Йодометрическое определение дубильных веществ в растительном сырье

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНОБРНАКИ РОСИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

«Чувашский государственный университет имени И.Н.Ульянова»

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

НА ТЕМУ: «Йодометрическое определение дубильных веществ в растительном сырье»

Дипломник:

Алешина Наталья Дмитриевна

Научный руководитель:

ст. преподаватель

Турусова Е.В.

Чебоксары -2016



Введение

Актуальность темы. В последние годы возрастает интерес к лекарственным препаратам растительного происхождения в силы биодоступности действующего вещества и сбалансированного минерального состава. дубильный реагент йод пирогаллол

На данный момент ассортимент лекарственных средств растительного происхождения на рынке России составляет более 40% [1]. Лекарственное растительное сырье (РС), содержащее дубильные вещества (ДВ) нашли широкое применение в терапевтической практике в качестве дезинфицирующих и противовоспалительных средств. Однако несоблюдение условий проботбора и хранения РС содержащего ДВ приводит к уменьшению его количества. Согласно НД для количественной оценки содержания ДВ в РС рекомендуют применение фотометрических [2] и потенциометрических [3] способов, недостатками которых являются применение токсичных растворителей при извлечении реагента, необходимость строгого соблюдения условий проведения анализа и высокая трудоемкость.

Несмотря на столь широкое применения физико-химических способ определения ДВ в РС не потеряли своего значения и объемные, в силу простоты исполнения. Среди них особое значение занимает йодометрическое определение восстановителей входящих в состав РС, что может быть использовано и при определение полифенолов. К сожалению возможности йодометрического определения, ограничиваются необходимостью стандартизации титранта ввиду его летучести. В связи с чем разработка чувствительного и селективного способа определения ДВ в РС актуально.

Недостатки классической иодометрии можно устранить применением фотогенерированного йода. В данном случае отпадает необходимость стандартизации раствора титранта, т.к. йод получают в результате облучения раствора, содержащего йодид калия, ацетатный буферный раствор и эозин. Визуальное фиксирование точки эквивалентности заменяется инструментальным, т.к. за содержанием титранта в ячейке следят амперометрически с двумя поляризованными электродами.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка экспрессного способа определения ДВ в пересчете на пирогаллол в РС.

Для достижения поставленной цели возникает необходимость решения ряда задачи:

1. Исследование возможности фотохимического титрования пирогаллола фотогенерированным йодом.

2. Разработка методических указаний фотохимического определения пирогаллола в субстанции.

3. Апробация фотохимического способа определения пирогаллола на образцах дикорастущего и культивированного РС.

Объект данного исследования. Ассортимент РС, содержащих простые фенольные соединения.

Научная новизна результатов исследования. Впервые предложен фотохимический способ определения пирогаллола.

Практическая значимость. Разработан фотометрический способ определения пирогаллола в модельных системах. На основе экспериментальных данных предложена возможная схема взаимодействия пирогаллола с фотохимическим титрантом.

Проведена апробация фотохимического определения ДВ в пересчете на пирогаллол на образцах дикорастущего и культивированного РС.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Методика фотохимического титрования пирогаллола в субстанции.

2. Методика фотохимического титрования пирогаллола в растительном сырье.

Апробация. Результаты работы доложены на научно-практической конференции Регионального фестиваля студентов и молодежи «Человек. Гражданин. Ученый» (Чебоксары, 2015).

Структура и объем диплома. Диплом состоит: из введения, 3 глав, списка цитируемой литературы из 37 источников. Материал работы изложен на 37 страницах, содержит 6 рисунков, 8 таблиц.

1. Дубильные вещества

1.1 Общая характеристика

Дубильными веществами (таннидами) называются растительные полифенольные соединения с молекулярной массой от 500 до 3000, способные образовывать прочные связи с белками и алкалоидами и обладающие дубящими свойствами. Эта способность основана на их взаимодействии с коллагеном, приводящая к образованию устойчивой поперечносвязанной структуры. Подобные связи могут образовываться так же в тех случаях, когда молекулы достаточно велики, чтобы присоединить соседние цепочки коллагена, и имеют достаточное количество фенольных групп для образования поперечных связей [1, 2].

В результате сложного строения дубильных веществ, их классификация затруднена.

Наибольшее признание получила классификация Г. Поварнина (1911 г.) и К. Фрейденберга (1933 г.), основанная на химической природе дубильных веществ (ДВ) и их отношении к гидролизующим агентам. Согласно этой классификации ДВ делятся на две группы: гидролизуемые и конденсированные.

Гидролизуемые ДВ - смеси сложных эфиров фенолкарбоновых кислот с сахарами и несахаридами. В водных растворах в кислой и щелочной средах они гидролизуются на составные части фенольной и нефенольной природы. В свою очередь гидролизуемые ДВ можно разделить на:

1. Галлотаннины - сложные эфиры галловой (структура I), дигалловой кислот и других ее полимеров с циклическими формами cахаров (обычно D-глюкозой).

Турецкий таннин (структура II), выделенный из турецких галлов, представляет собой гекса- и гептагаллоилглюкозу.

Дубильные вещества этой группы содержатся и преобладают в корневищах и корнях кровохлебки, корневищах змеевика, корневищах бадана, соплодиях ольхи, коре дуба.

2. Эллаготаннины - эфиры кислоты эллаговой (структура III) и других кислот, имеющих с ней биогенетическое родство, с циклическими формами cахаров (D-глюкозой).

Эллаготаннины сложны по структуре и содержатся главным образом в тропических и субтропических растениях. Найдены в околоплоднике плодов гранатника, коре эвкалипта, околоплоднике грецкого ореха, коре дуба, соплодиях ольхи, листьях и соцветиях кипрея узколистного (иван-чая).

Галлотаннины и эллаготаннины в растениях могут встречаться одновременно.

3. Несахаридные эфиры фенолкарбоновых кислот ? эфиры галловой кислоты с хинной, гидроксикоричными (хлорогеновой, кофейной, гидроксикоричной) кислотами, а также с флаванами (катехингаллат (структура IV)).

