58

Размещено на http://www.allbest.ru/

Цитокинопосредованная дисфункция локомоторной активности фагоцитов и ее коррекция у детей с травматической болезнью

14.00.36 - аллергология и иммунология

14.00.35 - детская хирургия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Злакоманова Ольга Николаевна

Челябинск, 2008

Работа выполнена в лаборатории диагностики иммунодефицитных состояний Научно-исследовательского института иммунологии и на кафедре хирургии, травматологии и ортопедии детского возраста Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Научные консультанты:

Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Долгушин Илья Ильич

доктор медицинских наук, профессор Чукичев Александр Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович

доктор медицинских наук, профессор Рудакова Эмилия Акиндиновна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный университет Росздрава (г. Москва)

Защита состоится "25" ноября 2008 г. в ______ час. на заседании диссертационного совета Д. 208.117.03. при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" по адресу 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, д.64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Автореферат разослан "___" _______________2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Л.Ф. Телешева

Общая характеристика работы

В последние десятилетия отмечается устойчивая тенденция к росту травматизма, что определяет актуальность данной медицинской проблемы. Около 25% пациентов с травмой составляют дети, у которых механические повреждения выступают на первое место как причина заболеваемости, инвалидности и смертности. Посттравматические состояния, приводящие к инвалидности, наблюдаются у 4,5 %, а длительные функциональные расстройства, затрудняющие учебу - у 38 % детей (Кузнечихин Е.А., Немсадзе В.П., 1999; Баиров Г.А., 2000).

Закономерным следствием травмы являются изменения со стороны иммунной системы. Несмотря на непрерывное совершенствование антибактериальной терапии и хирургической техники, инфекционные осложнения, являющиеся одним из основных клинических проявлений иммунной недостаточности, остаются главной причиной смерти у пациентов, особенно детей, с серьезными повреждениями (Баиров Г.А., 2000; Деллинджер Э.П., 2001; Белобородов В.Б., Митрохин С.Д., 2003; Пхакадзе Т.Я. и соавт., 2003; Калинина Н.М. с соавт., 2005; Страчунский Л.С. и соавт., 2007).

После воздействия повреждающего фактора в ткани развивается острое экссудативно-деструктивное воспаление, основными эффекторами которого являются фагоциты. Результативность формирующейся фагоцитарной реакции во многом определяется характером и интенсивностью ее начального этапа - хемотаксиса.

Способность к направленной миграции составляет основу функциональной пластичности фагоцитов, но из-за своей сложности хемотаксис является одной из наиболее уязвимых форм реактивности нейтрофилов и моноцитов. Поэтому многие дисфункции фагоцитов и других иммуноцитов связаны с патологией движения клетки. Снижение двигательной активности фагоцитов может быть результатом не только их повреждения, но и хемотаксиской деактивации, развивающейся после контакта с различными хемоаттрактантами и приводящей к угнетению хемотаксиса.

Известно, что механическая травма вызывает индуцированную форму вторичного иммунодефицитного состояния, характеризующуюся количественными и функциональными изменениями различных гуморальных факторов, активности иммунокомпетентных клеток и приводит к расстройству их цитокиновой регуляции (Хаитов Р. М., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Фрейдлин И.С. и соавт., 2002; Симбирцев А.С., 2004; Малыш И.Р., Козлов В.К., Згржебловская Л.В., 2005). Поэтому было логично предположить, что аномалии миграции клеток наряду с дефектами цитокиновой регуляторной сети, развивающимися после механической травмы, могут являться одной из главных причин развития гнойного воспаления и нарушения репаративных процессов в поврежденной ткани.

Изучение роли фагоцитов и секретируемых ими медиаторов воспаления в патогенезе травматической болезни и процессах репаративной регенерации костной ткани является весьма актуальной проблемой, еще далекой от окончательного разрешения. Её дальнейшее исследование позволить разработать новые подходы к диагностике и лечению иммунодефицитного состояния при травматических повреждениях, а также определить возможность коррекции нарушенных звеньев гомеостаза.

