Транскриптомика и протеомика плазмы крови

Размещено на http://www.allbest.ru/

Транскриптомика и протеомика плазмы крови



Транскриптомика - дисциплина, изучающая всю совокупность транскрибируемых последовательностей (мРНК, рРНК и тРНК, разнообразные малые некодирующие РНК), а так же происходящие с ними процессы. плазма кровь иммуноглобулин протеомика

Транскрипт -- молекула РНК, образующаяся в результате транскрипции (экспрессии соответствующего гена или участка ДНК). (Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: в трех томах. )

Совокупность транскриптов всех генов, экспрессирующихся в какой-либо клетке на какой-либо стадии ее развития, называется транскриптом клетки. Соответственно, существуют также транскриптомы ткани, органа и организма. Поскольку транскрипты являются продуктами транскрипции генов, их совокупность представляет собой первый уровень фенотипа, т.е. первый уровень развертывания и реализации генетической информации, заключенной в геноме. Структура транскриптома сложно организована и постоянно изменяется, поскольку зависит от стадий клеточного цикла, от типа клеток и тканей, от стадий развития организма, от состояния (норма-болезнь) тканей и органов, от наличия внешних сигналов как для самой транскрипции генов, так и для различных пост-транскрипционных процессов - сплайсинга, редактирования, взаимодействия с микроРНК (miRNA) или короткими интерферирующими РНК (siRNA). Иными словами, транскриптому изначально присуща пространственная дифференциальность и высокая динамичность в распределении транскриптов разных генов и изоформ транскриптов отдельного гена.

Исследование структуры и динамики транскриптома, лежащих в основе формирования второго уровня фенотипа - протеома клеток, тканей и т. д ., является задачей транскриптомики.

Клиническое исследование плазмы крови является необходимым условием для диагностики многих заболеваний различных органов и систем в организме человека.

В настоящее время информативность такого исследования относительно невелика, т.к. достоверно подвергаются экспертной оценке лишь несколько показателей из сотен тысяч потенциально возможных. Для расширения базы объектов лабораторной диагностики с 2002г. на международном уровне реализуется масштабный проект по изучению протеома плазмы крови, т.е.по анализу всего спектра веществ плазмы, имеющих белковую природу, на первом этапе которого была структурирована и исследована разрозненная информация о более чем трех тысячах белков плазмы человеческой крови и разработаны критерии методики оценки достоверности полученных результатов.

Результаты работы проекта на данный момент:

было изучено и идентифицировано:

*889 белков плазмы, идентифицированы с достоверностью 95%

*3020 белков при идентификации двух пептидов и более

*9504 белка на основе масс-спектрометрического выявлению одного или двух пептидов каждого белка

Полученные в ходе реализации проекта научные данные в ближайшем будущем позволят существенно расширить базу лабораторных показателей при изучении плазмы крови и повысить информативность лабораторно-клинических исследований.

Реализация проекта «Геном человека» позволяет обнаруживать мутации в генах, приводящие к наследственным заболеваниям или к повышению вероятности возникновения многих патологий, таких, например, как онкологические, сердечно-сосудистые (атеросклероз), диабет, метаболический синдром, шизофрения и др. В практику лабораторной диагностики уже успешно внедрены методы идентификации мутаций, наиболее часто приводящих, например, к различным раковым заболеваниям. Эти методы основаны на применении ПЦР (полимеразной цепной реакции) и маркерных генов, содержащих нарушения, приводящие к конкретным патологиям. Развитие геномики патологий позволяет, однако, не только проводить их молекулярно-генетическую диагностику, но и, как следующий этап, определять интенсивность синтезов РНК и белков, имеющих отношение к возникновению и развитию заболеваний. Это делается с помощью определения транскрипционных профилей, характеризующих экспрессию всех генов, активных в данном образце.

Технологии, при этом применяемые, основаны на так называемых «ДНК-микрочипах» (DNA microarray). Такой генный чип - это твердая подложка, на которую в определенном порядке нанесены в виде точек индивидуальные гены (их ДНК). Чтобы определить, транскрибируется ли данный ген, на чип помещают (с определенными координатами) лишь его часть - олигонуклеотид. Этот олигонуклеотид соответствует экспрессируемой части гена (экзону). Затем из образца (например, опухоль) выделяется вся (суммарная) РНК. На основе всех молекул РНК данного образца получают их ДНК-копии - кДНК (обратная транскрипция), которые флуоресцентно метят и потом проводят гибридизацию с иммобилизованными на микрочипе олигонуклеотидами. Если в данных условиях какие-то точки с конкретными генами не гибридизуются, это значит, что данный ген не транскрибируется. Если же данная точка микрочипа «светится», значит олигонуклеотиды на этой площадке прогибридизовались с флуоресцентно меченой кДНК, ген транскрибируется.