Эта группа широко распространена в растениях. Эфиры кислоты галловой и катехинов находятся в листьях чая китайского - Camellia sinensis (L.) Kuntze. Из зеленого чая выделен теогаллин (структура V), представляющий собой эфир кислот хинной и галловой (кислота 3-О-галлоилхинная).

Для конденсированных ДВ не характерны сложноэфирные свойства. Полимерная цепь образована посредством углерод-углеродных связей (-С-С-), что обусловливает их устойчивость к воздействию кислот, щелочей и ферментов. При действии минеральных кислот происходит образование флобафенов, или красеней, красно-коричневого цвета.

Конденсированные ДВ - продукты конденсации катехинов (флаван-3-олов) (структура VI), лейкоантоцианидинов (флаван-3,4-диолов) (структура VII), реже гидроксистильбенов (фенилэтиленов).

Высокое содержание конденсированных ДВ наблюдается в коре калины, корневищах лапчатки, плодах черники, плодах черемухи, траве зверобоя, листьях чая.

В состав смесей ДВ входят также простые фенолы (резорцин, пирокатехин, пирогаллол, флороглюцин и др.) и свободные фенолкарбоновые кислоты (галловая, эллаговая, протокатеховая и др.).

Чаще всего в растениях встречается смесь гидролизуемых и конденсированных таннидов с преобладанием той или иной группы, поэтому классифицировать растительное сырье (РС) по типу ДВ достаточно сложно. В некоторых видах сырья отмечено почти одинаковое содержание обеих групп дубильных веществ (например, корневища змеевика).

1.2 Реакции идентификации ДВ

Качественные реакции для определения дубильных веществ можно разделить на две группы: реакции осаждения и цветные реакции. Для проведения качественных реакций из исследуемого растительного сырья готовят водное излечение.

Реакции осаждения

1. К 2-3мл извлечения (отвара, танин) добавляют по каплям 1% раствор желатины. Появляется муть исчезающая при добавлении избытка реактива.

2. К 2 - 3 мл извлечения (китайский танин или пирогаллол) прибавляют несколько капель 1% раствора хинина хлорида. Появляется аморфный осадок.

3. К 10 мл извлечения (пираголлола) прибавляют 5 мл смеси, состоящей из 2 мл HCl (1:1) и 3 мл 40% раствора формальдегида. Полученную смесь кипятят 30 минут в колбе, снабженной обратным холодильником. При наличии конденсированных дубильных веществ, они выпадают в осадок (конденсированные дубильные вещества). Осадок отфильтровывают.

4. К 1 мл извлечения (танин) добавляется 2 мл 10% CH₃COOH и 1 мл 10% Pb(CH₃COO)₂ - гидролизуемые дубильные вещества образуют осадок.

5. К 2-3 мл извлечения (пирогаллола) прибавляется по каплям бромную воду (5 г брома в 1 л воды) до того момента, когда в жидкости станет ощущаться запах брома. При наличии конденсированных дубильных веществ сразу образуется осадок.

6. Реакция с солями алкалоидов. Образуется аморфный осадок за счет образования водородных связей с гидроксильными группами дубильных веществ и атомами азота алкалоида.

Цветные реакции

1. При добавлении к 2-3 мл извлечения 4 - 5 капель раствора железоаммониевых квасцов в случае гидролизуемых дубильных веществ появляется черно-синее окрашивание или осадок, а конденсированных - черно-зеленое окрашивание или осадок.

2. Катехины дают красное окрашивание с ванилином (в присутствии конц. HCl или 70 %-ной H₂SO₄ развивается яркая красная окраска).

3. К 2 мл фильтрата добавляют10 капель 1% железоамманиевых квасцов и около 0,2 мл кристаллического ацетата свинца, раствор перемешивают. В случае наличия гидролизуемых дубильных веществ появляется синее или фиолетовое окрашивание (в нейтральной среде).

4. К 10% водному извлечению прибавляют нитрозометилуретан и кипятят. При этом конденсированные таниды осаждаются полностью; присутствие гидролизуемых танидов можно обнаружить, как было описано выше (фиолетовое окрашивание).

5. К извлечению добавляют 1% раствор ванилина в конц. HCl. При наличии катехинов жидкость окрашивается в красный цвет (на конденсированные дубильные вещества).

Хроматографическое определение катехинов.

Спиртовое извлечение из сырья хроматографируют в тонких слоях сорбента на пластинках «Silufol» в системе растворителей ВУВ (40:12:28) в течение 1,5ч. По окончании хроматографирования (пробег 10-12см) пластинку высушивают на воздухе, после чего обрабатывают 1% раствором ванилина в растворе HCl (с= 1,19 г/мл). Катехины проявляются в виде красно-оранжевых пятен [3].

1.3 Способы количественного определения ДВ

Согласно ОФС.1.5.3.0008.15 в основе определения ДВ лежат объемный и спектрофотометрический способы определения [4, 5], основанные на извлечение ДВ из исследуемого образца кипящей водой и дальнейшим титрованием образца перманганатом калия в присутствии индигосульфокислоты, в качестве индикатора или фотометрированием фосфорномолибденово-вольфрамовой гетерополикислоты при длине волны 760 нм.

В силу простоты и доступности оборудования наибольшее применение при определении антиоксидантной емкости получили спектрофотометрические способы [4, 6, 7, 8]. Так авторы работ [8] рекомендуют определять полифенольные соединения по собственному поглощению при длине волны 460 нм. Однако возможности метода ограничиваются низкой селективностью. Повысить селективность определения можно путем специфических реакций. Так реакция комплексообразования полифенолов (ПФ) с хлоридом алюминия позволяет проводить определение агликоновых и гликозидных форм [9], а реактив Фолена-Чокалтеу [10, 11, 12, 13, 14, 15] ? не только в растительном сырье, но и напитках (винах). Повысите селективность определения, позволяет проведение анализа в режиме твердофазно-спектрофотометрии. Авторы работы [6] разработали кремне?титановые ксерогели позволяющие проводить количественную оценку содержания рутина, кверцетина и дигидрокверцетина без проведения предварительной пробоподготовки. Однако применение данных гелей чревато увеличением единичного времени определения. Уменьшить время единичного определения при сохранении высокой чувствительности и селективности позволяет применение метода FRAP [16]. Авторы работы [17] для определения общей антиоксидантной силы по методу FRAP рекомендуют проводить с реагентом 2,4,6?трипиридил?s?триазином. Несмотря на высокую чувствительность возможности метода ограничиваются необходимостью применения реагентов высокой чистоты. Для снижения стоимости анализа авторы работы [18] рекомендуют судить о содержание полифенолов по продукту окисления N,N'?дифенил?n?фенилендиамина (ДФФД) с фотометрированием продукта при 450 нм. Не смотря на простоту исполнения и доступность аппаратурного формления возможности метода ограничиваются низкой селективностью определения.

