Корекція процесів синтезу глутатіону для стабілізації прогресування вікової катаракти

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА «ІНСТИТУТ ОЧНИХ ХВОРОБ І ТКАНИННОЇ ТЕРАПІЇ ім. В.П. ФІЛАТОВА АМН УКРАЇНИ»

УДК 617.741-004.1-053.9-07+577.11-085

КОРЕКЦІЯ ПРОЦЕСІВ СИНТЕЗУ ГЛУТАТІОНУ ДЛЯ СТАБІЛІЗАЦІЇ ПРОГРЕСУВАННЯ ВІКОВОЇ КАТАРАКТИ

14.01.18 - Офтальмологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

НАБІЛЬ АСЛАМ

ОДЕСА - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в ДУ «Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України».

Науковий керівник: доктор медичних наук, старший науковий співробітник ПУТІЄНКО Олексій Олексійович, ДУ «Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України», старший науковий співробітник відділу вітреоретинальної і лазерної хірургії

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, старший науковий співробітник ДРОЖЖИНА Галина Іванівна, ДУ «Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України», керівник відділу патології рогівки

доктор медичних наук, доцент МОГІЛЕВСЬКИЙ Сергій Юрійович, Донецький державний медичний університет, професор кафедри очних хвороб

Захист відбудеться ” 23 ” квітня 2010 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.556.01 в ДУ «Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України» за адресою: 65061, м. Одеса, Французький бульвар, 49/51.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ «Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України» (65061, Україна, м. Одеса, Французький бульвар, 49/51).

Автореферат розісланий ” 22 ” березня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук, професор І.П. Метеліцина



АНОТАЦІЯ

Набиль Аслам. Корекція процесів синтезу глутатіону для стабілізації прогресування вікової катаракти. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.18 - офтальмологія. - ДУ «Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В. П. Филатова АМН України», Одеса, 2010.

Дисертація присвячена актуальному питанню офтальмології - можливості стабілізації прогресування вікової катаракти на основі отримання нових наукових даних про процеси синтеза глутатіону. В експерименті показано, що причиною зниження рівня цієї речовини в кришталику є низький рівень амінокислот-попередників, а також знижена активність ферментів його синтезу. Клінічні дослідження підтвердили експериментальні дані, виявивши істотне зниження рівня вільних амінокислот-попередників глутатіону в крові, камерній волозі і кришталику, а також зниження активності ферментів біосинтезу глутатіону. Розроблений спосіб лікування вікової катаракти, застосування якого дозволило досягти стабілізації прогресування помутнінь кришталика протягом 2 років спостереження у 80 хворих, що складає 94,1% обстежених осіб і зберегти гостроту зору 0,85-1,0 у 81% хворих. глутатіон катаракта амінокислота

Ключові слова: вікова катаракта, амінокислоти-попередники глутатіону, ферменти біосинтезу глутатіону, спосіб лікування вікової катаракти.



АННОТАЦИЯ

Набиль Аслам. Коррекция процессов синтеза глутатиона для стабилизации прогрессирования возрастной катаракты. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.18 - офтальмология. - ГУ «Институт глазных болезней и тканевой терапии им. В.П. Филатова АМН Украины», Одесса, 2010.

Диссертация посвящена актуальному вопросу офтальмологии - возможности стабилизации прогрессирования возрастной катаракты, на основе получения новых научных данных об особенностях процессов синтеза глутатиона при этой патологии.

При моделировании световой катаракты у кроликов через 18 недель воздействия было обнаружено снижение уровня глутамата до 31,6%, глицина до 33,9% и цистеина до 25,7% относительно контроля. В камерной влаге уровень указанных аминокислот был понижен до 63,4%, 83,0% и 45,0%, соответственно по отношению к норме. В период 45-недельного воздействия выявлено повышение содержания аминокислот в изучаемых тканях за исключением цистеина, содержание которого в хрусталике и камерной влаге оставалось сниженным по отношению к контролю (47,2% и 70,0%, соответственно). Изучение действия перорального применения аминокислот-предшественников глутатиона на развитие патологических изменений в хрусталиках показало, что достоверно выраженное влияние на этот процесс оказывает только препарат цистеин. Результаты исследования процесса синтеза глутатиона в хрусталиках кроликов, подвергнутых облучению в течение 45 недель позволили заключить, что активность г-глутамилцистеинсинтетазы оказывается сниженной на 56,0% (р=0,001), а активность глутатионсинтетазы снижалась на 68,0 % (р=0,001).

Таким образом, длительное световое воздействие вызывает резкое снижение процессов синтеза глутатиона из аминокислот-предшественников, а также приводит к снижению активности ферментов его синтеза.

Проведенные клинические исследования позволили заключить, что наиболее низкий уровень глутамата отмечается в хрусталиках со смешанной формой катаракты, его содержание снижено до 74 % по сравнению с нормой при р<0,0001. При субкапсулярной форме катаракты уровень этого соединения составляет 79,0 % (р<0,0001), и при ядерной форме катаракты - не отличается от нормы. Наиболее значительное снижение глицина отмечается при смешанной и ядерной формах катаракт, составляя 40,0% и 53,3% (р<0,0001) по отношению к норме, соответственно. Уровень цистеина более снижен при смешанной форме катаракты и составлял 64,0% (р<0,0001), а при субкапсулярной и ядерной формах катаракты составлял 84,0% и 88,0% по отношению к норме, соответственно.

Исследование уровня аминокислот-предшественников глутатиона в хрусталиках при быстром и медленном прогрессировании катаракты показало, что концентрация всех трех изучаемых соединений достоверно ниже при ее быстром прогрессировании. При этом наиболее выраженные отличия отмечаются в уровне цистеина у пациентов с быстропрогрессирующей катарактой по сравнению с медленным течением этого заболевания.