Чтобы определить, является ли полученный результат ошибкой или нет, проводится сравнение двух объектов. Для этого берут образец А (патология), из него получают суммарную РНК и после обратной транскрипции всех ее молекул флуоресцентно метят (красным) все молекулы кДНК. То же проводят и с образцом В (норма), но метят молекулы кДНК другим цветом (зеленым). Затем проводят гибридизацию ДНК-микрочипа со смесью этих двух препаратов кДНК (конкурентная гибридизация - преимущественно образуют гибриды те молекулы, которых больше). Если сигнал в данной точке на чипе будет красным, значит в клетках А (патология) транскрипция данного гена сильней, чем в клетках В (норма) . Если сигнал зеленый, то транскрипция сильнее в клетках В (норма). Если красного и зеленого поровну, то получится желтый цвет. Таким образом, можно сравнивать уровень транскрипции данного гена в разных тканях и органах, в биологических жидкостях при норме и патологии, до терапии и в ее процессе, до хирургической операции и после.

Протеомика плазмы крови.

Протеомика -- наука, основным предметом изучения которой являются белки и их взаимодействия в живых организмах, в том числе -- в человеческом.

Белки плазмы.

Белки плазмы - сложная смесь, включающая не только простые белки, но и смешанные или конъюгированные молекулы, например гликопротеины и различные типы литопротеинов.

Разделение сложной смеси белков на индивидуальные белки осуществляется при помощи растворителей и (или) электролитов; при этом выделяют различные белковые фракции в зависимости от их растворимости.

В плазме крови содержится 7% всех белков организма при концентрации 60 - 80 г/л. Белки плазмы крови выполняют множество функций. Одна из них заключается в поддержании осмотического давления, так как белки связывают воду и удерживают её в кровеносном русле.

Функции белков плазмы крови:

1.Белки плазмы образуют важнейшую буферную систему крови и поддерживают рН крови в пределах 7,37 - 7,43.

2.Альбумин, транстиретин, транскортин, трансферрин и некоторые другие белки (табл. 14-2) выполняют транспортную функцию.

3.Белки плазмы определяют вязкость крови и, следовательно, играют важную роль в гемодинамике кровеносной системы.

4.Белки плазмы крови являются резервом аминокислот для организма.

5.Иммуноглобулины, белки свёртывающей системы крови, б1-антитрипсин и белки системы комплемента осуществляют защитную функцию.

Содержание некоторых белков в плазме крови может резко увеличиваться при острых воспалительных процессах и некоторых других патологических состояниях (травмы, ожоги, инфаркт миокарда). Такие белки называют белками острой фазы, так как они принимают участие в развитии воспалительной реакции организма. Основной индуктор синтеза большинства белков острой фазы в гепатоцитах - полипептид интерлейкин-1, освобождающийся из мононуклеарных фагоцитов. К белкам острой фазы относят С-реактивный белок, называемый так, потому что он взаимодействует с С-полисахаридом пневмококков, б1-антитрипсин, гаптоглобин, кислый гликопротеин, фибриноген. Известно, что С-реактивный белок может стимулировать систему комплемента, и его концентрация в крови, например, при обострении ревматоидного артрита может возрастать в 30 раз по сравнению с нормой.

Альбумин.

Синтезируется в печени, и его единственная цепь состоит из 610 аминокислот. Молекула альбумина содержит много дикарбоновых аминокислот, поэтому может удерживать в крови катионы Са2+, Cu2+, Zn2+. Около 40% альбумина содержится в крови и остальные 60% в межклеточной жидкости, однако его концентрация в плазме выше, чем в межклеточной жидкости, поскольку объём последней превышает объём плазмы в 4 раза. Участвует в поддержании коллоидно-осмотического давления и служит молекулой-переносчиком. Транспортирует билирубин, жирные кислоты, многие лекарственные вещества и элементы, содержащиеся в плазме крови в следовых концентрациях.

