Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Исследование изменения активности РНКаз пресноводного моллюска Viviparus viviparus L. под воздействием техногенных загрязнителей

03.02.08 - экология (биологические науки)

ФИЛКОВ ПАВЕЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

Москва - 2011

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химии

Московского педагогического государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Коничев Александр Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Васильев Андрей Валерьевич

кандидат биологических наук,

доцент

Проскурина Ирина Константиновна

Ведущая организация: Московский государственный

гуманитарный университет имени М.А. Шолохова

Защита диссертации состоится « » _______________ 201 г. в « » ч на заседании диссертационного совета Д 212.155.13 при Московском государственном областном университете по адресу: 141014, МО, Мытищи, ул. Веры Волошиной, 24; www.mgou.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского

государственного областного университета по адресу: 105005, Москва,

ул. Радио, д. 10а.

Автореферат разослан « » _______________ 201 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук,

доцент Снисаренко Т.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одной из наиболее актуальных проблем современности является техногенное загрязнение окружающей среды. Увеличение содержания в воде загрязняющих веществ, в частности тяжелых металлов, представляет угрозу для жизнедеятельности водных экосистем (Подгурская О.В., 2006). Оценка качества водного объекта физико-химическими методами не раскрывает всей полноты взаимодействия между собой компонентов водной среды. Мировой тенденцией в биотестировании является использование водных моллюсков в качестве биоиндикаторов, так как они обладают рядом преимуществ перед остальными видами тест-объектов (Цветков И.А. и др., 1997; Rainbow P.S., Phillips D.J., 1993; Boening D.W., 1999).

В настоящее время разработано множество систем биотестирования, основанных на количественных показателях выживаемости, смертности, плодовитости тест-объектов, однако, в то же время, существует относительно мало систем биотестирования с клеточными и субклеточными маркерами. В частности, рекомендуется определять уровни металлотионеинов в тканях двустворчатых моллюсков для оценки концентраций тяжелых металлов в среде (Boening D.W., 1999; Fishelson L. et al., 1999; Boisson F. et al., 1998; Regoli F., Orlando E., 1999; Hung T.C. et al., 2001), однако, для оценки воздействия органических загрязнителей подобных маркеров не до сих пор не предложено.

Группой исследователей (Hauser M.J.B., Olsen L.F., 1996; Olsen L.F., Hauser M.J.B., Kummer U., 2003) ранее было предложено использовать неспецифические реакции адаптации организма к изменившимся условиям окружающей среды, выраженные в изменении активности и фракционного состава молекулярных форм кислых гидролаз. В частности, был использован пресноводный брюхоногий моллюск Viviparus viviparus L., ферментные комплексы которого демонстрировали изменение активности неспецифического характера в ответ на воздействие тяжелых металлов и загрязнителей органической природы (Попов А.П., 2002). На этом же объекте ранее был установлен неспецифический характер изменения активности фосфатаз в ответ на воздействие техногенных загрязнителей (Цветков И.А., 1998; Цветков И.А. и др., 1997). До настоящего времени подобных исследований, охватывающих метаболизм РНК и активность РНКаз данного моллюска не проводилось. Принимая во внимание специфику данной группы ферментов, можно предположить наличие значительной адаптивной реакции на воздействие загрязнителей, что делает актуальным изучение метаболизма РНК и активности РНКаз моллюска в условиях воздействия сублетальных и летальных концентраций загрязнителя.

Цель исследования состояла в изучении изменения активности рибонуклеаз и фракционного состава РНК пресноводного моллюска V. viviparus, под воздействием сублетальных и летальных концентраций загрязняющих веществ органической и неорганической природы в модельных растворах и в загрязненной воде из природных водоемов.

Задачи исследования.

1. Охарактеризовать комплекс РНКаз моллюска V. viviparus в естественных условиях: установить значения рН среды, соответствующие максимальной активности РНКаз в ткани пищеварительной железы и в мышечной ткани; изучить состав множественных форм РНКаз; охарактеризовать сезонные колебания активности РНКаз; выделить и изучить фракционный состав препарата тотальной РНК пищеварительной железы моллюска; исследовать физико-химические свойства кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска.