Исследование уровня аминокислот-предшественников глутатиона в камерной влаге показало, что наиболее выраженные изменения касались аминокислоты цистеина: при субкапсулярной и смешанной формах катаракты его уровень снижался на 67,6% и 68,0% (р<0,0001) соответственно по отношению к норме.

Проведенные исследования уровня изучаемых аминокислот в камерной влаге больных при быстром и медленном прогрессировании катаракты не выявили достоверных отличий.

Исследование концентрации аминокислот-предшественников глутатиона в крови больных показало, что уровень глутаминовой кислоты снижен при всех трех формах катаракты, наиболее значительное снижение отмечается при субкапсулярной и смешанной формах помутнений на 20,0% и 22,0% соответственно (р<0,0001). Уровень глицина также снижен, наиболее выражено при субкапсулярной и смешанной катарактах на 25,0% и 22,0% (р<0,0001). Исследование уровня цистеина также выявило достоверное снижение его концентрации при всех трех формах помутнений.

Изучение активности ферментов синтеза глутатиона в хрусталике показало, что активность г-глутамилцистеинсинтетазы при смешанной катаракте составляет всего 27,6% по отношению к норме, при субкапсулярной - 33,3%, а при ядерной - 40%. Активность фермента заключительной стадии биосинтеза глутатиона - глутатионсинтетазы также резко снижена, ее показатели составляют при смешанной форме катаракты 16,5 %, при субкапсулярной - 22,3 %, а при ядерной - 36,2 % по отношению к норме. Сравнение активности г-глутамилцистеинсинтетазы и глутатионсинтетазы не выявило достоверных отличий в зависимости от скорости развития катаракты.

Таким образом, проведенные исследования обнаружили существенное снижение уровня трех аминокислот-предшественников глутатиона в крови, в камерной влаге и хрусталике, а также снижение уровня активности ферментов биосинтеза глутатиона в хрусталике, что свидетельствует о важной патогенетической роли этих соединений в развитии возрастной катаракты.

Предложен новый способ стабилизации прогрессирования возрастной катаракты, заключающийся в применении глазных капель, содержащих цистеин 3 раза в сутки на фоне приема препарата «Ацетилцистеин лонг» на протяжении 6 месяцев по 200 мг 2 раза в сутки после еды (патент Украины

№ 35408 А). Применение разработанного способа позволило сохранить остроту зрения 0,85-1,0 у 81% больных в течение 2 лет наблюдения, что в 1,6 раза больше, чем у лиц контрольной группы.

Ключевые слова: возрастная катаракта, аминокислоты-предшественники глутатиона, ферменты биосинтеза глутатиона, способ лечения возрастной катаракты.



ANNOTATION

Nabil Aslam. Correction of processes of glutathione synthesis for stabilization of progressing of the age-related cataract . - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 14.01.18 - Ophthalmology. -State Institution «The Filatov Institute of Eye Diseases and Tissue Therapy Academy of Medical Sciences of Ukraine», Odesa, 2010.

Dissertation is devoted to important question of ophthalmology - elaboration the method of stabilization of the age-related cataract progression on the basis of new scientific data about the glutathione synthesis. Experimental investigations showed, that the low level of this metabolite in the lens connected with a decreased level of its amino acid - precursors, and also decreased activity of enzymes of its synthesis . Clinical researches were confirmed by experimental data, it was revealed considerably decreased level of free amino acid-precursors of glutathione in blood, anterior chamber fluid and lens and also low activity of enzymes of biosynthesis of this metabolite. The method of treatment of the age-related cataract which was proposed, allowed to obtain stability of age-related cataract development during 2 years follow up at 80 patients (94,1% persons) and stabilized visual acuity 0,85-1,0 at 81% of patients during 2 years follow up.

Keywords: age-related cataract, amino acid-precursor of glutathione, enzymes of glutathione biosynthesis, method of age-related cataract treatment.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вікова катаракта є однією з основних причин зниження зору і сліпоти. Кількість незрячих внаслідок цього захворювання постійно збільшується. Це пов'язано, передусім, із збільшенням тривалості життя, оскільки частота захворюваності катарактою подвоюється з кожним десятиліттям після 40 років (Крыжановская Т. В., 2002; Риков С. О., 2003; Мальцев Э. В., 2004; Taylor H., Keeffe J. E., 2001; Knudtson M. D., Klein B. E., Clein R., 2005).

Катаракту можливо усунути хірургічним шляхом. При цьому хірургічне видалення помутнілого кришталика і заміна його штучною лінзою не вирішують повністю проблему інвалідності та професійних обмежень при цій патології, тому є актуальним питання профілактики вікової катаракти і можливості стабілізації процесу на ранніх стадіях її розвитку. Якщо вдасться уповільнити появу вікової катаракти на 10 років, борючись з чинниками виникнення її ризику, то необхідність хірургічного лікування може знизитися наполовину (Веселовская З. Ф., Боброва Н.Ф., Вит В. В., 2002; Полунин Г. С., Полунина Е. Г., Шеремет Н.Л., 2003; Delcourt C., Carriere I., 2000).

Запропоновані до теперішнього часу препарати, що спрямовані на стабілізацію білкових компонентів кришталика, не досягають істотного терапевтичного ефекту в клініці. Цей парадокс може бути обумовлений двома моментами: багатокомпонентністю механізмів захисту і стабілізації кришталика і великою кількістю чинників, що ушкоджують його в процесі життєдіяльності. Порушення рівноваги між функціональним станом захисних систем і дією чинників, що пошкоджують, призводить до розвитку патологічного процесу в кришталику (Леус Н. Ф., 1985; Воскресенская Л. К., 1993; Balasubramanian D., 2000).

