Анализ содержания нитратов и нитритов в продуктах питания

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«БРЯНСКИЙ БАЗОВЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ»

ДОПУСКАЮ К ЗАЩИТЕ

Заместитель директора по УР

_____________М.А. Захарова

«____» __________ 20 __г.

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ НИТРАТОВ И НИТРИТОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ

Выполнена студенткой Симановская Кристина Николаевна

Группа 59л3

Программа подготовки специалистов среднего звена 31.02.03

Лабораторная диагностика

Форма обучения очная

Руководитель Р.Б. Ахмедов __________________

г. Брянск, 2018

Содержание

Введение

Глава I. Теоретическая часть исследования

1.1 Понятие и механизм канцерогенеза

1.2 Химические факторы канцерогенеза. Оксидированные формы азота как канцерогенные факторы

1.3 Источники реактивных форм азота, их токсическое действие на организм человека и нормы содержания

1.4 Методы качественного и количественного определения нитратов, нитритов, нитрозоаминов

Выводы по теоретической части исследования

Глава II. Практическая часть исследования

2.1 Материалы и методы исследования

2.2 Результаты исследования и их обсуждение

Выводы по практической части исследования

Заключение

Рекомендации

Литература

Введение

Актуальность данного исследования во многом объясняется важной и нерешенной на данный момент проблемой онкологических заболеваний. В основе их патогенеза лежит воздействие канцерогенного фактора на организм. При этом химическому канцерогенезу отводиться основная роль в онкогенезе. Большинство химических канцерогенов ассоциировано с вредными производственными воздействиями, вредными привычками, плохой экологией. Они легко отслеживаются и, как правило, находятся на постоянном мониторинговом контроле. Люди, подвергающиеся подобным воздействиям, входят в группы риска по развитию рака.

Однако с рядом потенциальных мутагенов и канцерогенов каждый человек сталкивается повседневно при употреблении обычных продуктов. К таким веществам относятся нитраты, нитриты и их производные. В отличие от остальных факторов они действуют массово, не ограничиваются и не контролируются. Также не предусмотрены профилактические мероприятия по данной проблематике. Существует и негативный моральный аспект использования нитратов и нитритов, который заключается в отсутствии информированности населения об их вреде и безальтернативности многих продуктов содержащих данные вредные вещества.

Проблема настоящей работы заключается в широком использовании нитратов и нитритов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве, и их негативном воздействии на организм человека.

Объектом исследования являлись содержащиеся в продуктах питания оксидированные формы азота, предметом аналитические методы определения данных веществ.

Целью нашего исследования являлся качественный и количественный анализ нитратов и нитритов в продуктах питания растительного и животного происхождения. Для реализации поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Проведен обзор существующих литературных данных о канцерогенезе, химических факторах данного процесса, азотсодержащих канцерогенах, нормах их содержания в продуктах питания и аналитических методах их определения.

2. Проведена оптимизация существующих методов качественного и количественного определения оксидированных форм азота для экспресс-анализа продуктов питания.

3. Определено содержание нитратов и нитритов в продуктах питания растительного и животного происхождения. Сформулированы выводы и написаны рекомендации по использованию подобных продуктов.

В работе были использованы аналитические методы химического анализа продуктов питания, основанных на спектрофотометрии. Также применялись методы математической статистики и ИКТ.

Практическая значимость квалификационной работы заключается в получении сведений о содержании оксидированных форм азота в продуктах питания и применении полученных навыков проведения химического анализа в последующей профессиональной деятельности.

Глава 1. Теоретическая часть

1.1 Понятие и механизм канцерогенеза

Канцероген - называют фактор, воздействие которого достоверно увеличивает частоту возникновения опухолей (доброкачественных или злокачественных) в популяциях человека или животных, или фактор, который сокращает период развития опухолей [7].

Канцерогенез - сложный многостадийный процесс, для реализации которого необходимо несколько, последовательных генетических событий [10].

В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что ведущая роль в индукции и промоции канцерогенеза принадлежит генетическим нарушениям. Многие неблагоприятные факторы окружающей среды могут оказывать воздействие на этот процесс, однако подобное влияние чаще всего опосредуется через накопление мутаций в генах. Около 1% генов человека ассоциированы с канцерогенезом. Эти гены делятся на два класса, как по характеру своего действия, так и по типам кодируемых белков. Первый класс - это протоонкогены или доминантные онкогены. Их продукты, как правило, участвуют в позитивном контроле клеточного роста. Второй класс составляют супрессоры опухолей или рецессивные онкогены, называемые также антионкогенами. Кодируемые этими генами белки часто являются негативными регуляторами клеточного роста и в норме обладают противоопухолевым эффектом.

Таким образом, в основе развития любых онкологических заболеваний лежит накопление мутаций в специфических генах, причем это происходит в тех соматических клетках, которые затем вовлекаются в процесс неопластической трансформации. Известно, что на скорость возникновения мутаций существенное влияние могут оказывать как экзогенные, так и эндогенные факторы. Любые физические и химические воздействия, усиливающие мутагенез, такие как облучение или действие мутагенов, обладают канцерогенным эффектом и приводят к развитию индуцированных форм раков. С другой стороны, наследование инактивирующей мутации в генах, участвующих в поддержании целостности генома, может опосредовано приводить к значительному увеличению частоты возникновения мутаций в других онкогенах и антионкогенах, а значит и к ускорению злокачественной трансформации клетки. Для подобной ситуации будет характерен семейный характер опухолей, причем в некоторых случаях, хотя и не всегда, их локализация у родственников может быть одинакова.

В настоящее время доказано, что некоторые функциональные полиморфные аллели, в частности, в протоонкогенах или в генах ферментов метаболизма канцерогенов, являются генетическими факторами риска, предрасполагающими к развитию опухолей. В этих случаях частоты полиморфных аллелей в пяти выборках больных будут достоверно превышать контрольные уровни, и этот эффект становится особенно очевиден, когда больной подвергается действию канцерогенов. Онкологические заболевания, ассоциированные с подобными полиморфизмами, формально относятся к классу мультифакториальных болезней, то есть болезней с наследственной предрасположенностью. При этом в семье также может наблюдаться более одного больного, хотя и реже, чем при наследственных формах раков. Кроме того, сходный характер локализации опухолей у родственников в этом случае менее вероятен.