При анализе простых лекарственных форм широкое применение в аналитической практике нашли УФ?спектрофотометрические методы. Расширить круг объектов УФ?спектрофотометрического исследования позволяет применение предварительного разделения компонентов отваров и экстрактов. Так авторами работы [19] проведена апробация УФ?спетрофотометрического метода для определения полифенолов в рябине.

Нельзя забывать и о кулонометрических способах определения. Так авторы работы [10] для определения полифенолов в чае. Варьирование электрогененрированных титрантов (иода и гексацианоферрат(III)?ионов) позволяет определять полифенолы в присутствии аскорбиновой кислоты с ошибкой определения не превышающей 0,07 [20].

Особое место в анализе лекарственных средств органической и минеральной природы при определении в них фенолов занимают хроматографические методы [21]. Наиболее широкое применение из хроматографических нашел метод тонкослойной и ВЭЖХ с флуоресцентным, УФ? и масс? спектрометрическими детекторами (ПрО 1?10 мкг/ мл) [7]. Предложенный способ позволяет анализировать сложные аналитические матрицы. Так, например, авторами работы [22] благодаря методу высокоэффективной жидкостной хроматографии и метод масс?спектрометрии в варианте MALDI/TOF/MS удалось установить и идентифицировать проантоцианидины; гликозиды кверцетина, лютеолина, апигенина и кемпферола; оксикоричные кислоты: п?кумаровой, кофейной и эллаговой в образце репешки обыкновенной. Их количественную оценку определения в сырье проводили с использованием абсолютной градуировки методом ОФ ВЭЖХ в пересчете на гиперозид и лютеолин?7?глюкозид. Применение в качестве подвижной фазы использовали смеси ацетонитрила с 0,01 М водным раствором фосфатного буфера в объёмном соотношении 35:65 (рН = 3) с последующим спектрофотометрическим детектированием при длине волны л = 289 нм позволяет определять содержание полифенолов в сложной органической матрице [23]. Обращено -фазовая ВЭЖХ на колонке Luna 5u C18(2) позволяет проводить селективное определение ряда флавоноидов (кверцетина, нарингенина, хризина, морина, рутина и нарингина) в пищевом концентрате полифенолов винограда «Эноант» и в вытяжках лекарственных растений [24]. Основным недостатком вышеуказанного метода является необходимость применения растворителей с нужной степенью очистки, дороговизна и сложность аппаратурного оформления.

В силу простоты исполнения и доступности аппаратурного оформления в аналитической практике определения полифенолов в сложной матрице метод тонкослойной хроматографии. Повысить селективность определения позволяет проведение предварительной экстракции, что, конечно же, увеличивает время единичного определения. Так авторы работы [8, 25] для разделения танина, галловой кислоты и пирогаллола из водно?солевых растворов проводили с применением подвижной фазы, состоящей из бутанола?1, уксусной кислоты и хлороформа в соотношении (об.) 4 : 1 : 5. Установлено, что по сравнению с известными хроматографическими системами время разделения аналитов при этом уменьшается с 60 до 20?30 минут.

В силу простоты исполнения все больше практическое применение находят методы инверсионной вольтамперометрии [7]. Так авторами работы [26] разработаны амперометрические сенсоры на основе углеродистых наноматериалов, позволяющие улучшить аналитические характеристики определения фенольных антиоксидантов. Данные сенсоры нашли применение в оценке содержания полифенольных соединений в растительном сырье, а установка ЦветЯуза?01?АА» с амперометрическим детектированием (АД) позволяет оценить антиоксидантную активность сложной биологической матрицы с пределом обнаружения 10^-9?10^-12 г [27]. Повысить селективность определения позволяет модификация электродов. Так, например, авторы работы [28] рекомендуют модифицировать электрод из угольной пасты SiO₂. Это позволяет снизить предел определяемой концентрации пирогаллола до 0,7 мкмоль (после накопления в течение 4 мин). Разработанный метод был успешно использован для определения пирогаллола в воде и образцах зеленого чая.

Не следует и забывать потенциометрических методах определения. Так авторы работы [4, 5] рекомендуют применять потенциометрический метод как альтернативу фармакопейным методикам.

1.4 Пропоотбор и пробоподготовка

Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах проводят согласно ОФС.1.5.3.0008.15. Лекарственное растительное сырье количественно переносят в коническую колбу емкостью 250 мл, прибавляют 150 мл воды и кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин. Полученный образец, отфильтровывают через бумажный фильтр диаметром около 125 мм, отбрасывая первые 50 мл фильтрата.

1.5 Заготовка, сушка и хранение РС содержащего ДВ

Заготовку РС проводят в период максимального накопления ДВ. У травяных растений, как правило, минимальное содержание ДВ отмечается весной в период отрастания, затем их содержание увеличивается и достигает максимума в период цветения (например, корневища лапчатки). К концу вегетации количество ДВ постепенно снижается. Фаза вегетации влияет не только на количество, но и на качественный состав ДВ. Весной, в период сокодвижения, в коре деревьев и кустарников и в фазу отрастания у травянистых растений преимущественно накапливаются гидролизуемые ДВ, а осенью в фазу отмирания растений - конденсированные ДВ и продукты их полимеризации - флобафены (красени). Производится в период наибольшего содержания в растениях ДВ, исключить попадания воды на сырье.