Накопичені до теперішнього часу дані експериментального і клінічного характеру дозволяють припустити, що значна роль в підтриманні стабільності структур кришталика належить адекватному амінокислотному забезпеченню метаболічних і біофізичних процесів, які у ньому відбуваються. Отримані раніше дані переконливо свідчать про те, що при віковій катаракті спостерігається зниження активності ферментів амінокислотного обміну як в кришталику, так і в крові хворих (Путиенко А. А., 1994; Kwock L., Lin P. S., Ciborovski L., 1981; Yamada K., 1999).

Одна з найважливіших функцій амінокислот (гліцину, глутамату, цистеїну) в кришталику полягає у використанні їх для біосинтезу глутатіону, який є головним компонентом, що забезпечує нативність волокон кришталику, захищаючи білкові і ліпопротеїдні компоненти мембран від вільно-радикального ушкодження, а також бере участь в їх регенерації (Virgolici B., Popescu L.,2006).

Завдяки дослідженням, проведеним в ДУ "Інститут ОХ і ТТ ім. В. П. Філатова АМН України" в останні два десятиліття, значною мірою розкрита роль окислювально-відновної системи глутатіону в катарактогенезі. Зокрема, доведено, що недостатня метаболічна забезпеченість рибофлавіном глутатіонредуктази стала чинником ризику, а порушення детоксікаційної функції глутатіону пов'язане із швидкістю розвитку патологічних змін в кришталику при початковій катаракті (Леус Н. Ф., 1980; Дрожжина Г. И., 1991; Кравченко Л. И., 2004; Леус Н. Ф., Метелицына И. П., Олейник Т. В., 1995). Виявлена також роль пірідоксальфосфату - головного кофермента амінокислотного обміну в стабільності структур кришталика в умовах дії катарактогенних чинників (Путиенко А. А., 1994).

У той же час залишається нез'ясованим стан метаболізму амінокислот - попередників глутатіону при розвитку вікової катаракти, відсутні дані про дію катарактогенних чинників на транспорт і обмін цих амінокислот, а також на активність ферментів синтезу цієї сполуки.

В цілому усе вищесказане свідчить про необхідність вивчення ролі амінокислот-попередників глутатіону в катарактогенезі і визначенні можливості їх застосування в комплексній медикаментозній терапії вікової катаракти.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною науково-дослідної роботи, яка зареєстрована в ДУ «Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В. П. Філатова АМН України» «Обгрунтувати доцільність метаболічної корекції порушень окремих ланок патогенезу при дистрофічних та запальних захворюваннях органу зору», 2007-2009 рр. (шифр теми 112А/03,

№ держреєстрації 0107U002648), де дисертант був співвиконавцем.

Мета дослідження: підвищення ефективності лікування хворих віковою катарактою шляхом корекції рівня вільних амінокислот-попередників глутатіону на підставі отримання нових наукових даних про роль цих сполук в катарактогенезі.

Завдання дослідження:

1. Дослідити спрямованість і вираженість змін рівня вільних амінокислот - попередників глутатіону (цистеїну, глутамату і гліцину) і активність ферментів його синтезу (г-глутамілцистеїнсинтетази і глутатіонсинтетази) в кришталику і камерній волозі при розвитку експериментальної світлової катаракти.

2. Виявити наявність зв'язку між рівнем вільних амінокислот (цистеїну, глутамату і гліцину) в кришталику та камерній волозі і швидкістю розвитку патологічних змін в кришталику на моделі світлової катаракти.

3. Визначити рівень вільних амінокислот-попередників глутатіону в кришталику, камерній волозі і крові хворих з різними клінічними формами і швидкістю прогресування вікової катаракти.

4. Вивчити особливості змін активності ферментів синтезу глутатіону в кришталиках хворих з різними клінічними формами і швидкістю прогресування вікової катаракти.

5. Розробити новий спосіб стабілізації прогресу вікових помутнінь кришталика на основі корекції рівня вільних амінокислот- попередників глутатіону і визначити його ефективність.

Об'єкт дослідження: вікова катаракта.

Предмет дослідження: зміна рівня вільних амінокислот - попередників глутатіону (цистеїну, глутамату і гліцину) і активності ферментів його синтезу (г-глутамілцистеїнсинтетази і глутатіонсинтетази) в кришталику і камерній волозі в динаміці розвитку світлової катаракти. Зміна концентрації вільних амінокислот-попередників глутатіону і активності ферментів його синтезу в кришталику, камерній волозі і крові хворих з різними клінічними формами і швидкістю прогресування вікової катаракти.

Методи дослідження: загальноклінічні; офтальмологічні: візометрія, біомікроскопія, офтальмоскопія, тонометрія; біохімічні: визначення рівня цистеїну, глутамату, гліцину, а також активності ферментів г-глутамілцистеїнсинтетази і глутатіонсинтетази; статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показано, що опромінення кришталиків світлом високої інтенсивності призводить до зниження рівня глутатіону в кришталику внаслідок зниження активності ферментів його синтезу in vitro на 28%, а in vivo (у термін 45 тижнів моделювання світлової катаракти) - на 62%.

Доповнено наукові дані про механізми розвитку експериментальної світлової катаракти, які полягають в тому, що на ранньому терміні дії (18 тижнів) порушуються процеси транспорту амінокислот-попередників глутатіону в кришталик, що проявляється зниженням їх рівня на 70%, а в остаточний термін формування (45 тижнів) ключовим катарактогенним чинником є низький рівень цистеїну, що складає 41,2% по відношенню до норми.