Таким образом, в этиологии любых онкологических заболеваний присутствует генетический компонент, что и находит отражение в образном выражении: «рак - это болезнь генов» [8].

Один из механизмов образования опухолевой клетки - мутация, приводящая к тому, что сигнальную молекулу будут вырабатывать и выделять те же клетки, которые имеют рецепторы к этой молекуле. Например, мутировавший фибробласт начинает вырабатывать ТФР. Очевидно, такие клетки начинают размножаться без стимуляции извне, они стимулируют сами себя собственным ТФР и, в итоге, образуют опухоль. К появлению опухолевых клонов могут приводить также мутации других генов, кодирующих белки цепи сигнал - рецептор - посредники - эффекторы. Когда один из этих генов мутирует и структура соответствующего белка нарушается таким образом, что этот белок оказывается постоянно активированным без активации предшествующими белками, то клетка будет получать ложный сигнал к размножению, будет расти и делиться, без связывания внешней сигнальной молекулы (истинного сигнала). Очевидно, такое деление мутантной клетки будет непрерывным, бесконтрольным, т.е. клетка образует опухолевый клон. Такие мутантные гены назвали онкогенами, а их предшественники - нормальные гены, которые кодируют белки, участвующие в восприятии и проведении сигналов - протоонкогенами. канцерогенез нитрат продукты питания

Системы, воспринимающие сигналы, могут контролировать и другие формы деятельности клетки, например, вызывать ее движение, перемещение на новое место. Например, как уже говорилось, в ране ТФР из тромбоцитов крови, связавшись с рецепторами фибробластов, может вызывать их химиотаксис, т.е. направленное движение в рану. В этой реакции, по-видимому, конечным эффектором являются молекулы цитоскелета - белка типа актина, активируемые через цепь молекул-посредников. Сборка этих молекул в специальные нити вызывает на поверхности клетки выпячивание особых временных выростов - псевдоподий, при помощи которых клетка двигается. У опухолевой клетки ложная активация тех же молекул мутантными белками - продуктами онкогенов - приводит к патологической подвижности, которая может быть одной из причин перемещения таких клеток в соседние ткани (инвазия) и в другие органы (метастазирование).

Таким образом, изучение генетических механизмов образования разных опухолей привело к расшифровке неизвестной ранее сложной системы, которая в клетке ответственна за восприятие внешних сигналов, контролирующих размножение и движение этих клеток.

1.2 Химические факторы канцерогенеза. Оксидированные формы азота как канцерогенные факторы

Сейчас выявлено уже несколько десятков протоонкогенов, кодирующих молекулы сигналов, рецепторов, посредников и эффекторов разных типов [5]. Химический канцерогенез - сложный многоступенчатый процесс образования опухоли, происходящий под длительным воздействием химических веществ - канцерогенов, в основе которого лежит поражение генов и эпигенетические изменения [27]. Химические канцерогены ответственны за возникновение до 80-90 % всех злокачественных опухолей человека [4].

Химический канцерогенез у человека был впервые описан J. Hill, наблюдавшим развитие полипоза слизистой оболочки носа у людей, вдыхавших чрезмерные количества лекарств. Sir Percival Patt (1775) первый дал описание рака мошонки у трубочистов. С тех пор описано более 1000 химических канцерогенных веществ, из которых только 20, как было доказано, инициируют опухоли человека. Хотя основные исследования в области химического канцерогенеза проводятся на лабораторных животных и в клеточных культурах, тем не менее, есть наблюдения опухолей человека, развитие которых обусловлено воздействием химических канцерогенов. Яркими примерами могут служить профессиональные опухоли - рак мочевого пузыря у работающих с анилиновыми красителями, рак легкого у людей, контактирующих с асбестом, рак печени работников поливинилхлоридного производства и др. [18]. Канцерогенные агенты подразделяются на две большие группы: генотоксические и эпигенетические в зависимости от их способности взаимодействовать с ДНК. К генотоксическим канцерогенам относятся полициклические ароматические углеводороды, ароматические амины, нитрозосоединения и др. Эпигенетические химические канцерогены не дают положительных результатов в тестах на мутагенность, однако их введение вызывает развитие опухолей. Эпигенетические канцерогены представлены хлорорганическими соединениями, иммунодепрессантами и другими. В свою очередь часть генотоксических канцерогенов может напрямую взаимодействовать с ДНК, поэтому они называются прямыми. Другие же должны претерпеть химические превращения в клетках, в результате которых они становятся активными, приобретают электрофильность, могут концентрироваться в ядрах клеток и взаимодействовать с ДНК. Последний вид генотоксических канцерогенов называется непрямым. Активация непрямых генотоксических канцерогенов происходит с участием ряда ферментных систем клетки, таких как монооксигеназной ферментной системы, основным действующим компонентом которой является цитохром Р-450-гемопротеид, эпоксидгидратазы, а также трансферазы, катализирующих реакции конъюгации канцерогенных веществ. Активированные метаболиты реагируют с различными участками ДНК, вызывая алкилирование ее оснований - аденина, гуанина, цитидина и тимидина. Образование алкилгуанина может приводить к точковым мутациям в геноме клетки. Названные ферментные системы обнаружены в клетках печени, бронхиального, желудочного, кишечного и почечного эпителия. Происхождение химических канцерогенов может быть экзо- и эндогенным. Известными эндогенными канцерогенами считаются холестерин, желчные кислоты, аминокислота триптофан, некоторые стероидные гормоны, перекиси липидов. Накоплению эндогенных канцерогенов в организме могут способствовать некоторые заболевания, а также хронические гипоксические состояния.

