Бактериофаги (по вирусам)

Анализ процессов бактериофагии. Характеристика стадий взаимодействия вирулентного фага с бактериальной клеткой. Морфологические особенности становления генома. Вирулентные и умеренные фаги. Практическое применение бактериофагов в биологии и медицине.

Рубрика Медицина
Вид лекция
Язык русский
Дата добавления 12.05.2013
Размер файла 39,7 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ставропольская Государственная Медицинская Академия

Кафедра микробиологии иммунологии и вирусологии

Лекция для студентов специальностей:

лечебное дело, педиатрия, стоматология

Раздел: общая микробиология, иммунология, вирусология

Лекция № 5 Бактериофаги (по вирусам)

Составил:

доктор медицинских наук

Таран Т.В.

Ставрополь, 2009.

Бактериофаги (или просто фаги) - вирусы бактерий (от лат. Bacteriophaga - пожирающий бактерии).

Бактериофагия - процесс взаимодействия фагов с бактериями, часто заканчивающийся разрушением последних.

Приоритет открытия фагов (1916) принадлежит Феликсу Д'Эррель - канадскому ученому, работавшему в Париже в Институте Пастера. Занимаясь изучением дизентерии, Феликс Д'Эррель обратил внимание на то, что возбудитель, высевающийся в начале заболевания в большом количестве, в конце болезни перестает выделяться. Заподозрив здесь действие какого-то агента, Д'Эррель решил его обнаружить. С этой целью к свежей бульонной культуре дизентерийной палочки он стал добавлять по нескольку капель фильтрата испражнений больного. В результате Д'Эррель обнаружил этот агент по способности разрушать дизентерийные бактерии и назвал его Bacteriophagum intestinale, т.е. «выделенный из кишечника пожиратель бактерий». Последующие наблюдения показали, что фаги распространены повсеместно. Они встречаются везде, где есть бактерии - в почве, воде, кишечном тракте человека и животных, гнойных выделениях и т.д.

Т.о., бактерии являются хозяевами специальной группы вирусов, названных бактериофагами, или «фагами». Хотя любой фаг строго специфичен в отношении своего хозяина, вероятно, что каждый тип бактерий может быть хозяином для одного и более фагов. Фаги имеют большое значение, т.к. являются идеальными объектами для изучения взаимоотношений хозяин-паразит и вирусной репродукции. Фаги различаются по форме, типу взаимодействия с микробной клеткой и специфичности.

Простота культивирования, короткий период генерации, высокий выход потомства и возможность точного его количественного учета способствовали успешному изучению как структуры вирусных частиц, так и механизмов их взаимодействия с бактериальной клеткой. Именно фаги оказались удобной моделью для изучения тонкой структуры гена, молекулярных механизмов мутагенеза, расшифровки генетического кода, влияния ионизирующей радиации на наследственные структуры организма.

Выделение и очистка. Если к растущей в жидкой питательной среде культуре чувствительных бактерий добавить в небольшом количестве частицы вирулентного бактериофага, то некоторые бактериальные клетки окажутся зараженными. Вначале никаких видимых изменений зараженных клеток обнаружить нельзя. Обычно этот период продолжается от 15 мин до 1 ч и более. Затем внезапно происходит лизис зараженных клеток. При лизисе зараженных клеток высвобождается большое количество новых фаговых частиц потомства. Эти фаги могут в свою очередь заражать другие клетки популяции, при этом вновь и вновь повторяется тот же самый процесс. Через определенное время практически вся популяция бактерий будет уничтожена.

Число фаговых частиц или зараженных бактериальных клеток в суспензии легко определить, если подходящее разведение этой суспензии нанести на чашку с агаром, на поверхность которого равномерно нанесена разбавленная суспензия чувствительных интактных бактерий. После соответствующей инкубации вся поверхность чашки будет покрыта сплошным слоем бактерий, за исключением тех мест, где оказались частицы фага или зараженные фагом бактерии. В результате последовательных циклов развития фага пленка бактерий вокруг таких точек локально разрушается и образуются прозрачные зоны лизиса - бляшки.

Если имеется смесь зараженных клеток и свободных фаговых частиц, то их можно разделить, используя, например, дифференциальное центрифугирование. Затем с помощью описанного метода подсчета бляшек определить по отдельности число тех и других. Если нужно определить лишь число фаговых частиц, содержащихся в суспензии, то можно избирательно убить присутствующие в ней зараженные клетки. Обычно для этого суспензию клеток и фага встряхивают с хлороформом, к которому фаги устойчивы, а бактерии погибают. Можно пропустить суспензию через мембранный фильтр, который задержит на себе бактериальные клетки, а в фильтрате окажутся частицы фага. При необходимости получения больших количеств фага заражают фагом экспоненциально растущую в жидкой среде культуру бактерий. В результате ряда циклов развития фага большинство, а иногда и все клетки культуры лизируются. Затем оставшиеся в культуре клетки и их обломки удаляют с помощью низкоскоростного центрифугирования, а получившуюся жидкость стерилизуют либо фильтрованием, либо обрабатывая ее хлороформом. В результате получается стерильный лизат, который содержит обычно от 109 до 1012 фаговых частиц, которые освобождаются из клеток при лизисе.

Для окончательной очистки бактерифагов обычно используют ультра центрифугирование. Даже самые мелкие частицы фага осаждаются при ускорениях порядка 100 000 g (в 105 раз превышающих ускорение под действием земного притяжения). Часто предварительно вирусные частицы осаждают сульфатом аммония или некоторыми другими веществами.