При гипоальбуминемии осмотическое давление плазмы крови снижается. Это приводит к нарушению равновесия в распределении внеклеточной жидкости между сосудистым руслом и межклеточным пространством. Клинически это проявляется как отёк. Относительное снижение объёма плазмы крови сопровождается снижением почечного кровотока. Однако при недостатке альбумина, который должен удерживать Na+, другие катионы и воду, вода уходит в межклеточное пространство, усиливая отёки. Гипоальбуминемия может наблюдаться и в результате снижения синтеза альбуминов при заболеваниях печени (цирроз), при повышении проницаемости капилляров, при потерях белка из-за обширных ожогов или катаболических состояний (тяжёлый сепсис, злокачественные новообразования), при нефротическом синдроме, сопровождающемся альбуминурией, и голодании. Нарушения кровообращения, характеризующиеся замедлением кровотока, приводят к увеличению поступления альбумина в межклеточное пространство и появлению отёков. Быстрое увеличение проницаемости капилляров сопровождается резким уменьшением объёма крови, что приводит к падению АД и клинически проявляется как шок.

Транстиретин (преальбумин) называют тирок-синсвязывающим преальбумином. Это белок острой фазы. Транстиретин относят к фракции альбуминов, он имеет тетрамерную молекулу. Он способен присоединять в одном центре связывания ретинолсвязывающий белок, а в другом - до двух молекул тироксина и трийодтиронина.

Глобулины.

Глобулины - белки, нерастворимые в воде, но растворимые в растворах солей. Глобулярным белкам свойственна высокоупорядоченная пространственная структура (конформация), которая способствует выполнению специфических биологических функций. Глобулины сыворотки - гетерогенная сложная смесь белковых молекул, называемых alpha-, beta-, gamma-глобулинами (классификация основана на электрофоретической подвижности). Более рациональна классификация по структуре и функциях глобулинов.

Гликопротеины содержат ковалентно связанные фрагменты олигосахаридов. Эти белки обнаруживаются во фракциях alpha1- и alpha2-глобулинов. Среди гликопротеинов имеется много специализированных белков с функциями, которые изучены в различной степени.

Иммуноглобулины (антитела) выполняют роль эффекторов гуморальной иммуннной системы. Синтезируются b-лимфоцитами или образующимися из них плазматическими клетками. Антитела связываюстя с антигенными детерминантами других молекул. У млекопитающих выделяют пять классов антител -- IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, различающихся между собой по строению и аминокислотному составу тяжёлых цепей и по выполняемым эффекторным функциям.

Схема строения иммуноглобулина G: 1 - легкая цепь; 2 - тяжелая цепь; 3 - гипервариабельные участки; 4 - шарнирная область; 5 - остаток олигосахарида; 6 - N-концы; 7 - С-концы; VL и VH - соотв. вариабельные домены легкой и тяжелой цепей; CH1, CH2 и СH3 - постоянные домены тяжелой цепи; пунктиром обведены Fab- и Fc-фрагменты.

Все молекулы иммуноглобулинов состоят из двух идентичных легких (L) цепей (мол. масса 23 000) и двух идентичных тяжелых (H) цепей (мол. масса 53 000 - 75 000), образующих тетраметр (L2H2) при помощи дисульфидных связей.

При исследовании аминокислотной последовательности было обнаружено, что все легкие и тяжелые цепи имеют одну принципиальную структурную особенность: они состоят из двух частей -- вариабельной и константной. Вариабельные части легких цепей сильно отличаются друг от друга у всех исследованных иммуноглобулинов, а константные имеют близкую аминокислотную последовательность в пределах одного класса как легких, так и тяжелых цепей.

Каждая цепь может быть условно разделена на специфические домены, или области, имеющие определенное структурное и функциональное значение. Половину легкой цепи, включающую карбоксильный конец, называют константной областью (СL), а N-концевую половину легкой цепи - вариабельной областью (VL).

Примерно четвертую часть тяжелой цепи, включающую N-конец, относят к вариабельной области H-цепи (VN), остальные 3/4 ее длины - это константные области (Сh, Сh2, Сh3).Участок иммуноглобулина, связывающийся со специфическим антигеном, формируется N-концевыми вариабельными областями легких и тяжелых цепей, т.е. VL и VH-доменами. Эти домены формируют вторичные глобулярные образования с вторичной и третичной структурой, обеспечивающие эффективное связывание со специфическими антигенами.

Молекулы иммуноглобулинов связанные с поверхностью лимфоцитов, имеют дополнит. гидрофобные "хвосты" на С-концах тяжелых цепей, которые встроены в мембраны клеток. Пептидные цепи иммуноглобулинов и ряда белков клеточных мембран (антигены гистосовместимости, рецепторы для антигенов Т-лимфоцитов) по своей первичной структуре сходны между собой, что указывает на общее эволюционное происхождение всех этих белков.

