Детекция генов, отвечающих за формирование связывания пилей в аутоштаммах Escherichia Coli, выделенных из кишечного биотопа детей

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБУ "Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека" СО РАМН

ДЕТЕКЦИЯ ГЕНОВ, ОТВЕЧАЮЩИХ ЗА ФОРМИРОВАНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ ПИЛЕЙ В АУТОШТАММАХ ESCHERICHIA COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КИШЕЧНОГО БИОТОПА ДЕТЕЙ

Иванова Елена Иннокентьевна

Escherichia coli, являясь постоянным обитателем кишечника человека, входит в состав его микробиоценоза, выполняя ряд полезных для хозяина функций (синтез витаминов и аминокислот, поддерживание колонизационной резистентности кишечника, обеспечение антигенной стимуляции местного иммунитета). Между тем, при нарушениях микроэкологического характера E.coli способна резко наращивать не только свое количественное присутствие, но и проявлять патогенные свойства, что играет важную роль в патогенезе развития дисбиоза кишечника [1,2].

На поверхности энтеропатогенных кишечных палочек (EPEC) был найден ген, кодирующий формирование связывание пилей (расшифровка английского термина bfp), он играет важную роль в обеспечении вирулентных свойств этих штаммов. Данный ген bfp отвечает за формирование связей пилей между бактериями, что ведет к образованию бактериальных агрегаций (микроколоний), а также за инициацию адгезии бактерий с клеткой хозяина (в данном случае - с эпителиоцитами кишечника) и, следовательно, колонизацию эпителия слизистой толстой кишки человека [3, 4, 5, 6].

В связи с этим, цель исследования - определение генов, кодирующих формирование связывания пилей у разных фенотипических вариантов E.coli, выделенных у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта. ген фенотипический микробиота бактерия

Материалы и методы. Для изучения факторов патогенности использовали 271 штамм E.coli (с нормальной ферментативной активностью - 189,со слабой ферментативной активностью - 59 и с гемолитической активностью - 23), выделенных от детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта (абдоминальный синдром, расстройства дефекации, расстройства билиарного тракта, функциональные запоры, колики в течение не менее 12 недель за последние 12 месяцев). Группа сравнения включала 20 здоровых детей, репрезентативных по возрасту, у которых были выделены штамм E.coli (с нормальной ферментативной активностью - 20,со слабой ферментативной активностью - 10). Оценка степени нарушений микроценоза толстой кишки проводили согласно ОСТ [7]. По культурально-ферментативным свойствам и антигенным характеристикам исследуемые штаммыE.coliявлялись типичными представителями индигенной микробиоты рода Escherichia.

Выделение тотальной ДНК проводили, амплификацию, электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов осуществляли по ранее описанным методикам [8]. Штаммы E.coli подвергались генетическому исследованию методом ПЦР по наличию/отсутствию генов патогенности, кодирующих способность к формированию связывания пилей (bfp). Реакцию проводили с применением опубликованных праймеров и протокола реакции амплификации [8, 9].

Для выявления долевого участия разных видов в структуре биоценоза использовали показатель постоянства (с), определяемый по формуле С = (р / Р)Ч100%, где: с - показатель постоянства; р - число наблюдений, содержащих изучаемый вид; Р - общее число наблюдений. При с > 50% вид относится к разряду постоянных; при с = 25-50% - к добавочным; с < 25% - к случайным [10].

Полученные результаты

По результатам бактериологических исследований копрологических проб почти у всех детей с функциональными нарушениями (ФН) желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) диагностированы нарушения состава нормальной микробиоты толстой кишки различной степени выраженности. Дисбаланс облигатной микробиоты в основном характеризовался снижением популяционного уровня на 1-3 порядка представителей индигенных бактерий (73,3±2,94%). Дефицит бифидобактерий выявлен в 55,5±3,31%, лактобацилл - в 1,3±0,75% и E.coli с нормальными ферментативными свойствами - в 16,4±2,46%. В целом иерархия бактериального сообщества в изучаемой группе была четко выражена. У детей с ФН ЖКТ отмечается наиболее значимая роль бифидо- и лактобактерии (с=100%), энтерококков в составе микробиоценоза (с=71,4%) по сравнению с другими видами микроорганизмов, которые в большинстве случаев попадают в категорию случайных видов (с=18,6% - 2,0%), за исключением Klebsiellaspp., E.coli со слабой ферментативной активностью и Staphylococcusspp., попадающих в группу добавочных видов. В группе здоровых детей наблюдалась аналогичная картина с представителями индигенных видов бактерий.

Частота встречаемости генов патогенности, кодирующих способность к формированию связывания пилей (bfp) была высокой как по разным биохимическим вариантам E.coli, так и по разным возрастным группам детей, по сравнению с остальными искомыми детерминантами патогенности. В общем пуле исследуемых штаммов эшерихий, выделенных у детей с ФД ЖКТ отмечена высокая частота встречаемости гена bfp (90,9%). Из них у E.coli с нормальной ферментативной активностью регистрировалось в 92,1% случаев, у E.coli со слабой ферментативной активностью в 86,6% и у гемолитических E.coliв 91,6% случаев. При этом выявляемость гена bfp в геноме E.coli с нормальной ферментативной активностью при ее содержании в кишечнике детей ниже нормы (106 КОЕ/мл) составляло 6,4%. При нормальном физиологическом содержании E.coli с нормальной ферментативной активностью в кишечнике детей (107 - 108 КОЕ/мл) частота определения bfp увеличивалась и составляла 36,7% до 49,0%.

