Результати роботи відкривають перспективи пошуку антигіпоксантів нового типу в ряду похідних дикарбонових кислот.

Основний зміст роботи

реперфузія ішемія антиоксидантний гліколітичний

Матеріали та методи дослідження. Робота виконана на 914 білих нелінійних мишах-самцях масою 18-20 г., 862 білих нелінійних щурах-самцях масою 180-200 г. та 35 котах масою 2,5 кг. Усі експериментальні дослідження проводили із дотриманням Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 18.03.86). Всі маніпуляції, які викликали біль, проводили під етамінал-натрієвим наркозом (40 мг/кг маси тіла внутрішньоочеревинно) (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000), або під ефірним наркозом. Евтаназію проводили згідно правилам (Стефанов О.В. зі співавт., 2001). Для виключення впливу сезонних та добових коливань (Золотухин С.Е. и др., 1991) на показники, які вивчали, основні дослідження були проведені в осінньо-зимовий період у ранкові часи.

В роботі були використані наступні експериментальні моделі: гостра гіпоксична гіпоксія (Лукьянова Л.Д., 1990; Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000), гостра нормобарична гіпоксія (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000), гостра гемічна гіпоксія (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000), гістотоксична гіпоксія (Бармін Д.А., 1997; Лук'янова Л.Д., 1990), хронічна гемічна гіпоксія (Макушкін О.Е., 1979), хронічна дихальна гіпоксія, зумовлена запаленням, (Аникеева С.П., Ананенко А.А., 1976).

Стан периферичної крові визначали за стандартними гематологічними методами (Меньшиков В.В., 1987). на мікроскопі біологічному «Біолам» №787520, 2000 р. Кислотно-основний стан і газовий склад артеріальної і венозної крові вивчали за методом Astrup Р., 1955 на БМС-3МК-2 мікроаналізаторі кислотно-основної рівноваги фірми «Радіомер» (Копенгаген, Данія). За нормограмою Sіggaard-Andersen знаходили: рСО₂, мм. рт. ст.; рО₂, мм. рт. ст.; BE (Base Excess), моль/л; SB (Standard Bіcarbonate), моль/л; AB (Actual Bіcarbonate), моль/л; BB (Buffer Base), моль/л; tCO₂, мм. рт. ст.; HbО₂, %. Гостру регіональну ішемію міокарда викликали за методом R.B. Jennings (1996).

Діяльність серцево-судинної системи оцінювали за наступними показниками: артеріальний тиск (систолічний та діастолічний), мм рт. ст.; середній артеріальний тиск, мм рт. ст., частота серцевих скорочень (ЧСС), уд/хв; час систолічного викиду; час діастолічного розслаблення; ударний об'єм серця, мл; хвилинний об'єм серця, л/хв; індекс енергетичних затрат серця; робота серця, кг/м (Jennings R.B., Murry C.E., Remier K.A., 1996) і показники ЕКГ (електрокардіограф багатоканальний, модель ОВ) (Кечкер М.И., 1993). Для оцінки енергетичного обміну визначали вміст у міокарді макроергічних фосфатів (КФ, АТФ, АДФ, АМФ), у мкмоль/г вологої тканини. Обробку екстрактів проводили за допомогою наборів реактивів фірми «Мангайм» (Германія). Активність Са²⁺-АТФ-ази в мітохондріях серцевого м'яза визначали за методом Фалі (1963). Кількість білка визначали за методом Lowry O.H. et al. (1951).

Для оцінки системи перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) і активності ферментів антиоксидантного захисту використовували методи спектрофотометрії на двохпроменевому спектрофотометрі «Specord UV VIS» (Германія) і біохемілюмінесценції (БХЛ) на біохемілю-мінометрі медичному ХЛМ1У-01 (Гаврилов В.Б. та ін., 1987). У сироватці крові, міокарді й інкубаційних середовищах визначали вміст основ Шиффа (Flercher B.L. et al., 1973), дієнових і трієнових кон'югатів (ДК і ТК) (Леднев А.Н., Рууге Э.Е., 1985), малонового диальдегіду (МДА) (Patterson A., Lazarow A., 1955), активність супероксиддисмутази (СОД) (L'able P.W., 1990), каталази (L'able M.R., Ficher P.W., 1990). Визначення гідроперекисів ліпідів проводили спектрофотометричним методом (El-Saadani M., Esterbauer H. et al, 1989). Анти-радикальну активність тіазоліламідетану (ТАЕ) in vitro визначали за здатністю уловлювати гідроксильні (ОН) та супероксидні радикали (О₂) (Misra H.P., Fridovich I., 1972; Halliwel B. et al, 1987). Антиокислювальну активність ТАЕ in vitro визначали у модельній системі жов-точних ліпопротеїдів за його здатністю гальмувати накопичення ТБК-активних продуктів у порівнянні з іонолом (Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., 1999). Загальну анти-окислювальну активність (ЗАА) визначали інгібуванням окислення твіну-80 (Клебанов Г.И. и др., 1999) та хемілюмінометрично (Каган В.Е. та ін., 1986; Владимиров Ю.А. и соавт., 1991).