2. Охарактеризовать изменения активности рибонуклеаз пищеварительной железы моллюска V. viviparus под воздействием сублетальных и летальных концентраций различных загрязнителей (ионов ртути (II); кадмия (II); свинца (II); меди (II); трихлорметана; симм-тетрахлорэтилена; тетрахлорметана; фенола; бензина; ПАВ (синтанол ДС-10; неонол АФ-9-4).

3. Выявить изменения фракционного состава препарата тотальной РНК пищеварительной железы моллюска V. viviparus под воздействием летальных концентраций ионов ртути (II) и кадмия (II).

4. Выявить изменения в наборе форм кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска под воздействием сублетальных концентраций тетрахлорметана, хлороформа и тетрахлорэтилена.

5. Исследовать изменения активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска под воздействием загрязненной воды из природного водоема; установить концентрации загрязнителей в воде физико-химическими методами и рассчитать корреляцию результатов анализа и биотестирования.

Научные результаты, выносимые на защиту.

1. Изменение активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска происходит под воздействием загрязнителей, содержащихся в модельных растворах и в загрязненной воде природного водоема и имеет вид неспецифических волнообразных изменений, схожих у различных токсикантов.

2. Воздействие летальных концентраций ионов ртути (II) и кадмия (II) приводит к необратимым изменениям метаболизма РНК, характеризующимся изменением соотношения основных фракций, образованием низмолекулярных фрагментов и исчезновением высокомолекулярных фракций РНК (28s РНК). Воздействие сублетальных концентраций хлорорганических углеводородов, провоцирующее образование свободных радикалов, вызывает изменение активности определенных форм кислой РНКазы и появление новых форм фермента с ОЭП 0,20 и 0,45.

3. Основные фракции РНК пищеварительной железы моллюска V. viviparus соответствуют фракциям 28s и 18s РНК печени крысы. Молекулярная масса кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска находится в диапазоне 14 - 18 кДа.

Научная новизна. Впервые охарактеризована удельная активность РНКазы в ткани пищеварительной железы и в мышечной ткани пресноводного моллюска V. viviparus, имеющая сезонные колебания (6,47 х 10-3 ± 1,1 х 10-4 у.е. летом и 2,55 х 10-3 ± 2,6 х 10-4 у.е. зимой); установлено значение рН 4,6, соответствующие максимальной активности фермента; множественные формы кислой РНКазы с ОЭП 0,35, 0,50 и 0,70; приблизительная молекулярная масса фермента 14-18 кДа.

Выделен и изучен препарат тотальной РНК пищеварительной железы моллюска V. viviparus, охарактеризован фракционный состав и молекулярная масса ее основных фракций.

Показано неспецифическое изменение активности кислой РНКазы под воздействием in vivo загрязнителей различной природы; изменение фракционного состава и активности множественных форм кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска.

Показана разница в изменении метаболизма РНК пищеварительной железы моллюска под воздействием летальных концентраций токсикантов, что свидетельствуют о различных предполагаемых механизмах действия загрязнителей на субклеточные системы.

Показана положительная корреляция между изменением активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска и содержанием в воде загрязняющих веществ.

Разработан метод выявления множественных форм РНКазы (моллюсков), характеризующийся, по сравнению с ранее известными методами, более четкими результатами.

Теоретическая значимость. Впервые выделены и охарактеризованы препараты тотальной РНК и кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска V. viviparus, что дает представление об их метаболизме в организме пресноводного моллюска; показана высокая чувствительность и неспецифическая природа изменения активности кислой РНКазы пищеварительной железы пресноводного моллюска V. viviparus (маркера) под воздействием различных загрязняющих веществ органической и неорганической природы, что может быть положено в основу методики интегральной скрининговой оценки качества водного объекта.

Практическая значимость. Использование неспецифических внутриклеточных маркеров, таких как кислая РНКаза пищеварительной железы моллюска, позволяет создать универсальный скрининговый метод контроля состояния водного объекта, характеризующийся высокой степенью интегральности оценки качества водного объекта.

Полученные экспериментальные данные можно использовать при разработке учебного курса «Экотоксикология» или «Экологическая биохимия».