Химический канцерогенез имеет многоступенчатый характер и протекает в несколько стадий: инициации, промоции и прогрессии опухоли (Рис.1). Каждая из стадий требует специальных этиологических факторов и отличается морфологическими проявлениями. Инициация опухолевого роста. Процесс непосредственного действия канцерогена на клетки, запускающий их трансформацию, называется инициацией опухолевого роста[13]. В стадию инициации происходит взаимодействие генотоксического канцерогена с геномом клетки, что вызывает его перестройки. Однако для злокачественной трансформации этого недостаточно. Последняя обеспечивается действием еще одного повреждающего агента, вызывающего дополнительные перестройки в геноме. Клетка малигнизируется, начинает бесконтрольно делиться. Вещество, используемое на 2-й стадии, называется промотором. Промоция опухолевого роста. Процесс, в ходе которого инициированная клетка завершает неопластическую трансформацию называется промоцией [13]. В качестве промоторов нередко выступают эпигенетические канцерогены, а также вещества, не являющиеся сами по себе канцерогенами.

Рис.1 Стадии химического канцерогенеза

Эффект химических канцерогенов зависит от длительности введения и дозы, хотя и нет пороговой минимальной дозы, когда канцерогенный агент может считаться безопасным. Инициация является необратимым процессом. Кроме того, эффект от действия различных химических канцерогенов может суммироваться. Резюмируя данные по химическому канцерогенезу, следует подчеркнуть, что для реализации своего действия химические канцерогены должны воздействовать на ядерную ДНК и вызвать ее повреждения [18]. По данным ВОЗ, более 75% случаев злокачественных опухолей человека вызвано воздействием химических факторов внешней среды. К возникновению опухолей приводят преимущественно факторы сгорания табака (примерно 40%); химические агенты, входящие в состав пищи (25-30%) и соединения, используемые в различных сферах производства (около 10%). Известно более 1500 химических соединений, обладающих канцерогенным эффектом (Рис.2). Из них не менее 20 определённо являются причиной опухолей у человека. Наиболее опасные канцерогены относятся к нескольким классам химических веществ.

Рис.2 Классификация химических канцерогенов

Химические канцерогены:

1. Полициклические ароматические углеводороды. Наибольшей канцерогенной активностью среди них обладают 3,4-бензпирен, 20-метилхолантрен, диметилбензантрацен. Ежегодно в атмосферу промышленных городов выбрасываются сотни тонн этих и подобных им веществ.

2. Гетероциклические ароматические углеводороды. В эту группу входят дибензакридин, дибензкарбазол и другие соединения.

3. Ароматические амины и амиды. К ним относятся 2-нафтиламин, 2-аминофлюорен, бензидин и др.

4. Нитрозосоединения. Наиболее опасные среди них - диэтилнитрозамин, диметилнитрозамин, нитрозометилмочевина.

5. Аминоазосоединения. Высокоэффективными канцерогенами среди них считаются 4-диметилами-ноазобензол и ортоаминоазотолуол.

6. Афлатоксины - продукты метаболизма (производные кумаринов) плесневых грибов, в основном аспергилл Aspergillus flavus (отсюда название производимых ими веществ).

7. Прочие органические вещества с канцерогенной активностью: эпоксиды, пластмассы, уретан, четырёххлористый углерод, хлорэтиламины и другие.

8. Неорганические химические канцерогены: например, хроматы, мышьяк и его соединения, кобальт, окись бериллия, асбест и ряд других.

9. Эндогенные канцерогены. Эти соединения образуются в организме в результате физико-химической модификации продуктов нормального обмена веществ. Полагают, что такими потенциально канцерогенными веществами являются жёлчные кислоты, эстрогены, некоторые аминокислоты (тирозин, триптофан), липопероксидные соединения [1].

Азот - химический элемент V группы периодической системы Менделеева, порядковый номер 7, относительная атомная масса 14,0067; бесцветный газ, не имеющий запаха и вкуса. В организме NО может преобразовываться в другие формы оксидов азота, определяющие особенности его биологического действия. В зависимости от локального восстановительного потенциала в клетках и тканях NO существует в трех взаимосвязанных редокс-формах: оксид азотного радикала (NО*), нитрозониевого катиона (NО+) и нитроксильного аниона (NО-). Эти формы обладают различной реактивностью и существенно разнообразят регуляторные и токсичные свойства NО [15].

Основным процессом, приводящим к образованию НА, является нитрозирование. В качестве нитрозируемых соединений могу выступать, различны моно-, ди- и полиамины, а также другие азотсодержащие вещества. Наиболее легко и быстро нитрозируются вторичные и третичные амины, а также другие соединения, содержащие группы (CH3)2N и (C2H5)2N. Нитрозирующими агентам обычно служат производные азотистой кислоты XNO (X - Hal, NO2, NO3, OR), а также нитрозоний-катион и др. Нитрит-ион и свободная HNO2 в кислой среде претерпевают превращения в активные нитрозирующие агенты [12].

Существует несколько механизмов токсического воздействия нитратов на организм человека. Сами по себе нитраты относительно малотоксичны (относительно других распространенных токсикантов), в биологической среде в результате биохимических реакций они превращаются в нитриты, или соли азотистой кислоты (HNO2). Нитриты далее в желудочно-кишечном тракте человека (в кислой среде) взаимодействуют с соединениями, имеющими вторичные аминогруппы, и превращаются в N-нитрозоамины, которые являются канцерогенными соединениями, т.е. способствуют образованию злокачественных опухолей. Нитриты токсичнее нитратов в 450 раз [17].

1.3 Источники реактивных форм азота, их токсическое действие на организм человека и нормы содержания

Азот - элемент, который стимулирует рост растений, влияет на качество плодов и содержание в них белка. Большие запасы азота содержатся в атмосфере. Азот непрерывно извлекается из этого природного хранилища с помощью сине-зеленых водорослей и специфических бактерий, живущих в корнях бобовых растений.

И органические, и минеральные удобрения, содержащие соединения азота, превращаются в почве в нитраты (соли азотной кислоты), вместе с водой поступающие в растения. В корневой системе, стеблях, листьях, плодах нитраты под воздействием ферментов восстанавливаются до иона аммония NH+4, который становится основой аминокислот и далее белков (т. е. минеральный азот превращается в безвредный органический азот - компонент природных соединений). Когда же удобрений поступает слишком много, растения не справляются с их переработкой, и нитраты скапливаются в плодах, попадающих к нам на стол.