Цель исследования

Целью настоящей работы является исследование роли нарушений двигательных функций фагоцитов (нейтрофилов и моноцитов) в патогенезе травматической болезни у детей, взаимосвязи таких изменений с уровнем цитокинов, активностью репаративной костной регенерации, возникновением гнойно-воспалительных осложнений, а также разработка патогенетически обоснованных подходов к коррекции выявленных нарушений.

Задачи работы

1. Оценить функциональное состояние (фагоцитарная, лизосомальная, НСТ-редуцирующая, секреторная активность) нейтрофилов и моноцитов и показатели гуморального иммунитета при деструкции костной ткани в различные периоды травматической болезни у детей с неосложненным и осложненным ее течением.

2. Изучить базальную и индуцированную митогенами (ЛПС и ФГА) продукцию ИЛ-1в, ИЛ-10, ИЛ-8, ИЛ-4 и ИНФ-б клетками периферической крови здоровых и травмированных детей.

3. Исследовать хемотаксическую и миграционную активности нейтрофилов и моноцитов периферической крови в ответ на различные хемоаттрактанты у здоровых и травмированных детей и установить взаимосвязь между степенью изменения кинетической функции фагоцитов и уровнем цитокинов.

4. Определить уровни биохимических маркеров костного ремоделирования (кальцитонина, остеокальцина и С-телопептидов коллагена I типа CrossLaps) у здоровых и травмированных детей и их взаимосвязь со степенью нарушения цитокинпродуктивной и локомоторной функций клеток периферической крови у пациентов с механической травмой.

5. Изучить хемотаксические свойства и способность индуцировать “хемотаксическую деактивацию" нейтрофилов у возбудителей, наиболее часто вызывающих развитие посттравматических гнойно-воспалительных осложнений у детей (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa).

6. Исследовать хемотаксические свойства и способность вызывать “хемотаксическую деактивацию" нейтрофилов у антибиотиков, применяемых при лечении посттравматических гнойно-воспалительных осложнений у детей (амоксиклав, гентамицин, линкомицин, цефотаксим).

7. Выяснить влияние антибактериальных препаратов (амоксиклав, гентамицин, линкомицин, цефотаксим) на спонтанную и индуцированную ЛПС продукцию цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ИНФ- клетками периферической крови при травматической болезни у детей.

8. Изучить действие иммунотропных препаратов (метилурацил, нуклеинат натрия и АТФ) на подвижность фагоцитов in vitro у здоровых детей и у травмированных пациентов - до и после лечения, и на основе этого разработать патогенетически обоснованные подходы к коррекции выявленных нарушений фагоцитарных функций у детей с травматической болезнью.

Научная новизна

В работе впервые установлено, что у детей в процессе развития травматической болезни происходит изменение секреции медиаторов воспаления, проявляющееся в гиперпродукции провоспалительных индукторов и приводящее к дисбалансу в цитокиновой сети регуляции, в большей степени в системе хемокиновых интерлейкинов.

Установлена взаимосвязь между уровнями продукции цитокинов и нарушениями локомоторных функций фагоцитов у детей с травматической болезнью, свидетельствующая о роли дефекта миграции клеток в развитии дисбаланса постоянства внутренней среды организма после травмы.

Представлены новые сведения об участии фагоцитарных реакций в восстановлении костной ткани при травматических повреждениях опорно-двигательной системы. Установлена существенная роль фагоцитов в резорбции костной ткани. Определена динамика маркеров костного метаболизма в зависимости от периодов травматической болезни у детей.

Впервые показано, что антибиотики, используемые в лечении гнойно-воспалительных осложнений при травматической болезни у детей, выступают как модуляторы воспалительной реакции, изменяющие цитокин-продуктивную активность фагоцитов. Определены хемотаксические и хемокинетикотропные эффекты амоксиклава, гентамицина, линкомицина, цефотаксима in vitro в норме и при лечении детей с гнойно-воспалительными осложнениями травматической болезни. Обнаружено, что они усугубляют двигательные дисфункции фагоцитов и опосредованно способствуют замедлению процессов репарации костной ткани.