После сбора сырье необходимо быстро высушить, так как под влиянием ферментов происходят окисление и гидролиз ДВ. Собранное сырье сушат на воздухе в тени или в сушилках при температуре 50-60 градусов. Подземные органы и кору дуба можно сушить на солнце.

Хранят в сухом помещении хорошо проветриваемых помещениях без доступа прямых солнечных лучей по общему списку в течение 2?6 лет, в плотной упаковке, желательно в целом виде, так как в измельченном состоянии сырье подвергается быстрому окислению вследствие увеличения поверхности соприкосновения с кислородом воздуха.



2. Фотохимические реакции

Фотохимия изучает химические реакции, протекающие под действием света или вызываемые им. Основные особенности фотохимических реакций делают их применение в аналитической химии весьма перспективным:

1. Высокая селективность, которая может быть увеличена при использовании фильтрованного или монохроматического света определенной длины волны.

2. Легкость регулирования скорости реакций в широких пределах изменением интенсивности светового потока, быстрое и полное ее приостановление с прекращением облучения.

3. Возможность получения веществ, которые не могут быть получены обычными реакциями.

4. Возможность получения продуктов, свободных от примеси избытка реагентов, так как роль реагента играет свет.

5. Возможность работы с исключительно малыми количествами веществ (10^-8ч10^-9 г) при большой точности определения [30]. Так же основные особенности и преимущества фотохимического метода перед другими методами обусловлены особенностями одного из участников реакции - фотона. Рассматривая фотон как компонент реакции, можно считать, что фотохимические реакции в растворах являются гомогенными. Концентрацию фотонов в растворе легко регулировать изменением интенсивности света. Независимость скорости многих фотохимических реакций от температуры делает эти реакции особенно ценными для использования в кинетических методах [31].

2.1 Фотогенерированный иод как аналитический реагент

Иодид-ионы в присутствии кислорода и сенсибилизаторов (эозина, флуоресцеина и др.) легко окисляются с образованием молекулярного йода при освещении раствора видимым светом в области длин волн на участке поглощения сенсибилизатора [30]. При наличии в растворе веществ, способных реагировать с йодом, последний непрерывно расходуется на реакцию. После ее завершения в системе появляется свободный йод. Изменение количества тиранта в поглотительной ячейке регистрируется амперометрически с двумя поляризованными

Продолжительность последующего освещения раствора до появления в нем прежнего количества йода, а соответственно и прежней величины тока в цепи, является основной величиной, характеризующей концентрацию определяемого вещества [34].



3. Экспериментальная часть

3.1 Реактивы и растворы

1. Калий йодистый, ч.д.а. по ГОСТ?у 4232?74. 0,1 М раствор готовили растворением 16 г KI в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл.

2. Эозинат натрия, ч.д.а. по ТУ 6?09?183?75. 0,01 М раствор готовили растворением 0,66 г препарата в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл. Для приготовления 1•10^-4 М раствор 1 мл 0,01 М раствора количественно переносили в мерную колбу емкостью 100 мл и доводили водой до метки.

3. Йод (фиксанал) по ГОСТ?у 4159?13. 0,05 моль/л раствор готовили разбавлением содержимого фиксанала в мерной колбе емкостью 1 л. Для приготовления 1•10^-3 моль/л раствора 10 мл 0,05 моль/л раствора количественного переводили в мерную колбу емкостью 1000 мл и доводили водой до метки.

4. Натрия тиосульфат (фиксанал) по ГОСТ?у 244?76. 0,1 моль/л раствор готовили разбавлением содержимого фиксанала в мерной колбе емкостью 1 л. Для приготовления 2•10^-3 моль/л раствора 10 мл 0,1 моль/л раствора количественного переводили в мерную колбу емкостью 1000 мл и доводили водой до метки.

5. Гидроксид натрия по ГОСТ?у 4328?77. 1 моль/л раствор готовили растворением 2 г гидроксида натрия в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл.

6. Уксусная кислота по ГОСТ?у 19814?74. 1 моль/л раствор готовили растворением 6 г уксусной кислоты в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл.

7. Ацетатный буферный раствор с рН=5,65 по ГОСТ?у 9.801?82. Для приготовления буферного раствора в мерную колбу емкостью 500 мл, содержащую 50 мл 1 моль/л раствора гидроксида натрия количественно переносили 57,4 мл 1 моль/л уксусной кислоты. Объем в мерной колбе доводили водой до метки. рН контролировали потенциометрически со стеклянным индикаторным электродом.

8. Крахмал, ч.д.а. по ГОСТ?у 10163?76. 3,5 % раствор готовили растворением навески массой 1,4 в 20 мл холодной воды. Полученный раствор влили в 20 мл кипящей воды и прокипятили.

9. Этиловый спирт ТУ 18300?87;

10. Азотная кислота 1:1. Готовили разбавлением концентрированной азотной кислоты (с=1,513 г/мл) в два раза;

11. Вода дистиллированная ГОСТ 6709?72;

12. Перманганат калия по ГОСТ?у 20490?75. Раствор готовили из фиксанала. Содержимое ампулы для приготовления 0,1 н. раствора количественно переносили в мерную колбу вместимостью 1000 см, растворялиРазмещено на http://www.allbest.ru/

в дистиллированной воде и объем раствора доводили дистиллированной водой до метки.

13. Пирагаллол, х.ч. по ГОСТ-у 23740?79

14. Серная кислота по ГОСТ?у 4204?77, 2н раствор

3.2 Оборудование и посуда

15. Весы аналитические ВЛТЭ?150 ГОСТ 24104?2001;

16. Электрическая плитка ЭПТ1?1/220;

17. Ионометр рН?410 ТУ 4215?00?18294344?01;

18. Сушильный шкаф ЭКРОС ПЭ?0041;

19. Анализатор фотохимический АСФХ?3;

20. Воронки лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336?82;

21. Колбы мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 1770?74 вместимостью 100, 500, 1000 мл;

22. Колбы лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336?82 вместимостью 25, 50, 100 мл;

23. Стаканы лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336?82 вместимостью 50, 100, 1000 мл;

24. Палочки стеклянные;

25. Пипетки мерные лабораторные стеклянные по НТД исполнений 1, 4 и 5 1-го класса точности вместимостью 1 мл, исполнений 1, 4 и 5, 1 и 2-го классов точности вместимостью 2 мл; исполнений 2, 3, 6 и 7, 1 и 2-го классов точности вместимостью 5, 10, 20, 25 мл;

26. Ступка и пестик лабораторные фарфоровые по ГОСТ 9147?80 соответственно с наружным диаметром 70 или 90 мм и высотой 90 мм;

27. Цилиндры мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 1770?74 вместимостью 100, 250 мл;

28. Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026?76;

2.3. Объекты исследования.

