроматографическом процессе реализуются малейшие различия в физико-химических свойствах компонентов системы благодаря многократному повторению процессов распределения вещества между неподвижной фазой (жидкость или твердое тело, общий термин - сорбент) и подвижной фазой (жидкость или газ). Поэтому положение и форма хроматографических пиков дают не только информацию, необходимую для полной аналитической характеристики веществ, а определяются основными термодинамическими закономерностями и отражают различные кинетические параметры. В связи с этим хроматография применяется не только как аналитический метод, но также как метод измерения физико-химических величин. Сегодня хроматография используется для изучения адсорбционных явлений, термодинамики растворов, фазовых переходов, в кинетике, катализе и других разделах физической химии.

Ни один из методов исследования физикохимических характеристик систем твердое тело - газ, жидкость - газ или жидкость - твердое тело, включая статические, калориметрические или спектроскопические методы, не может сравниться с хроматографией по эффективности и широте использования. С помощью хроматографии можно исследовать изомеры и изотопы водорода, нейтральные молекулы и ионы, неорганические и органические соединения, природные и синтетические полимеры, белки, вирусы и даже живые клетки.



Список литературы

Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ганкина Э.С., Шац В.Д. Аналитическая хроматография. М., Химия, 1993.

Азимов А. Краткая история химии: развитие идей и представлений в химии. СПб., Амфора, 2000.

Васильев В. П. Аналитическая химия, В 2 кн. Кн. 2 Физико-химические методы анализа: Учеб. для студ. вузов, обучающихся по химико-технол. спец. - 4-е изд., стереотип. - М.: Дрофа, 2004 - 384 с.

Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия (Аналитика). В 2 книгах. 5-е издание. М.:Высшая школа, 2010

Основы аналитической химии. В 2 книгах. 2-е издание. Под редакцией Ю.А.Золотова - М.: Высшая школа, 2000

Размещено на Allbest.ru

...