Резистентность к факторам окружающей среды. Фаги обладают большей устойчивостью к действию физических и химических факторов, чем многие вирусы человека. Большинство из них инактивируется при температуре не ниже 65-70 єС. Фаги хорошо переносят замораживание и длительное хранение при низких температурах, а также высушивание. 0,5 % раствор сулемы, 1 % раствор фенола не оказывают на них заметного действия, но 1 % раствор формалина инактивирует фаг через несколько минут. Фаги обладают высокой чувствительностью к кислотам. УФ лучи и ионизирующая радиация вызывают их инактивацию, а в более низких дозах - мутации.

Морфология. Большинство фагов имеет форму головастика или сперматозоида, некоторые фаги имеют кубическую или нитевидную форму. Из всех бактериофагов наиболее изучена группа фагов, которые паразитируют на клетках штамма B Escherichia coli. Это несколько фагов, обозначенные номерами от Т1 до Т7 (здесь Т означает «тип» - типовые). Как оказалось, три из этих фагов (Т2, Т4 и Т6) оказались близкородственными и обладают рядом свойств, которые делают их особенно удобными для экспериментальной работы. В частности, ДНК этих Т-четных фагов содержит вместо цитозина уникальное основание, 5-оксиметилцитозин. Определяя химическим методом его содержание, можно следить за синтезом вирусной ДНК в зараженных клетках в присутствии избытка бактериальной ДНК (содержащей обычный цитозин).

Долгие годы считали, что Т-четные фаги являются типичными представителями фагов. Однако при ЭМ-исследовании выявилось, что вирионы Т-четных фагов устроены гораздо сложнее, чем у других фагов, а механизмы их адсорбции и проникновения в клетку-хозяина в значительной степени специализированы. Тем не менее, после проникновения Т-четных фагов в клетку в ней, по-видимому, происходят такие же события, что и при заражении другими ДНК-содержащими фагами.

Размеры фагов колеблются от 20 до 200 микрон, т.е. в тех же пределах, что и размеры вирусов. Величина и форма фагов варьируют в довольно широких пределах даже у особей одного и того же вида, что говорит о морфологической изменчивости фагов.

Фаги могут существовать в двух формах:

1) внутриклеточной (это профаг, чистая ДНК);

2) внеклеточной (это вирион).

Структура фага. Большинство фагов имеют сперматозоидную форму. Под микроскопом отчетливо видно, что они состоят из вытянутой икосаэдрической головки и хвостового отростка, внутри которого имеется цилиндрический стержень, сообщающийся отверстием с головкой. Снаружи хвостовой отросток покрыт чехлом, который способен сокращаться наподобие мышцы. Заканчивается хвостовой отросток шестиугольной базальной пластинкой, имеющей короткие шипы с нитевидными структурами, называемыми фибриллами.

Головка соответствует плотно упакованному ядру, состоящему из нуклеиновой кислоты, окруженной белковой оболочкой - капсидом. Белковый капсид головки состоит из идентичных субъединиц (капсомеров), объединенных в призматическую структуру, обычно имеющую гексагональную форму в поперечном разрезе.

Бактериофаги содержат или ДНК, или РНК. Нуклеиновые кислоты фагов могут быть двунитевыми, однонитевыми, линейными, кольцевыми. Большинство фагов содержит двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо. Количество ДНК и белка примерно одинаково. Самый мелкий из известных фагов имеет головку размером 25 нм; другие фаги имеют размеры от 55Ч40 до 100Ч70 нм. У некоторых фагов внутри головки находится внутренний гистоноподобный белок, обеспечивающий суперспирализацию ДНК.

Хвостовой отросток фаговой частицы по сложности своей структуры варьирует у разных фагов. Наиболее сложного состава хвост у фага Т2, а также у ряда других коли- и тифозных фагов. У этих фагов хвост состоит, по крайней мере, из 3 частей: полого центра шириной 6-10 нм, сократительной стенки шириной 15-25 нм и терминальной базальной пластинки гексагональной формы, к которой могут прикрепляться выступы (зубцы) и (или) хвостовые нити. От последних зависит специфическая адсорбция на клетке-хозяине.

На электронных микрофотографиях, полученных при негативном контрастировании, можно видеть фаговые частицы в двух состояниях: у одних частиц головка резко выделяется на электроноплотном фоне и чехол отростка растянут, у других головка мало отличается от фона по плотности и чехол находится в сокращенном состоянии. Первое состояние характерно для активного фага, в головке которого заключена ДНК, второе - для фага, который инъецировал свою ДНК в бактериальную клетку.

Хвост фага является органом для адсорбции (для тех фагов, у которых он есть). Однако некоторые фаги полностью утратили хвосты: у РНК-содержащих фагов, например, капсид представляет собой простой икосаэдр. Фаги могут также различаться по морфологии терминальной структуры: одни имеют базальные пластинки, другие - «выпуклости», у третьих специфические терминальные структуры утрачиваются. Многие бактериофаги имеют более простое строение.

В хвостовом отростке фага содержится лизоцим, растворяющий стенку клетки-хозяина; на конце отростка расположены фибриллы, определяющие специфичность адсорбции.