Доповнено наукові дані про протекторну дію цистеїну на процес розвитку світлової катаракти, які підтверджуються відсутністю кришталиків з вираженою мірою помутнінь в термін дії 30 тижнів і відсутністю кришталиків з найбільш розвинутою стадією помутнінь в остаточному - 45 тижневому терміні спостереження.

Вперше показано, що зниження рівня глутатіону в кришталиках хворих при субкапсулярній і змішаній формах вікової катаракти відбувається внаслідок зниження активності ферментів його синтезу - г-глутамілцистеїнсинтетази на 31% і глутатіонсинтетази на 20% по відношенню до норми.

Доповнені наукові дані про механізми прогресування вікової катаракти, що полягають в більш вираженому зниженні рівня амінокислот-попередників глутатіону в кришталику при швидкому прогресуванні помутнінь на 15% порівняно з повільним перебігом захворювання.

Практичне значення отриманих результатів. Запропоновано новий спосіб стабілізації прогресування вікової катаракти, що полягає в застосуванні очних крапель, які містять цистеїн, 3 рази на добу на фоні прийому препарату «Ацетилцистеїн лонг» упродовж 6 місяців по 200 міліграм 2 рази на добу після їжі (патент України № 35408 А).

Застосування розробленого способу лікування дозволило зберегти гостроту зору 0,85-1,0 у 81% хворих, що в 1,6 разів більше, ніж у осіб контрольної групи.

Впровадження результатів в практику. Методологічні аспекти отриманих результатів впроваджено в роботу лабораторії біохімії ДУ «Інститут ОХ і ТТ ім. В. П. Філатова АМН України». Запропонований спосіб лікування впроваджено у відділі мікрохірургії катаракти ДУ «Інститут ОХ і ТТ ім. В. П. Філатова АМН України».

Особистий внесок здобувача. Автором спільно з науковим керівником д.мед. н., ст. наук. співробітником О.О. Путієнком запропонована ідея дослідження. Самостійно проведений пошук і аналіз наукової літератури з проблеми вікової катаракти. Аспірант обстежував і проводив спостереження в динаміці за 134 хворими з віковою катарактою. Дисертант спільно із співробітниками лабораторії біохімії ДУ «Інститут ОХ і ТТ ім. В. П. Філатова АМН України» проводив моделювання світлової катаракти в різних умовах експерименту і виконував біохімічні дослідження: визначення рівня вільних амінокислот-попередників глутатіону. Статистична обробка отриманих даних здійснювалася за участю наукового співробітника Драгомирецької О.І. Аспірант спільно з керівником брав участь у формулюванні наукових положень і висновків, підготував друкарські роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались і обговорювались на 5 міжнародній конференції офтальмологів країн Причорномор'я (Одеса, 2007), на міжнародній науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження академіка Н.О. Пучківської (Одеса, 2008), на засіданні Одеського обласного товариства офтальмологів (Одеса, 2008), на міжнародній науковій конференції «Філатовські читання» (Одеса, 2009), на засіданні Вченої ради ДУ «Інститут ОХ і ТТ ім. В. П. Філатова АМН України» (Одеса, 2009).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 друкарських робіт, з них 4 статті в наукових виданнях, затверджених ВАК України, отримано 1 патент України на винахід, 3 роботи опубліковано в матеріалах наукових конференцій.

Об'єм і структура дисертації. Дисертація викладена російською мовою на 167 сторінках. Складається зі вступу, огляду літератури, розділу «Матеріал і методи досліджень», двох розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел. Ілюстрована 31 таблицею і 33 малюнками, які розміщені по тексту. Список літератури містить 257 джерел, розташований на 26 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи досліджень. Експериментальні дослідження були проведені на 70 кролях породи Шиншила вагою 1,8-2,5 кг, які знаходились в стандартних умовах віварію. У першій серії досліджень (вивчення стану обміну вільних амінокислот-попередників глутатіону в кришталику і камерній волозі) було використано 27 кролів (54 ока). Тварини були поділені на 3 групи: 1 - контрольна (9 тварин, 18 очей) і дві дослідні (по 9 кролів в кожній, 36 очей). В дослідних групах катаракту моделювали шляхом опромінення тварин світлом високої інтенсивності дуговою ртутною лампою типу ДРФ-1000 (1000 Вт) в спектральному діапазоні від 350 до 1150 нм щодня в режимі світлового дня протягом 9 годин (Леус М. Ф., Метеліцина І. П., Дрожжина Г. І. та ін. Патент України № 20178 "Спосіб моделювання променевої катаракти", 1997). Тварин першої групи опромінювали протягом 18 тижнів, а тварини другої групи - протягом 45 тижнів.

У другій серії досліджень (вивчення перорального застосування амінокислот-попередників глутатіону в процесі моделювання світлової катаракти) використовували 43 кроля. Тварини були поділені на 4 групи. I група - світлова дія - 11 кролів (22 ока), II група - світлова дія на тлі прийому гліцину - 11 кролів (22 ока), III група - світлова дія на тлі прийому глутамату - 11 кролів (22 ока) і IV група - світлова дія на тлі прийому цистеїну - 10 кролів (11 очей). Тварини усіх груп опромінювалися протягом 45 тижнів.

Упродовж експерименту стан кришталиків оцінювали за допомогою біомікроскопії з використанням щілинної лампи фірми "Карл Цейсс", підрозділяючи виявлені зміни на 5 стадій (Путиенко А.А., 1994; Bhat K.S.,1986 ).