Посредине тяжелых цепей иммуноглобулинов имеется шарнирная область с межцепьевыми дисульфидными связями (у IgG и IgA между первыми и вторыми доменами; на рис. 1 - между СН1 и СН2), длины которых неодинаковы у разных подклассов этих белков. Шарнирная область чувствительна к протеолитическим ферментам. При расщеплении ими (напр., папаином) иммуноглобулин распадается на два идентичных Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. Fab-Фрагмент слагается из четырех доменов. Два из них принадлежат легкой цепи, два других - N-концу тяжелой цепи. Fab-Фрагменты сохраняют способность к связыванию с антигеном.

Иммуноглобулин G.

Количество иммуноглобулинов G составляет около 70% всех сывороточных иммуноглобулинов.

Функции иммуноглобулинов G:

* проникают через плацентарный барьер, обеспечивая организму новорожденного естественный пассивный иммунитет;

* активно участвуют в развитии иммунного ответа и одновременно регулируют его;

* являются поздними антителами против полисахаридных антигенов бактерий;

* участвуют в активации комплемента;

* усиливают фагоцитоз.

Иммуноглобулины G вырабатываются при обязательном участии Т-лимфоцитов. Поэтому воздействия на иммунную систему, такие, как облучение и прием иммунодепрессантов подавляют синтез иммуноглобулинов G.

Иммуноглобулин М.

Составляют 5 -10% от общего количества.

Функции иммуноглобулинов М:

* первыми синтезируются в организме новорожденного;

* являются ранними антителами против вирусов и грамотрицательных бактерий;

* участвуют в активации комплемента;

* усиливают фагоцитоз.

К классу иммуноглобулинов М принадлежат холодовые агглютинины, антитела против стрептококка, ревматоидный фактор, агглютинины групп крови. Иммуноглобулины М привлекают фагоциты в очаг инфекции и активируют фагоцитоз. Являются слабоспецифичными, могут связывать одновременно пять молекул антигена. Это приводит к образованию больших иммунных комплексов, что способствует более быстрому выведению антигенов из циркуляции, и предотвращает прикрепление антигенов к клеткам. Агглютинирующая и комплементсвязывающая способности иммуноглобулинов М в сотни раз выше, чем у иммуноглобулинов G.

Иммуноглобулин А.

Составляют 10 -15% от общего количества.

Функции иммуноглобулинов А:

* защищают слизистые оболочки;

* нейтрализуют вирусы и бактериальные токсины.

Иммуноглобулины А в больших количествах содержатся в слюне, слезах, желудочном и кишечном секретах, желчи, во влагалище, легких, бронхах, мочеполовых путях. Богатым источником иммуноглобулина А является грудное молоко. Этим обеспечивается защита детей первых месяцев жизни при естественном вскармливании.

Иммуноглобулин Е.

Составляют около 0,2% от общего количества иммуноглобулинов.

Функции иммуноглобулинов Е:

* индуцируют аллергическую реакцию и анафилаксию;

* защищают от паразитов;

* активируют тканевые базофилы.

Иммуноглобулины Е защищают слизистые оболочки, контактирующие с окружающей средой.

Они прикрепляются к специфическим рецепторам поверхности тучных клеток и базофилов, и если происходит связывание с антигеном, то образуется комплекс, стимулирующий освобождение из клеток медиаторов аллергических реакций.

Иммуноглобулин D.

Составляют около 0,2% от общего количества иммуноглобулинов.

Функции иммуноглобулинов D:

* функционируют почти исключительно в качестве мембранных рецепторов для антигенов;

* участвуют в дифференцировке лимфоцитов.

б-Глобулины

Различают альфа-1 глобулины (б1-антитрипсин - ингибитор некоторых ферментов и б1-гликопротеид - участвующий в транспорте прогестерона и тестостерона); альфа-2 глобулины (б2-макроглобулин -- ингибитор ряда протеолитических ферментов, гаптоглобин - осуществляет транспорт гемоглобина, церулоплазмин - окисляет двухвалентное железо в трехвалентное) и наконец апопротеиды А, В и С, входящие в состав липопротеидов.

Содержание альфа-глобулинов в сыворотке крови может сильно меняться при различных патологических состояниях, поэтому наряду с другими фракциями белков измерение концентрации альфа глобулинов имеет большое диагностическое значение.

Норма альфа-1-глобулинов составляет 3-6%, или 1-3 г/л.

Среди альфа-1-глобулинов выделяют:

- альфа-1-антитрипсин;

- альфа-1-липопротеин;

- альфа-1-гликопротеин;

- альфа-1-фетопротеин;

альфа-1-антихимотрипсин.

Эти вещества также называют белками острой фазы: они вырабатываются в увеличенных количествах при различных повреждениях органов (химических или физических), при вирусных и бактериальных инфекциях. Они останавливают дальнейшее повреждение тканей и не дают размножаться патогенным микроорганизмам.