В зависимости от формы зрелых фаговых частиц различают ряд морфологических типов фагов:

- нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют «мужские» клетки, несущие F-плазмиды;

- фаги с аналогом отростка - это мелкие РНК-содержащие фаги и фаги с одной спиралью ДНК;

- фаги без отростка;

- фаги с коротким отростком и двунитчатой ДНК (Т3, Т7 и др.), отличаются между собой строением отростка;

- ДНК-содержащие фаги с несокращающимся «чехлом» отростка и головкой разной формы и величины (Т1, Т5 и др.).

Длинный отросток заканчивается базальной пластинкой разнообразной формы;

- фаги с сокращающимся «чехлом» отростка и сложной структурой (Т2, Т4, Т6 и др.).

Нитевидные фаги весьма различаются своей морфологией. Характер упаковки их вириона еще недостаточно изучен. ДНК образует комплекс с белком и служит материалом для центральной части вирусной частицы.

Большинство фагов содержит двухцепочечную ДНК, но были обнаружены фаги с одноцепочечной ДНК и несколько с одноцепочечной РНК. РНК-содержащие фаги fr, Q и др. обладают наименьшими из известных геномов: в них 3500-4500 нуклеотидов.

Подобно другим вирусам, фаги неподвижны.

Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой, внутриклеточное развитие и репродукция фага:

Наиболее часто процесс взаимодействия фага с клеткой протекает по типу продуктивной инфекции и обычно заканчивается лизисом клеток бактериальной культуры. Но возможна и абортивная инфекция, при которой фаговое потомство не образуется, а бактериальные клетки сохраняют свою жизнедеятельность. Наконец, нередко наблюдается лизогенизация бактериальных клеток инфицирующим фагом, в результате чего возникает состояние лизогении (вирогении), характеризующееся интеграцией генома фага в геном бактериальной клетки.

В зависимости от типа взаимодействия различают вирулентные и умеренные бактериофаги. Вирулентные бактериофаги взаимодействуют с бактерией по продуктивному типу. Умеренные бактериофаги заражают бактерий-хозяев, но не размножаются в них автономно и не вызывают лизиса - интегративный тип взаимодействия. При интегративном типе - геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней.

Процесс взаимодействия вирулентного фага с бактериальной клеткой состоит из последовательной смены отдельных стадий. Стадии продуктивной инфекции:

I стадия - адсорбция. На клеточной стенке бактерий имеются рецепторы, на которых адсорбируются соответствующие фаги. Рецепторы различаются по химическому составу. Рецепторы для одних фагов находятся в липопротеиновом слое, для других - в липополисахаридном. Для ряда фагов рецепторы находятся на отростках клеток - жгутиках или пилях. Фагорезистентность некоторых бактерий определяется, вероятно, отсутствием у них соответствующих рецепторов в результате мутаций. При избытке бактериофага на одной клетке может адсорбироваться 200-300 фаговых частиц, хотя для заражения достаточно и одной. Фаг может адсорбироваться и на изолированных клеточных стенках, в то время как на протопластах, полностью лишенных клеточной стенки, адсорбции не происходит. Литический цикл инфекции начинается с того, что частица бактериофага случайно сталкивается с клеткой-хозяином. Если у вириона имеется участок адсорбции, химически комплементарный специфическому рецепторному участку на поверхности бактериальной клетки, то происходит необратимая адсорбция.

На процесс адсорбции фага большое влияние оказывают условия среды: солевой состав, рН, температура, а также наличие в среде строго определенных веществ - кофакторов адсорбции, например, триптофана для адсорбции фагов Т4, Т6. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют половые пили бактерий.

II стадия - пенетрация (проникновение). Фаги, имеющие сократительный механизм в хвостовой части, такие, как Т3, подобно шприцу инъецируют свою ДНК в периплазматическое пространство между клеточной стенкой и клеточной мембраной. Затем ДНК проникает в клетку через мембрану с затратой энергии хозяина.

Некоторые мелкие кубические фаги, способные адсорбироваться на половых пилях, вводят свою нуклеиновую кислоту через канал этих пилей.

Известен механизм пенетрации и других фагов. Нитевидные ДНК-содержащие фаги проникают в клетку по другому механизму. В этом случае через клеточную стенку проникает весь вирион. Белок, преобладающий в оболочке фаговой частицы, остается на клеточной мембране (ЦПМ), а фаговая ДНК, вместе с минорным оболочечным белком (А-белком) проникает в цитоплазму.

Установление фагового генома:

Однонитевая ДНК - к репликативному аппарату для синтеза комплементарной ей нити и образования репликативной формы; далее - аналогично двунитевой.

Двунитевая ДНК - к транскрипционному аппарату для синтеза мРНК и последующей трансляции вирусспецифических белков (ферментов и структурных).

РНК-геном - к трансляционному аппарату для синтеза вирусспецифических белков (ферментов репликации и структурных).

III стадия - биосинтез фаговой НК и белков капсида. В первые минуты после проникновения НК внутрь бактериальной клетки в течение латентного периода фаговые частицы обнаружить не удается. У E. coli этот период продолжается в среднем 25 мин, в искусственно разрушенных бактериальных клетках также не удается обнаружить фага.

Инъецированная ДНК фага, прежде всего, вызывает полную перестройку метаболизма зараженной клетки. Сразу же прекращается синтез бактериальной ДНК, через несколько минут прекращается также синтез бактериальной РНК и бактериальных белков, хотя общее количество белка продолжает непрерывно возрастать. Синтез ДНК возобновляется, даже с повышенной скоростью. Сначала фаговая ДНК образуется за счет распавшейся бактериальной. Эту перестройку и последующее новообразование фаговой ДНК можно проследить по увеличению количества 5-гидроксиметилцитозина - основания, специфичного для ДНК Т-четных фагов. Необходимые для синтеза фаговой ДНК ферменты образуются в клетке уже вскоре после заражения; это так называемые «ранние» белки. К «поздним» белкам относятся белки оболочки и фаговые лизоцимы, или эндолизины; они образуются лишь во второй половине латентного периода.