Ушкодження клітинних і субклітинних мембран оцінювали за виходом у кров і перфузат ферментів: цитохромоксидази (ЦХО) (Прохорова М.І., 1982), сукцинатдегід-рогенази (Сингер і Керні, 1957) і -кетоглутаратдегідрогенази мітохондрій (Бергмейер і Бернт, 1970). Вміст у біологічних рідинах і в тканині міокарда цАМФ і міоглобіну визначали радіоімунним методом з використанням комерційних наборів відповідно до інструкцій фірм-виготовлювачів. Математичну обробку результатів радіометрування проб проводили на ПЕОМ із використанням пакету прикладних програм «РІА» (ПО «Медапаратура», Україна).

Для оцінки вуглеводного обміну досліджували активність гліколізу, ферменти пентозо-фосфатного шляху (ПФШ) - глюкозо-6-фосфат-дегідрогеназу (Г-6-ФДГ) (Patterson A., Lazarow A., 1955), фосфорилазу (Bernt E., Bergmeyer H.U., 1970); для визначення вмісту пірувату використовували метод Цока та Лампрехта (1970) і лактату - метод Хохорста (Сокирко Т.А., Попова Э.М., 1978).

Електронно-мікроскопічні дослідження міокарда проведені методом ультратонких зрізів на мікротомі №2279, 2001 р. Зрізи забарвлювали уранілацетатом та цитратом свинцю та отримували робочі фотовідбитки при збільшенні х 14000.

При розробці схем комплексного лікування гострого інфаркту міокарда у щурів запозичили комплексні схеми лікування ургентних хворих кардіологічного профілю. Дози препаратів, які застосовуються в клініці, були перераховані для тварин за формулою Риболовлєва Ю.П. та співавт. (1981).

Для виконання поставлених задач в роботі застосовували антигіпоксанти широкого використання в практичній медицині (оксибутират натрію, емоксипін, мексидол, -токоферолу ацетат) та нову субстанцію ТАЕ - похідне етан - (етилен) - дикарбонової кислоти, синтезоване на кафедрі органічної хімії під керівництвом чл.-кор. НАН України, професора В.П. Черниха, яка проявила на етапі скринінгових досліджень виражену антигіпоксичну дію.

Гостру токсичність ТАЕ вивчали на двох видах тварин - мишах і щурах при внутрішньоочеревиному і внутрішньошлунковому шляхах уведення у вигляді водного розчину тонкодисперсної водної суспензії, стабілізованої твіном-80 (Коваленко В.М. та ін., 2001). Розрахунок гострої токсичності проводили за методом Кербера (Сернов Л.Н.,

Гацура В.В., 2000), оцінку токсичності - за загальноприйнятою класифікацією К.К. Сидорова (1973). Розрахунок ефективної дози ТАЕ проводили за методом Б.М. Штабського (1980). Антигіпоксичний індекс розраховували за співвідношенням DL₅₀/DE₅₀. Антиексудативну активність ТАЕ вивчали на моделі гострого карагенінового запалення, викликаного субплантарним введенням в одну з лапок миші 0,05 мл 1% розчину карагеніну

(Стефанов О.В. зі співавт., 2001). Анальгетичну активність досліджували на моделі «гарячої пластини» (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000). Діуретичну активність визначали за методом Е.Б. Берхина (1977). Антиаритмічну дію досліджували за Горчаковою Н.О. (2001).

Статистичну обробку отриманих результатів проводили методом математичної статистики з використанням t-критерію Ст'юдента. Математичні розрахунки біохімічних показників проводили користуючись комп'ютером IBM PC - III.

Результати досліджень та їх обговорення. Першим етапом наших досліджень стало вивчення патогенетичних механізмів розвитку гіпоксії серцевого м'язу в умовах гострої оклюзії коронарної артерії і функціонального стану міокарда за умов ішемії та реперфузії.

Порушення кровообігу міокарда є основним патогенним фактором розвитку ішемічної хвороби серця. Припинення ішемічного епізоду і початок репаративного процесу, згідно з даними літератури, завжди розцінювали як завершення дії на міокард ушкоджуючих факторів (Литвицкий П.Ф., 2002).

Разом з тим, у період інтенсивної розробки і впровадження в клініку хірургічних і медикаментозних засобів відновлення коронарного кровообігу нагромадилося досить фактів, які свідчать про порушення серцевої діяльності і кардіогемодинаміки не тільки в умовах гіпоксії, але і під час, і на ранньому етапі після відновлення перфузії міокарда

(Ольминская Л.И., Литвицкий П.Ф., 1986).