Внесение неумеренных доз азотных удобрений на поля с целью резкого увеличения их продуктивности приводило к различным отрицательным последствиям и прежде всего к накоплению излишнего количества нитратов в сельскохозяйственной продукции. Это вызвало отравление людей, ухудшало их здоровье, что повлекло негативное отношение к нитратам. Но нитраты - одно из важнейших звеньев природного круговорота азота, без которого невозможно существование земной биоты. Ее основной строительный материал - белок, а он в обязательном порядке включает химически связанный азот. Поэтому нитраты хорошо усваиваются растениями и под действием ферментов восстанавливаются до аммиака. Последний с кетокислотами образуют аминокислоты, образующие потом белки [20].

Свежие фрукты и овощи помимо пользы для здоровья могут таить в себе немалую опасность. Виной тому - различные химикаты, поступающие в растения вместе с удобрениями, вносимыми в почву при их выращивании. Накопление нитратов зависит от биологических особенностей растения, формы и способа внесения удобрений, соблюдения сроков подкормки и сбора овощей. Для нашего организма нитраты сами по себе безвредны. Опасны, прежде всего, не нитраты, а их метаболиты - нитриты, которые образовываются при хранении, кулинарной обработке и собственно пищеварении. Нитриты блокируют насыщение кислородом клеток. Связывается гемоглобин, возрастает содержание холестерина и молочной кислоты [19].

Нитрат-ионы в избыточных количествах создают потенциальную опасность для здоровья человека и животных, ухудшают биологическое качество растительной продукции. Оценке содержания нитратов в объектах окружающей среды уделяется большое внимание, так как применение азотных удобрений приводит к повышению их содержания в почвах, водах и сельскохозяйственных культурах. Большое внимание со стороны аналитических служб уделяется контролю над содержанием данного аниона в природных, питьевых, сточных водах и почвах. Для определения микроколичеств нитрат-ионов при большой концентрации матричных элементов в растворе перспективно применение сорбционных методов концентрирования с использованием полимерных сорбентов, содержащих в качестве функционально-аналитической (ФАГ) аминогруппу. Эффективность их использования обусловлена хорошей избирательностью по отношению к изучаемому аниону, которая определяется природой введенной в структуру сорбента ФАГ и высокими коэффициентами распределения элементов при сорбции [3].

Нитриты появляются в воде главным образом в результате биохимического окисления аммиака или восстановления нитратов. В поверхностных водах в присутствии достаточных количеств кислорода при высоких значениях окислительно-восстановительного потенциала доминируют процессы биохимического окисления. Восстановление нитратов с образованием нитритов протекает в условиях дефицита кислорода в придонных слоях воды и в донных отложениях. В совокупности с другими ингредиентами концентрация нитратов и ее динамика и распределение в водоеме могут служить важными показателями названных выше процессов. Присутствие в повышенных концентрациях нитритов может свидетельствовать о загрязнении водоема.

Увеличение концентрации нитратных ионов наблюдается поэтому в летнее время в период массового отмирания фитопланктона и высокой активности нитрификаторов. Другим важным источником обогащения поверхностных вод нитратами являются образующиеся при атмосферных электрических разрядах окислы азота, которые после поглощения атмосферными водами попадают на земную поверхность. Нитраты являются конечным продуктом биохимического окисления аммиака, образующегося главным образом в результате распада белковых веществ. В поверхностных водах нитраты обычно присутствуют в заметных количествах за исключением периода интенсивного развития фитопланктона в водоемах, когда содержание нитратов может падать до исчезающе малых величин. Повышенная концентрация нитратов может свидетельствовать об имевшем место в предшествующий период фекальными загрязнении водоема. В поверхностных и подземных источниках воды присутствуют соединения азота в виде нитратов и нитритов [27].

Одной из важных проблем экологии человека является охрана его внутренней среды от попадания токсических веществ с продуктами питания.

Не смотря на то, что человечество достигло больших успехов во всех отраслях науки и производства, у него существует слабое и уязвимое место - пища, которая всегда будет связывать его с окружающим миром и ставить в зависимое положение от качества окружающей среды.

Именно питание является одним из главных факторов условий жизни, от которого зависят здоровье, долголетие и работоспособность человека.

На сегодняшний день продовольственный вопрос во всем мире является главенствующим: количество населения неуклонно растет, в сферу производства продуктов питания вовлекаются все новые и новые технологии, которые еще не успели охарактеризоваться как абсолютно безопасные, растет количество потенциальных угроз. Примерами могут быть широкое использование химикатов, генно-модифицированных культур в сельском хозяйстве, пищевых добавок в пищевой промышленности. Помимо всего этого, питание современного человека, который руководствуется популярностью тех или иных продуктов питания сокращает продолжительность и качество жизни, обеспечивая людей среднего и старшего возраста такими заболеваниями как ожирение, сахарный диабет, рак.

В последнее время гигиенисты проявляют большой интерес к вопросу о содержании нитритов в продуктах питания: продуктах мясного происхождения (колбасных изделиях).

Как известно, мясо и мясопродукты относятся к категории наиболее ценных продуктов питания. Входящие в состав мяса компоненты служат исходным материалом для построения тканей, биосинтезе необходимых систем, регулирующих жизнедеятельность организма, а также для покрытия энергетических затрат [23].

Источники попадания нитратов в организм человека: овощи (около 70%), вода (20%), мясо и консервы (6%). Оставшиеся 4 % приходятся на хлебобулочные изделия, молочную продукцию, фрукты и лекарственные препараты и табак. Само по себе присутствие нитратов в организме человека естественно и обнаруживается даже у людей, рацион которых полностью лишен нитратов. Но опасным может быть избыток этих веществ: прежде всего возможностью восстановления до более токсичных нитритов (солей азотистой кислоты) и нитрозаминов (высокотоксичных соединений, которые при попадании в организм поражают печень, вызывают кровоизлияния, конвульсии, могут привести к коме), которое происходит как в самих продуктах питания, так и в организме человека. Нитраты превращаются в нитриты благодаря деятельности микроорганизмов, преимущественно обитающих в толстом кишечнике. У людей с пониженной кислотностью желудочного сока микрофлора толстого кишечника может проникать в верхние отделы пищеварительного тракта, и в этом случае количество восстановленных и поступивших в кровь нитритов резко увеличивается.