Репликация фаговой ДНК протекает в соответствии с общим механизмом репликации, однако детали этого механизма варьируют в зависимости от того, реплицируется ли фаговая ДНК в виде кольцевой (симметричный и асимметричный способы) или в виде линейной молекулы. В течение очень короткого периода (минуты) в клетке синтезируется несколько сотен новых фаговых хромосом, которые по мере образования беспорядочно обмениваются генетическим материалом.

РНК-содержащие бактериофаги.

У многих бактериофагов генетическим материалом в вирионах является одноцепочечная молекула РНК.

Сразу же после того, как молекула вирусной РНК проникает в цитоплазму клетки-хозяина, она опознается рибосомами как информационная. Рибосомы связываются с ней и синтезируют на этой РНК вирусные белки, в том числе РНК-репликазу (РНК-зависимую РНК-полимеразу). Этот фермент осуществляет репликацию вирусной РНК, полимеризуя рибонуклеозидтрифосфаты и используя в качестве матрицы вирусную РНК. Новосинтезированные «плюс» - цепи либо вновь используются репликазой для образования новой формы, либо соединяются с капсомерами, образуя зрелые вирионы.

Т.о, после проникновения в цитоплазму клетки вирусная РНК немедленно узнается как информационная РНК, присоединяется к рибосомам и транслируется с образованием вирусных белков. Один из этих белков - сложный фермент РНК-полимераза, которая обеспечивает полимеризацию рибонуклеозидтрифосфатов аденина, гуанина, цитозина на матрице вирусной РНК. Полная нуклеотидная последовательность определена в РНК фага MS2. Эта РНК представляет собой одну молекулу, состоящую из 3566 нуклеотидов, содержит 3 функциональных гена, кодирующих соответственно РНК-полимеразу, белок оболочки и минорный белок (белок А). Одноцепочечная РНК способна складываться с образованием двухцепочечных участков путем спаривания оснований; это вторичная структура играет большую роль в регуляции репликации вирусной РНК и ее трансляции.

Белковые субъединицы головки и хвостовой части фага самопроизвольно агрегируются (самосборка) с образованием полного капсида. Эта самосборка идет в определенной последовательности.

IV cтадия - морфогенез фага. Созревание состоит в необратимом объединении нуклеиновой кислоты и белковой оболочки фага. Зрелая частица представляет собой морфологически типичный инфекционный вирус, который не репродуцируется в той клетке, в которой он образовался. Если клетки лизировать клетки в поздней стадии латентного периода, то можно обнаружить незрелые фаговые частицы, в которых ДНК еще не соединена с белком необратимо и может быть легко выделена.

V стадия - высвобождение зрелых вирионов. При литической инфекции в конце латентного периода в клетке появляется еще один «поздний» вирусспецифический белок - фаговый лизоцим. Этот фермент воздействует на пептидогликановый слой стенки бактериальной клетки, гидролизуя связи между остатками сахара в цепях остова слоя. В результате стенка становится все менее прочной, размягчается и, в конце концов, разрывается под действием внутриклеточного осмотического давления, а фаговое потомство выходит вместе с остальным содержимым клетки в окружающую среду. Весь литический цикл от адсорбции бактериофага на бактерии до его выхода из нее занимает 20-40 мин.

Хотя обычно фаги высвобождаются из клетки-хозяина в результате ее лизиса, из этого общего правила имеется исключение, которое составляют нитевидные ДНК-содержащие фаги, например, уже упоминавшийся фаг fd. В этом случае новосинтезированные белки фаговой оболочки располагаются на клеточной мембране. Созревание фага и его высвобождение происходит в результате того, что фаговая ДНК выталкивается из клетки и во время прохождения через мембрану соединяется с белком оболочки. Во время этого процесса высвобождения фаговых частиц (почкование) клетка-хозяин остается жизнеспособной и продолжает расти и развиваться.

ЛИЗОГЕНИЯ И УМЕРЕННЫЕ ФАГИ:

Наряду с вирулентными фагами существуют умеренные фаги, отличающиеся от первых характером взаимодействия с бактериальной клеткой. Их основная особенность состоит в том, что они способны переходить из вегетативного состояния, присущего вирулентному фагу, в неинфекционную форму, названную профагом. Клетка, содержащая профаг в геноме, называется лизогенной и отличается от исходной наличием дополнительной генетической информации за счет генов профага. Это явление фаговой или лизогенной конверсии, т.к. профаг придает бактерии новые свойства, (лат. conversio - превращение). Конвертироваться могут морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие свойства бактерий. Например, наличие профага в дифтерийной палочке обусловливает ее способность продуцировать дифтерийный экзотоксин.

Лизогения:

Большинство исследований по выяснению природы профага и лизогенного состояния проведено с ДНК-содержащим бактериофагом ?, который сначала был обнаружен в виде профага, присутствующего в штамме К12 E. coli. Где же локализован геном фага l в лизогенной клетке? Каков механизм, обеспечивающий синхронную репликацию этого генома и почти обязательную сегрегацию его реплик в дочерние клетки?