Для досліджень in vitro використовували ізольовані очі кролів (всього 28 очей). Гомогенати кришталиків готували на фізіологічному розчині відносно 1:9 за допомогою гомогенізатора Поттера-Ельвейема: проміжок між товкачиком і посудиною гомогенізатора 0,16-0,24 мм, час гомогенізації 90 с. Для роботи використовували як надосадну рідину, отриману в результаті центрифугування гомогенату при 1100 g протягом 10 хвилин на центрифузі К-24, так і ресуспендований осад кришталика. Опромінення гомогенатів виконували поліхромним світлом (350-1150 нм) дугової ртутно-вольфрамової лампи ДРФ-1000 в кварцевих пробірках протягом 3 годин при температурі 0 - +4°С при постійному перемішуванні гомогенату. Контрольні проби знаходилися в темному місці протягом 3 годин при температурі 0 - +4°С.

Глутамінову кислоту визначали ензиматичним методом з використанням глутаматдегідрогенази за реакцією окислення глутамату з утворенням відновленої форми коферменту і визначенням приросту екстинкції на спектрофотометрі при довжині хвилі 340 нм. Кількість глутамату еквімолярна кількості відновленого нікотинамідного коферменту. Коефіцієнт варіації - 3,0 % (Bergmeyer H. U., 1984).

Зміст гліцину визначали за допомогою специфічного мікрометоду. Гліцин перетворюється за участю нінгідріну у формальдегід, який потім визначали за реакцією з хромотропною кислотою на спектрофотометрі при довжині хвилі

575 нм. Коефіцієнт варіації - 4,0 % (Blackburn S.,1975).

Про рівень цистеїну судили за різницею між загальним змістом вільних тіолових з'єднань, які визначали за допомогою реактиву Елмана і концентрації вільної форми глутатіону, яку визначали ензиматичним методом з використанням гліоксалази. Коефіцієнт варіації - 5,0 % (Bergmeyer H. U., 1984; Balcerczyk A., 2003).

Активність г-глутамілцистеїнсинтетази визначали в супернатантах гомогенату кришталика за допомогою ензиматичного аналізу у присутності піруваткінази і лактатдегідрогенази, а також за наявності в реакційному розчині аденозинтрифосфорної кислоти, відновленого нікотинамідного коферменту, глутамату, цистеїну і фосфоенолпірувату. Коефіцієнт варіації - 5,0 % (Bergmeyer H. U., 1984; Rathbun W. B., Murray D. L.,1991).

Активність глутатіонсинтетази визначали на спектрофотометрі за спадом в інкубаційному середовищі енергетичного еквіваленту аденозинтрифосфорної кислоти, яку визначали за допомогою методу ензиматичного аналізу. Коефіцієнт варіації 6,0% (Bergmeyer H. U., 1984; Rathbun W. B., 1984; Rathbun W. B.,1986).

Клініко-біохімічне дослідження було виконано у 116 хворих віковою катарактою. Пацієнти з ядерною формою катаракти - 38 (38 очей), субкапсулярною формою - 35 (35 очей), а також пацієнти із змішаними формами помутнінь (ядерно-корково-субкапсулярними) - 43 (43 ока). У 68 пацієнтів була катаракта, що швидко розвивається (розвиток помутнінь протягом двох років спостереження), а у 79 - катаракта, що розвивається повільно (розвиток помутнінь протягом більш, ніж двох років спостереження). Контрольну групу складали 18 чоловік, яким була виконана енуклеація очей з приводу меланоми увеального тракту.

Основну групу пацієнтів, у яких застосовувався розроблений спосіб лікування, склали 85 хворих з початковою віковою катарактою, контрольну - 62. Вихідний клінічний стан очей по локалізації помутнінь кришталика в двох групах достовірно не відрізнявся. В обох групах переважали хворі зі змішаною формою помутнінь, в основній - 52 хворих (61,2%), в контрольній - 40 (64,6%)

Пацієнти основної групи отримували 2 курси лікування з інтервалом в 6 місяців. В контрольній групі пацієнтам закапували краплі вітайодуролу по 1 краплі 3 рази в день упродовж всього періоду спостереження. Ефективність лікування оцінювали за гостротою зору та ступенем прогресування помутнінь кришталика за даними біомікроскопії.

Загальний термін спостережень в обох групах склав 2 роки. За цей період хворі оглядалися двічі.

Отримані дані оброблялися за допомогою параметричних і непараметричних методів статистики з використанням статистичного пакету SPSS 11.0. При обчисленні непараметричних даних використовувався метод для незалежних вибірок Мана-Уітні, а для множинних порівнянь - метод Крускала-Уоліса. Для статистичної обробки параметричних даних використовувалися методи описової статистики з обчисленням коефіцієнта Ст'юдента.

Результати і їх обговорення. Роль амінокислот-попередників глутатіону в розвитку експериментальної катаракти. Через 18 тижнів світлової дії 25 % кришталиків залишалися інтактними, в інших випадках були відмічені початкові ознаки формування катаракти (1 стадія).

Відносні показники рівня амінокислот-попередників глутатіону в кришталику і камерній волозі кролів за цей термін представлені на малюнках 1 і 2. Дані свідчать про різке зниження в кришталику вмісту глутамату, гліцину і цистеїну в цей період до 31,4%, 33,9% і 25,7%, відповідно.

В цей же час в камерній волозі рівень вказаних амінокислот знижений до 63,4%, 83,0% і 45% відповідно.

Порівняння рівня вільних амінокислот в кришталику і камерній волозі дає змогу вважати, що при опроміненні тварин поліхромним світлом найбільш виражено порушуються процеси транспорту амінокислот в кришталик, на відміну від транспортних процесів в бар'єрі кров - передньокамерна волога.

В період 45 тижнів опромінення більш, ніж в 80 % очей кролів другої групи відзначалися патологічні зміни в кришталиках, характерні для 3-ої - 5-ої стадій розвитку помутнінь кришталика. При цьому рівень амінокислот в кришталику і камерній волозі за цей період свідчив про помітне підвищення їх змісту в тканинах, що вивчалися, в порівнянні з періодом 18-тижневої світлової дії.

