Изучение генотоксичности производных индола при их действии на Allium cepa

Полная исследовательская публикация ______________________ Селезнева Е.С. и Белоусова З.П.

Размещено на http://www.allbest.ru/

24 ______________ http://butlerov.com/ _______________ ©--Butlerov Communications. 2016. Vol.47. No.7. P.21-25.

Тематический раздел: Биохимические исследования. Полная исследовательская публикация

Подраздел: Молекулярная генетика. Идентификатор ссылки на объект - ROI: jbc-01/16-47-7-21

г. Казань. Республика Татарстан. Россия. __________ ©--Бутлеровские сообщения. 2016. Т.47. №7. _________ 21

Самарский национальный исследовательский университет

имени академика С.П. Королева

Изучение генотоксичности производных индола при их действии на Allium cepa

Селезнева Екатерина Сергеевна

Изучение различных аспектов адаптаций организмов к химическим агентам приводит к мысли о предетерминированности реакции, которая создаётся в процессе эволюции организ-мов. Что связано с их способностью на разных стадиях развития использовать многообразные механизмы защиты от чужеродного вмешательства. Многие исследователи считают, что именно физико-химические свойства органических веществ в значительной степени определяют воз-можность соединений преодолевать тканевые и клеточные барьеры живых организмов и вмешиваться в их метаболизм [1, 2].

Традиционно в первую очередь внимание обращается на соединения антропогенной природы, которые в значительных количествах поступают в окружающую среду. Чтобы понять возможности приспособления диких популяций к антропогенной нагрузке необходимо иссле-довать вещества, поступающие в окружающую среду в малых количествах, но постоянно. Для оценки такого рода воздействий необходимо проведение модельных экспериментов с использованием нетоксичных доз синтетических органических веществ. Особый интерес представляют соединения, являющиеся аналогами природных, механизм действия которых более или менее изучен. К их числу относятся и производные индола. Внимание к химии и фармакологии индола и его производных повышается с каждым годом в связи востре-бованностью в фармакологии [3-5].

Ранее мы показали, что 1-метилиндол является более сильным мутагеном, чем 1_(фенил-сульфонил)-1H-индол 6, поэтому возникла необходимость в исследовании воздействия индола и его производных на разные стадии онтогенеза растений.

Целью данного исследования является синтез и изучение генотоксичности индола (I), 5,6-диме-тилиндола (II) и 1-(фенилсульфонил)-1H-индола (III) в низких концентрациях при различной продолжи-тельности воздействия на Allium cepa [1].

Экспериментальная часть

Объектом исследования служили семена лука Allium cepa. Исследовали токсичность I-III в 5% водном растворе изопропилового спирта в концентрациях: 0.0001; 0.001; 0.01 мг/мл. Токсичность оценивали по способности соединений влиять на всхожесть семян и на рост корней. Для оценки митотической и мутагенной активности готовили давленные, окрашенные ацетокармином препараты из корневой меристемы лука по стандартной методике [7, 8].

Было проведено две серии экспериментов. В первой серии семена Allium cepa по 30 штук на чашку Петри в трех повторах проращивали в спиртовых растворах выбранных концентраций. Контролем служили семена, проращиваемые в 5% водном растворе изопропилового спирта. Во второй серии семена проращивали в течение суток в кипяченой воде, затем их переносили в чашки Петри с выбранными концентрациями соединений. Контролем служили семена, в течение суток проращи-ваемые в воде и затем пересеянные в растворитель. Длительность обоих серий экспериментов сос-тавила 5 суток. генотоксичность мутагенность онтогенез клеточный

Митотическую активность - по способности соединений влиять на величину митотического индекса (МИ), на относительную продолжительность фаз митоза (ОПМ), подсчитывали по следую-щим формулам:

P - профаза, M - метафаза, A - анафаза, T - телофаза.

Мутагенную активность оценивали с помощью ана-телофазного анализа [6]. Достоверность различий между опытом и контролем оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и критерия хи-квадрат [9].

Результаты и их обсуждение

Анализ способности индола и его производных I-III влиять на всхожесть семян показал, что все они ингибируют всхожесть семян и с ростом концентрации, растёт их токсичность (p < 0.001), но достоверных различий между ингибирующими свойствами соединений обнару-жено не было.

Рис. 1. Влияние I-III на всхожесть семян Allium cepa Рис. 2. Влияние I-III на рост корней Allium cepa

Необходимо заметить, что если во второй серии экспериментов, на токсичность I не влияло суточное проращивание семян в воде, то для II и III мы обнаружили достоверное снижение их ингибирующих свойств (p < 0.05).