Опыты по рекомбинации позволяют проводить картирование бактериальной хромосомы. Если донор и реципиент отличаются по нескольким генетическим признакам, то, проводя анализ рекомбинантов, можно установить, какие гены были унаследованы им от родителя-донора, а какие - от реципиента. Чем ближе расположены друг к другу два гена на хромосоме донора, тем с более высокой частотой они будут совместно наследоваться одной и той же рекомбинантной клеткой. Такие гены называют тесно сцепленными.

При рекомбинации не лизогенных донорских клеток с несущими профаг, реципиентными клетками профаг наследуется таким образом, как будто бы он занимает определенное место на хромосоме бактерии между генами gal и bio, которые кодируют ферменты, участвующие соответственно в метаболизме галактозы и в биосинтезе биотина. Следовательно, профаг прикреплен к бактериальной хромосоме и реплицируется синхронно с ней. При клеточном делении каждая дочерняя хромосома получает бактериальную хромосому вместе с прикрепленным к ней профагом.

Сразу после того, как геном фага проникает в клетку-хозяина, он замыкается в кольцо. Геном фага l имеет участок, который спаривается со специфическим участком бактериальной хромосомы, расположенным рядом с локусом gal. В результате единичного перекреста внутри области спаривания геном фага l оказывается встроенным в бактериальную хромосому. Встроенный в хромосому геном и представляет собой профаг. Начиная с этого момента, он реплицируется уже как часть бактериальной хромосомы даже в том случае, если репликация свободной ДНК фага полностью подавляется фаговым репрессором.

Некоторые факторы (УФО) обусловливают «выщепление» фаговой ДНК из клеточной хромосомы, в этом случае начинается литический цикл развития фагов, клетка в конце концов лизируется высвобождает зрелые вирионы.

Как оказалось, описанные выше события происходят и при образовании профага рядом других фагов, родственных фагу l, поэтому данный вариант лизогении получил наименование «лизогения - типа».

Итак, профаг представляет собой геном вируса, ассоциированный с бактериальной хромосомой. В отличие от генома вирулентного фага, функция которого определяет активную репродукцию вируса, профаг воспроизводится как часть бактериальной ДНК и синхронно с ней реплицируется. Некоторые фаги (Р1) локализуются в цитоплазме бактериальной клетки и не включаются в ее хромосому. Бактерия при этом выживает и нормально делится. В большинстве клеток потомства структурных вирусных белков не образуется, и большая часть генов вируса оказываются репрессированными. Однако изредка в отдельных клетках геном дерепрессируется, начинается литический цикл развития, клетка в конце концов лизируется высвобождает зрелые вирионы.

Бактериальные клетки, содержащие в своей хромосоме профаг, называются лизогенными, а явления, связанные с лизогенизацией, - лизогенией (то же, что и вирогения). Это название отражает потенциальную способность лизогенных бактерий к продукции фага. Переход профага в вегетативный фаг в естественных условиях существования лизогенных бактерий происходит нечасто. В результате такого перехода отдельные клетки бактериальной популяции, в которых произошло указанное превращение, лизируются и освобождают фаговые частицы.

Одной из особенностей лизогенных бактерий является приобретенный ими иммунитет к последующему заражению одноименным фагом. Вследствие этого освободившиеся из отдельных клеток вирионы не оказывают действие на остальную популяцию лизогенных бактерий.

Выявить эти фаги можно путем посева лизогенной культуры или ее фильтрат, освобожденного от бактерий, на так называемую индикаторную культуру, не лизогенную по данному фагу. При заражении клеток индикаторной культуры освободившимся из лизогенных бактерий фагом одни из них лизируются в результате продуктивной инфекции, другие подвергаются лизогенизации. Поэтому на газоне индикаторной культуры под агаровым покрытием на чашке Петри образуются типичные для умеренных фагов мутные бляшки с более плотным центром. Наличие просветленного участка в бляшке обусловлено лизисом клеток, а мутность и уплотнение связаны с ростом лизогенизированных бактерий.

Продукция фага лизогенными бактериями значительно увеличивается при их облучении УФ-лучами или под влиянием некоторых химических соединений, взаимодействующих с ДНК. Данный феномен называется индукцией фага и используется на космических кораблях для определения дозы радиации. Под влиянием радиации увеличивается число фаговых частиц, продуцируемых клетками лизогенных бактерий. Некоторые лизогенные бактерии могут утрачивать профаг самопроизвольно без перехода его в вегетативное состояние.

Как уже отмечалось, наличие профага в составе бактериальной хромосомы не мешает репликации ДНК бактериальной клетки и самого профага. Однако гены профага, встроенные в клеточную ДНК, не транскрибируются. Это связано с образованием в бактериальной клетке репрессора - низкомолекулярного белка, блокирующего считывание генетической информации, записанной в фаговой ДНК. Синтез репрессора контролируется генами профага. При инактивации репрессора УФ-лучами профаг выходит из состава бактериальной хромосомы и превращается в вегетативный фаг, который вызывает продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом клеток хозяина.

Лизогенизация бактерий лежит в основе фаговой, или лизогенной, конверсии, наблюдаемой у бактерий. Данный феномен заключается в приобретении лизогенными бактериями определенных признаков, например, способности продуцировать токсины, изменять морфологию или антигенные свойства и др. Эти признаки контролируются генами профага и бактериальной клетки или только профага.