Разработан оригинальный подход к подбору индивидуальной дозы нуклеината натрия, метилурацила и АТФ на основе оценки их влияния на хемотаксис нейтрофилов и моноцитов in vitro, что позволяет не только снизить уровень интоксикации, но и восстановить у травмированных детей кинетическую функцию фагоцитов, предотвращая развитие посттравматических гнойно-воспалительных осложнений.

Практическая значимость работы

Доказано, что в раннем посттравматическом периоде происходит изменение продукции цитокинов, которое приводит к дисбалансу в системе про - и противовоспалительных цитокинов, наиболее выраженному в хемокиновом звене. Дисбаланс системы цитокинов является одной из причин локомоторных дисфункций фагоцитов и нарушения процессов репаративной регенерации костной ткани.

Исследованы хемокинетикотропные эффекты антибактериальных препаратов, применяемых при лечении хирургических инфекций. Выявлено, что антибиотики усугубляют двигательные дисфункции фагоцитов и опосредованно способствуют замедлению процессов репарации костной ткани.

Разработан метод коррекции нарушений локомоторной функции фагоцитов у детей с травматической болезнью, основанный на изучении хемотаксиса фагоцитов под воздействием различных концентраций препаратов на клетки in vitro, позволяющий эффективно применять лекарственный препарат через 4-5 часов с момента начала исследования и оптимизировать процесс лечения больных с повреждением опорно-двигательного аппарата, снижая риск развития гнойно-воспалительных осложнений.

На основании полученных данных разработаны “Способ изучения хемокинеза нейтрофилов под воздействием биологических веществ”, “Способ индивидуального подбора дозы АТФ" и “Способ прогнозирования эффективности нуклеината натрия у детей с травматической болезнью” (рационализаторские предложения: № 149 от 20.03.2000, № 183 от 14.03.2002 года, № 184 от 14.03.2002).

Положения, выносимые на защиту

1. Клетки периферической крови здоровых детей обладают выраженной цитокин-продуктивной активностью. Стандартные митогены индуцируют продукцию цитокинов, амплитуда и направленность которой имеют феноменологическое сходство у оппозитных пулов цитокинов, что свидетельствует о состоятельности регуляторных и эффекторных функций цитокиновой системы в норме.

2. Нейтрофилы и моноциты периферической крови здоровых детей проявляют хемотаксическую активность к регуляторам иммунного воспаления: ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-8, ГМ-КСФ, смесь ИНФб2 (c) б2 (d), лейкинферон, А5-фракция пептидосодержащих секреторных продуктов нейтрофилов, активированных латексом, к живым суточным культурам бактерий, наиболее часто вызывающих хирургическую инфекцию, к антибактериальным препаратам - амоксиклаву, гентамицину, линкомицину, цефотаксиму. Непосредственный контакт in vitro биорегуляторов, микроорганизмов и антибактериальных препаратов вызывает двигательную рефрактерность данных клеток.

3. Одним из проявлений развивающегося иммунодефицитного состояния у детей при травматической болезни является гиперпродукция провоспалительных цитокинов с дисбалансом в цитокиновой регуляторной сети, преимущественно в системе хемокиновых интерлейкинов.

4. Дефекты цитокиновой регуляторной сети детерминируют развитие мобилизационной блокады фагоцитов, наиболее выраженной в остром периоде травматической болезни и при развитии гнойно-воспалительных осложнений. Кинезия нейтрофилов и моноцитов взаимосвязана с уровнем остеорепарации. Локомоторная дисфункция фагоцитов влияет на интенсивность резорбтивных процессов и может приводить к замедленному сращению перелома.

5. Антибактериальные препараты, применяемые в качестве средств этиотропной терапии при лечении гнойно-воспалительных осложнений травматической болезни, выступают как модуляторы цитокин-продуктивной активности фагоцитов и, в целом, воспалительной реакции, что усугубляет двигательные дисфункции данных клеток.