Оскільки більш, ніж 90% всієї енергії, що утворюється, витрачається серцем на механічну роботу в процесі скорочення, яке є його основною фізіологічною функцією, оцінка механічної функції серця (ЧСС, сили серцевих скорочень, роботи серця) і швидкості споживання кисню дозволяє з великою точністю характеризувати ефективність процесів енергоутворення в серцевому м'язі (Меерсон Ф.З., 1984; 2001).

З огляду на наведені факти, найбільш перспективним є пошук засобів, які нормалізують внутрішньомембранний метаболізм і енергетичне забезпечення клітин міокар-ду і, як наслідок, стабілізують основні показники кардіогемодинаміки (Литвицкий П.Ф., Демуров Е.А., 1993). У зв'язку з цим, вивчення показників кардіогемодинаміки не тільки при ішемії, але і при реперфузії, а також на фоні введення антигіпоксантів дозволяє розкрити основні механізми порушень функцій серця в цих умовах.

Нами встановлено, що гостра коронарна оклюзія викликала виражені зміни ЕКГ. Вже в перші 30 хв після оклюзії знижувалася ЧСС з 179,811,0 уд/хв у контролі до 95,17,6 уд/хв, а через годину розвивалася брадикардія, яка продовжувала зростати й у наступну годину спостереження. Через 2 год після оклюзії ЧСС склала 68,87,4 уд/хв. Такі ж виражені зміни ми спостерігали і за іншими показниками: зменшувався час проведення збудження від передсердь до шлуночків (PQ) - 125,96,0 мс до 62,02,1 мс; після розвитку гострої регіональної ішемії міокарда різко скорочувався час проведення збудження по міокарду шлуночків - 53,82,4 мс на початку експерименту до 30,01,2 наприкінці (Р 0,05); порушувалася провідність міокарду: час електричної систоли скорочувався з 278,211,2 мс на початку оклюзії до 200,214,0 через 2 год.

Зміни електрофізіологічної активності серця пов'язані з дефіцитом кисню і субстратів метаболізму, які виникають при перев'язці коронарної артерії (Кресюн В.И. и др., 1998). Наслідком дефіциту кисню і субстратів метаболізму є гальмування тканинного дихання і порушення енергетичного забезпечення кардіоміоцитів.

Наступним етапом експерименту стало дослідження показників кардіогемодинаміки при гострій ішемії і реперфузії. Гостра миттєва перев'язка коронарної артерії викликала прогресуюче зниження всіх показників діяльності серця, які реєстрували. Так, через 10 хв після оклюзії систолічний артеріальний тиск знизився з 108,0 ±1,3 мм рт. ст. до 89,0±1,2 мм рт. ст. (Р < 0,05), хвилинний об'єм серця зменшився до 0,27±0,01 л/хв, показники роботи сер-ця погіршилися на 27%. ЧСС у перші 10 хв ішемії міокарда трохи збільшувалася, а потім зменшувалася і на 90-й хв була на 15,5% нижчою за фонову. Систолічний тиск і ударний об'єм на 40-й і 90-й хв ішемії міокарда продовжували прогресивно знижуватися і були нижче фонових на 30 і 12% відповідно. Аналогічним чином змінювалися показники хвилинного об'єму, роботи серця й індексу енергетичних витрат. Так, на 90-й хв ішемії міокарда вони знизилися в порівнянні з фоном на 23%, 45% і 44% відповідно. Як видно, зміни показників кардіогемодинаміки при ішемії міокарда мають односпрямований характер і узгоджуються з даними літератури (Меерсон Ф.З., 1984; Медведев О.С. и др., 1989; Литвицкий П.Ф., 2002).

Динаміка показників серцевої діяльності при реперфузії міокарда різна в залежності від тривалості попередньої ішемії. Так, при реперфузії після 10 хв ішемії міокарду відмічалося зниження показника ЧСС, який склав 89% від «ішемічного» і 93% від фонового. Надалі ЧСС у періоді реперфузії після 40 і 90 хв ішемії міокарду продовжувала знижуватися і через 1,5 години була на 35% нижчою за фонову.

Систолічний артеріальний тиск у період реперфузії після 10 хв ішемії міокарда підвищився до 109±1,3 мм рт. ст., і вже на 40-й і 90-й хв ішемії міокарду в період реперфузії мав чітку тенденцію до зниження, і, в остаточному підсумку, був на 22% нижчим за фон. Ударний і хвилинний об'єми на 90-й хв ішемії міокарда в періоді реперфузії знизилися на 12,7%, робота серця і індекс енергетичних витрат - на 47 і 12% відповідно в порівнянні з фоном. Таким чином, дані експерименту свідчать про те, що в період реперфузії після 10 хв ішемії міокарду показники кардіогемодинаміки мають тенденцію до стабілізації. Але вже на 40-й і 90-й хв ішемії міокарда в період реперфузії функція серцевого м'яза була значно гіршою за доішемічний рівень. Показники кардіогемодинаміки мали тенденцію до зниження. Так, на 90-й хвилині ішемії міокарда в період реперфузії ЧСС складала 316±11,0 уд/хв, тоді як у тварин, яким не вводили препарати, - 280±12,0 уд/хв, ударний і хвилинний об'єми перевищували зазначені показники у тварин, яким не вводили препарати, на 40 і 25%. Показники роботи серця й індексу енергетичних витрат також були стабілізовані.

