Розробка і стандартизація технології та методів контролю якості біотехнологічних препаратів на прикладах інтерферону альфа-2b та низькомолекулярного гепарину

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В даний час препарати інтерферону альфа-2b (Iб-2b) генно-інженерного походження широко використовуються для лікування захворювань людини різної етіології: онкологічних захворювань, хронічних гепатитів B та C, герпетичних уражень шкіри та інше. Застосування інтерферонів базується на сукупності їхньої біологічної дії: противірусної, антипроліферативної та імуномоделюючої. Добре зарекомендували себе препарати інтерферону: Інтрон-А, (ф. «Schering-Plough»), Вірогель (ф. «Jadran»), Реальдирон (ф. «Teva»), Лаферон (ф. «Фармбіотек»), Назоферон (ф. ВАТ «Фармак») та інші, як для ін'єкційного введення, так і для назального застосування. В той же час, при використанні препаратів Iб-2b спостерігається значна кількість побічних ефектів, таких як: втома, лихоманка, нейропенія, анемія, алопеція, депресія, головокружіння, біль в кістках та м'язах.

В зв'язку з вище сказаним, стає актуальним завдання створення нових лікарських форм Iб-2b, які б відрізнялись високою ефективністю та зниженням прояву побічних ефектів. Такими препаратами можуть стать сучасні лікарські форми інтерферону: розчини та ліпосоми (ЛС). Це дозволить більш ефективно проводити лікування хворих за рахунок зниження побічних ефектів, а також збільшити дозу препарату, що вводиться.

Препарати на основі низькомолекулярних гепаринів (НМГ) сьогодні добре відомі і важко уявити профілактику та лікування патологічних уражень судин і тканин без цієї групи біологічно-активних сполук. Відомо, що гепарини застосовують для лікування великої кількості захворювань: тромбозів і тромбоемболій, ішемічної хвороби серця та інфаркту міокарда, гломерулонефриту та інших. Застосування НМГ може призводити до побічних ефектів: кровотечі в різних місцях, тромбоцитопенії, шкірних реакцій, некрозів шкіри, гематом в місці введення, еозинофілії, генералізованих реакцій підвищеної чутливості та ін. На даний час відсутні ефективні методи, що дозволяють оцінити присутність в препаратах гепарину гіперсульфованого хондроїтинсульфату (ГХС) і дерматан-сульфату, які в значній мірі відповідають за побічні ефекти. Тому можливість ідентифікації домішок є необхідною в стандартизації препаратів на основі НМГ.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт ДП «ДНЦЛЗ», за "Комплексною програмою розвитку медичної промисловості України на 1997-2003 рр., затвердженою Постановою КМУ № 1538 від 18.12.1996 р. (№№ держ. реєстрації 0103U008804, 0103U002352) і планами інноваційного розвитку ВАТ «Фармак» на 2007-2011 роки (№ держ. реєстрації 0109U001995, 0109 U001994).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи є розробка складу, стандартизація і контроль технології отримання препаратів Iб-2b у вигляді стабільних розчинів та в формі ЛС, а також розробка методики ідентифікації та кількісного визначення домішки ГХС в препараті НМГ на основі еноксапарину натрію та проведення фармакопейних досліджень препарату «Фленокс» (ВАТ «Фармак» ) на основі активної діючої речовини - НМГ (еноксапарину натрію).

Схема отримання ліпосомальної форми інтерферону

Рис. 1 Схема отримання ліпосомальної форми інтерферону

В результаті проведених досліджень встановлена стабільність запропонованої ЛС-форми препарату протягом 24 місяців. Подальше зберігання препарату приводить до зменшення противірусної активності. Також необхідно відзначити, що при цьому зберігається розмір ЛС, який навіть при 28 місяцях зберігання має розмір ЛС 140-240 нм. (табл. 3). Вивчені фізико-хімічні, біофармацевтичні й біологічні властивості ЛС-форми розробленого препарату Iб_2b.

Таблиця 3. Вивчення основних показників якості ліпосомального препарату з інтерфероном альфа-2b в процесі зберігання

Показано зниження токсичних властивостей ЛС-форми в порівнянні з вільним Iб-2b. Встановлені основні параметри критичних точок технологічного процесу. В результаті проведених досліджень отримані дані, що підтверджують стабільність лікарської форми ліофілізованого ліпосомального Iб-2b протягом 28 місяців.