В работе использовали дикорастущее и культивированное РС, общая характеристика которых представлена в табл. 1.

Таблица 1. Общая характеристика растительного сырья

Наименование	Назначение
Urtнca diуica (крапива двудомная)	В листьях крапивы содержатся медь, кальций, железо, магний, вит. Е, К, В, флаваноиды, фитонциды, вяжущие вещества, гликозиды, хлорофилл, кислоты органические. Все эти вещества наделяют крапиву целебными свойствами и дают возможность использовать ее как общеукрепляющее, заживляющее, отхаркивающее, слабительное, желчегонное, расширяющее сосуды, противовоспалительное, иммуностимулирующее, противосудорожное средство. Практикуют наружное применение листьев крапивы - при кожных болезнях, кровотечениях, открытых ранах, проблемах с волосами.
Quercus cortex (кора дуба)	Этот природный материал обладает противовоспалительным, вяжущим, противогнилостным и еще целым рядом лечебных свойств. Такой широкий спектр действия объясняется тем, что кора дуба содержит пектины, белки, дубильные вещества, жирные масла, крахмалы и многие другие полезные компоненты.
Plantбgo mбjor (подорожник большой)	Подорожник содержит безазотистые и азотистые экстрактивные вещества, жиры, клетчатку, гликозид аукубин, углевод маннит, флавоноиды, витамины К и С, горечи, дубильные вещества, алкалоиды, олеиновую и лимонную кислоты, жирное масло, слизи, ферменты, ситостерин, микроэлементы (свинец, бор, молибден, стронций, железо, кобальт, никель, магний, цинк, селен, медь, ванадий, кальций, марганец, барий, калий, хром). Обладает подорожник противовоспалительным, вяжущим, противомикробным, отхаркивающим, слабительным, обволакивающим, репаративным свойствами, стимулирует аппетит.

3.4 Методика эксперимента

Калибровка прибора. В поглотительную ячейку, содержащую 40 мл 1 М раствора KI, 1 мл 0,1 %-ого раствора эозина, 20 мл ацетатного буферного раствора с рН=5,6 и 15ч20 мл воды вводили определенное количество натрия тиосульфата фиксируя изменение тока на шкале гальванометра. Введение тиосульфата натрия в поглотительную ячейку приводит к уменьшению количества йода и как следствие к уменьшению силы тока в ячейке. Облучение поглотительного раствора в присутствии кислорода воздуха до первоначального значения количества йода позволяет определить время генерации титранта [35].

Исследование взаимодействия фотогенерированного йода с пирогаллолом.

При определении действующего компонента в субстанции, брали точную навеску пирогаллола массой 1,0 г, которую растворяли в этаноле при нагревании, отфильтровывали и фотохимически оттитровывали. Предварительно поглотительный раствор, содержащий 20 мл ацетатного буферного раствора, 40 мл 0,1М раствора иодида калия и 10 мл 10^-4 М раствора эозината натрия продували кислородом воздуха в течение 2-3 минут и облучали светом до появления в амперометрической цепи тока в 200 мА, что соответствует 4,71·10^-3 ммоль йода.

0, 2 мл рабочего раствора пирогаллола вводили в поглотительную ячейку, содержащую 4,71·10^-3 ммоль йода и фиксировали изменение силы тока в ячейке, произошедшее в результате уменьшения количества титранта в ней. Содержание титранта контролировали амперометрически с двумя поляризованными электродами. После установления постоянства тока в ячейке, поглотительный раствор вновь продували в течение 2-3 минут кислородом воздуха и вновь облучали светом и фиксировали время необходимое для восполнения количества титранта в ячейке. Содержание пирогаллола в растворе рассчитывали по формуле:

где Ц.д. - цена деления гальванометра по силе тока (2,353•10^-5 ммоль/мА) и времени генерации (6,14•10^-6 ммоль/с); () - изменение силы тока (времени генерации) в результате фотохимического титрования; М - молярная масса пирогаллола (126 г/моль).

Систему использовали при выполнении 20-30 определений.

Фотохимическое определение ДВ в РС.

Навеску РС массой 10 г количественно перенесли в стеклянную круглодонную колбу, вместимостью 500 мл, залили 250 мл воды и прокипятили на плитке 15 минут с обратным холодильником. Профильтровали полученное извлечение через складчатый фильтр и довели раствор до метки диализованной водой (рабочий раствор).

Аликвотную порцию рабочего раствора вводили в поглотительную ячейку, содержащую раствор фотогенерированного йода, полученного в результате облучения реакционной смеси состоящей из 20 мл ацетатного буферного раствора, 40 мл 0,1М раствора иодида калия и 10 мл 10^-4 М раствора эозината натрия в присутствии кислорода воздуха. В результате фотохимического титрования происходило уменьшение количества титранта в поглотительной ячейке, что контролировали амперометрически с двумя поляризованными электродами. После установления постоянного значения силы тока в цепи амперометрической установки поглотительный раствор вновь продували воздухом в течение 1ч2 минут и облучали до достижения первоначального значения тока в цепи, что соответствует времени генерации титранта.

Содержание ДВ в пересчете на пирогаллол (ОФС.1.5.3.0008.15) определяли по формуле:

где ?? - массовая доля действующего компонента в анализируемой пробе, %; Ц.д. - цена деления гальванометра по силе тока (2,353•10^-5 ммоль/мА) и времени генерации (6,14•10^-6 ммоль/с); ДI (Дф) - изменение силы тока (времени генерации) в результате фотохимического титрования; М - молярная масса пирогаллола (126 г/моль); n - число электронов принимающих участие в реакции; V_к - объем мерной колбы, мл; V_п - объем пипетки Мора; m - масса навески растительного сырье; W - содержание влаги в образце, доля.