В группе сравнения ген, кодирующих способность к формированию связывания пилей (bfp) выявлялся в геноме E.coli с нормальной ферментативной активностью и в геноме у E.coli со слабой ферментативной активностью в 100% случаев.

У детей до года (85 чел) выявляемость гена bfp была чуть ниже (90,6%), чем у детей старше года (94,3). Регистрация данного гена в зависимости от фенотипического варианта кишечной палочки имела следующую картину. Так ген bfp определялся в геноме аутоштаммов E.coli с нормальной ферментативной активностью у детей до года и после в 95,6% и 91,8% соответственно, в геноме аутоштаммов E.coli со слабой ферментативной активностью в 81,6% и 86,4%, в геноме аутоштаммов гемолитических E.coli в 87,8% и 94,3% случаев, соответственно.

Результаты продемонстрировали высокую частоту присутствия данного гена в популяциях различных биохимических вариантов, в том числе E.coli с нормальной ферментативной активностью, что свидетельствует об эффективных процессах адгезии E.coli к эпителию кишечника. А это дает ей огромные преимущества, как в конкурентной борьбе за сайты адгезии с условно-патогенной микробиотой, что позволяет ей занимать экологическую нишу. И возможность типичной E.coliзадерживаться в кишечнике и тем самым осуществлять выполнение полезных для хозяина функций (синтез витаминов и аминокислот, поддержание колонизационной резистентности кишечника, обеспечение антигенной стимуляции местного иммунитета и др.). О чем свидетельствуют и данные выявления гена bfp у кишечных палочек в группе здоровых детей.

Обращает на себя внимание то, что при низкой концентрации (106 КОЕ/г)E.coli с нормальной ферментативной активностью в кишечнике в ее геноме ген bfp тестируется с низкой частотой встречаемости - 6,4%, что ведет к начинающимся дисбиотическим нарушениям, происходящим в кишечнике. Но при этом высокая выявляемость данного гена в геномах атипичных E.coli является нежелательной, в связи с тем, что наличие данных микроорганизмов наряду с дефицитом бифидо- и лактобактерий является также результатом начинающихся дисбиотических нарушений, а при наличии данного гена возможно усугубление течения заболевания.

Поскольку патогенность микроорганизмов является полидетерминантным признаком, который определяется совокупным действием различных факторов патогенности, присущих возбудителю. Таким образом, для определения этиологической значимости E.coli необходимо изучения комплекса факторов патогенности.

Библиографический список

1. Караев Я.М. Протективные и иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина: автореф. дис. … канд. ветерин. наук. - Краснодар, 2008. - 25 с;

2. Мамбетова Э.Ф. Сравнительная характеристика некоторых биологических свойств монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Serratia и Staphylococcus aureus: автореф. дис. …канд. мед. наук. - Челябинск, 2007. - 21 с.

3. Girуn J.A., Qadri F., Azim T., Jarvis K. J., Kaper J. B., Albert M. J. Monoclonal antibodies speci?c for the bundle-forming pilus of enteropathogenic Escherichia coli // Infection and immunity. - 1995. - Vol. 63. - № 12. - P. 4949-4952.

4. Tobe T., Sasakawa C. Role of bundle-forming pilus of enteropathogenic Escherichia coli in host cell adherence and in microcolony development // Cellular Microbiology. - 2001. - № 3(9). - P. 579-585.

5. Saldana Z., Erdem A. L., Schьller S., Okeke I.N., Lucas M., Sivananthan A., Phillips A.D., Kaper J.B. et al. The Escherichia coli common pilus and the bundle-forming pilus act in concert during the formation of localized adherence by enteropathogenic E. coli // Journal of bacteriology. - 2009. - Vol. 191. - № 11. - P. 3451-3461.

6. Ramboarina S., Fernandes P.J., Daniell S., Islam S., Simpson P., Frankel G., Booy F.,. Donnenberg¶ M.S., Matthews S. Structure of the bundle-forming pilus from enteropathogenic Escherichia coli // The journal of biological chemistry. - 2005. - Vol 280. - № 48. - P. 40252-40260.

7. Отраслевой стандарт ОСТ 91500.11.0004-2003. Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника". Утв. 09.06.03.

8. Выявление генов патогенности, кодирующих способность к токсинообразованию, у штаммов Escherichia coli, выделенных из кишечного биотопа детей / Е.И. Иванова, С.М. Попкова, Ю.П. Джиоев, Е.Б. Ракова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2013. - № 2(90), Ч. 2. - С. 111-114.

9. Gunzburg S T, Tornieporth N G., Riley L W. Identification of enteropathogenic Escherichia coli by PCR-based detection of the bundle-forming pilus gene // J. Clin. Microbiol. - 1995. - Vol. 33. - № 5. - P. 1375-1377.

10. Захарова Е.А., Азизов И.С. Микроэкологическая характеристика кишечного микробиоценоза часто болеющих детей // Журн. микробиол., 2012. - № 2. - С. 63-68.

Размещено на Allbest.ru