Таким чином, через 45 тижнів дії концентрація глутамату в кришталику істотно не відрізнялася від контрольних величин, а показники рівня інших амінокислот в камерній волозі і кришталику достовірно перевищували контрольні значення, за винятком цистеїну, зміст якого в кришталику і камерній волозі залишався пониженим по відношенню до контролю (47,2 % і 70 %, відповідно).

У механізмі змін рівня вільних амінокислот, що спостергіалися в кінцевий термін дії катарактогенного чинника, ймовірно, провідну роль відігравала активація протеолітичних ферментів в кришталику, що призводить до збільшення пулу амінокислот за рахунок деградації білкових молекул.

В цілому, аналіз отриманих даних дозволяє заключити, що в початкові періоди розвитку світлової катаракти доцільне застосування амінокислот-попередників глутатіону з метою підвищення рівня цього трипептиду в кришталиках. Це сприятиме підвищенню стійкості компонентів кришталику до дії катарактогенних чинників.

Отримані нами результати досліджень по вивченню впливу перорального застосування амінокислот-попередників глутатіону на розвиток патологічних змін в кришталиках при моделюванні світлової катаракти.

За представленими даними, видно, що вже на 30-му тижні експерименту застосування цистеїну призводило до достовірно вираженого зменшення кількості кришталиків з 3 і 4 стадією помутнінь в порівнянні з контрольною групою (р=0,014).

Найбільш виражена дія цистеїну відзначалася після 45 тижнів світлової дії, коли в контрольній групі було відмічено помутніння 5-ої стадії в трьох кришталиках, а в групі з цистеїном така стадія помутнінь не була відмічена ні в одному з кришталиків (р = 0,007).

Вивчення активності ферментів г-глутамілцистеїнсинтетази і глутатіонсинтетази при опроміненні гомогенатів кришталиків показало, що активність ферменту першої стадії синтезу глутатіону - г-глутамілцистеїн- синтетази в цих умовах знижується на 33 % (р = 0,001), тоді як активність ферменту завершальної стадії - глутатіонсинтетази знижена на 22 %

(р = 0,006). Таким чином, фермент г-глутамілцистеїнсинтетаза є чутливішим до світлової дії в порівнянні з глутатіонсинтетазою. Ця обставина може бути обумовлена особливостями структур цих ферментів.

Результати дослідження процесів біосинтезу глутатіона в кришталиках кролів через 45 тижнів опромінення показали, що активність г-глутамілцистеїнсинтетази знижена на 56% (р = 0,001), а глутатіонсинтетази - на 68 % (р = 0,001) в порівнянні з контролем.

Ця обставина разом зі зниженням рівня цистеїну в кришталиках після 18-тижневого і 45-тижневого строку опромінень розкриває механізми зниження рівня глутатіону в кришталиках при тривалій світловій дії і може розглядатися як найважливіша ланка механізму катарактогенної дії світлової енергії.

Рівень амінокислот-попередників і активність ферментів синтезу глутатіона в кришталиках хворих з різними клінічними формами вікової катаракти. Визначення концентрації глутамінової кислоти в кришталиках хворих віковою катарактою показали, що найбільш низький рівень цієї сполуки відмічається в кришталиках із змішаною формою катаракти. Її зміст понижений до 74% (р < 0,0001) в порівнянні з контролем. При субкапсулярній формі помутнінь рівень глутамінової кислоти знижується до 79 % (р < 0,0001), а при локалізації помутнінь в ядрі кришталика істотно не змінюється.

При швидкому розвитку катаракти рівень цього метаболіту в кришталиках значно нижчий: так при змішаній формі він складає 67,7% (р = 0,013), а при субкапсулярній - 74 % (р = 0,013). Ці дані свідчать про те, що швидкий розвиток вікової катаракти супроводжується більш вираженим порушенням транспорту глутамінової кислоти в кришталиках.

Дослідження змісту гліцину виявило найбільш значне зниження цієї сполуки в кришталиках хворих при змішаній і ядерній формах катаракт, що складає 40% і 53,3% по відношенню до норми відповідно.

Порівнюючи концентрації цієї амінокислоти в кришталиках хворих із швидким і повільним розвитком катаракти, необхідно відмітити нижчі показники при швидкому темпі перебігу захворювання (36,7 % - при змішаній формі і 46,7% - при ядерній формі катаракти).

Дані по визначенню рівня цистеїну в катарактальних кришталиках дозволили зробити висновок, що рівень цього метаболіту більш за все знижений при змішаній формі катаракти і складає 64 % (р < 0,0001), а при субкапсулярній і ядерній формах катаракт його рівень складає 84% і 88 % по відношенню до норми, відповідно.

Найцікавіші дані були отримані при вивченні змісту цистеїну при різних клінічних формах катаракти залежно від швидкості її розвитку. Так, повільний розвиток ядерної катаракти взагалі не призводив до достовірної зміни рівня цистеїну в кришталиках хворих. Найбільш різке зниження (до 56%) відзначалося при швидкому розвитку змішаної форми катаракти. При субкапсулярній формі катаракти також рівень цистеїну був істотно нижче при швидкому розвитку захворювання в порівнянні з повільним розвитком - 72% і 80 % по відношенню до норми, відповідно.

Результати дослідження змісту амінокислот-попередників глутатіону в камерній волозі виявили, що найнижчий зміст глутамінової кислоти відзначається при змішаній формі катаракти і складає 42,7% (р<0,0001). При субкапсулярній і ядерній формах катаракт вміст цієї амінокислоти складає 54,3% і 72,3%, відповідно відносно норми (р<0,0001).