Використання рекомбінантного Iб-2b в клініці для лікування онкологічних і вірусних захворювань вимагає наявності Iб-2b у високих дозах: від 1 млн МО/мл до 30 млн МО/мл. Першорядним завданням є проведення досліджень за визначенням номенклатури допоміжних речовин, їх концентрації і співвідношення. За рахунок оптимального підбору допоміжних речовин можна суттєво підвищити терапевтичний ефект лікарських препаратів.

Допоміжні речовини, які використовуються для створення ін'єкційних лікарських форм, повинні додавати розчину необхідні технологічні та фізико-хімічні властивості, які забезпечують стабільність розчину, необхідну розчинність субстанції та її стабільність в процесі зберігання, оптимальну фармакокінетику діючої речовини. Крім того, вони мають бути хімічно індиферентні і не виявляти негативного впливу на організм хворого, а у випадку Iб-2b володіти мінімальними цитотоксичними властивостями. Нами проведено вивчення складу допоміжних речовин і їх властивостей та їх вплив на біологічні і фізико-хімічні властивості Iб_2b.

Для вивчення впливу допоміжних речовин на біодоступність Iб-2b були розроблені і досліджені речовини різної природи, які найчастіше використовують в сучасній фармацевтичній практиці для білкових препаратів, зокрема, інтерферонів. Крім того, ми частково використовували досвід, накопичений нами при розробці назальних форм препаратів Iб-2b (табл.5). Склад допоміжних речовин визначався роллю кожного окремого компоненту допоміжних речовин. Одними із компонентів буферної системи є трометомол (трис _ гідроксиметил _ амінометан) та трометомол гідрохлориду (трис _ гідроксиметил _ амінометангідрохлорид), які здатні регулювати кислотно-лужну рівновагу, практично нетоксичні, входять до складу парентеральних препаратів, які використовуються в якості трометомолових солей, та не впливають на активність інтерферону у процесі зберігання. Лізин гідрохлорид - амінокислота, яка входить до складу молекули інтерферону у різних ділянках білкової молекули, та за рахунок надлишку попереджує гідроліз білкової молекули. Динатрієва сіль етилендіамінтетраоцтової кислоти - хелатоутворюючий засіб, який утворює комплекси з іонами металів у розчині, що запобігає реакції розщеплення білка за рахунок взаємодії з іонами металів. В якості консерванта можуть бути використані ніпагін та крезол які не впливають на стабільність молекули інтерферону у розчині та традиційно використовуються в якості консерванта в ін'єкційних розчинах, назальних і очних краплях. Натрію хлорид - ізотонізуючий агент і гарантує отримання ізотонічного розчину. Речовини гідроксипропілметилцелюлоза (гіпромелоза), лізину гідрохлорид та полісорбат-80 використані також і для захисту антивірусної активності, динатрію гідрогенфосфат і натрію дігідрогенфосфат здатні регулювати кислотно-лужну рівновагу. м-крезол і ніпагин використані як консерванти в концентраціях, рекомендованих для даної групи препаратів, що забезпечують стерильність розчину в процесі його використання. Експериментально встановлено, що концентрація ніпагину 0,033 % і м-крезолу 0,075 % при зберіганні при 2-8 C забезпечує антимікробну дію консерванту протягом терміну використання первинної упаковки лікарського засобу.

Для визначення оптимального складу розчину Iб-2b з вмістом речовини 18 млн МО/3 мл та 25 млн МО/2,5 мл було досліджено склади плацебо на культурі клітин клітин А549 і L41 для визначення їх цитотоксичної дії та можливого впливу на інтерфероногенну активність субстанції (табл. 4).

У табл. 5 наведені результати вивчення цитотоксичності окремих компонентів і розчинів плацебо загалом. Дані, наведені в таблиці 6 підтверджують відсутність цитотоксичної дії як у окремих компонентів, так і комбінації допоміжних речовин (плацебо 1.1, 1.2). Кількість консерванту була вибрана на основі даних цітотоксичності - вміст м-крезолу в концентраціі 0,75 г/л.