4. Результаты и их обсуждение

4.1 Калибровка установки

Калибровку установки проводили по стандартному раствору натрия тиосульфата. В результате взаимодействия натрия тиосульфата с фотогенерированным йодом, происходит уменьшение содержания титранта. Амперометрическое фиксирование положения точки эквивалентности не только устраняет недостатки классической иодометрии, но и повышает чувствительность и точность определения. Фотохимическое титрование проводили до установления постоянства силы тока цепи амперометрической ячейке. Продувание поглотительной ячейки воздухом в течение 1ч2 минут с дальнейшим ее облучением позволяет установить время генерации титранта, необходимое для восполнения его убыли в поглотительной ячейке.

Таблица 2. Время генерации титранта при различных чувствительностях

Чувствительность	Время генерации	Ц.д., ммоль/с	Ц.д., мА/с
I	32,58	6,14·10-6	0,26
II	85,53	1,16·10-5	0,29

На основании результатов представленных в табл. 2 выбрана I чувствительность определения, используемая в дальнейшей работе.

Результаты калибровки фотохимической установки, представленные на рис. 3, 4 позволили рассчитать цену деления гальванометра, которая на I чувствительности составила 2,35·10^-5 ммоль/мА и на II чувствительности - 0,23 ммоль/мА. В дальнейшей работе нами использовалась I чувствительность, в связи с более низким ПрО.



4.2 Исследование взаимодействия фотогенерированного йода с пирогаллолом

Согласно результатам фотохимического титрования модельных систем пирогаллола установлен механизм взаимодействия определяемого вещества с титрантом 1:1 (табл. 3). Содержание пирогаллола контролировали методом отдельных навесок и методикой, рекомендованной НД (ОФС.1.5.3.0008.15). Согласно полученным результатам (табл. 4) установлено, что содержание пирогаллола, найденное фотохимическим способом по изменению силы тока и времени генерации титранта, согласуются между собой и результатами, полученными по методике (ОФС.1.5.3.0008.15).

Таблица 3. Исследование механизма взаимодействия пирогаллола с фотохимическим титрантом (n=5, р=0,98)

Введено, n·104, ммоль	Найдено I2·104, ммоль
	по , мА	по , с
	n	nпр:n (I2)	n	nпр:n (I2)
2,9	2,8	1,00:0,97	2,8	1,00:0,97
5,8	5,6	1,00:0,97	5,8	1,00:1,00
8,7	8,7	1,00:1,00	8,5	1,00:0,98
11,6	11,4	1,00:0,98	11,6	1,00:1,00
14,5	14,4	1,00:0,99	14,3	1,00:0,99

Согласно результатам, представленным в табл. 3 содержание пирогаллола, найденное фотохимическим способом по изменению силы тока и времени генерации титранта, согласуются между собой. Таким образом, возможный механизм взаимодействия пирогаллола с фотогенерированным йодом можно представить следующим образом:



Таблица 4. Результаты определения пирогаллола в субстанции (n=6, р=0,95)

Введено, мкг	Найдено, мкг
	ОФС.1.5.3.0008.15	Фотохимический метод
		Sr, %	по , мкА	по , с
				Sr, %		Sr, %
1	2	3	4	5	6	7
36,5	35,72±2,68	7,5	35,58±1,07	3,0	35,59±1,17	3,3
1	2	3	4	5	6	7
73,1	72,96±5,33	7,3	74,13±2,15	2,9	71,56±2,15	3,0
109,6	109,18±7,32	6,7	109,71±3,07	2,8	108,30±3,14	2,9
146,2	145,37±9,74	6,7	142,32±3,70	2,6	144,66±3,91	2,7
182,7	181,61±11,80	6,5	174,94±4,02	2,3	183,34±4,58	2,5
219,2	217,89±13,94	6,4	216,45±4,33	2,0	219,32±4,39	2,0

Валидацию фотохимической методики определения пирогаллола осуществляли по показателям линейная значимость времени генерации и изменения силы тока от концентраций, специфичность и точность (правильность и прецизионность) в соответствии с требованиями [36], на основе модельных систем.

Достоверность полученных результатов подтверждали методом добавок (табл. 5). Согласно результатам, представленным в табл. 5 фотохимический способ определения пирогаллола характеризуется достаточной воспроизводимостью и специфичностью.

Таблица 5. Результаты фотохимического определения пирогаллола в модельных системах (n=6, р=0,95)

Введено, мкг	по , мкА	по , с
	Найдено, мкг	Абсолютная ошибка, мкг	Sr, %	Найдено, мкг	Абсолютная ошибка, мкг	Sr, %
36,5	36,3	-0,2	±0,55	36,4	-0,1	±0,27
73,1	72,8	-0,3	±0,41	72,9	-0,2	±0,27
109,6	109,0	-0,6	±0,55	109,3	-0,3	±0,27
146,2	145,0	-1,2	±0,82	145,9	-0,3	±0,21
182,7	181,0	-1,7	±0,93	182,0	-0,7	±0,38
219,2	217,7	-1,5	±0,68	218,5	-0,7	±0,32

Полученные зависимости линейны в интервале от 0,0 до 147,0 мкг, и могут быть использованы для определения пирогаллола в РС и фармацевтических препаратах.

Таким образом, фотохимический способ определения позволяет анализировать пирогаллол на уровне концентраций 0,0 мкг ч147,0 мкг. ПрО приогаллола, рассчитанный по 3S ? критерию составил 1,4 и 1,2 мкг по изменения силы тока и времени генерации титранта соответственно, с ошибкой определения не превышающей 2,0%, а следовательно может быть рекомендован для ДВ в РС. Результаты фотохимического титрования пирогаллола найденные по времени генерации характеризуются высокой воспроизводимостью и точностью относительно методики рекомендованной НД.