6. Метилурацил, нуклеинат натрия и АТФ обладают выраженным стимулирующим влиянием на угнетенную кинетическую функцию фагоцитов детей с механической травмой. Максимальная эффективность кинетикостимулирующего действия этих препаратов достигается подбором индивидуальной дозы, основанным на оценке хемотаксиса клеток к стандартному хемоаттрактанту под действием различных концентраций препаратов in vitro.

Внедрение результатов исследования

Разработанный методический подход внедрен в практику работы детского городского ортопедотравматологического отделения МУЗ ГП№1 г. Челябинска и ортопедотравматологического отделения ГМЛПУЗ "Челябинская областная клиническая больница" и в лаборатории диагностики иммунодефицитных состояний НИИ иммунологии ГОУ ВПО "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедрах хирургии, ортопедии и травматологии детского возраста и микробиологии, вирусологи, иммунологии ГОУ ВПО "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на постерной сессии конкурса молодых ученых VI конгресса педиатров России (Москва, 2000); на I научно-практической конференции “Вклад молодых ученых и специалистов в развитие науки и культуры г. Челябинска. Состояние. Проблемы. Перспективы" (Челябинск, 2000); на XIV Российской научной конференции “Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях” (Челябинск, 2000); на конференции, посвященной 20-летию ЦНИЛ Челябинской государственной медицинской академии “Современные технологии в биологии и медицине” (Челябинск, 2000); на III Российской межрегиональной конференции, посвященной 60-летнему юбилею Челябинской государственной медицинской академии "Новые технологии и фундаментальные исследования в медицине" (Челябинск, 2002); на межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья “Биохимия: от исследования молекулярных механизмов до внедрения в клиническую практику и производство” (Оренбург, 2003); на Российской научно-практической конференции “Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии в педиатрии" (Оренбург, 2003); на VII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2003); на Первой Международной Конференции “Проблемы популяционного здоровья” (Челябинск-Монреаль, 2003); на III конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003); на научной сессии, посвященной 60-летию Челябинской государственной медицинской академии "Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения" (Челябинск, 2004); на конференции, посвященной 10-летию НПЦ диагностики, лечения и профилактики дисбактериозов НИИ иммунологии ЧелГМА и 60-летию ГОУ ВПО “Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ” “Современные проблемы диагностики и лечения дисбактериозов” (Челябинск, 2004); на VIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. "Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии" (Санкт-Петербург, 2004); на Объединенном Иммунологическом Форуме (Екатеринбург, 2004); на IV конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 28 научных работ. Издана монография.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 360 страницах текста, набранного на компьютере в текстовом редакторе Microsoft Word, иллюстрирована 46 таблицами, 43 рисунками и 5 фотографиями, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 366 источников, в том числе 241 отечественных и 125 зарубежных авторов.

Содержание работы

Материал и методы исследования

Нами проведено клинико-иммунологическое обследование 235 детей с механической травмой в различные периоды травматической болезни, находившихся на лечении в детских травматологоортопедическом и хирургическом отделениях Челябинской областной клинической больницы. Преимущественно это были мальчики - 172 (73,19 %). Средний возраст детей составил 9,5 лет.109 (46,38%) пострадавших поступили в первые 24 часа после травмы. У 165 (70,21%) больных были выявлены изолированные, у 52 (22,12%) - множественные и у 12 (7,67%) - сочетанные повреждения. У 222 (94,46%) пациентов травма носила закрытый характер. У 27 % детей при множественной и сочетанной травме были повреждены одновременно 2 и 3 сегмента. Ведущим было повреждение трубчатых костей скелета. Из 293 переломов 72% приходились на сегменты верхней конечности. Переломы плечевой кости - в 35,15% (103) случаях, переломы костей предплечья - в 31,3% (92) эпизодах. Повреждения костей нижней конечности диагностированы у 81 (27,65%) ребенка. Переломы бедра выявлены в 13% (38) случаях, а переломы костей голени - в 14,68% (43) наблюдений.