Наведені в табл. 6 дані підтверджують відсутність цитотоксичної дії як у окремих компонентів, так і плацебо 1.1 та 1.2. Для подальших досліджень було вибрано наступний склад допоміжних речовин: м-крезол 0,75 г, трометамолу НCl 3,5 г, трометамол 0,4 г, динатрію едетат 0,1 г, натрію хлорид 4,8 г, лізину гідрохлорид 7,3 г, гіпромелози 1,2 г, вода для ін'єкцій - до 1 л. Вказаний склад допоміжних речовин був використаний для отримання розчину інтерферону альфа-2b з вмістом діючої речовини 18 млн МО/3 мл та 25 млн МО/2,5 мл. Отримані препарати досліджували як на цитотоксичність, так і на противірусну активність.

Таблиця 4. Склад плацебо для виявлення цитотоксичності

Таблиця 5. Результати вивчення цитотоксичності допоміжних речовин

Як видноіз наведених даних (табл. 5, 6) максимальна активність забезпечувалася допоміжними речовинами плацебо 1.2. Препарати з іншими компонентами було використовувати недоцільно, оскільки залучення в якості буферу суміші натрію фосфорнокислого двозаміщеного та натрiю фосфорнокислого однозаміщеного знижує активність інтерферону (плацебо 2.2 - «Інтрон» (ф. «Шерінг Плау»), а також суміш фосфатів володіє цитотоксичністю (табл.5). Використання iнших плацебо також приводило до зниження активності. Крім того, використання ніпагіну, який погано розчиняється у воді (температура зберігання препарату 2-8°С), робить його присутність в препараті недоцільним.

У складі плацебо 1.2. кожен компонент виконує певну роль: трометамол і трометамол HC1 спроможні регулювати кислотно-лужну рівновагу; гіпромелоза стабілізує білкову молекулу; лізин гідрохлорид - амінокислота, яка входить до складу молекули інтерферону у різних ділянках білкової молекули та за рахунок надлишку, попереджає гідроліз білкової молекули; хлорид натрію є ізотонізуючим агентом, щоб гарантувати отримання ізотонічного розчину| з уникненням ризику пошкодження тканин завдяки ефекту гіпотонічних або гіпертонічних розчинів; діяльність стабілізуючих речовин в запропонованому складі посилюється за допомогою присутності динатрієвої сілі етилендіамінтетраоцтової кислоти; і, нарешті, м-крезол - це стабілізуюча речовина, яка використовується в різних складах завдяки її здатності стримувати зростання таких мікроорганізмів, як грампозитивні і грамнегативні бактерії, дріжджі і цвіль.

Таблиця 6. Візначення цитотоксичності, специфічної активності та автентичності препаратiв iнтерферону альфа-2b з вмістом речовини 25 млн МО/2,5 мл (10 млн МО/мл)

Комбінація цих допоміжних речовин призвела до стабілізації активного інгредієнта, тому даний новий склад може використовуватися як терапевтичний продукт.

Після проведення ряду попередніх досліджень, нами була запропонована наступна схема отримання розчину Iб-2b з вмістом речовини 18 млн МО/3 мл та 25 млн МО/2,5 мл. Приготування розчину 1 (трометамол, трометамолу HC1, хлорид натрію, лізину HC1, м-крезол). Приготування розчину 2 (2 % розчин гіпромелози). Приготування фінального розчину розчину Iб-2b. Стерилізуюча фільтрація та розлив у флакони.

В наступній групі експериментів ми проводили вивчення стабільності розроблених препаратів як в умовах прискореного старіння, так і в умовах довгострокового зберігання. Нами було проведено вивчення стабільності розчинів Iб-2b з вмістом речовини 18 млн МО/3 мл та 25 млн МО/2,5 мл протягом 24 місяців по показниках АНД і встановлене наступне. Так, при вивчені розчину 25 млн МО/2,5 мл препарат повинен містити від 9,010⁶ до 1110⁶ МО/мл (визначення рівня інтерферону проводили на чутливих культурах клітин L41, А549) після двох років зберігання отримані наступні данні: препарат на початку зберігання 10,6 10⁶; через 12 місяців - 10,4610⁶; через 24 місяці - 10,110⁶ При вивчені стабільності розчину з вмістом 18 млн МО/3 стабільність підтвердилась.