Лизогения Р1-типа:

Многие бактериофаги, из которых лучше всего изучен фаг Р1, отличаются от фагов группы двумя очень важными свойствами:

Во-первых, опыты по рекомбинации между лизогенными и нелизогенными клетками не выявили определенного места локализации профага Р1 и других фагов этого типа на хромосоме бактерии, т.е. сцепления с определенными генами.

Во-вторых, фаги Р1 и l различаются по способу образования трансдуцирующих частиц, т.е. таких вирионов, которые содержат фрагменты хозяйской ДНК. ДНК фага Р1, выделенная из лизогенных клеток, оказывается кольцевой молекулой того же размера, что и молекулы ДНК в вирионах Р1; ее связи с бактериальной ДНК не обнаружено. Это подтверждает внехромосомную локализацию профага Р1.

Весьма вероятно, что профаги типа Р1 прикреплены не к хромосоме, а к мембране клетки. Наличие на мембране таких мест прикрепления объясняет, по-видимому, упорядоченную репликацию и сегрегацию внехромосомных генетических элементов - плазмид. Т.о, фаг типа Р1 может реплицироваться синхронно с клеткой в виде профага, прикрепленного, по-видимому, к клеточной мембране, или может пойти по литическому пути и начать неконтролируемую вегетативную репликацию. В большинстве лизогенных клеток литическое действие предотвращается в результате действия фагового репрессора, точно так же, как это происходит в случае лизогении фагами типа l. Умеренные фаги могут быть дефектными, т.е. неспособными к образованию зрелых фаговых частиц ни в естественных условиях, ни под влиянием индуцирующих агентов. Такого рода фаги осуществляют трансдукцию и используются в генной инженерии.

Дефектные профаги. Время от времени в профагах происходят мутации или делеции, которые делают профаг не способным к нормальному развитию. Мутация может, например, привести к тому, что утрачивается способность к вегетативной репликации или способность синтезировать какой-либо существенный для развития вирусный белок. Такие профаги называются дефектными. Их присутствие в клетке выявляется по тому, что клетка сохраняет свою иммунность к суперинфекции коиммунным фагом. Кроме того, если дефектный профаг получился из индуцибельного фага, то обработка таких клеток индуцирующими агентами может по-прежнему депрессировать оставшиеся функциональными гены профага и привести к лизису клетки под действием фагового лизоцима.

Поэтому, обрабатывая клетки индуцирующими агентами, можно выявить наличие дефектных профагов в бактериях, выделенных из природных источников. Лизис клеток укажет на то, что они содержат какой-то индуцибельный дефектный профаг.

Специфичность действия фага:

Каждый бактериофаг вызывает лизис определенного вида бактерий. Кроме того, имеются фаги к определенным типам и даже штаммам бактерий.

По степени специфичности фаги могут быть разделены на три группы: полифаги - активные в отношении нескольких родственных видов бактерий; монофаги - лизирующие микробов одного вида; типовые фаги - способные лизировать только определенные типы данного вида бактерий.

Практическое применение бактериофагов:

Фаги используются для типирования бактерий, а в ряде случаев для их индикации (выявления) в окружающей среде. Кроме того, они применяются для лечения и профилактики ряда инфекционных заболеваний.

В практике эпидемиологического обследования широко применяется фаготипирование бактерий - метод дифференцирования их внутри вида для определения фаготипа. Этот метод позволяет распознать подлинный источник инфекции и дает возможность проследить иногда очень сложный путь возбудителя от источника инфекции до восприимчивого организма.

Существует два способа фаготипирования бактерий. При первом бактерии подразделяют на фаготипы по свойствам выделяемых из них умеренных фагов, при втором - по чувствительности исследуемых бактерий к специфическим (типовым) фагам:

- Вследствие широкого распространения лизогении среди патогенных бактерий продуцируемые ими умеренные фаги служат своеобразной «меткой», по которой можно проследить за судьбой их хозяина. На основании различий в спектре литического действия умеренных фагов, присущих данному типу (варианту) бактерий одного и того же вида, стало возможным дифференцировать их друг от друга. Это позволяет распознать родственные штаммы, выяснить их происхождение и пути распространения инфекции. При помощи данного метода определяют фаготипы сальмонелл, кишечных палочек и др.

- При втором способе используют наборы типоспецифических фагов, способных вызывать лизис только определенных типов (вариантов) бактериальной культуры. В связи со сравнительно широким спектром литического действия вирулентных фагов они оказались малопригодными для этой цели. Поэтому в качестве типовых фагов используют умеренные фаги, выделенные из лизогенных культур. Они отличаются узкоспецифическим спектром литического действия и позволяют дифференцировать возбудителей на большое количество фаготипов. Например, этим методом удалось выявить до 72 фаговаров брюшнотифозных бактерий и до 90 фаговаров S. typhimurium.

В 1955 г. В.Д. Тимаковым и Д.М. Гольдфарбом предложен метод определения патогенных микроорганизмов непосредственно в исследуемом материале без выделения чистой культуры. Этот метод - реакция нарастания титра фага - основан на способности индикаторного фага к репродукции в чувствительных бактериях. При внесении такого фага в исследуемый материал, содержащий искомый возбудитель, определяется нарастание титра фага. С помощью этой реакции оказалась возможной индикация возбудителей инфекционных заболеваний (дизентерия, брюшной тиф, паратифы, бруцеллез, холера, чума) в материале от людей, из объектов внешней среды, пищевых продуктов.