Уровень альфа-1-глобулинов повышается при:

- вирусной и бактериальной инфекции;

- остром и хроническом воспалении;

- злокачественной опухоли;

- повреждении кожи (ожоге, травме);

- отравлении;

- изменении гормонального фона (терапии стероидами, беременности);

- системной красной волчанке;

- повышении температуры тела;

- артрите;

- многоплодной беременности;

- пороках развития плода или его смерти.

Понижается уровень альфа-1-глобулинов при нарушении работы следующих органов:

-легких (эмфизема);

- печени (цирроз, рак);

- почек (нефротический синдром);

- яичек (рак) и при онкологии других органов.

Альфа-2-глобулины:

Их концентрация в норме составляет от 9 до 15% (6-10 г/л).

Среди альфа-2-глобулинов выделяют:

- альфа-2-макроглобулин;

- гаптоглобин;

- церулоплазмин;

- антиотензиноген;

- альфа-2-гликопротеин;

- альфа-2- HS-гликопротеин;

- альфа-2-антиплазмин;

- белок А.

Среди веществ данной группы есть белки острой фазы, а также транспортные белки.

Количество альфа-2-глобулинов увеличивается при:

- поражении печени (циррозе, гепатите);

- повреждении тканей (ожоге, травмах);

- воспалении;

- некрозе тканей (отмирании);

- злокачественных опухолях (с метастазами);

- эндокринных заболеваниях (сахарный диабет, микседема);

- изменении гормонального фона (лечении стероидными гормонами, беременности);

- желтухе;

- аутоиммунном заболевании;

- нарушении в работе почек (нефротический синдром).

Концентрация альфа-2-глобулинов может быть понижена при следующих условиях:

- недостаточном количестве белка в еде;

- ревматическом полиартрите;

- малокровии;

- заболеваниях желудочно-кишечного тракта;

- недостаточном питании;

- нарушении всасывания в кишечнике.

в-глобулины

При достаточном уровне бета-глобулинов их концентрация должна быть в пределах 8-18% (7-11 г/л).

В категории бета-глобулинов различают:

- гемопексин;

- трансферрин;

- стероид-связывающий бета-глобулин;

- бета и пребета-липопротеины.

Большинство бета-глобулинов -- это транспортные белки.

Бета-глобулины повышаются при:

- дефиците железа;

- приеме гормональных контрацептивов;

- беременности;

- сахарном диабете;

- дистрофии;

- повышенном уровне эстрогенов.

Причиной пониженного уровня бета-глобулинов могут служить:

- воспаление:

- злокачественная опухоль;

- малокровие;

- заболевание печени;

- недостаточное количество белка в пище;

- нефротический синдром;

- увеличенный уровень гормонов (тестостерона, пролактина, глюкокортикоидов);

- синдром недостаточной восприимчивости клеток к инсулину;

- нарушения в работе гипофиза;

- нарушения функций эндокринной системы.

Фибриноген - белок, вырабатываемый в печени и превращающийся в нерастворимый фибрин - основу сгустка при свертывании крови. Фибрин впоследствии образует тромб, завершая процесс свертывания крови. Фибриноген является ценным показателем гемостаза (коагулограмма). Анализ фибриногена - необходимый этап предоперационного обследования, пренатальной диагностики, проводится при воспалительных, сердечно-сосудистых заболеваниях. Содержание фибриногена в крови повышается при возникновении острых воспалительных заболеваний и отмирания тканей. Фибриноген влияет и на скорость оседания эритроцитов (СОЭ).

Норма фибриногена: 2-4 г/л.

Повышенный фибриноген в крови человека - симптом следующих заболеваний:

· острые воспалительные и инфекционные заболевания (грипп, туберкулез)

· инсульт

· инфаркт миокарда

· гипотиреоз

· амилоидоз

· пневмония

· злокачественные опухоли (рак легких и др.).

Повышение фибриногена сопровождает ожоги, операционные вмешательства, прием эстрогенов и оральных контрацептивов.

Нормальный уровень фибриногена снижается при таких заболеваниях, как:

· ДВС-синдром

· заболевания печени (гепатит, цирроз)

· токсикоз беременности

· недостаток витамина С и В12

· эмболия околоплодными водами (у новорожденных)

· хронический миелолейкоз

· полицитемия.

Уровень фибриногена понижается при отравлениях змеиным ядом, при приеме анаболических гормонов, андрогенов и рыбьего жира.

Размещено на Allbest.ru

...