Исследование показателей общей реактивности организма проводились в различные сроки после травмы: 1-2, 3-7, 8-14, 15-21 сутки, что соответствовало периодам течения травматической болезни: острый период, период развернутой клинической картины болезни и период реабилитации [по классификации Ю.Г. Шапошникова и соавт. (1989)]. В острый период травматической болезни нами были обследованы 109 детей, в катаболическую и анаболическую фазы периода развернутой клинической картины - соответственно 103 и 85 пострадавших и к моменту выздоровления - 85 детей. Группу контроля составил 41 здоровый ребенок. При анализе результатов обследования детей с переломами трубчатых костей нами было установлено, что у 88,1% из них травматическая болезнь протекала в целом благоприятно, а у 27 больных (12 %) развились гнойно-воспалительные осложнения, среди которых наиболее часто встречались нагноения ран. Возбудитель был идентифицирован только у 9 пациентов и представлен золотистым стафилококком.

Большинство (211 детей - 89,8 %) обследованных детей с травмой поступали в клинику в удовлетворительном и средней степени тяжести состоянии. Все они были беспокойны и жаловались на боли различной интенсивности в зоне повреждения. У 65,1% пострадавших болевой синдром был значительно выражен. У всех детей отмечено повышение местной температуры в области поражения, которое сопровождалось умеренной гиперемией кожных покровов. Выраженный отек области перелома с распространением на соседние участки выявлен у 65,11%, кровоизлияние в ткани в месте перелома - у 23,25% пострадавших. Видимая деформация поврежденного сегмента наблюдалась у 79 % пациентов, ограничение функции - у 82,36% детей. Патологическая подвижность и крепитация наблюдались у 13,95% больных.

Общая температурная реакция характеризовалась кратковременным повышением температуры чаще до субфебрильных цифр.

О развитии острофазовой воспалительной реакции мы судили по уровню гаптоглобина, б₁-антитрипсина, б₂-макроглобулина, трансферрина, С-реактивного белка, который определяли иммунонефелометрическим методом на аппарате `”ARRAY” фирмы “Beckman” (USA).

Состояние гуморального звена иммунитета оценивали по уровню сывороточных иммуноглобулинов классов A, G и M, а также по содержанию С3 - и С4-фрагментов комплемента, изучаемых с помощью иммунонефелометрического метода на аппарате `”ARRAY” фирмы “Beckman” (USA).

О характере изменений фагоцитарной системы судили по количеству циркулирующего пула поли - и мононуклеарных фагоцитов периферической крови и их функциональной способности.

Эффекторную функцию фагоцитов оценивали по спонтанной миграции, хемокинезу и хемотаксису (Nelson R. D. et al., 1975; Эберт Л.Я. и соавт., 1985), способности поглощать частицы полистирольного латекса (Эберт Л.Я. и соавт., 1985), по восстановлению нитросинего тетразолия в частицы дифармозана (Маянский А.Н., Виксман М.Е., 1979; Segal A. W., 1974) и по уровню суммарного свечения лизосом в цитоплазме клеток (Хейфец Л.Б., Абалакин В.А., 1973; Фрейдлин И.С. и соавт., 1977; Gordon S., 1973). Нейтрофилы и моноциты из периферической крови получали методом, предложенным Wong L., Wilson R. D, 1975.

Цитокиновый профиль оценивали по спонтанной и индуцированной продукции стандартными митогенами - липополисахаридом (ЛПС) E. coli и ФГА цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10 и ИНФ- в супернатантах клеток периферической крови. Для этого были использованы соответствующие тест-системы для ИФА, произведенные ООО "Цитокин" (Санкт-Петербург). В наборах применен “сандвич” - вариант твердофазного ИФА. Результат анализа вычисляли по калибровочному графику после измерения оптической плотности с помощью микропланшетного ридера “ANTHOS 2020” при длине волны 492 нм.

Определение уровня маркеров костного метаболизма производили ИФА-методом на иммуноферементном анализаторе Personal Lab (Италия) с использованием тест-систем Calcitonin ELISA (США), N-MID Osteocalcin ELISA (США), Serum Cross-Laps ELISA (США).