Апробация работы. Результаты исследований были представлены в виде тезисов, пленарных и стендовых докладов за период с 2004г. по 2008г. на российских и международных симпозиумах и конференциях: IV сессия международной Постоянно действующей конференции «Эволюция инфосферы», круглый стол «Экология и город» (Москва, 2004); Международный конгресс по отходам «Waste-Tech 2005» (Москва, 2005); Международная конференция «Analytica-Expo 2006» (Москва, 2006); Конференция РАЕН «Региональные и муниципальные проблемы устойчивого развития территорий» (Москва, 2006); Седьмой международный конгресс «Вода: экология и технология» (Ecwatech - 2006) (Москва, 2006); Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология - современные биоаналитические системы, методы и технологии». (Пущино-Тула, 2006); V сессия международной Постоянно действующей конференции «Эволюция инфосферы», часть первая, круглый стол «Экология и город» (Москва, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ (1 в печати), из них 3 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ; 4 статьи в материалах международных, всероссийских и других конференций.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения и содержит 36 таблиц, 39 рисунков, 3 приложения. В списке литературы 235 источников, в том числе 205 на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю д.б.н., проф. Коничеву А.С., а также сотрудникам кафедры Органической и биологической химии МПГУ д.б.н. Кутузовой Н.М., д.б.н. Егоровой Т.А., д.б.н. Севастьяновой Г.А., д.б.н. Клуновой С.М., к.б.н. Иванову В.Г., к.б.н. Пиунковой С.А. за консультации и советы в проведении эксперимента. Автор выражает глубочайшую признательность д.м.н., проф. Осипенко М.Ф. и Осипенко С.М. за поддержку и конструктивные советы при написании этой работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Биотестирование с использованием моллюсков. Современное представление о рибонуклеазах. Приведены данные литературы о тенденциях развития и потенциале применения методов биотестирования на практике; рассмотрена специфика воздействия на организм морских и пресноводных моллюсков различных загрязнителей, биохимические процессы, сопряженные с реакциями их детоксикации; обобщены современные представления о рибонуклеазах, их строении, свойствах, приведены системы классификации и области применения.

Глава 2. Материалы и методы исследований. После экспонирования моллюска в растворе токсиканта методом вивисекции извлекали пищеварительную железу, которую промывали 0,15М раствором хлорида натрия, взвешивали и гомогенизировали с трех-пятикратным объемом 0,15М хлорида натрия в гомогенизаторе Поттера. Гомогенат центрифугировали при охлаждении и 6000g в течение 15 минут, в супернатанте определяли содержание белка по методу Лоури (Lowry O.H. et al., 1951). Определение активности РНКазы проводили по методу Рассела (Razzel W., Khorama H., 1961). Для определения множественных форм фермента использовали электрофорез в ПААГ по методу Дэвиса (Davis J.R., 1964) с мягким дегидратированием 85% этанолом и последующим регидратированием инкубационным буфером, содержащим субстрат РНК, переносом пластины в чистый инкубационный буфер, инкубированием, остановкой реакции, окраской горячим раствором метиленового синего и отмывкой горячей дистиллированной водой. Электрофорез тотального белкового препарата проводили в денатурирующих условиях по Лэммли (King J. and Laemmli, 1971) и в неденатурирующих условиях по Дэвису (Davis J.R., 1964). Окрашивание электрофореграмм тотального белкового препарата, проведенных в денатурирующих условиях проводили Кумасси-R250, в неденатурирующих условиях - коллоидным серебром. При необходимости, пластины геля с электрофореграммами высушивали, дегидратируя ацетоном.

Выделение РНК из пищеварительной железы моллюска проводили классическим фенол-хлороформным методом с гуанидилтиоцианатом в качестве ингибитора РНКаз, выделение РНК из печени крысы проводили аналогично. Электрофорез РНК проводили в ПААГ с последующей окраской горячим раствором метиленового синего и отмывкой горячей дистиллированной водой. Пластины ПААГ фотографировали на столике трансиллюминатора и обрабатывали на компьютере в программе «Phoretix 1D».

Выделение кислой РНКазы проводили методом гель-фильтрации через сефадекс G-75 fine с последующим десятикратным концентрированием полиэтиленгликолем.