Порівняння даних при швидкій і повільній формах вікової катаракти показало, що найбільш значні відмінності відзначаються тільки при змішаній формі катаракти, коли рівень глутамату складає при повільній формі 46,6 %, а при швидкій - 38,5 % (р = 0,004).

Найбільш низький рівень гліцину в камерній волозі відмічено при субкапсулярній формі катаракти, коли його рівень знижується до 76,7% (р<0,0001) відносно норми.

Зіставлення даних концентрації гліцину при швидкому і повільному темпі захворювання істотних відмінностей не виявило.

При дослідженні змісту цистеїну в камерній волозі хворих віковою катарактою найбільш суттєве зниження відзначалося при субкапсулярній і змішаній формах катаракти - 67,6% і 68,0% по відношенню до норми, відповідно.

Порівняння даних змісту цистеїну в камерній волозі при швидкій і повільній швидкості розвитку захворювання відмінностей не виявило.

Дані за визначенням концентрації амінокислот-попередників глутатіону в плазмі крові хворих віковою катарактою свідчили про те, що рівень глутамінової кислоти понижений в крові хворих при всіх трьох формах катаракти, найбільш вагоме зниження відзначається при субкапсулярній і змішаній формах помутнінь: на 20% і 22% відповідно (р<0,0001). Рівень гліцину також понижений, що найбільш виражено, при субкапсулярній і змішаній катарактах на: 25% і 22% (р<0,0001). Дослідження рівня цистеїну також виявило достовірне зниження його концентрації при всіх трьох формах помутнінь. Так у хворих ядерною катарактою вміст цієї сполуки був знижений на 19,5% (р<0,001), при субкапсулярній на - 21,5% (р<0,001), а при змішаній катаракті на - 18,5% (р<0,05) .

З метою визначення метаболізму амінокислот-попередників глутатіону в кришталиках хворих віковою катарактою були вивчені процеси синтезу глутатіону з вказаних амінокислот. Дослідження показали, що активність ферментів, що синтезують діпептиди і трипептиди з амінокислот-попередників в кришталиках хворих віковою катарактою різко знижена. Найбільш значне зменшення відзначається у хворих із змішаною і субкапсулярною формою вікової катаракти. Так, активність г-глутамілцистеїнсинтетази при змішаній катаракті складає всього 27,6 % в порівнянні з нормою, при субкапсулярній - 33,3 %, а при ядерній - 40,0%.

Активність ферменту завершальної стадії біосинтезу глутатіону - глутатіонсинтетази також різко знижена, її показники складають при змішаній формі катаракти 16,5%, при субкапсулярній - 22,3%, а при ядерній - 36,2% по відношенню до норми.

Аналіз показників активності ферментів синтезу глутатіона залежно від швидкості розвитку патологічного процесу в кришталиках показує, що при швидкому прогресуванні розвитку захворювання найсильніше понижена активність г-глутамілцистеїнсинтетази і глутатіонсинтетази у хворих із змішаною формою катаракти, їх відносна величина складає при цьому 20% і 14,8% по відношенню до норми відповідно. Така ж закономірність, тільки у меншій мірі, характерна для субкапсулярної форми катаракти, при швидкому розвитку якої активність ферменту г-глутамілцистеїнсинтетази складає 26,7%, а глутатіонсинтетази - 21,1%.

Таким чином, зіставляючи дані відносно концентрації амінокислот-попередників глутатіону в кришталику і активності ферментів біосинтезу цієї сполуки, можна вважати, що основою різкого зниження рівня глутатіону в кришталиках при розвитку катарактального процесу є порушення транспорту і синтезу глутатіону при цьому захворюванні.

На основі проведення експериментальних досліджень, що виявили найбільш виражений антикатарактальний ефект цистеїну, був розроблений новий спосіб лікування вікової катаракти. Спосіб полягає в застосуванні очних крапель, що містять цистеїн по 1 краплі 3 рази в день на тлі прийому препарату «Ацетилцистеїн лонг» по 200 міліграм 2 рази на добу після їжі упродовж 6 місяців (Пат. № 35408 А Україна, 2009).

Як видно з представлених даних, у хворих основної групи, спостерігалась тенденція до зниження гостроти зору в процесі спостереження, при цьому достовірних відмінностей по цьому показнику як через 1 рік, так і через 2 роки після лікування виявлено не було, що також підтверджувалося даними біомікроскопії.

Отже, використання запропонованого способу лікування дозволило добитися стабілізації процесу прогресу катаракти протягом 2 років спостереження в цій групі у 80 хворих, що складає 94,1%.

У пацієнтів контрольної групи динаміка гостроти зору свідчила про прогресування помутнінь. Через рік спостереження зниження гостроти зору не було достовірним, при цьому через 2 роки посилення помутнінь привело до достовірного погіршення зорових функцій.

Порівняння гостроти зору у пацієнтів основної і контрольної групи в термін 2 роки показало, що гострота зору 0,85-1,0 зберіглася у 80,7% хворих основної групи, при цьому в контрольній групі така гострота зору була відмічена тільки у 52,4% пацієнтів.

Таким чином, проведені дослідження виявили істотні порушення в процесах синтеза глутатіону при розвитку вікової катаракти, що пов'язано з низьким рівнем амінокислот-попередників, а також пониженою активністю ферментів синтезу цієї сполуки в катарактальних кришталиках. При цьому найбільш виражені зміни торкалися амінокислоти цистеїну. Тривале системне застосування препарату, що містить цистеїн, на тлі інстиляцій крапель, до складу яких входить ця амінокислота, привело до стабілізації прогресування вікової катаракти, підтвердивши отримані експериментальні і клінічні дані.