Таким чином, проведені дослідження показали, що різка дестабілізація показників кардіогемодинаміки відбувається не тільки при збільшенні ішемічного періоду, але і під час відновлення перфузії міокарду.

Оскільки основною задачею дослідження є патогенетичне обґрунтування застосування антигіпоксантів-коректорів енергетичного обміну в комплексній терапії гострого інфаркту міокарда нами для подальшої роботи були використані відомі антигіпоксанти, що широко використовуються в медичній практиці, такі як оксибутират натрію, мексидол, емоксипін, -токоферолу ацетат та нова субстанція - похідне дикарбонових кислот, синтезована на кафедрі органічної хімії під керівництвом чл.-кор. НАН України професора В.П. Черниха та умовно названа тіазоліламідетан (ТАЕ).

Нами показано, що ТАЕ при профілактичному введенні (за годину до початку експерименту) і при введенні його відразу після оклюзії сприяв нормалізації показників ЕКГ, як при профілактичному, так і при лікувальному введенні. Однак, більш істотний вплив він виявляв при профілактичному введенні.

Введення ТАЕ за 1 год до оклюзії сприяло тому, що проведення збуджень від передсердь до шлуночків (PQ) після операції не суттєво відрізнялося від норми (127,06,8 уд/хв - інтактний контроль + ТАЕ і 119,86,2 уд/хв - оклюзія і 60 хв після введення ТАЕ). Оклюзія без введення ТАЕ вже через 30 хв викликала грубі порушення усіх показників ЕКГ. Профілактичне введення ТАЕ сприяло наближенню показників QRS і QT до норми. Нормалізація діяльності провідникової системи серця під впливом ТАЕ свідчила про відновлення енергетичного забезпечення кардіоміоцитів.

Згідно з даними літератури, до основних патогенетичних механізмів розвитку зазначеного стану міокарда слід віднести: зниження кальційтранспортуючої функції мембран саркоплазматичного ретикулума, зменшення запасів аденіннуклеотидів у кардіоміоцитах, зменшення вмісту катехоламінів в міокарді (Гацура В.В., 1993; Литвицкий П.Ф., 2002).

У зв'язку з цим, наступним етапом експерименту стало дослідження зміни АТФ-азної активності та вмісту аденінових нуклеотидів в серцевому м'язі щурів і котів при гострому інфаркті міокарда. Встановлено, що при гострій оклюзії коронарної артерії вже в першу годину знижується вміст усіх трьох аденінових нуклеотидів і Са²⁺-залежна АТФ-азна активність міозину серцевого м'язу поза зоною некрозу. Наші результати узгоджуються з даними літератури (Куприянов В.В., Лакомкин В.А. и др., 1986; Маколкин В.И., 2000). Пояснюється це тим, що навантаження на «здорові» ділянки серцевого м'яза підвищується і, як наслідок, зростає утилізація енергії на одиницю м'язової тканини (Меерсон Ф.З., 1984). У цих умовах потрібно забезпечити посилення процесів енергоутворення для підтримки основної функції серцевого м'яза - скорочення - на досить високому рівні.

Суттєвий інтерес становить стан метаболізму серцевого м'яза в умовах гострої ішемії, що може у подальшому бути відправним пунктом для пошуку речовин, які володіють антигіпоксичною, антиоксидантною та енергозберігаючою дією. Проведені дослідження показали, що гостра оклюзія коронарної артерії викликає чіткі зсуви в енергетичному обміні міокарду. З даних рис. видно, що вже через 10 хв гострої ішемії активність цитохромоксидази (ЦХО) знижувалася. Поглиблення ступеня ішемії приводило до ще більшого інгібування цього ферменту, який втратив 60% своєї вихідної активності. Оклюзія протягом 30 та 60 хв супроводжувалася пригніченням таких окислювально-відновних ферментів, як сукцинатдегідрогеназа, до 60% вихідного рівня.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Динаміка окислювальних процесів у зоні гострої ішемії міокарда при гострій оклюзії коронарної артерії під впливом мексидолу.

А - без введення препарату; Б - при введенні мексидолу

Відомо, що ферменти дихального ланцюга і дегідрогенази циклу Кребса багато в чому визначають інтенсивність аеробного окислювання - основного шляху утворення енергії (Калинский М.И. и др., 1999).