Глава 3. Характеристика метаболизма РНК и активности РНКаз пресноводного моллюска V. viviparus в отсутствие техногенных загрязнителей. В главе приведены экспериментально полученные данные о метаболизме РНКаз и РНК пищеварительной железы моллюска. Выбор этого органа для эксперимента был сделан из-за интенсивных процессов метаболизма (Розенгарт Е.В. и др., 1993; Цветков И.Л., 1998), гемопоэза (Avanesyan A.V., Ataev G.L., 2004), простоты его препарирования и локализации процессов детоксикации ксенобиотиков (James M.O., 1982; Руденко C.C., Морозова T.B., 2008, Попов А.П. и др., 2003).

Установлено, что фермент обладает нуклеолитической активностью по отношению к высокополимерной дрожжевой РНК в кислом диапазоне рН с выраженным оптимумом рН 4,6 (рис. 1).

Выявлено, что удельная активность кислой РНКазы (опт. рН 4,6) в мышечной ткани почти в 3 раза ниже, чем в пищеварительной железе: (2,03 ± 0,54) х 10-4 у.е. и (6,15 ± 0,67) х 10-4 у.е. соответственно.

Рис. 1. Изменение активности РНКазы пищеварительной железы моллюска в зависимости от рН среды инкубации.

Нами установлено, что основные фракции препарата тотальной РНК пищеварительной железы моллюска имеют коэффициенты седиментации, близкие к 28s и 18s РНК, что соответствует аналогичным фракциями РНК печени крысы Rattus rattus при электрофорезе на пластине ПААГ, что не противоречит данным (McArthur A.G., 1996). тРНК пищеварительной железы моллюска имеет несколько больший коэффициент седиментации, чем 4s тРНК печени крысы.

Фермент был очищен на сефадексе G-75 по оптимальной прописи (Protein purification handbook). Профиль выхода белка представлен двумя значительными пиками во фракциях 5 - 8 и 15 - 21, в то время как во фракциях 9 - 14 концентрация белка оставалась довольно низкой (до 100 мкг/мл) (рис. 2). Кислая РНКаза (опт. рН 4,6) присутствовала во фракциях элюата с 6 по 14 включительно с выраженным пиком в 10 и 11 фракциях, которые были использованы для дальнейшего концентрирования полиэтиленгликолем до десятикратного уменьшения объема. По результатам гель-фильтрации, молекулярная масса белковых комплексов, обладающих РНКазной активностью, составила около 54 кДа. Для оценки содержания белков в элюате фракций 10 - 11 была проведена серия электрофоретических разделений в 7,5% ПААГ в неденатурирующих условиях с одновременным получением энзимограммы (рисунок 3, 4).

Рис. 2. Гель-фильтрация кислой РНКазы (опт. рН 4,6) через сефадекс G-75. (Сплошная линия - концентрация белка, заштрихованные столбцы - активность кислой РНКазы)

На энзимограмме кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска после гель-фильтрации и концентрирования была обнаружена только одна зона активности с ОЭП, равной 0,93-0,94, что свидетельствует о молекулярной массе фермента около 14 - 18 кДа и указывает на диссоциацию комплекса РНКаза-ингибитор, который существовал в гомогенате и был разрушен на этапе концентрирования в полиэтиленгликоле и электрофореза.

Следует отметить, что в гомогенате ткани пищеварительной железы множественные формы кислой РНКазы, очевидно, представлены белковыми комплексами различной молекулярной массы, которые выявлены нами методом энзим-электрофореза в ПААГ (рис. 5). Эти комплексы имеют ОЭП 0,35; 0,50 и 0,70 соответственно и относительную активность 53-55%; 25-26% и 20-21% от суммарной активности гомогената ткани пищеварительной железы моллюска.

Рис. 3. Энзимограмма активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска V. viviparus в элюате фракций после гель-фильтрации и концентрирования на ПЭГ-20000. Обозначения треков (слева направо): трек №1, 2, 3 - фракция 10 после концентрирования; №4, 5 - фракция 11 после концентрирования; №6, 7 - фракция 11 после гель-фильтрации; №8, 9 - фракция 10 после гель-фильтрации; №10 - негативный контроль.