Возможно применение фагов с лечебной (гнойные и анаэробные инфекции, дизентерия) или диагностической целью. В последнее время фаги вновь привлекают к себе внимание ввиду все более широкого распространения антибиотикорезистентных форм патогенных и условно-патогенных бактерий.

Выпускаются отечественные препараты дизентерийного, сальмонеллезного, коли-протейного, стафилококкового и др. фагов, а также наборы фагов для фаготипирования брюшнотифозных бактерий, бруцелл, стафилококков и некоторых других видов бактерий.

Выделение фага из воды может быть использовано как показатель ее бактериального загрязнения с помощью реакции нарастания титра специфического фага.

Фаг как препарат представляет собой фильтрат бульонных культур лизированных бактерий.

Бактериофаги широко применяют в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК.

Антигенные свойства фагов:

Бактериофаги содержат группоспецифические и типоспецифические антигены, обладают иммуногенными свойствами, вызывая синтез специфических антител в организме.

Антитела, взаимодействуя с бактериофагами, могут нейтрализовать их литическую активность против бактерий. По типоспецифическим антигенам фаги делят на серотипы. На агаре, к которому добавлена антифаговая сыворотка, зараженные фагом бактерии дают нормальный рост.

Бактериофаги (фаги):

Бактериофаги (от бактерия + греч. phagos - пожирающий) - вирусы бактерий, специфически проникающие в бактериальные клетки и поражающие их.

Бактериофаги содержат ДНК или РНК. Различают бактериофаги с длинным отростком, имеющие сокращающийся или несокращающийся чехол, а также бактериофаги с короткими отростками, с аналогами отростков, без отростков и нитевидные. Размер бактериофагов колеблется от 20 до 800 им (у нитевидных форм). Бактериофаги, имеющие форму сперматозоида, достигают длины до 200 нм и состоят из хвостового отростка, головки икосаэдрического типа, содержащей нуклеиновую кислоту.

Капсид головки и чехол хвостового отростка бактериофага состоят из полипептидных субьединиц, уложенных по икосаэдрическому (головка) или спиральному (отросток) типу симметрии. Хвостовой отросток имеет внутри трубку (стержень), сообщающуюся с головкой, а снаружи - чехол отростка, заканчивающийся шестиугольной базальной пластинкой с шипами, от которых отходят фибриллы (нити).

Вирулентные бактериофаги, попав в бактерию, реплицируются, формируя 200-300 фаговых частиц, и вызывают гибель (лизис) бактерии. Это продуктивный тип взаимодействия.

Бактериофаги с сокращающимся чехлом адсорбируются на клеточной стенке с помощью фибрилл хвостового отростка. Чехол хвостового отростка сокращается, и стержень с помощью ферментов (лизоцима) как бы просверливает оболочку клетки. Через канал трубки бактериофага нуклеиновая кислота инъецируется из головки в бактериальную клетку, а капсид бактериофага остается снаружи бактерии. Инъецированная внутрь клетки нуклеиновая кислота подавляет биосинтез компонентов клетки, заставляя ее синтезировать нуклеиновую кислоту и белки бактериофага.

Образовавшиеся в разных частях клетки компоненты бактериофага собираются в фаговые частицы путем заполнения фаговой нуклеиновой кислотой пустотелых капсидов головки. Сформированная головка соединяется с хвостовой частью, образуя новый фаг. Затем в результате лизиса клетки бактериофаги выходят из нее.

Умеренные бактериофаги взаимодействуют с бактериями либо по продуктивному, либо по интегративному типу.

Продуктивный тип умеренного фага идет как и у вирулентных фагов и заканчивается лизисом бактерий.

При интегративном типе ДНК умеренного фага встраивается в хромосому бактерии, реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса (передается при делении бактерии). ДНК фага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, а культура бактерий - лизогенной; сам процесс - лизогенией (от греч. lysis - разложение, geneo - происхождение).

НК умеренного фага лямбда, введенная в бактерию, вызывает либо лизис, либо лизогенизацию (проникшая в бактерию ДНК умеренного фага приобретает форму кольца и интегрирует в строго определенную область хромосомы). УФ-облучение индуцирует литический процесс. При лизогении фаги не образуются в результате «выключения» фаговых генов репрессором, кодируемым одним геном фага.

Профаги могут спонтанно или под действием индуцирующих агентов (УФ-лучи, митомицин С и др.) дерепрессироваться, исключаться из хромосомы. Этот процесс заканчивается продукцией фагов (индукция профага) и лизисом бактерий. клетка бактериофаг медицина

Профаг придает бактерии новые свойства, что получило название фаговой конверсии (лат. conversio - превращение). Конвертироваться могут морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие свойства бактерий. Например, наличие профага в дифтерийной палочке обусловливает ее способность продуцировать дифтерийный экзотоксин.

Бактериофаги применяют для профилактики, лечения инфекций, в генной инженерии, а также для диагностики (например, для фаготипирования с целью выявления источника инфекции).

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

  • История открытия бактериофагов, особенности их строения. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Методы культивирования бактериальных вирусов и их индикация. Выделение фага из объектов окружающей среды, определение спектра его литического действия.

    курсовая работа [2,8 M], добавлен 21.02.2011

  • Строение вирусов, поражающих клетки бактерий. Их виды по форме, структуре, типу нуклеиновой кислоты, характеру взаимодействия с клеткой. Индикация и выделение бактериофагов. Их применение для диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

    презентация [2,2 M], добавлен 15.10.2014

  • Свойства вирусов и плазмид, по которым они отличаются от остального живого мира. Морфология вирусов. Исходы взаимодействия вирусов с клеткой хозяина. Методы культивирования вирусов. Вирусы бактерий (бактериофаги). Этапы взаимодействия фагов и бактерий.