Одним из основных условий нормальной жизни человека является вода. Поэтому, именно загрязненная питьевая вода вызывает 70-80% всех имеющихся заболеваний, которые на 30% сокращают продолжительность жизни человека. В питьевой воде из подземных вод содержится до 200 мг/л нитратов, гораздо меньше их в воде из артезианских колодцев. Нитраты попадают в подземные воды с различными химическими удобрениями (нитратные, аммонийные), которые стекают с полей и выбрасываются химическими предприятиями по производству этих удобрений. Наибольшее количество нитратов содержится в грунтовых водах, а значит, и в колодезной воде. Обычно жители городов пьют воду, где содержится до 20 мг/л нитратов, жители же сельской местности - 20-80 мг/л нитратов.

Нитраты и нитриты используют для обработки и консервирования многих пищевых продуктов. Рыбная и мясная продукция в натуральном виде содержит немного нитратов (5 - 25 мг/кг в мясе и 2- 15 мг/кг в рыбе). Но нитраты и нитриты добавляются в готовую мясную продукцию для улучшения ее потребительских свойств и для более длительного хранения (особенно в колбасных изделиях). В сырокопченой колбасе содержится нитритов 150 мг/кг, а в вареной колбасе - 50 - 60 мг/кг.

Нитраты попадают в организм человека также через табак. Выяснено, что некоторые сорта табака содержат до 500 мг нитратов на 100 г сухого вещества. В растениях нитраты в основном скапливаются в корнях, корнеплодах, стеблях, черешках и крупных жилках листьев, значительно меньше - в плодах [26].

Действие токсичных веществ на организм человека. Воздействие токсичных соединений на организм проявляется по-разному. Характеризовать токсичность веществ количественно достаточно сложно, поскольку судят о ней по результатам воздействия вещества на живой организм, для которого характерны индивидуальные реакция и вариабельность, кроме того, в группе испытуемых животных всегда присутствуют более или менее восприимчивые к воздействию изучаемого токсина индивидуумы.

Токсичность (от греч. toxikon - яд) - способность вещества вызывать нарушения физиологических функций организма, в результате чего возникают симптомы интоксикаций (заболевания), а при тяжелых поражениях - его гибель. Степень токсичности вещества характеризуется величиной токсичной дозы - количеством вещества, отнесенным, как правило, к единице массы животного или человека и вызывающим определенный токсический эффект. Чем меньше токсическая доза, тем выше токсичность. Различают среднесмертельные дозы (ЛД50), абсолютно смертельные (ЛД90-100), минимально смертельные (ЛД0-10), среднеэффективные (ED50), а также дозы, вызывающие определенные токсические эффекты, и др. Наиболее часто используют величины ЛД50, ЛД100, т. е. дозы, вызывающие при однократном введении гибель 50 или 100% экспериментальных животных.

Степень токсичности вещества характеризуется предельно допустимой концентрацией (ПДК) - максимальным количеством вещества в единице объема воздуха или воды, которое при ежедневном воздействии на организм в течение длительного времени не вызывает в нем патологических изменений и не нарушает нормальной жизнедеятельности человека. Важное значение в проявлении токсичности вещества играют скорость поступления вещества в кровь, скорость метаболических превращений вещества в крови и тканях внутренних органов, а также некоторые другие факторы, определяющие величины токсических концентраций и особенности характера токсического действия на организм [16].

Для взрослого человека предельно допустимая норма нитратов 5мг на 1кг массы тела человека. Для ребёнка допустимая норма не более 50мг. 500мг - это предельно допустимая доза (600мг - уже токсичная доза для взрослого человека). Для отравления грудного малыша достаточно и 10 мг нитратов. В Российской Федерации допустимая среднесуточная доза нитратов - 312 мг [21]. Допустимые нормы нитратов (по данным ВОЗ) составляют 5 мг (по нитрат-иону) в сутки на 1 кг массы взрослого человека, т. е. при массе 50-60 кг - это 220-300 мг, а при 60-70 кг -- 300-350 мг [22].

1.4 Методы качественного и количественного определения нитратов, нитритов, нитрозоаминов

Методы количественного определения нитратов и нитритов

Количественное определение суммарного содержания нитратов и нитритов проводят с помощью реактива Грисса. Нитраты предварительно переводят в нитриты цинковой пылью в кислой среде при рН = 3. Затем 10 капель исследуемого раствора подкисляют 10 каплями уксусной кислоты и прибавляют 8-10 капель реактива Грисса. Через 5-10 мин появляется розовое или красное окрашивание [24].

Фотометрический метод определения нитратов и нитритов. Фотометрический метод определения нитратов и нитритов распространяется практически на все продукты: на все виды свежей и кулинарно-переработанной растительной продукции; на плодоовощные консервированные, продукты, включая консервы для детского питания, в рецептуру которых могут входить, помимо растительной части, также жиры, мясо, молочные продукты; на все виды зерна и зернопродуктов; на все виды молочных продуктов. Для анализа чаще всего используется сульфаниловая кислота. Сущность метода заключается во взаимодействии нитритов в исследуемой пробе воды с сульфаниловой кислотой в присутствии 1-нафтиламина с образованием красно-фиолетового окрашенного соединения с последующим фотометрическим определением и расчетом массовой концентрации нитритов в пробе исследуемой воды [9].

Определение нитритов заключается в экстрагировании их водой, очистке экстракта и фотометрическом измерении интенсивности окраски азосоединения, образующегося при взаимодействии нитритов с ароматическими аминами. Нижний предел определения нитритов - 0,02 мг NO2 в 1 см3 колориметрируемого раствора. Нижний предел определения нитритов в анализируемой пробе - 0,1 мг NO2/кг (для жидких продуктов) и 0,5 мг NO2/кг (для твердых продуктов).

Определение нитратов заключается в экстрагировании их водой, очистке экстракта, восстановлении нитратов до нитритов на кадмиевой колонке с последующим фотометрическим измерением интенсивности окраски азосоединения, образующегося при взаимодействии нитритов с ароматическими аминами. Нижний предел определения нитратов - 0,03 мг NO3 в 1 см3 колориметрируемого раствора.