Исследование влияния на рост корней показало, что в низких концентрациях I и III стимулировали ростовые процессы, а в высоких 0.01 мг/мл подавляли по сравнению с контролем (p < 0.05), II во всех концентрациях ингибировал ростовые процессы.

Предварительное суточное проращивание семян в воде с последующим воздействием исследуемыми производными индола выявило сходную картину, однако для I различия между первой и второй серией эксперимента не достоверны для p < 0.05, а для II и III достоверно ослабляются для p < 0.005.

Чтобы выяснить митозомодифицирующее влияние исследуемых веществ была рассчи-тана величина митотического индекса в клетках меристемы корней Allium cepa в разных сериях эксперимента. Результаты цитологического анализа представлены на рис. 3.

Рис. 3. Влияние I-III на пролиферативную активность в клетках корневой меристемы Allium cepa Рис. 4. Мутагенная активность I-III

Анализ величины митотического индекса при прямом воздействии веществ на корневую меристему лука выявил усиление митозомодифицирующего влияния с ростом концентрации для p < 0.05. Различия между второй и первой серии эксперимента выявило достоверные различия только для III (p < 0.03).

Наблюдаемая тенденция в цитотоксичности соединений схожа с токсичностью соедине-ний, обнаруживаемой на макроуровне (всхожесть, длина корней).

Чтобы выявить стадии митоза, наиболее чувствительные к действию веществ, мы про-анализировали относительную продолжительность фаз митоза в опыте и контроле. Резуль-таты суммированы в табл. 1.

Табл. 1. Влияние производных индола на относительную продолжительность фаз митоза при разном воздействии на клетки корневой меристемы Allium cepa

Как видно из представленных результатов, соединения вызывают блоки на разных ста-диях митоза. I вызывает блок на стадии телофазы, II - профазы, а III - на стадии анафазы.

По мнению Алова [10], блок на стадии профазы говорит о способности веществ влиять на метаболизм предшественников ДНК, блоки на стадиях анафазы и телофазы говорят о спо-собности соединений вызывать хромосомные аберрации и изменять клеточный аппарат, обес-печивающий расхождение хромосом. Исходя из этого, можно предположить, что мишенями цитотоксического воздействия исследованных индолов являются разные метаболитические шунты. Специфичность их воздействия сохраняется в обеих сериях эксперимента.

Соединения, воздействующие на различные этапы клеточного деления, должны обла-дать мутагенным действием. Для ответа на этот вопрос был применён ана-телофазный анализ. Результаты представлены на рис. 4.

Наблюдаемое воздействие I-III подтверждает предположение о том, что они оказывают влияние на разные мишени. Максимальной мутагенностью обладал I, минимальной - III.

Двухфакторный дисперсионный анализ выявил достоверные различия как в мутаген-ности соединений (p < 0.005), так и во влиянии на число хромосомных аберраций, индуци-рованных исследованными веществами в разных концентрациях. Возможно, разница в их мутагенности определяется и скоростью проникновения в клетку. Выявленный ряд мутаген-ности: I > II > III противоположен ряду молекулярного объёма и величины липофильности: I < II < III. Линейной зависимости между исследованными биологическими параметрами и величиной дипольного момента мы не выявили.

Табл. 2. Физико-химические параметры изученных соединений, рассчитанные с использованием программы Spartan'10 Evaluation

В ходе эксперимента мы также предположили, что на низких концентрациях I-III можно выявить специфические типы хромосомных аберраций для каждого соединения. При использовании высоких концентраций I-III в силу их высокой токсичности это сделать невоз-можно. Так, для I в низких концентрациях выявляются аберрации типа: «двойные мосты», фрагментация хромосом, многополюсные митозы, в высоких концентрациях ни в одном из препаратов мы не выявили многополюсные митозы. Для II в низких концентрациях мы выявляли отставания хромосом и многополюсные митозы, в высоких концентрациях - только отставания хромосом. III индуцировал только мосты и фрагментацию хромосом, причём в низких концентрациях - только фрагментацию хромосом.

Возможно, потеря некоторых типов хромосомных аберраций, выявленных на низких концентрациях I-III, связана с тем, что в высоких концентрациях клетки, подвергшиеся воздействию этих соединений, погибают.

Мы не обнаружили достоверных отличий в мутагенности между сериями эксперимента для каждого из соединений, что также подтверждает гипотезу о специфичности действия соединений независимо от длительности и фазы развития, на которые действуют данные производные индола.