ВИСНОВКИ

1. Частота розвитку вікової катаракти складає 3,3% випадків у осіб у віці 50 років, збільшуючись до 46,3% в 70 років і старше. В патогенезі розвитку вікових помутнінь кришталика провідна роль відводиться порушенням в окислювально-відновній системі глутатіону - центральної ланки антирадикального захисту кришталика. В зв'язку з цим дослідження обміну амінокислот-попередників глутатіону і вивчення активності ферментів його синтезу є актуальним і своєчасним.

2. Опромінення світлом високої інтенсивності призводить до зменшення в кришталику рівня глутатіону в результаті зниження активності г-глутамілцистеїнсинтетази в умовах in vitro на 33,3% і 22,1% відповідно, а при моделювання світлової катаракти через 45 тижнів експерименту - на 55,6% і 67,8% відповідно.

3. Встановлено, що в ранні терміни моделювання світлової катаракти (18 тижнів) порушуються процеси транспорту амінокислот-попередників глутатіону в кришталик, що проявляється зниженням їх рівня на 66,1% - 74,3%, а в остаточному терміні формування (45 тижнів), ключовим катарактогенним чинником залишається низький рівень цистеїну - на 52,8%.

4. Виявлений протекторний вплив цистеїну на розвиток експериментальної світлової катаракти, що характеризується уповільненням розвитку помутнінь кришталика як через 30, так і 45 тижнів опромінення.

5. Встановлено, що зниження рівня глутатіону в кришталиках хворих віковою катарактою викликане зниженням активності г-глутамілцистеїн синтетази і глутатіонсинтетази - відповідно на 31% і 20% при субкапсулярній і змішаній формах відносно норми.

6. Встановлена можливість стабілізації прогресування вікової катаракти шляхом застосування очних крапель, що містять цистеїн, 3 рази на добу на тлі прийому препарату "Ацетилцистеїн лонг" упродовж 6 місяців по 200 міліграм 2 рази на добу після їжі.

7. Запропонований спосіб стабілізації прогресування початкової вікової катаракти, що базується на метаболічній корекції процесів синтеза глутатіону, дозволяє зберегти гостроту зору 0,85-1,0 у 81% хворих упродовж 2 років спостереження.



СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Леус Н. Ф. Уровень свободных аминокислот в хрусталике и камерной влаге глаза при развитии экспериментальной катаракты / Н. Ф. Леус, Аслам Набиль, А. А. Путиенко // Офтальмол. журн. - 2007. - № 3. - С. 50-54.

Автор визначав рівень амінокислот в тканинах, що досліджувалися, частково виконав статистичну обробку і аналіз отриманих результатів.

2. Леус Н. Ф. Влияние глутамата, цистеина, и глицина на развитие экспериментальной катаракты / Н. Ф. Леус, Аслам Набиль, А. А. Путиенко // Офтальмол. журн. - 2008. - № 2. - С. 58-62.

Автор особисто провів усі біомікроскопічні спостереження за тваринами в динаміці експерименту, проаналізував отримані результати, брав участь у формулюванні висновків роботи.

3. Леус Н. Ф. Результаты исследования уровня свободных аминокислот - предшественников глутатиона в хрусталике, камерной влаге и в крови больных с различными клиническими формами и скоростью прогрессирования возрастной катаракты / Н. Ф. Леус, Аслам Набиль, А. А. Путиенко // Офтальмол. журн. - 2008. - № 5. - С.78-81.

Автором проведено клінічне обстеження усіх хворих, а також виконані біохімічні дослідження по визначенню рівню амінокислот-попередників глутатіону в тканинах, що досліджувалися, проведена статистична обробка отриманих результатів.

4. Леус Н. Ф. Активность ферментов синтеза глутатиона в хрусталиках при различных клинических формах и скорости прогрессирования возрастной катаракты / Н. Ф. Леус, Аслам Набиль, А. А. Путиенко // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології: збірник наукових праць. - 2008. - Вип. 3-4, № 84-85. - С. 197-202.

Автором проведено біохімічне визначення активності ферментів, виконана статистична обробка і аналіз результатів дослідження.

5. Пат. № 35408 А Україна, МПК А 61/F, 9/002006 Спосіб лікування вікової катаракти / Путиенко А. А., Набиль Аслам. № u 2008 06870 10.09.08. Бюл. № 17. - С. 5.19.

Автором проведено інформаційно-патентний пошук, описана суть способу, формула і реферат, проведена клінічна апробація.

6. Леус Н. Ф. Экспериментальное обоснование применения метаболической коррекции антиоксидантной системы в реабилитации больных увеальной катарактой / Н. Ф. Леус, В. В. Савко (младший), Аслам Набиль // 5 Міжнародна конференція офтальмологів країн Причорномор'я, 24 травня 2007 г.: матеріали. - Одеса, 2007. - С. 61-63.

7. Путиенко А. А. Содержание свободных аминокислот в хрусталике и камерной влаге глаза при моделировании катаракты в эксперименте /

А. А. Путиенко, Аслам Набиль // Совеременные аспекты клиники, диагностики и лечения глазных болезней: междун. научн. конф., посвященная 100-летию со дня рождения академика Н. А. Пучковской, 29-30 мая 2008 г.: материалы. - Одеса, 2008. - С. 89-90.

8. Путиенко А. А. Изучение активности ферментов синтеза глутатиона в хрусталике при различных клинических формах и скорости прогрессирования возрастной катаракты / А. А. Путиенко, Аслам Набиль // Филатовские чтения: научно-практическая конференция офтальмологов с междунардным участием, 28-29 мая 2009 г.: материалы. - Одесса, 2009 - С. 71-72.

Размещено на Allbest.ru

...