Ионометрический метод определения нитратов. Сущность метода состоит в извлечении нитратов из анализируемого материала раствором алюмокалиевых квасцов с последующим измерением их концентрации в полученной вытяжке. Для ускорения анализа вместо вытяжки может быть использован сок анализируемой продукции, разбавленной раствором алюмокалиевых квасцов. При анализе капусты для разрушения примесей, мешающих определению нитратов, дополнительно проводят их окисление марганцовокислым калием.

Метод непригоден, если содержание хлоридов в анализируемом материале более чем в 25 раз превышает содержание нитратов при их концентрации до 50 мг/кг и в 50 раз - при более высоких.

Существует методика выполнения измерений концентраций нитратов в пищевых продуктах методом ионной хроматографии, основанная на извлечении нитратов из анализируемого продукта водой и анализе полученной водной вытяжки методом ионной хроматографии [11].

Метод газожидкостной хроматографии заключается в нитровании органических соединений ряда бензола в присутствии серной кислоты, разделении их, испарении и количественном определении нитропроизводных пламенно-ионизационным детектором. Обладает высокой чувствительностью и достаточной точностью [25].

Спектрофотометрический метод основан на нитровании ароматических органических соединений, окислении органических соединений, восстановлении нитрат-ионов до нитрит-ионов, поглощении нитратов в УФ-области спектра. Интенсивность светопоглощения пропорциональна содержанию нитратов в анализируемой пробе [25].

Методы качественного определения нитратов и нитритов. Проба с дифениламином. Сущность данного метода состоит в визуальной оценке окрашенных соединений, образующихся при взаимодействии NO3- с дифениламином. Для качественного обнаружения нитратов на свежий срез овоща или на предметное стекло с нанесенной каплей свежеотжатого сока добавляем каплю дифениламина в серной кислоте. Окраска развивается в течение 20-30с. В зависимости от концентрации нитрат-иона окраска может быть от бледно-голубой до интенсивно-синей [14].

Реакция с бруцином. В фарфоровую чашечку помещают 1 мл исследуемого фильтрата, добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты, охлаждают и прибавляют кристаллик бруцина. При наличии нитратов жидкость окрашивается в розовый, а затем в желтый цвет.

Проба с железом сульфата. Натрия, калия, кальция и аммония нитраты в водных растворах, смешанных с раствором железа сульфата (закисного), при подслаивании концентрированной серной кислотой образуется на границе двух слоев коричневое кольцо железа нитрозилсульфата [2].

Флюориметрический метод. Метод определения N-нитрозаминов в пищевых продуктах и продовольственном сырье состоит в выделении летучих N-нитрозаминов (НА) путем перегонки с паром или в вакууме; экстракции хлористым метиленом НА из водного дистиллята; концентрации экстракта; денитрозировании НА бромистым водородом в уксусной кислоте; алкилировании образовавшихся аминов 8-метокси-5-хинолинсульфонилазиридином (КАЗ), разделении и количественном определении образовавшихся флуоресцирующих 8-метокси-5-[N-(2-N-диэтиламино)] хинолинсульфонамидных производных (КАЭ-производные) в тонком слое силикагеля.

Хемилюминесцентный метод. Его суть состоит в выделении летучих нитрозаминов путем перегонки с паром, экстракции хлористым метиленом нитрозаминов из водного дистиллята, концентрировании экстракта, разделении смеси методом газожидкостной хроматографии и количественном определении немодифицированных нитрозаминов с помощью высокоселективного и высокочувствительного хемилюминесцентного детектора [30].

Выводы по теоретической части исследования

1. Изучены литературные данные об особенностях канцерогенеза, механизмах развития злокачественных опухолей и факторах индуцирующих процесс канцерогенеза. Отмечено, что развитие онкологии напрямую связано с различного рода воздействиями на генетический материал клеток.

2. Описан процесс химического канцерогенеза, лежащего в основе мутационной теории развития рака. Определены основные этапы онкогенеза под действием мутагенов химической природы. Определена основополагающая роль химических канцерогенных факторов в развитии онкологии, приведена их классификация.

3. Рассмотрен вопрос об оксидированных формах азота, как факторах химического канцерогенеза. Выявлены основные источники поступления в организм человека нитратов и нитритов - это свежие овощи и фрукты, выращенные при использовании повышенных доз нитратных удобрений и готовые к употреблению мясные полуфабрикаты соответственно.

4. Определен общий механизм канцерогенного действия нитратов и нитритов основанный на последовательном восстановлении нитратов до нитритов и нитрозировании биогенных аминов с образованием N-нитрозоаминов, которые и являются канцерогенами. Установлены предельно допустимые уровни потребления нитратов.

5. Описаны основные аналитические методики, используемые для количественного и качественного определения нитратов и нитритов. Определены их основные характеристики, преимущества и недостатки.

Глава 2. Практическая часть

2.1 Материалы и методы исследования

Работа по определению нитритов проводилась на образцах мясной продукции глубокой переработки, для выявления нитратов использовали свежие овощи и фрукты. Описание образцов представлено в таблице 2.1. Базой исследовательской работы являлись химическая и биохимическая лаборатории Брянского базового медицинского колледжа.

Таблица 2.1 Описание использованных продуктов питания

№ обр.	Характеристика
1м	Сосиски «Деревенские» ООО «МПК» «Атяшевский», 97 руб./кг.
2м	Сосиски «Докторские» Суханов, 195 руб./кг.
3м	Сосиски Молочные 1 сорт Трубчевск, 282 руб./кг.
4м	Сосиски Молочные Птица Калуга, 108 руб./кг.
5м	Сосиски Сочные вареные в полиамиде БМК, 136 руб./кг.
1о	Редис свежий, магазин «Магнит», 24.04.2018 г.
2о	Морковь свежая, магазин «Магнит», 24.04.2018 г.
3о	Редька, магазин «Магнит» 24.02.2018 г.
4о	Капуста, магазин «Магнит» 24.04.2018 г.
5о	Картофель свежий, магазин «Магнит» 24.04.2018 г.
6о	Огурец свежий, магазин «Магнит» 24.04.2018 г.
7о	Лук репчатый, магазин «Магнит» 24.04.2018 г.