У зв'язку з цим було важливо дослідити динаміку вмісту АТФ та її метаболітів. Як видно з рис., виражені зміни концентрації АТФ виникали лише при оклюзії протягом 30 хв.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вміст компонентів аденілової системи у зоні гострої ішемії міокарду при гострій оклюзії коронарної артерії і введенні мексидолу

А - без введення препаратів; Б - при введенні мексидолу

Одночасно зі зменшенням рівня АТФ виявлено накопичення продуктів його розпаду - АДФ і АМФ, проте загальний вміст аденіннуклеотидів не змінювався. Про інтенсивний розпад АТФ свідчило не тільки накопичення продуктів його дефосфорилювання, але і підвищення рівня цАМФ - у 4 рази при гострій ішемії протягом 30 хв і, особливо, протягом 120 хв. Наведені дані свідчать про те, що при інфаркті міокарда активізувався невластивий нормальній тканині шлях перетворення АТФ - з утворенням цАМФ. Змінювався також і подальший обмін продуктів розпаду АТФ, зокрема АМФ.

Виявивши певні зсуви в аеробному шляху енергоутворення і у співвідношенні компонентів аденінової системи, важливо було вивчити стан іншого можливого шляху генерації енергії - анаеробного гліколізу. Отримані дані свідчать про значні зміни в анаеробному метаболізмі міокарда.

Мексидол і ГОМК при гострій оклюзії коронарної артерії протягом 30 та 120 хв оклюзії значно покращують енергетичні процеси у міокарді. Особливо це проявляється активацією ферментів ПФШ. Так, активність Г-6-ФДГ підвищувалася у 2 рази в порівнянні з контролем і практично досягала рівня у інтактних щурів до 120-ї хв оклюзії.

У зоні ішемії на 10-й хв оклюзії помірно знижувався вміст глікогену, активізувалися гліколіз, фосфорилаза та підвищувався рівень молочної кислоти. При підвищенні ступеня ішемії (на 30-й хв) виявлені зсуви наростали, що виражалося в зменшенні на 1/3 вмісту глікогену, підвищенні фосфорилази, накопиченні молочної кислоти. При гострій ішемії протягом 60 хв у зоні ішемії відбувалося подальше підвищення інтенсивності гліколізу, активності фосфорилази та вмісту молочної кислоти. Разом з тим, рівень глікогену не тільки не знижувався в порівнянні з контролем, але в деяких дослідах перевищував останній. При гострій ішемії міокарда змінювався й інший шлях обміну вуглеводів - ПФШ, тісно пов'язаний з гліколізом низкою загальних метаболітів. Так, у зоні інфаркту міокарда (гостра ішемія протягом 120 хв) підвищилася активність Г-6-ФДГ, досягши максимуму (400%) в порівнянні з контролем. У той же час активність транскетолази підвищувалася не значно.

При чіткому підвищенні активності ферменту окислювальних реакцій - Г-6-ФДГ - залишалася на вихідному рівні активність транскетолази - ланки реакцій, які лімітують ПФШ. ПФШ, як відомо, бере активну участь в акцептуванні водневих іонів і в синтезі РНК (Калинский М.И. и др., 1999) і, безсумнівно, має значення в адаптації міокарда до ішемії.

Таким чином, проведені дослідження показали, що оклюзія коронарної артерії супроводжувалася вираженими зсувами процесів енергоутворення в міокарді. Найбільш чутливою при цьому виявилася аеробна ланка енергообміну, про що свідчило гальмування активності ЦХО вже при оклюзії коронарної артерії протягом 10 хв. При підвищенні часу ішемії міокарда приєднувалися зрушення в активності ферментів циклу Кребса - сукцинат-дегідрогенази та -кетоглутаратдегідрогенази. З даних літератури відомо, що гальмування активності окислювально-відновних ферментів знижує інтенсивність споживання серцем кисню і, виходячи з цього, приводить до пригнічення аеробного шляху генерації енергії (Гацура В.В., 1993; Cannon C.E., Zmith S.C., 1999). Отримані нами дані разом з тим показали, що, незважаючи на пригнічення аеробного окислювання, рівень АТФ залишається досить високим при початковому ступені ішемії і знижується на 40% лише при подальшому збільшенні часу ішемії міокарда. Отже, динаміка вмісту АТФ не підлягала прямій лінійній залежності від ступеня ішемії у серцевому м'язі. Очевидно, стабільний рівень АТФ залежить від швидкого споживання глюкози міокарда. Цьому сприяє значне підвищення концентрації цАМФ - могутнього регулятора гліколізу в міокарді. Впливаючи на кіназу фосфорилази, цАМФ каталізує перетворення неактивної форми фосфорилази в активну, що приводить до розпаду глікогену в міокарді та утворення додаткової кількості «гліколітичної» АТФ

(Гацура В.В., 1993). Слід відзначити, що, незважаючи на високу активність гліколізу, вміст глікогену в міокарді змінювався при гострій оклюзії коронарної артерії незначно або залишався в межах нормальних значень. Очевидно, це пов'язано з тим, що цАМФ пригнічує глікогенсинтетази і подальший синтез глікогену не підсилюється.