Рис. 4. Электрофореграмма растворимых белков пищеварительной железы моллюска V. viviparus в процессе выделения кислой РНКазы (опт. рН 4,6). Обозначение треков (слева направо): трек №1, 3, 4 - маркерные белки, №2 - негативный контроль, №5-19 - электрофореграмма по стадиям разделения.

Рис. 5. Схема энзимограммы множественных форм кислой РНКазы пищеварительной железы пресноводного моллюска V. viviparus (стрелкой показано направление электрофореза; белыми прямоугольниками выделены зоны РНКазной активности (1, 2 и 3), соответствующие множественным формам фермента).

Глава 4. Влияние тяжелых металлов на метаболизм РНК и активность кислой РНКазы пищеварительной железы пресноводного моллюска V. viviparus. В результате собственных исследований было установлено, что в сублетальных и летальных концентрациях ионы тяжелых металлов in vivo вызывают изменения метаболизма РНК и активности РНКаз пищеварительной железы моллюска (рис. 6, 7), имеющие волнообразный характер и остающиеся неспецифичными для большинства исследованных загрязнителей. В начальный период времени было отмечено падение активности фермента до 50 - 80% от контроля, исключение составило воздействие меди в концентрации 2 х 10-4 мг/л, что, по всей видимости, объясняется важной физиологической ролью этого металла для жизнедеятельности моллюска (Ivankoviж D. et al., 2010; Jaenicke E. et al., 2010). Затем был отмечен рост активности до 115 - 300 % от контроля с последующим снижением через 24 ч воздействия.

Далее, нами установлено, что воздействие сублетальных концентраций ионов ртути (II) и кадмия (II) по-разному влияет на метаболизм РНК (табл. 1.). По всей видимости, воздействие ионов ртути приводит к дестабилизации мембран лизосом и высвобождению некой лизосомной РНКазы (Цветков И.Л., 1998; Попов А.П., 2002), которая, по нашим данным, оказывается специфичной к 18s РНК на фоне роста общей активности фермента. В отличие от ртути, воздействие ионов кадмия значительно снижают выработку АТФ в клетке (Hand S.C., Hardewig I., 1996; Hulbert A. et al., 2002), в результате чего происходит переключение белок-синтезирующего аппарата клетки на синтез металлотионеинов для компенсации воздействия загрязнителя (Pytharopoulou S. et al., 2006), а при высоких концентрациях металла или острой энергетической недостаточности возникает инактивация рибосом и белок-синтезирующего аппарата клетки (Pytharopoulou S. et al., 2006), что мы наблюдали в эксперименте в виде исчезновения 28s РНК.

Добавление тяжелых металлов в концентрациях 5 х 10-4 мг/л для ртути, 1 х 10-3 мг/л для кадмия и 1 х 10-2 мг/л для свинца in vitro вызывало увеличение активности фермента на 152%, 176% и 163% от контроля соответственно, связанное, по всей видимости, с диссоциацией комплекса РНКаза - ингибитор и селективным гидролизом РНК под влиянием ионов тяжелых металлов, что известно в отношении воздействия тяжелых металлов (David L. et al., 2001).

Рис. 6. Изменение активности кислой РНКазы пищеварительной железы пресноводного моллюска V. viviparus под воздействием сублетальных концентраций тяжелых металлов (1 ПДК)

Рис. 7. Изменение активности кислой РНКазы пищеварительной железы пресноводного моллюска V. viviparus под воздействием летальных концентраций тяжелых металлов (10 ПДК)

Таблица 1. Изменения фракционного состава препарата тотальной РНК пищеварительной железы моллюска V. viviparus под воздействием летальных (10 ПДК) концентраций тяжелых металлов, 2,7% ПААГ.

Глава 5. Влияние органических загрязнителей на активность и множественные формы кислой РНКазы пресноводного моллюска V. viviparus.

Исследованные загрязнители органической природы в сублетальных и летальных концентрациях in vivo вызывали изменения активности кислой РНКазы моллюска (рис. 8, 9). Их воздействие приводило к падению активности фермента до 60 - 90 % через 4 ч воздействия, росту до 100 - 110 % через 12 ч воздействия и дальнейшему уменьшению до 70 - 90 % через 72 ч воздействия с последующей стабилизацией или незначительным ростом.

