Характеристика ферментного препарата фитазы микробного происхождения

Полная исследовательская публикация _____________ Шатилова Т.И., Витол И. С., Карпиленко Г.П.,

Белопухов С.Л. и Семко В.Т.

Размещено на http://www.allbest.ru/

72 ______________ http://butlerov.com/ _______________ ©--Butlerov Communications. 2010. Vol.20. No.6. P.70-73.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Характеристика ферментного препарата фитазы микробного происхождения

Ферментный препарат фитазы под названием Кормофит, разработан учеными РАН и используется как кормовая добавка к сухим кормам для моногастричных животных с целью лучшей утилизации фосфора. Он выпускается в виде порошка светло-бежевого цвета, с активностью 2500 фитазных ед. в грамме (активность фитазы определяется как количество фермента, освобождающее 1 ммоль неорганического фосфора [РО₄^3-] в минуту, из 1.4-ммолярного раствора фитата натрия при рН 5.0 и температуре 37°С). Помимо фитазы, продуцируемой грибной культурой Penicillium canescens, препарат содержит карбогидразы -

ферменты, расщепляющие полисахариды, такие как целлюлоза, в-глюканы, ксиланы, гемицеллюлозы, декстрозы [1]. Цель исследований: определение оптимальных условий действия микробной фитазы (препарат Кормофит) на зерновом и стандартном субстрате и возможности его использования в процессе получения сусла при дифференцированной переработке зерна ржи в технологии этанола.

В работе использовали фуражное зерно ржи, полученное со спиртового завода ОАО «Алвист» (Тверская область).

Определение активности фитазы основано на определении ионов РО₄^3-образовавшихся в результате реакции гидролиза фитина. Определение содержания Р0₄ проводят колориметрическим методом с использованием калибровочной кривой (65). Расчет фитазной активности осуществляют по формуле:

микробный фитаза ферментный зерно

[РО₄^3-] * 10⁶ * R_pc *R_E = [РО₄^3-] * 2,45 *R_E М_ф._та *10³ * t_p

где: R_pc - разбавление ферментного препарата в реакционной смеси; R_e - предварительное разбавление ферментного препарата; М_ф.та - молекулярная масса фосфата.

Молекулярную массу микробной фитазы определяли методом гель-хроматографии [2]. Содержа-ние водорастворимого белка - по методу Лоури.

На первом этапе работы определяли молекулярную массу фитазы ферментного препарата Кормофит методом гель-хроматографии. Препарат наносили на колонку, заполненную гелем Toyopearl HW-55F, в количестве 5 мл.

Элюцию проводили дистиллированной водой. Фракционирование проб осуществляли на коллекторе фракций «ULTRORAC» фирмы LKB (Швеция) при 4 ^oС в холодильной камере «Colora». Объем собираемых фракций - 4 мл. Регистрацию оптической плотности элюата во фракциях осуществляли при длине волны 280 нм на спектрофотометре. Профили элюции представлены на рис. 1.

Рис. 1. Фракционирование микробной фитазы методом гель-хроматографии на колонке с TSK-gel Toyopearl HW-55F

В объединенных фракциях, соответствующим пикам на рис. 1, определяли содержание белка и фитазную активность. Полученные данные свидетельствуют о том, что при фракционировании выявляются три основных фракции. При этом фитазная активность обнаруживается во фракциях 25-29 (II пик), выходящих с объемом элюции 96-116 мл, что соответствует 12000-23000 Дальтон.

При традиционной характеристике ферментных препаратов выявление оптимума температуры и рН, как и других кинетических параметров, проводится с использованием стандартного субстрата [2]. В наших экспериментах в качестве стандартного субстрата при определении фитазной активности использовался рисовый фитин, в качестве зернового субстрата - измельченное зерно ржи.

Вместе с тем в промышленных условиях, в том числе конкретной технологии спиртового производства, в качестве субстрата выступает сложная гетерогенная система, что приводит к изменению основных кинетических параметров ферментативной реакции. В технологии этанола - это многокомпонентная система, представляющая собой смесь зернового помола и воды. Состав данного субстрата может оказать влияние на характер протекания процесса гидролиза и изменить оптимальные значения рН и температуры [3].

При изучении влияния рН на активность исследуемого препарата Кормофит (рис. 2) установлено, что оптимум рН при гидролизе фитина зернового субстрата сдвигается в кислую область относительно стандартного субстрата и соответствует рН 4.5-5.0, в то время как на стандартном - имеет значение оптимума 5.5.

Также можно отметить, что в целом расширяется диапазон рН, при котором Кормофит работает достаточно активно. При рН 4.0 и 6.0 на зерновом субстрате активность составляет около 80% от максимальной.

а) стандартный субстрат

б) зерновой субстрат

Рис. 2. Влияние рН на активность ферментного препарата Кормофит

При исследовании влияния температуры на активность ферментного препарата Кормофит (рис. 3) установлено, что температурный оптимум при действии на стандартный субстрат имеет четко выраженный пик при 45°С.

а) стандартный субстрат

б) зерновой субстрат

Рис. 3. Влияние температуры на активность ферментного препарата Кормофит

Снижение температуры до 35°С и увеличение ее до 55°С сопровождается уменьшением фитазной активности соответственно до 70% и 50%.

Исследование влияния температуры на активность препарата, проведенное на зерновом субстрате, показало, что оптимум температуры сдвигается в область более высоких температур, также расширяется диапазон варьирования температур, при которых Кормофит проявляет достаточно высокую активность. Так, при температуре 30°С на зерновом субстрате выявлена активность 70% против 55% о на стандартном. При 65-70°С на зерновом субстрате активность сохраняется до 30-60% от максимальной активности, в то время как на стандартном - она практически отсутствует.

Выводы

С использованием метода гель-хроматографии показано, что фитаза микробного препарата Кормофит имеет молекулярную массу 12000-23000 Дальтон.

Выявлены оптимумы действия микробной фитазы препарата Кормофит. Оптимум рН при гидролизе фитина зернового субстрата сдвигается в кислую область относительно стандартного субстрата и соответствует рН 4.5-5.0, в то время как на стандартном - значение оптимума рН составляет 5.5. Оптимум температуры при гидролизе фитина зернового субстрата составляет 45-55°С.

Полученные данные по гидролизу фитина зернового субстрата под воздействием микробной фитазы препарата Кормофит позволяют рекомендовать технологические параметры - рН 4.5-5.0; температура 45-50°С - для стадии предобработки фракции шелухи при дифференцированном способе переработки зерна ржи в технологии производства этанола.

Литература

микробный фитаза ферментный зерно

Кузнецова Е.А., Синицин А.П., Корячкина С.Я., Пригарина О.М. Применение комплексного ферментного препарата на основе фитазы при подготовки зерна пшеницы и ржи для производства зернового хлеба. Известия ВУЗов. Пищевая технология. 2006. №5. С. 23-24.

Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: Элевар. 2000. 512 с.

Чередниченко B.C., Абрамова И.М., Воробьева Е.Г. Применение ферментных препаратов в производстве спирта. Производство спирта и ликероводочных изделий. 2001. №1. С. 11.

Размещено на Allbest.ru