Наступним етапом експерименту стало вивчення впливу мексидолу і оксибутирату натрію на зміни показників вуглеводного обміну при ішемії і інфаркті міокарда. Результати дослідів показали, що при оклюзії протягом 30 хв і, особливо, протягом 120 хв мексидол і ГОМК у 2-2,5 разів зменшували вміст молочної кислоти - 4,120,4 мг/% у контролі і 2,520,16 мг/% після 120 хв оклюзії під впливом мексидолу та 2,400,41 мг/% після 120 хв оклюзії під впливом ГОМК. Кращі показники отримані при введені ГОМК: рівень молочної кислоти знизився з 6,220,4 мг/% на момент оклюзії до 2,400,41 мг/% у кінці експерименту. Препарати підвищували активність цитохромоксидази, сукцинатдегідрогенази і -кетоглутаратдегідрогенази. Однак, найбільш наочно дія препаратів проявилася на активність ферментів ПФШ.

Таким чином, компенсація нестачі кисневого забезпечення серцевого м'яза регулюється включенням механізмів за участю цАМФ, аденозину і ПФШ. Активацію ПФШ слід розглядати як найважливіший компенсаторний механізм, який бере участь в адаптації міокарда до ішемічної гіпоксії. Мексидол та оксибутират натрію значно нормалізують процеси енергоутворення у міокарді за рахунок активації ПФШ, що підтверджує значну роль ПФШ у адаптації міокарда до гіпоксії.

Оскільки зміни енергетичного обміну у серцевому м'язі та механізми дії антигіпоксантів в цих умовах - ключове питання даної роботи, ми провели серію експериментів з виявлення змін енергетичного обміну при гострої та хронічної дихальної гіпоксії у щурів та дослідження кардіопротекторних властивостей мексидолу, оксибутирату натрію, емоксипіну, -токоферолу ацетату та ТАЕ. Однак, для доведення нешкідливості дослідженої субстанції та її участі в енергетичному обміні нами були проведені дослідження з визначення гострої токсичності (ЛД50) і ефективній дозі (ЕД50) ТАЕ.

Аналіз експериментальних даних показав, що середньосмертельна доза ТАЕ (LD₅₀) при внутрішньоочеревинному введенні щурам дорівнює 1583,3 мг/кг, при внутрішньошлунковому введенні ЛД₅₀ ТАЕ у щурів і мишей встановити не вдалося. Такі результати дозволяють віднести ТАЕ до практично нетоксичних речовин, або V класу токсичності (Сидоров К.К., 1973; Березовская И.В. и др., 2002). ED₅₀ ТАЕ становить 18,6 мг/кг маси.

При дослідженні фармакологічних ефектів ТАЕ нами встановлено, що він має анти-гіпоксичну, антиоксидантну, антирадикальну, антиексудативну, анальгезуючу, діуретичну, антиаритмічну дії. Крім того, в хронічному експерименті встановлено, що ТАЕ не проявляє гонадотропної, ембріотоксичної дії та не впливає на репродуктивну функцію. Зазначене вище дозволяє розглядати його в якості потенційно перспективного препарату для лікування серцево-судинних захворювань та різного виду гіпоксій.

Найближчим аналогом за структурою та дією до ТАЕ був обраний мексидол, тому, що за хімічною структурою, згідно з даними літератури (Кузнецов Н.А. и др., 2003), мексидол є похідним 3-оксипіридину, містить сіль етан - (етилен) - дикарбонової кислоти (сукцинат) та відноситься до групи синтетичних антигіпоксантів. Мексидол має широкий спектр фармакологічної активності (антигіпоксичну, антиоксидантну, протиішемічну та ін.), ефективний при різних видах гіпоксії, і, завдяки своїм механізмам дії і широкому спектру фармакологічних ефектів, впливає на основні ланки патогенезу різних захворювань, пов'язаних із процесами вільно-радикального окислення і киснезалежними патологічними станами. Тому його застосовують при гострих порушеннях мозкового кровообігу, дисциркуляторній енцефалопатії, вегетосудинній дистонії, атеросклеротичних порушеннях функцій мозку, при інших станах, які супроводжуються гіпоксією тканини (Лукьянова Л.Д., 1990; Кузнецов Н.А. и др., 2003).