Исследование проводили по следующей схеме: получение водной вытяжки из анализируемого твердого образца > прибавление к вытяжки реактивов и развитие окраски > спектрофотометрическое исследование образцов > расчет концентрации на основе определенной оптической плотности. Использованные для эксперимента методики описаны ниже.

Методика фотометрического определения нитратов

Сущность метода.

Определение основано на реакции между салициловой кислотой и нитрат-ионами с образованием нитропроизводных салициловой кислоты, которые в щелочной среде окрашены в желтый цвет.

Мешающие влияния. Определению мешает ион хлора, если его массовая концентрация превышает 500 мг/дм3, и железо, если его массовая концентрация превышает 0,5 мг/дм3. Для устранения, мешающего влияния ионов хлора воду разбавляют. Для устранения влияния железа - добавляют сегнетову соль.

Реактивы:

Дистиллированная вода; кислота серная, концентрированная, плотность - 1,83 мг/дм3; 10% раствор салициловой кислоты; сегнетовая соль 0,1 г; 20% раствор гидроокиси натрия; фарфоровая чашка, стеклянная палочка, пробирки объемом 5 мл; посуда мерная: пипетка с делениями объемом 1мл, цилиндр мерный или мерная пробирка объемом 5...10 мл или мерная пробирка объемом 10 мл.

Проведение анализа.

В небольшую фарфоровую чашку наливают пипеткой 1 мл анализируемой воды. Если концентрация ионов железа превышает 0,5 мг/дм3, в чашку вносят 0,1 г. сегнетовой соли. Содержимое чашки выпаривают досуха на водяной бане. После охлаждения в чашку добавляют 4-5 капель салициловой кислоты так, чтобы смочить весь сухой остаток. Добавляют 0,5 мл серной кислоты. Растирают сухой остаток с кислотой по дну и стенкам чашки. Затем, не вынимая палочку из чашки, дают жидкости постоять около 5 мин, добавляют 3-4 мл дистиллированной воды, чтобы смыть стенки чашки. К полученному раствору добавляют 4-5 мл раствора гидроокиси натрия. При наличии в воде нитрат-ионов сразу появляется желтая окраска. Затем содержимое чашки сливают в пробирку с меткой на 10 мл, ополаскивают чашку и палочку, добавляют слив в пробирку и доводят объем пробирки дистиллированной водой до метки. Затем, определяют концентрацию нитратов фотоколориметрическим методом.

Методика фотометрического определения нитритов

Сущность метода.

Определение нитритов основано на экстрагировании их водой, очистке экстракта и фотометрическом измерении интенсивности окраски азосоединения, образующегося при взаимодействии нитритов с ароматическими аминами.

Реактивы:

1. Реактив Грисса. Растворяют 0,1 г альфа- нафтиламина в 100 мл дистиллированной воды при кипячении в течение 15 минут, охлаждают, добавляют 5 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл 1% сульфаниловой кислоты. Реактив должен быть бесцветным.

2. Уксусная кислота, 12% раствор. Дистиллированной водой разбавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты до 200 мл (125 мл на 1 л).

3. Стандартные растворы нитрита натрия. 1) Основной раствор. В мерной колбе вместимостью 1 л в бидистиллированной воде растворяют 1,497 г высушенного при температуре 105 градусов по Цельсию нитрита натрия и доводят до метки. Раствор консервируют, прибавляя 1-2 мл хлороформа.

2) Рабочий раствор. Его готовят разбавлением основного раствора бидистиллированной водой в мерной колбе сначала в 100 раз, а затем полученный раствор еще в 10 раз. Применяют свежеприготовленным.

Ход определения.

В колбу или в стаканчик помещают 100 мл исследуемой воды, (или водной вытяжки) добавляют 5 мл реактива Грисса и перемешивают. Окраска появляется через 40 минут и сохраняется в течение 3 часов. Через 40 минут растворы фотометрируют в кюветах с толщиной оптического слоя 5 см с зеленым светофильтром (длина волны 540 нм) по отношению к дистиллированной воде с добавлением реактива Грисса.

2.2 Результаты исследования и их обсуждение

Определение нитритов проводили в водных вытяжках, полученных экстракцией в течение 30 минут из пяти образцов мясных полуфабрикатов. Для лучшего извлечения образец измельчали. После выполнения этапов методики проводили определение оптической плотности в кислой и щелочной среде. Полученные данные приведены в таблице 2.2. Для спектрофотометрического анализа использовали спектрофотометр для микрообъемов (нанофотометр) NanoVuePlus (Рисунок 2.1).

Рисунок 2.1 Внешний вид нанофотометра NanoVuePlus

Таблица 2.2 Оптическая плотность анализируемых растворов

Образцы	1м	2м	3м	4м	5м
D рН<7	1,965	2,396	1,439	1,653	1,240
D рН>7	1,681	2,484	0,961	0,792	1,004

По данным таблицы 2.2, а также визуального анализа определили, что более достоверные результаты были получены при подщелачивании раствора, так как в таком случае уменьшалась его мутность, связанная с растворением органических веществ.

Для расчета концентрации нитрита натрия в мясной продукции готовили серию калибровочных растворов с содержанием NaNO2 50, 25, 10 и 5 мг/л(кг) и проводили для них определение оптической плотности, аналогичное описанному выше. В результате были получены соответствующие значения 2,015, 1,010, 0,432 и 0,199, использованные для построения калибровочного графика, по которому определяли содержание нитритов в проанализированных образцах (Рисунок 2.2, Таблица 2.3). Полученные результаты также представлены на диаграмме 2.1.