4.3 Фотохимическое определение ДВ в РС

Апробацию фотохимического метода определения пирогаллол проводили на образцах соцветий и листьев такого ЛРС, как: Urtнca diуica (крапива двудомная), Plantбgo major (подорожник большой) и Сortex quercus (кора дуба), ПФК «Фитофарм» ООО.

Образцы ЛРС, являющиеся многолетними травянистыми растениями, были собраны на территории деревни Новые Выселки Алатырского района Чувашской Республики в период вегетации. Результаты определения ДВ в ЛРС представлены в табл. 8. Содержание ДВ контролировали по методике рекомендованной НД [37]. Результаты определения ДВ найденные по изменению силы тока и времени генерации согласуются между собой, но не согласуются с результатами определения по методу Левенталя. Это связано с наличием в водной вытяжке восстановителей иной природы.

Согласно полученным результатам содержание дубильных веществ обнаруженных в крапиве выше, чем в коре дуба. Это обусловлено высокой степенью измельчения образца коры дуба и как следствие высокой степенью разложения дубильных веществ в образце. Таким образом, предложенный способ определения дубильных веществ прост в исполнении, экспрессен и не требует дорогостоящего оборудования и стандартизации титранта.



Выводы

1. Согласно проведенному литературному исследованию установлено необходимость разработки экспрессных методов определения полифенольных соединений растительного сырья.

2. Установлен механизм взаимодействия пирогаллола с фотогенерированным титрантом. Полученная валидационная оценка позволила говорить о высокой точности и воспроизводимости метода. Предел обнаружения пирогаллола фотохимическим способом составил рассчитанный по 3S? критерию составил 1,4 и 1,2 мкг по изменения силы тока и времени генерации титранта соответственно, с ошибкой определения не превышающей 2,0%, а следовательно может быть рекомендован для ДВ в РС.

3. Апробацию фотохимического способа определения дубильных веществ в растительном сырье установила несоответствие содержание дубильных веществ в коре.



Список использованной литературы

1. Гринкевич, Л. Н. Химический анализ лекарственных растений: учеб. пособие для фарм. вузов / Н. И. Гринкевич, Л. Н. Сафронович / Москва: Высшая школа, - 1983. - С. 176.

2. Федосеева, Л.М. Изучение дубильных веществ подземных и надземных органов бадана толстолистного произрастающего на Алтае / Л. М Федосеева / Химия растительного сырья. - 2005. - №2. - С. 45-50.

3. Ковалев, В. Н. Практикум по фармакогнозии / В. Н. Ковалев. Учебное пособие для студ. вузов: - Москва, Издательствово НФаУ; Золотые страницы, - 2003. - С. 512.

4. Рябинина, Е. И. Фитохимическое исследование полифенольного комплекса из травы тысячелистника обыкновенного / Е. И. Рябинина, Е. Е. Зотова, Н. И. Пономарева / Наука и современность. - 2011. - № 9-2. - С. 65-69.

5. Рябинина, Е. И. Сравнительное исследование мелиссы лекарственной и шалфея лекарственного на содержание полифенолов / Е. И. Рябинина, Е. Е. Зотова, Н. И. Пономарева, С. В. Рябинин / Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2009. - № 2.

6. Моросанова, Е. И. Кремний-титановые ксерогели: получение и использование для определения аскорбиновой кислоты и полифенолов / Е. И. Моросанова, М. В. Беляков, Ю. А. Золотов / Журнал аналитической химии. ? 2012. ? Т. 67. ? № 1. ? С. 17.

7. Бельтюкова, С. В. Антиоксидантны в пищевых продуктах и методы их определения / С. В. Бельтюкова, А. А. Степанова, Е. О. Ливенцова / Вiсник Одеського нацiонального унiверситету. Хiмiя. - 2014. - Т. 19. ? № 4(52). - С. 16-31.

8. Глущенко, А. В. Количественное определение флавоноидов и суммы полифенолов в надземной части володушки золотистой / А. В. Глущенко, В. А. Георгиянц, Н. Ю. Бевз / Научные ведомости. Серия: Медицина. Фармация. - 2014. - № 11(182). - Выпуск 26/1. - С. 172-176.

9. Ткаченко, Е. К. Разработка лабораторной технологии получения и количественное определение суммарного содержания полифенолов в концентрате надземной части тысячелистника / Е. К. Ткаченко, С. В. Носийчук / Вестник стоматологии. - 2009. - № 2 (67). - С. 82-85.

10. Пилипенко, Т. В. Изучение качества и функциональных свойств образцов китайского зеленого чая / Т. В. Пилипенко / Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Пищевые и биотехнологии. - 2014. - Т. 2. - № 4. - С. 64-69.

11. Зугравый, Е. А. Влияние технологической обработки на антирадикальную активность и содержание полифенолов в молдавских винах / Е. А. Зугравый, Е. И. Кристя / В сборнике: Достижения, проблемы и перспективы развития отечественной виноградно-винодельческой отрасли на современном этапе. Материалы Международной научно-практической конференции. Российская академия сельскохозяйственных наук, ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт виноградарства и виноделия имени Я.И. Потапенко Российской академии сельскохозяйственных наук ( ГНУ ВНИИВиВ Россельхозакадемии). - 2013. - С. 244-248.

12. Fedotov, O. V.Search producers of polyphenols and some pigments among basidiomycetes / O. V. Fedotov, A. K. Veligodska / Biotechnologia Acta. - 2014. - Т. 7. - № 1. - С. 110-116.

13. Воронина, М. С. Изучение химического состава и антиоксидантной активности свежих плодов и продуктов переработки черноплодной рябины / М. С. Воронина, Н. В. Макарова / Садоводство и виноградарство. - 2015. - № 2. - С. 42-46.

14. Щеголева И. Д., Лисюкова С. В., Лагутин И. Д. Способ определения полифенолов чая Патент Российской Федерации № 2519767, МПК⁷ G01N 33/02, приемопередающее устройство Щеглова И. Д., патентообладатель Щеглова И. Д., заяв. 2013123427/15, опуб. 20.06.2014, Бюл. №17, 10 с.