LD₅₀ мексидолу при внутрішньошлунковому введенні щурам становить 4944,4 мг/кг;

ДЕ₅₀ = 140 мг/кг; при внутрішньоочеревинному введенні ЛД₅₀ = 405 мг/кг; ЕД₅₀ = 100 мг/кг. Таким чином, встановлено, що мексидол поступається за токсичністю та ефективною дозою ТАЕ. Антигіпоксичний індекс, який характеризує широту терапевтичної дії, у ТАЕ у 29,4 разів більший, ніж у мексидолу.

При подальшому дослідженні ТАЕ виявив антигіпоксичні властивості на всіх використаних моделях гострих гіпоксій. Ефективність ТАЕ була вищою за мексидол при гістотоксичній гіпоксії - 26,62,1 хв і 22,41,9 хв відповідно та при гемічній гіпоксії - 21,022,3 хв і 18,62,1 хв відповідно.

При хронічній гіпоксії ТАЕ також виявив виражені антигіпоксичні властивості, більші, ніж у ГОМКу. Так, на 10-ту добу хронічної гемічної гіпоксії кількість еритроцитів під впливом ТАЕ і ГОМКу значно збільшувалася - 8,090,20х10¹²Т/л і 7,340,42х10¹²/л відповідно по відношенню до контролю - 6,150,68х10¹²Т/л. На 10-ту добу хронічної дихальної гіпоксії під впливом ТАЕ та ГОМКу знижувалися показники молочної кислоти та піровиноградної кислот: 1,490,16 ммоль/л і 105,8212,22 мкмоль/л (ТАЕ) та 1,520,17 ммоль/л і 107,6214,53 мкмоль/л (ГОМК) відповідно по відношенню до контролю: молочна кислота - 1,620,06 ммоль/л, піровиногдна кислота - 108,3719,87 мкмоль/л.

Це дозволило встановити, що антигіпоксична активність ТАЕ зумовлена здатністю стабілізувати клітинні мембрани, поліпшувати постачання кисню тканинам та зменшувати чутливість тканин до його нестачі, оптимізувати тканинне дихання в умовах кисневого дефі-циту, нейтралізувати продукти метаболічного ацидозу, посилювати гемоглобіноутворювання і збільшувати кількість еритроцитів у крові. Крім того, ТАЕ зберігає високими артеріовенозний градієнт оксигемоглобіну та парціальний тиск кисню в артеріальній крові на фоні помірної напруги компенсаторних механізмів.

Зазначене вище стало підставою для вивчення ТАЕ та з'ясування механізмів його дії, поряд з антигіпоксантами, що широко використовуються в медичній практиці. Передусім, була проведена порівняльна оцінка участі антигіпоксантів, які були взяті для вивчення, в енергетичному та гліколітичному обміні міокардіоцитів на моделі гострої гіпоксичної гіпоксії у щурів.

Це дослідження здійснювалося з метою з'ясування енергозберігаючих властивостей у мексидолу, оксибутирату натрію, емоксипіну, -токоферола ацетату та ТАЕ. При гострій гіпоксичній гіпоксії препарати і ТАЕ вводили внутрішньоочеревинно за 30 хв до підйому в барокамері (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000) в ED₅₀: мексидол - 100 мг/кг, оксибутират натрію - 200 мг/кг, емоксипін - 600 мг/кг, -токоферолу ацетат - 300 мг/кг, ТАЕ - 18,6 мг/кг. Ці дози забезпечували максимальне виживання щурів при критичній гіпоксії. Контрольним тваринам вводили в рівному об'ємі 0,9% розчин NaCl (табл. 1).

В контрольній групі, у групі тварин, яким не вводили препарати, а також у групі тварин, яким вводили емоксипін та -токоферолу ацетат, при підйомі на висоту 8000 м загинули всі тварини. Попереднє введення щурам мексидолу, оксибутирату натрію та ТАЕ в ефективних дозах підвищувало резистентність тварин до гострої гіпоксії (див. табл. 1).

Вивчення метаболізму в серці після 30 хв перебування на висоті 8000 м показало, що гостра гіпоксія викликала в серці односпрямовані зміни всіх показників. Відзначали зниження вмісту в міокарді глікогену, креатинфосфату та АТФ, збільшення вмісту глюкози і лактату. Активація гліколізу в перші хвилини гіпоксії і виникнення енергетичного дефіциту супроводжувалися посиленням процесів ПОЛ на фоні підвищення активності СОД і каталази.

Таблиця 1. Вплив ТАЕ, мексидолу, оксибутирату натрію, емоксипіну та -токоферола ацетату на процеси перекисного окислення ліпідів та активність антиоксидантних ферментів в серці щурів при гострій гіпоксичній гіпоксії (Мm)

Примітки:

1. * - в порівнянні з контролем, Р 0,05;

2. ** - в порівняні з гіпоксією без лікування, Р 0,05.