    реферат [25,6 K], добавлен 21.01.2010

  • Вирусы: морфология, структура, влияние внешних факторов, размножение. Синтез компонентов вириона и освобождение вирусного потомства как стадии репродукции вируса. Цикл взаимодействия фага с клеткой. Способы предохранения от инфекционных заболеваний.

    лекция [25,5 K], добавлен 25.03.2013

  • Физические основы применения лазерной техники в медицине. Типы лазеров, принципы действия. Механизм взаимодействия лазерного излучения с биотканями. Перспективные лазерные методы в медицине и биологии. Серийно выпускаемая медицинская лазерная аппаратура.

    реферат [8,0 M], добавлен 30.08.2009

  • Применение в медицине микроскопических устройств на основе нанотехнологий. Создание микроустройств для работы внутри организма. Методы молекулярной биологии. Нанотехнологические сенсоры и анализаторы. Контейнеры для доставки лекарств и клеточной терапии.

    реферат [431,5 K], добавлен 08.03.2011

  • Понятие белков, их сущность и особенности, строение и функции в организме. Нуклеиновые кислоты – ДНК и РНК, их строение и значение. Сущность и роль в организме процессов транскрипции и трансляции. Практическое применение в медицине молекулярной генетики.

    реферат [16,9 K], добавлен 22.02.2009

  • Краткая история развития и становления фармакологии как науки. Ботаническое описание, географическое распространение, фармакологические свойства и фармакологическое действие папоротника. Применение папоротников в народной и традиционной медицине.

    курсовая работа [96,4 K], добавлен 11.05.2012

  • Основы квантовой теории. Понятие и виды флуоресценции, квантовый выход. Совмещение флуорохромов и задача колокализации. Подбор пар для FRET-микроскопии, ее механизм и физические показатели. FRET-исследования в области клеточной биологии и медицине.

    курсовая работа [3,3 M], добавлен 18.10.2013

  • Общая информация о растении, требования к качеству и плодородию почвы, теплу и свету; морфологические особенности. Сбор и сушка плодов черемухи; ее фармакологические свойства и применение в медицине. Кулинарные рецепты с черемухой, ее химический состав.

    реферат [16,3 K], добавлен 08.01.2010

  • Применение радиоактивного излучения в медицине и промышленности. История открытия радиоактивности французским физиком А. Беккерелем. Использование радиации для диагностики и лечения различных заболеваний. Сущность и особенности радиационной стерилизации.

    презентация [883,2 K], добавлен 28.10.2014

  • Роль математического образования в медицине. Вооружение студентов математическими знаниями и умениями, необходимыми для изучения специальных дисциплин базового уровня. Применение математических методов в медицине. Особенности медицинской статистики.

    презентация [775,9 K], добавлен 25.09.2014

  • Изучение фармакогнозии как отрасли фармации. Применение в современной медицине лекарств растительного происхождения. Механизм действия горечи, ее физические и химические свойства. Применение растения для повышения аппетита и улучшения пищеварения.

    курсовая работа [1,0 M], добавлен 28.01.2015

  • Геномика и медицина. Структура вирусного генома. Другие геномы. Структура генома прокариот. Ориентация генов (направление транскрипции). Гомологичные гены и копийность генов. Изменение функции гена в процессе эволюции. Исследования генома человека.

    курсовая работа [2,2 M], добавлен 04.01.2008

  • Применение ионизирующего излучения в медицине. Технология лечебных процедур. Установки для дистанционной лучевой терапии. Применение изотопов в медицине. Средства защиты от ионизирующего излучения. Процесс получения и использования радионуклидов.

    презентация [1016,4 K], добавлен 21.02.2016

  • Строение вируса иммунодефицита человека. Жизненный цикл возбудителя инфекции. Механизм взаимодействия с клеткой, патогенез. Пути передачи и методы профилактики. Поиск противовирусных препаратов, влияющих на ВИЧ, методы восстановления функций иммунитета.

    курсовая работа [541,4 K], добавлен 28.04.2012

  • Краткая ботаническая характеристика растения, ареал, местообитание и экологические особенности. Биологически активные вещества. История применения в медицине. Применение препаратов каштана конского в традиционной и народной медицине, гомеопатии.

    курсовая работа [323,2 K], добавлен 11.03.2011

  • Ареал, место обитания и экологические особенности смоковницы обыкновенной. Рациональные приёмы сбора, сушка и хранение сырья. Химический состав инжира. Применение растения в медицине. Анализ современного аптечного ассортимента лекарственных препаратов.

    курсовая работа [8,2 M], добавлен 03.11.2013

  • Лазерные методы диагностики. Оптические квантовые генераторы. Основные направления и цели медико-биологического использования лазеров. Ангиография. Диагностические возможности голографии. Термография. Лазерная медицинская установка длялучевой терапии.

    реферат [178,1 K], добавлен 12.02.2005

  • Ботаническое описание, распространение, агротехника выращивания и химический состав клещевины обыкновенной. Классификация жиров и жироподобных веществ. Фармакологические свойства касторового масла и применение препарата в косметологии и народной медицине.

    курсовая работа [459,6 K], добавлен 21.08.2011

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.