Наведені дані підтверджують стабільність розроблених ін'єкційних препаратів в процесі зберігання. Причому, звертає на себе увагу не тількине лише стабільність біологічної противірусної активності, але й стабільність домішок, визначених методом ВЕРХ, а також стабільність даних, отриманих при визначенні специфічного білка інтерферону IФА.

Специфічна активність, токсичність та автентичність розробленного препарату - розчину Iб-2b з вмістом речовини 18 млн МО/3 мл і 25 млн МО/2,5 мл та препарату порівняння «Інтрон» (ф. «Schering-Plough») вивчалась на культурах клітин L41 та А549 методом пригнічення цитопатогенної активності вірусу везикулярного стоматиту та в реакції нейтралізації з антитілами до інтерферону альфа. Досліджуваній препарат, розроблений нами згідно одержаних результатів, виявляв специфічну активність в перещеплюваних культурах клітин А549, L41 та був| нетоксичним. Автентичність Iб-2b підтверджена в реакції нейтралізації з антитілами до Iб-2b.

Проведено доклінічні дослідження специфічної антивірусної дії та токсикологічних властивостей розроблених лікарських засобів Iб-2b, результати яких свідчать про високу ефективність та безпеку досліджуваних препаратів.

У четвертому роздiлi приведені результати фiзiко-хiмiчних, бiофармацевтичних дослiджень щодо порівняння оригінального препарату «Клексан» (ф. «Sanofi Aventis») та біоподібного препарату «Фленокс» (ф. ВАТ «Фармак»). Розроблена методика ідентифікації і кількісного визначення домішки ГХС.

Використані препарати на основі НМГ, отримані біотехнологічними методами, повинні розглядатись як біоподібні, а не як генерики. Вони відрізняються способом отримання, складом та клінічною дією. Це вимагає проведення порівняльних досліджень їх фізико-хімічних і біологічних властивостей. Крім того, перспективи у тих виробників НМГ, котрі спроможні доповнити вимоги Фармакопеї методами аналізу, що дозволять стандартизувати препарати НМГ з метою зниження побічних ефектів.

Нами були проведені порівняльні фармакопейні дослідження препаратів «Клексан» та «Фленокс» щодо відповідності Державній фармакопеї України, Європейській фармакопеї та фармакопеї США 2008 р. Досліджено діючу речовину еноксапарину натрію виробництва компанії «Hangzhou Jiuyuan Gene Engineering Co., Ltd.» (Китай). Отримані дані підтвердили відповідність якості субстанції еноксапарину натрію виробництва «Hangzhou Jiuyuan Gene Engineering Co.,Ltd.» і препарату «Фленокс» вимогам фармакопей (табл. 8).

Відомі методики аналізу НМГ та виявлення в ньому домішок мають значні недоліки - необхідність використання приладів з високою робочою частотою, великої кількості зразка та є трудомісткими. Очевидною є необхідність розробки методики, адаптованої до приладів з низькою робочою частотою, доступніших в Україні. Тому нами були проведені експерименти по розробці доступного і швидкого методу дослідження ЯМР до вирішення завдання з ідентифікації НМГ та виявлення в ньому небажаної домішки ГХС. Нами використана двовимірна методика COSY-90 з переднасиченням сигналу HOD для аналізу зразків НМГ, а також зразка, приготовленого змішуванням діючої речовини препарату «Фленокс» та гіперсульфованого хондроїтин сульфату. Вимірювання спектру COSY-90 є таким же простим у виконанні і невимогливим до часу та кількості зразка, як і вимірювання звичайного спектру ПМР. По-перше, спектр COSY-90 стандартного зразка та спектр діючої речовини препарату «Фленокс» є ідентичними, що дозволяє ідентифікувати останній. По-друге, аналіз спектра COSY-90 гіперсульфованого хондроїтин сульфату дозволяє виявити групу кореляційних піків, що знаходяться в області, в якій немає кореляційних піків у спектрах діючої речовини препарату «Фленокс» і стандартного зразка НМГ. Це кореляції 4.4-5.0 м.ч., які, згідно з літературними даними, відповідають протонам GlcpA H-1/H-2, GlcpA H-2/H-3 та GlcpA H_3/H-4. Важливо, що піки є достатньо інтенсивними, тому саме їх ми пропонували використовувати в аналізі зразків НМГ з метою виявлення домішки гіперсульфованого хондроїтин сульфату. Ефективність саме такого аналізу демонструє спектр COSY-90 суміші діючої речовини препарату «Фленокс» та гіперсульфованого хондроїтину сульфату у ваговому співвідношенні 5:1. Відповідні кореляції добре видно у спектрі, який дозволяє однозначно зробити висновок про забрудненість зразка НМГ гіперсульфованим хондроїтин сульфатом. Якщо використати стандартні зразки НМГ та гіперсульфованого хондроїтину сульфату для калібрування інтегральних інтенсивностей піків, то використання методики COSY-90 дасть змогу кількісно оцінити вміст домішки в зразках НМГ промислового виробництва.