Выявленная нами способность на уровне организма справляться с токсичностью ве-ществ, и ее отсутствие на уровне репарации генетических повреждений говорит о необходи-мости исследования индуцированного мутагенеза для всех вновь синтезированных соеди-нений, особенно в тех случаях, когда существуют их природные аналоги, например, индолилуксусная кислота, участвующие в метаболизме используемых тест-объектов.

Выводы

1. Различия в воздействии на разные стадии раннего онтогенеза Allium cepa в большей сте-пени характерно для 5,6-диметилиндола и 1-(фенилсульфонил)-1H-индола, чем для индола. Исследованные соединения вызывают блоки на разных стадиях митоза. Индол вызывает блок на стадии телофазы, 5,6-диметилиндол - профазы, а 1-(фенилсульфонил)-1H-индол - на стадии анафазы.

2. Зависимость митозомодифицирующего воздействия от стадии онтогенеза, на которой про-исходит воздействие на корневую меристему Allium cepa достоверно только для 1-(фенил-сульфонил)-1H-индола.

3. Обнаруженная мутагенность, в противоположность молекулярному объёму и липофиль-ности убывает в следующем ряду: индол > 5,6-диметилиндол > 1-(фенилсульфонил)-1H-индол.

Литература

[1] Барыбин В.Ф. Общеэволюционная модель (биологические аспекты). Биологический вестник. 2007. Т.11. №1. С.108-120.

[2] Воробьёв С.И. Биологические и физико-химические свойства неионогенных поверхностно-активных веществ. Российский биотерапевтический журнал. 2009. Т.8. №3. С.3-8.

[3] Марышева В.В., Гаврев А.И., Шаюанов П. Д. Гeпатопротекторное действие производных тиазоло[5,4-b]индола. Психофармакология и биологическая наркология. 2006. Т.6. №4. С.1351-1354.

[4] Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2 т. 14-е изд. М.: ООО Издательство ”Новая Волна”: Издатель С.Б. Дивов. 2002. 608с.

[5] Митина Т.М., Стуковина А.Ю., Кучерявенко А.Ф., Суздалев К.Ф. Изучение влияния нового производного индола на функциональную активность тромбоцитов. III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010»: Сборник материалов конгресса. М. 2010. Т.3. С.379-381.

[6] Белоусова З.П., Селезнева Е.С. Генотоксичность производных индола. Вестник Самарского государственного университета. Естественнонаучная серия, Второй специальный выпуск. 2004. С.106-113.

[7] Генетические оценки состояния окружающей среды. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. ВОЗ, Женева. М.: Медицина. 1989. 131с.

[8] Гостимский С.А., Дьякова М.И., Ивановская Е.В., Монахова М.А. Практикум по цитогенетике. М.: МГУ. 1974. 327с.

[9] Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1990. 352с.

[10] Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. М.: Медицина. 1972. 183с.

Аннотация

Изучена генотоксичность и мутагенность индола (I), 5,6-диметилиндола (II) и 1_(фенилсульфонил)-1H-индола (III) для Allium cepa на разных стадиях раннего онтогенеза. Различия в воздействии на разные стадии раннего онтогенеза Allium cepa в большей степени характерны для соединений II и III, нежели для I. Все соединения проявляют митозомодифицирующую активность в зависимости от времени воздействия на клеточную меристему Allium cepa, вызывая блоки на разных стадиях митоза. I вызывает блок на стадии телофазы, II - профазы, а III - на стадии анафазы, но только для III обнаружили разницу от времени воздействия на клетки корневой меристемы. Все соединения проявляют мутагенность, которая в противоположность значениям их молекулярного объёма и липофильности, убывает в ряду I > II > III. Ключевые слова: индол, 5,6-диметилиндол, 1-(фенилсульфонил)-1H-индол, генотоксичность, мутагенность, индуцированный мутагенез, Allium cepa.

The genotoxic and mutagenic effects of indole (I), 5,6-dimethylindole (II), 1-(phenylsulfonyl)-1H-indole (III) were studied for Allium cepa seedlings on the different stages of early ontogenesis. The differences in the action on early ontogenesis stages were shown for II and III substances but not for I. All the tested substances demonstrated mitosis-modifying action on Allium cepa root meristem cells depending of the action time. They provided the blocks on different mitosis staged: I - on telophase, II - on prophase, III - on anaphase, but for III only the action time was the meaning factor. All the substances demonstrated the mutagenic effect that decreased in the contrary with their molecular volume and lipophilicity in a row I > II > III.

Keywords: indole, 5,6-dimethylindole, 1-(phenylsulfonyl)-1H-indole, genotoxicity, mutagenicity, induced mutagenesis, Allium cepa.

Размещено на Allbest.ru