В ряду хлорорганических загрязнителей наибольшее влияние оказал тетрахлорметан, воздействие которого вызвало вначале резкое падение активности фермента, а затем ее всплеск, сопровождавшийся падением и гибелью особей экспериментальной группы.

загрязнитель моллюск рибонуклеаз метаболизм

Рис. 8. Изменение активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска V. viviparus под воздействием сублетальных концентраций хлорорганических соединений (1 ПДК).

Рис. 9. Изменение активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска V. viviparus под воздействием сублетальных концентраций органических соединений (1 ПДК).

Выявлено изменение активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска, появление новых форм фермента с ОЭП 0,20 и 0,45 и исчезновение (полное ингибирование) форм с ОЭП 0,50 и 0,70 под действием тетрахлорметана (табл. 2). Можно предположить, что детоксикация тетрахлорметана сопровождается образованием большого количества свободных радикалов, инициирующих перекисное окисление липидов, образование активных форм кислорода, разрушение мембранных структур и развитие оксидативного стресса (Ribera D. et al., 1991; Salбnki J. et al., 2003; Dallinger R. et al., 2004; McVeigh A. et al., 2006). Фенол в указанной концентрации вызвал значительные изменения в активности фермента, что связано с истощением энергетических ресурсов организма, так как для детоксикации задействуется система цитохромов и глутатионтрансфераз (Elia A.C. et al., 2006).

Таблица 2. Изменение множественных форм кислой РНКазы под воздействием сублетальных концентраций хлорорганических соединений.

* - Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования (ГН 2.1.5.1315-03). Москва: Минздрав России, 2003

Глава 6. Влияние загрязненной воды природных водоемов на активность кислой РНКазы пресноводного моллюска V. viviparus.

Для исследования влияния на активность фермента in vivo загрязненной воды из природного водоема была использована вода из р. Яуза, взятая в месте впадения ее в р. Москву. С помощью физико-химического анализа было установлено превышение ПДК по некоторым из показателей (табл. 3). Воздействие данной воды на моллюсков экспериментальной группы вызывало изменение активности кислой РНКазы (рис. 10).

Таблица 3. Результаты химического анализа воды из реки Яуза в месте ее впадения в Москву-реку.

Рис. 10. Изменение активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска под воздействием загрязненной воды из р. Яуза.

Через 24 ч воздействия загрязненной воды было зафиксировано падение активности фермента до 20% от контроля, сопровождавшееся незначительным ее ростом до 40% через 96 часов воздействия, сменившимся очередным падением с незначительным ростом до завершения эксперимента.

Данный эксперимент наглядно иллюстрирует снижение биодоступности тяжелых металлов в сложном растворе за счет высокого содержания органического углерода (DePalma S.G. et al., 2011; Hines A. et al., 2010), и указывает на возможность применения метода исследования активности и множественных форм РНКазы для скрининговой оценки качества водного объекта.

Выводы

1. Впервые выделена и охарактеризована РНКаза моллюска V. viviparus. Фермент имеет оптимум активности при рН 4,6, с максимальной удельной активностью в ткани пищеварительной железы, молекулярную массу около 14 - 18 кДа, три множественные формы с ОЭП 0,35; 0,50 и 0,70 и относительной активностью 55%, 25% и 20%.

2. Впервые изучен фракционный состав тотальной РНК пищеварительной железы моллюска и сопоставлен с таковым печени крысы; 28s и 18s РНК моллюска и крысы имеют идентичные электрофоретические характеристики, тРНК моллюска имеет коэффициент седиментации, близкий к 4,5s.

3. Изучено воздействие широкого спектра загрязнителей (ионы тяжелых металлов, галогенуглеводороды, фенол, нефтепродукты, ПАВ) и установлено, что в сублетальных и летальных концентрациях при различных экспозициях (от 4 до 168 ч) они вызывают неспецифические циклические изменения активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска. Наиболее мощное воздействие на активность фермента оказывают ионы ртути (II), кадмия (II) в концентрации 10 ПДК и тетрахлорметан в концентрации 1 ПДК, а совместное присутствие в воде органического углерода и ионов тяжелых металлов приводит к снижению общей токсичности исследуемой воды.