Вперше розроблена зручна і ефективна експрес-методика ідентифікації НМГ та виявлення в ньому домішки ГХС за допомогою двовимірної методики COSY з переднасиченням сигналу HOD.

рекомбінантний інтерферон препарат

Таблиця 8. Порівняльна таблиця результатів аналізу препаратів «Клексан» (ф. «Sanofi Aventis») с 28441 та «Фленокс» (ВАТ «Фармак») с. S20070504

Перевага методики полягає в тому, що аналіз можна провести з невеликою кількістю зразка (близько 20 мг), швидко (аналіз триває 40-60 хв.) та на приладах ЯМР з порівняно невеликою робочою частотою.

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ

1. Проведено аналіз даних з сучасних методів контролю якості та технології отримання існуючих лікарських форм інтерферону альфа-2b і низькомолекулярних гепаринів.

2. Вперше на основі проведених досліджень розроблено та валідовано методику кількісного визначення вмісту інтерферону альфа-2b за допомогою імуноферментного аналізу. Проведені валідаційні дослідження підтверджують відтворюваність методики та можливість її використання для кількісного визначення інтерферону альфа-2b.

3. Розроблений експрес-метод визначення вмісту інтерферону альфа-2b дозволяє проводити визначення концентрації інтерферону на всіх стадіях технологічного процесу виробництва різних форм препарату інтерферону альфа-2b, а також може бути використаний для визначення автентичності генно-інженерного інтерферону альфа-2b.

4. Методика кількісного визначення інтерферону альфа-2b за допомогою імуноферментного аналізу включена в аналітичну нормативну документацію на препарат «Назоферон», спрей 100000 МО/мл, «Назоферон», краплі 100000 МО/мл, в аналітичну нормативну документацію на Інтерферон людський рекомбінантний альфа-2b, в Специфікацію на приготований розчин препарату «Назоферон», краплі та спрей виробництва (ф. ВАТ «Фармак»).

5. Визначені фізико-хімічні, фармако-токсикологічні властивості ліпосомального препарату інтерферону альфа-2b, які є основою розробки складу і технології. Обгрунтовано технологічні принципи отримання наночасток-ліпосом, які містять інтерферон альфа-2b; досліджені фізико-хімічні та біофармацевтичні властивості препарату; експериментально досліджена стабільність ліпосомального препарату протягом терміну зберігання. Проведено дослідно-промислове напрацювання препарату в умовах підприємства ЗАТ «Біолік» (м. Харьків).

6. Запропоновано склад і розроблена промислова технологія отримання ін'єкційного розчину інтерферону альфа-2b з вмістом речовин 18 млн МО/3 мл та 25 млн МО/2,5 мл, досліджені його технологічні фізико-хімічніі біологічні властивості. Експериментально доведена стабільність розчинів інтерферону протягом терміну зберігання, висока специфічна ефективність і біологічна нешкідливість. Проведено дослідно-промислове напрацювання препаратів в умовах підприємства ВАТ «Фармак» (м. Київ).