15. Денисенко, Т. А. Спектрофотометрическое определение кверцетина и суммы полифенолов с использованием 18-молибдодифосфорного гетерополикомплекса / Т. А. Денисенко, Л. П. Цыганок, А. Б. Вишникин / Методы и объекты химического анализа. - 2014. - № 9(3). - С. 130-138.

16. Цюпко, Т. Г. Определение суммарного содержания антиоксидантов методом FRAP / Т. Г. Цюпко, И. С. Петракова, Н. С. Бриленок, Н. А. Николаева, Д. А. Чупрынина, З. А. Темердашев, В. И. Вершинин / Аналитика и контроль. - 2011. - Т. 15. - № 3. - С. 287-298.

17. Батькова, И. А. Химический состав и антиоксидантные свойства столового винограда в Самарской области в 2013 г / И. А. Батькова, Н. В. Макарова, К. М. Ахметзакирова, О. И. Азаров, В. Д. Углов / Виноделие и виноградства. - 2014. - № 6. - С. 45-48.

18. Дадали, Ю. В. Сравнительное кинетическое исследование антирадикальной и антиоксидантной активности природных полифенолов в реакциях инициированного окисления N,N'-дифенил-n-фенилендиамина / Ю. В. Дадали, В. А. Дадали, В. Г. Макаров, В. А. Кулеба / Профилактическая и клиническая медицина. - 2014. - № 1 (50). - С. 93-99.

19. Писарев, Д. И. Химическое изучение биологически активных полифенолов некоторых сортов рябины обыкновенной - sorbus aucuparia / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, В. Н. Сорокопудов, М. А. Халикова, Е. Т. Жилякова, О. В. Огнева / Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2010. - Т. 22. - № 12-2. - С. 123-128.

20. Зиятдинова, Г. К. Гальваностатическая кулонометрия в анализе природных полифенолов и ее применение в фармации / Г. К. Зиятдинова, А. М. Низамова, Г. К. Будников / Журнал аналитической химии. - 2010. - Т. 65. - № 11. - С. 1202-1206.

21. Кочетова, М. С. Определение биологически активных фенолов и полифенолов в различных объектах методами хроматографии / М. С. Кочетова, Е. Н. Семенистая, О. Г. Ларионов,А. А. Ревина / Успехи химии. ? 2007. - Т. 76. ? № 1. ? С. 88-100.

22. Писарева, Н. А. Изучение полифенольного состава и разработка способов оценки качества травы репешка обыкновенного / Н. А. Писарева, Д. И. Писарев, О. О. Новиков, И. А. Севрук, О. А. Ванхин / Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2013. - Т. 24. - № 25-1 (168) - С. 104-109.

23. Никитченко Н. В. Экстракционно-хроматографическое определение качества лекарственного растительного сырья «расторопша пятнистая» / Н. В. Никитченко1,2, И. А. Платонов Л. А. Онучак, Ю. И. Арутюнов / Аналитика и контроль. - 2012. - Т. 16. - № 2. - С. 169-173.

24. Дмитриенко, С. Г. Особенности разделения флавоноидов методом обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии на колонке LUNA 5U C18(2) / С. Г. Дмитриенко, А. В. Степанова, В. А. Кудринская, В. В. Апяри / Вестник Московского университета. Серия 2: Химия. - 2012. - Т. 53. - № 6. - С. 369-373.

25. Суханов, П. Т. Экстракция таннина, галловой кислоты и пирогаллола из водных сред водорастворимыми полимерами и их определение в концентратах методом тонкослойной хроматографии / П. Т. Суханов, А. Н. Ильин, Е. В. Чурилина, Г. В. Шаталов / Аналитика и контроль. - 2015. - Т. 19. - № 3. - С. 268-273.

26. Зиятдинова. Г. К. Амперометрические сенсоры на фенольные соединения / Г. К. Зиятдинова, Г. К. Будников / В книге: Нигматуллинские чтения-2013 Международная научно-техническая конференция. Казань. - 2013. - С. 192-193.

27. Федина, П. А. Определение антиоксидантов в продуктах растительного происхождения амперометрическим методом / П. А. Федина, А. Я. Яшин, Н. И. Черноусова / Химия растительного сырья. - 2010. - № 2. - С. 91-97.

28. Ташкхуриан, Ж. Электрод из угольной пасты, модифицированный SiO₂, для электрохимического определения пирогаллола / Ж. Ташкхуриан, С. М. Гадеризадэ / Электрохимия. - 2014. - Т. 50. - № 10. - С. 1066.

29. Шретер, А.И. Методика определения запасов лекарственных растений / А. И. Шретер / Москва. - 1986. - С. 51.

30. Турусова, Е. В., Лыщиков А.Н., Насакин О.Е. Анализатор фотохимический Патент России № 122490. 2012. Бюл. № 33.

31. Додин, Е. И. Анализатор фотохимический / Е. И. Додин. - Москва: Металлургия, 1979. - С. 175.

32. Турусова, Е. В. Использование фотогенерированного йода при определении качества фармацевтических препаратов / Е. В. Турусова, А. В. Данилова, А. Н. Лыщиков / Заводская лаборатория. Диагностика материалов. - 2013. - Т. 79, № 4. - С. 24-27.

33. Крешков, А. П. Основы аналитической химии: Учебник для студентов химико-технологических специальностей вузов / А. П. Крешков. ? Москва: Химия, 1971. - Т. 2. - С. 456.

34. Государственная фармакопеи СССР. Изд-е: Х. Вып.-1 - Москва: Медицина, 1968. - С. 1081.

35. Турусова, Е. В. Использование фотогененированного йода для оценки содержания аминокислот в лекарственных средствах / Е. В. Турусова. Л. А. Григорьева, А. Н. Лыщиков, О. Е. Насакин / Фундаментальные исследования. - 2014. - № 6 (часть 5). - С. 951-955.

36. ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. ? Москва: Изд-во Стандартинформ, 2009. ? 24 с.

37. ОФС.1.5.3.0008.15. Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах. - Москва, 2 том., 2105.

Размещено на Allbest.ru

...