4. Установлено, что под воздействием летальных концентраций ионов ртути (II) и кадмия (II) изменяется метаболизм РНК, что выражено образованием низкомолекулярных фрагментов с ОЭП 0,13 - 0,24; 0,40 и 0,85; остановкой синтеза пре-РНК и исчезновением фракции 28s РНК под воздействием кадмия; изменением фракционного состава и соотношения 28s/18s РНК от 2/1 в норме до 4,5/1 под воздействием ртути.

5. Воздействие хлорорганических соединений, провоцирующих развитие свободнорадикальных реакций при детоксикации вызывает образование новых форм фермента с ОЭП 0,20 и 0,45 при полном угнетении форм фермента с ОЭП 0,50 и 0,70 по сравнению с контролем.

6. Загрязненная вода из природных водоемов вызывает изменение активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска и коррелирует (R2= 0,846 при р<0,05) с содержанием в ней нефтепродуктов, фенолов, тяжелых металлов.

Список основных публикаций по теме диссертации

Издания, рекомендованные ВАК РФ.

1. Коничев А.С., Попов А.П., Филков П.В., Цветков И.Л. Ферменты как биохимические маркеры загрязнения воды. // Приложение к вестнику Московского государственного университета. Серия «Естественные науки: география, экология, экономика: актуальные проблемы науки и образования. Москва, издательство МГОУ, 2005, стр. 151-153.

2. Филков П.В., Попов А.П., Карташов С.Н., Коничев А.С. Выделение и изучение фракционного состава РНК печени моллюска Viviparus viviparus L. // Вестник Московского государственного областного университета. Труды Центра фундаментальных научных исследований №2, Москва, Издательство МГОУ, 2006, с. 60-67.

3. Филков П.В., Коничев А.С. Изменение активности РНКаз моллюска живородка речная (Viviparus viviparus) при отравлении тяжелыми металлами. // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки», № 1, Москва, Изд-во МГОУ, 2007, с. 12 - 17.

Статьи в сборниках научных конференций.

4. Филков П.В., Миташова Н.И., Чулков Б.Г. Токсикология выбросов хлорорганических растворителей с предприятий химической чистки г. Москвы. Пора перемен: Материалы IV сессии постоянно действующей Международной конференции «Эволюция инфосферы», проведенной РФФИ, ЮНЕСКО, РАН в 2004. - М.: МГВП КОКС, проект РФФИ № 02-06-87086, 2005. - Т. 2.

5. Филков П.В., Коничев А.С., Миташова Н.И. Современные методы оценки качества водных объектов. Тенденции и перспективы. Эколого-экономические и социальные проблемы развития регионов России. // Сб. науч. тр. - М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2007. - 475 с.: ил.

6. Филков П.В. Изучение изменений обмена нуклеиновых кислот живородки речной (Viviparus Viviparus L.), инициированных воздействием тяжелых металлов. // Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология - современные биоаналитические системы, методы и технологии». Российская школа конференция молодых ученых. г. Пущино. 28 октября - 3 ноября 2006 г. Сборник статей. Пущино-Тула (2006)

7. Филков П.В., Попов А.П., Коничев А.С., Миташова Н.И. Оценка состояния водных объектов г. Москвы чувствительными биохимическими методами. // Постоянно действующая конференция памяти академика Н. Моисеева «Эволюция Инфосферы» РАН. V-сессия, часть 1-я, круглый стол «экология и город» - в печати

8. Ершов А.Н., Коничев А.С., Клунова С.М., Пашечко Ю.О., Филков П.В. Влияние тяжелых металлов на активность нуклеаз печени моллюска живородка речная (Viviparus viviparus L.) // Труды научной конференции посвященной 85-летию кафедры органической и биологической химии и 90-летию со дня рождения почетного профессора МПГУ Ю.Б.Филипповича. М. МПГУ, 2009. с.103-104.

Размещено на Allbest.ru