7. Розроблена ефективна експрес-методика ідентифікації низькомолекулярного гепарину (еноксапарину натрію) та виявлення в ньому домішки гіперсульфованого хондроїтин сульфату за допомогою двовимірної методики COSY (з переднасиченням сигналу HOD). Перевага методики полягає в тому, що аналіз можна провести з невеликою кількістю зразка (близько 20 мг), швидко (аналіз триває 40-60 хв.) та на приладах ЯМР з порівняно невеликою робочою частотою.

8. Впроваджено у виробництво методику ідентифікації низькомолекулярного гепарину (еноксапарину натрію) та визначення в ньому домішки гіперсульфованого хондроїтин сульфату. Метод апробовано та впроваджено в умовах Науково-виробничого підприємства «Укроргсинтез» (м. Київ).

СПИСОК ОПУБЛIКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦII

1. Борщевский Г.И. Стандартизация технологии изготовления липосомальной формы рекомбинантного интерферона альфа-2b / Борщевский Г.И., Дихтярев С.И. // Фармаком. - 2009. - № 3 - С. 53-58. (Особистий внесок полягає в розробці складу та способу отримання ліпосомальної лікарської форми інтерферону альфа-2b, проведенню експериментальних досліджень, підготовки статті).

2. Борщевська М.І. Фармакопейні аспекти якості препарату «Фленокс» на основі еноксапарину / М.І. Борщевська, В.А. Коноваленко, Г.І. Борщевський, І.В. Комаров. // Фармакологія та лікарська токсикологія. - 2009. - № 2(9). - С. 57-65. (Особистий внесок полягає в здійсненні експериментальних досліджень щодо вивчення зразків та оформлення результатів досліджень, підготовки статті).

3. Половинко В.В. Експрес-ідентифікація низькомолекулярного гепарину та виявлення в ньому домішки гіперсульфованого хондроїтин сульфату методом ЯМР / В.В. Половинко, Г.І. Борщевський, І.В. Комаров // Медична хімія. - 2009.- Т. 11, № 3, с. 21-25. (Особистий внесок полягає в розробці і апробації методики кількісного визначення гіперсульфованого хондроїтин сульфату).

4. Борщевский Г.І. Разработка и апробация экспресс-метода количественного определения рекомбинантного интерферона альфа-2b / Г.І. Борщевский, В.А. Коноваленко, Е.С. Колосовская, М.И. Борщевская, С.И. Дихтярев // Ветеринарна біотехнологія. - 2009. - № 15. - С. 69-74. (Особистий внесок полягає в розробці методики кількісного визначення інтерферону за допомогою імуноферментного аналізу).

5. Борщевский Г.И. К вопросу применения низкомолекулярных гепаринов / Г.И. Борщевский, М.И. Борщевская. // Український біофармацевтичний журнал. - 2009. - Т.1, № 3. - С. 48-57. (Особистий внесок полягає в зборі і систематизації літературних джерел та вибору напрямків дослідження, підготовки статті).

6. Пат. 44582 Україна, МПК GO1N 33/15. Застосування способу імуноферментного аналізу як способу кількісного визначення вмісту інтерферону в лікарських засобах / Борщевський Г.І., Коноваленко В.А., Колосовська О.С. - № u 2009 03696; заяв. 15.04.2009; опубл. 12.10.2009. Бюл. 19. (Особистий внесок полягає в теоретичному обґрунтуванні можливості використання методу імуноферментного аналізу для кількісного визначення інтерферону альфа-2b та розробці методу).

7. Борщевський Г.І. Розчин для ін'єкцій мультидозовий на основі інтерферону альфа-2b / Борщевський Г.І., Коноваленко, В.А., Борщевська М.І. // Ювілейний Х з'їзд Всеукраїнського лікарського товариства: Тез. допов. - Євпаторія, 2009. - С. 279-280.

8. Борщевський Г.І. Розробка технології отримання ліпосомальної форми інтерферону альфа-2b / Г.І. Борщевський, С.І. Діхтярев // Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів: Тез. доп. 3-ої наук.-практ. конф. - Тернопіль, 2009. - С. 46.

9. Борщевський Г.І. Кількісне визначення інтерферону методом імуноферментного аналізу за допомогою Human IFN Alfa Elisa Kit / Борщевський Г.І., Колосовська О.С., Гой А.М. // Тез. допов. ХІІ з їзду товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського. - 2009. - Ужгород. - С. 154.