Рисунок 2.2 Калибровочный график для определения нитрита натрия

Таблица 2.3 Концентрации нитрита натрия в исследованных образцах

Образцы	1м	2м	3м	4м	5м
D рН>7	1,681	2,484	0,961	0,792	1,004
С, мг/кг	41	61	23	19	25



Диаграмма 2.1 Концентрации нитрита натрия в исследованных образцах

Из данных таблицы 2.3 и диаграммы 2.1 видно, что все исследованные образцы содержали нитрит натрия в разных количествах. Для образцов 3м, 4м, 5м отмечено низкое содержание нитритов, примерно в два раза меньшее предельно допустимого количества в 50 мг/кг. Для образца 1м концентрация нитрита была незначительно ниже разрешенной, а в образце 2м превышала данный показатель. Таким образом, установлено, что каждый исследованный мясной полуфабрикат произведен с добавлением вещества с доказанным канцерогенным действием - нитрита натрия, а в некоторых продуктах его содержание близко или превышает допустимый уровень.

Определение нитратов проводили в водных вытяжках (соке), из семи образцов сезонных и тепличных овощей. Для лучшего извлечения нитрат анионов образец измельчали. Перед выполнением количественного определения нитрит ионов проводили качественную реакцию с дифенил аминов и концентрированной серной кислотой. В результате качественного определения все образцы кроме 7о дали положительную реакцию на нитраты в виде развития интенсивной синей окраски. Это говорит о высоком содержании нитрат ионов в данных образцах.

После выполнения этапов методики количественного анализа нитритов проводили определение оптической плотности на спектрофотометре для микрообъемов. Полученные в ходе эксперимента данные представлены в таблице 2.4 и на диаграмме 2.2. Для расчета концентрации нитратов готовили серию калибровочных растворов с содержанием нитрата натрия 500, 250, 100 и 50 мг/л(кг) и проводили для них определение оптической плотности, аналогичное описанному выше. В результате были получены соответствующие значения 0,357, 0,178, 0,072 и 0,036, использованные для построения калибровочного графика, по которому определяли содержание нитратов в образцах (Рисунок 2.3).

Рисунок 2.3 Калибровочный график для определения нитрат ионов

Таблица 2.4 Концентрации нитрат ионов в исследованных образцах

Образцы	1о	2о	3о	4о	5о	6о	7о
D	0,336	0,246	0,361	0,343	0,128	0,154	0,045
С, мг/кг	470	345	505	480	180	215	63



Диаграмма 2.2 Концентрации нитрат анионов в исследованных образцах

Из данных таблицы 2.4 и диаграммы 2.2 видно, что все исследованные образцы содержали нитраты в разных количествах. Для лука отмечено низкое содержание нитратов, остальные образцы содержали значительное количество нитрат аниона, однако данные значения не превышали допустимые уровни. Необходимо отметить, что накопительная способность овощей по отношению к нитратам различается достаточно в широких пределах, поэтому не существует общих строго установленных норм их содержания. Таким образом, почти каждый исследованный образец овощей содержал достаточно большое количество нитратов, которые могут нанести определенный вред здоровью человека.

Выводы по практической части исследования

1. Выбраны и оптимизированы методики определения оксидированных форм азота - нитратов и нитритов в продуктах питания растительного и животного происхождения. Определены объекты экспериментальной работы, подготовлены необходимые реактивы и оборудование.

2. Проведен спектрофотометрический анализ полуфабрикатов животного происхождения на содержание в них нитритов. Определены оптические плотности растворов после выполнения этапов анализа. Подготовлены растворы нитрита натрия с известной концентрацией, на основе которых построен калибровочных график, по которому рассчитаны концентрации нитрита натрия в исследованных образцах. Установлено, что каждый мясной продукт произведен с добавлением нитрита натрия.

3. Проведен спектрофотометрический анализ свежих овощей на содержание в них нитратов. Определены оптические плотности растворов после выполнения этапов анализа. Подготовлены растворы нитрата натрия с известной концентрацией, на основе которых построен калибровочных график, по которому рассчитаны концентрации нитрат ионов в исследованных образцах. Установлено, что каждый исследованный образец овощей содержал достаточно большое количество нитратов.

4. Написаны рекомендации для потребителей по безопасному использованию продуктов, содержащих оксидированные формы азота.

Заключение

В ходе написания настоящей выпускной квалификационной работы был проведен обзор литературных источников. Изучены данные об особенностях канцерогенеза, механизмах развития злокачественных опухолей и факторах индуцирующих процесс канцерогенеза. Описан процесс химического канцерогенеза, лежащего в основе развития рака, определены основные этапы онкогенеза и основополагающая роль химических канцерогенных факторов в развитии онкологии. Рассмотрен вопрос об оксидированных формах азота, как факторах химического канцерогенеза, выявлены основные источники поступления в организм человека нитратов и нитритов. Описаны основные аналитические методики, используемые для количественного и качественного определения нитратов и нитритов.

При выполнении экспериментальной части работы были выбраны и оптимизированы методики определения оксидированных форм азота - нитратов и нитритов, проведен спектрофотометрический анализ продуктов на содержание в них нитритов и нитратов, установлено, что каждый мясной продукт произведен с добавлением нитрита натрия, а каждый исследованный образец овощей содержал достаточно большое количество нитратов. По результатам исследования написаны рекомендации по употреблению продуктов, содержащих оксидированные формы азота.

Таким образом, в ходе нашего исследования были реализована поставленная цель и решены соответствующие задачи. Основным результатом работы являются определенные концентрации нитратов и нитритов в свежих овощах и мясных полуфабрикатах.

Рекомендации

По результатам выполненной работы были сформулированы рекомендации к проведению химического анализа нитритов и нитратов и использованию продуктов содержащих данные химические канцерогены для сотрудников лабораторий и потребителей соответственно:

1. Проводить анализ с четким соблюдением концентрационных и временных условий. Использовать чистые оригинальные реактивы, готовить рабочие растворы непосредственно перед выполнением анализа.

2. При наличии в изучаемых вытяжках красящих веществ, а также их повышенной мутности проводить анализ без дополнительной очистки не рекомендуется. Определять оптическую плотность необходимо после подщелачивания растворов гидроксидом натрия, так как это приводит к углублению окраски и снижению их мутности.

3. Не регулярно употреблять в пищу мясные полуфабрикаты, сделанные с использованием нитрита натрия, и по возможности полностью исключить их из рациона. Так как нитрит натрия является фиксатором окраски и консервантом, при выборе содержащей его продукции обращать внимание на ее состав, а так же на цвет и срок годности.

...