Оксибутират натрію, мексидол і ТАЕ в ефективних дозах коригували порушення метаболізму в серцевому м'язі: вміст глікогену в міокарді був вищим (мексидол - 6,410,70 мг/г, ГОМК - 6,350,62 мг/г, ТАЕ - 6,220,58 мг/г) в порівнянні з контролем (4,040,69 мг/г), а концентрація лактату - нижчою (мексидол - 4,380,49 ммоль/л, ТАЕ - 4,340,42 ммоль/л, ГОМК - 4,350,43 ммоль/л), ніж у контрольній групі (4,660,20 ммоль/л). Високим виявився вміст креатинфосфату в серці. Практично однакове підвищення концентрації глюкози в серці щурів дослідних груп в порівнянні з контрольною, поряд зі зменшенням концентрації лактату, свідчили про можливість активації препаратами процесу глюконеогенезу. Уведення тваринам препаратів гальмувало активацію процесів ПОЛ при гіпоксії. При цьому вміст малонового диальдегіду і гідроперекисів ліпідів підвищувався в меншому ступені в порівнянні з відповідними контрольними величинами (вірогідно чи у вигляді тенденції). Мексидол, оксибутират натрію і ТАЕ перешкоджали також зниженню активності СОД і сприяли нормалізації активності каталази.

Вплив ТАЕ на тканинне дихання зводиться до ранньої активації процесів гліколізу в перші хвилини гіпоксії, за рахунок чого гальмується утворення надлишку молочної кислоти. Стимулююча дія ТАЕ на тканинне дихання аналогічна дії ГОМК.

Встановлена різна ефективність впливу препаратів на гліколітичний обмін у міокарді в умовах гострої та хронічної гіпоксії: якщо мексидол, оксибутират натрію та ТАЕ поліпшували гліколітичний обмін у міокарді, то емоксипін і -токоферолу ацетат були практично неефективними.

Таким чином, попереднє введення щурам оксибутирату натрію, мексидолу і ТАЕ підвищувало резистентність серця до нестачі кисню, перешкоджало розвитку глибоких порушень енергетичного обміну, вираженого ацидозу, пригнічувало активацію процесів ПОЛ, перешкоджаючи тим самим ушкодженню мембранних структур, зберігаючи цілісність клітини і підтримання її функції. Отримані дані свідчили про те, що мексидол, оксибутират натрію і ТАЕ викликали ефекти, характерні для нормалізації мітохондріального окисного фосфорилювання (Кузнецов Н.А. и др., 2003). Отже, їх можна віднести до антигіпоксантів-коректорів енергетичного обміну.

Для більш повної та докладної інтерпретації результатів ми проведи експерименти з інтактними, оперованими тваринами без оклюзії коронарної артерії та тваринами, у яких був викликаний гострий інфаркт міокарда.

У щурів з тяжким інфарктом міокарду маса зони некрозу складала 29,82,0% від маси всього серця. Загальна смертність серед цих тварин становила 59,16,7%, причому найбільше щурів (44,75,4%) загинули протягом першої години після операції. Процент загиблих тварин розраховували з числа тих щурів, які залишалися живими протягом однієї години після коронарооклюзії. Як видно з табл. 2, мексидол, ГОМК та ТАЕ у середньому у 2,2 разів зменшували смертність від інфаркту міокарда і у 2,2 разів - його величину. Емоксипін і -токоферолу ацетат зменшували зону інфаркту на 12,4% і 14% відповідно, однак, на загибель щурів це практично не вплинуло.

При дослідженні макроергів через 3 год коронарооклюзії відзначена глибока деградація (майже в 3 рази) кожного з них в порівнянні з інтактними щурами і в 2 рази в порівнянні з контролем, та загального нуклеотидного пулу. Вміст суми аденінових макроергів у оперованих щурів без оклюзії був знижений (5,770,14 мкмоль на 1 г вологої тканини у інтактних тварин і 5,440,14 мкмоль на 1 г вологої тканини у оперованих щурів без оклюзії), але не настільки, щоб констатувати порушення обміну макроергів.

Сума аденінових нуклеотидів при гострому інфаркті (3 год оклюзії коронарної артерії) становила 1,920,7 мкмоль на 1 г вологої тканини проти 5,440,14 мкмоль на 1 г вологої тканини у щурів без оклюзії, тобто зменшувалася в 2,8 разів. Введення емоксипіну та -токоферолу ацетату не поліпшувало показників АТФ та АДФ, а рівень АМФ навіть знижувався на 10% відносно контролю.

Примітка: * - Р 0,05 відносно контролю.

Під дією оксибутирату натрію, мексидолу і ТАЕ зниження вмісту АТФ та АМФ було на 22-25% меншим, ніж у контролі. Рівень АДФ не змінювався, мабуть тому, що він є головним джерелом ресинтезу АТФ і АМФ. Загальний пул нуклеотидів при введенні оксибутирату натрію і мексидолу був вищим, ніж у контролі, у 1,8 разів.