БОРЩЕВСЬКИЙ Г.І. РОЗРОБКА І СТАНДАРТИЗАЦІЯ ТЕХНОЛОГІЇ ТА МЕТОДІВ КОНТРОЛЮ ЯКОСТІ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ НА ПРИКЛАДАХ ІНТЕРФЕРОНУ АЛЬФА-2B ТА НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНУ. - РУКОПИС

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.03 - стандартизація та організація виробництва лікарських засобів. - Державне підприємство «Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції», Харків, 2009.

Дисертація присвячена розробці, стабілізації та стандартизації складу промислової технології одержання лікарських препаратів, що містять рекомбінантний інтерферон альфа-2b, а також стандартизації та контролю препаратів низькомолекулярних гепаринів.

В роботі науково обгрунтована і експериментально підтверджена можливість кількісного визначення інтерферону альфа-2b імуноферментним методом для контролю промислового виробництва препаратів, що містять інтерферон альфа-2b на всіх стадіях технологічного процесу. Вперше науково обґрунтовані склади ін'єкційних форм розчину інтерферону альфа-2b з вмістом діючої речовини 18 млн МЕ/3 мл та 25 млн МО/2,5 мл. На основі комплексних фармако-технологічних, фізико-хімічних та біофармацевтичних досліджень обґрунтовано склад і розроблена оптимальна технологія отримання ліпосомальної лікарської форми препарату на основі інтерферону альфа-2b.

Розроблена двовимірна методика COSY-90 для ідентифікації та кількісного визначення домішки гіперсульфованого хондроїтину сульфату в розчинах низькомолекулярного гепарину.

Ключові слова: ін'єкційні розчини, ліпосоми, низькомолекулярний гепарин, рекомбінантний інтерферон альфа-2b, склад, технологія, стандартизація.

БОРЩЕВСКИЙ Г.И. РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ И МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ПРИМЕРЕ ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2B И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА. - РУКОПИС

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.03 - стандартизация и организация производства лекарственных средств. - Государственное предприятие «Государственный научный центр лекарственных средств и изделий медицинского назначения», Харьков, 2009.

Диссертация посвящена разработке, стабилизации и стандартизации состава промышленной технологии получения лекарственных препаратов, содержащих рекомбинантный интерферон альфа-2b (Iб-2b), а также стандартизации и контролю препаратов низкомолекулярных гепаринов.

В работе научно обоснована и экспериментально подтверждена возможность количественного определения Iб-2b иммуноферментным методом для контроля промышленного производства препаратов содержащих Iб-2b на всех стадиях технологического процесса. Разработанный метод может использоваться для определения подлинности препаратов, содержащих Iб-2b. Этот метод валидирован и введен в действующую нормативно-аналитическую документацию на препарат «Назоферон», спрей, капли производства ОАО «Фармак». Новизну исследования подтверждено патентом Украины № 44582.

На основе комплексних фармако-технологических, физико-химических и биофармацевтических исследований обоснован состав и разработана оптимальная технология получения липосомальной лекарственной формы препарата на основе Iб-2b. Проведено изучение влияния состава липосомы на количество включенного интерферона. Изучена зависимость между содержанием в препарате криопротектора лактозы и размером липосом как после лиофилизации, так и при хранении сухого препарата. Технология апробирована в условиях предприятия по производству иммунобиологических и лекарственных препаратов ЗАО «Биолек».

Впервые на основе результатов физико-химических, биофармацевтических и фармако-технологических исследований научно обоснованы составы инъекционных форм раствора Iб-2b с содержанием действующего вещества 18 млн МЕ/3 мл и 25 млн МЕ/2,5 мл. Промышленная технология апробирована в условиях фармацевтического предприятия ОАО «Фармак». Изучена цитотоксичность как отдельных компонентов плацебо, так и плацебо в целом. Изучена стабильность инъекционных форм раствора Iб-2b с содержанием действующего вещества 18 млн МЕ/3 мл и 25 млн МЕ/2,5 мл. Установлена стабильность противовирусной активности изучаемых образцов, причем стабильными оставались и физико-химические свойства препаратов. Разработаны проекты нормативно-технической документации.