Статистическая обработка результатов проведена с использованием компьютерной программы "STATISTICА" (StatSoft, USA), компьютер на базе процессора Intel Pentium (ОС Microsoft Windows XP Professional). Оценку полученных результатов проводили методами стандартной вариационной статистики. Для проверки гипотезы о нормальности распределения использовали критерии Колмогорова-Смирнова и ч^{2 (}Боровиков В.П., 2001). Сравнивали дисперсии изучаемых выборок, применяя F-критерий Фишера (Зайцев В.М., с соавт., 2003). Оценку достоверности различий между средними при нормальном распределении проводили с использованием t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони (Гланц С., 1998). Для оценки зависимости локомоторной функции фагоцитов от уровня цитокинов определяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r_s), р<0,01. Проверку статистической значимости новой технологии проводили с использованием двухстороннего t-критерия Стьюдента, t_крит.: 2,00 - 2,06, при р0,05 (Зайцев В.М., с соавт., 2003).

Обследование выполнено после одобрения этическим комитетом ЧелГМА протокола клинико-экспериментального исследования на соответствие предлагаемой работы требованиям Хельсинской декларации всемирной медицинской ассоциации.

цитокинопосредованная дисфункция локомоторная активность фагоцит

Результаты исследования и их обсуждение

Примечание: * - достоверные различия с контролем при уровне значимости р0,01, ** - достоверные различия средних исследуемых показателей ЛПС - и ФГА-индуцированной продукции цитокинов при уровне значимости р0,001.

Эти закономерности свидетельствуют, с одной стороны, о полноценности интегративных механизмов эндогенной системы цитокинов и способности к саморегуляции, а с другой стороны, о высоком активационном потенциале клеток здоровых детей к синтезу и секреции цитокинов.

Патогенетическая неоднородность или стадийность заболевания сочетается с неодинаковыми реакциями в цитокиновой сети, и по-разному от них зависят. Это подтверждается результатами исследования спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокинов ИЛ-1, ИЛ10, ИЛ-8, ИЛ-4 и ИНФ-б у детей с травматической болезнью в различные стадии процесса (табл.2). Уже в дебюте травматической болезни резко увеличивалась спонтанная продукция как про-, так и противовоспалительных цитокинов, с максимальной концентрацией ИЛ-8. При этом спонтанная продукция ИЛ-1 в остром периоде травмы превосходила таковую у здоровых детей почти в 7 раз, в то же время продукция амбивалентного цитокина ИЛ-10 возрастала - в 15 раз. Нестимулированная выработка ИЛ-8 достоверно увеличивалась в остром периоде травматической болезни по сравнению с нормой в 4,5 раз, в то время

Таблица 2. Показатели продукции цитокинов in vitro клетками периферической крови здоровых детей и пациентов с травматической болезнью

Примечание: * - достоверные различия с нормой при уровне значимости р0,02, # - достоверные различия с острым периодом при уровне значимости р0,05.

как синтез ИЛ-4, который подавляет продукцию хемокина (Ковальчук Л.В., Сайгитов Р.Т., 2000; Фрейдлин И.С. с соавт., 2002), возрастал только в 3 раза, одновременно с этим концентрация ИЛ-8 превосходила концентрацию ИЛ-4 почти в 30 раз.

В период развернутой клиники клетки периферической крови травмированных детей (табл.2) продолжали активно секретировать весь исследуемый спектр цитокинов даже в режиме спонтанного культивирования. Наиболее высокий уровень продукции демонстрировал ИЛ-10 и оппозитный острофазозый цитокин - ИЛ-1. Выработка ИЛ-8 в 2,6 раза была выше, чем показатели у здоровых детей, а ИЛ-4 лишь в 1,6 раза. Несмотря на относительно высокие параметры базальной продукции тестируемых медиаторов в данный период травматической болезни, нами отмечена относительная стабилизация повышенного уровня цитокинов, проявляющаяся в снижении секреции исследуемых цитокинов в среднем в 2 раза по сравнению с острым периодом, что возможно связано с активацией механизмов ауто - и паракринной регуляции секреции цитокинов (Козлов В.А., 2002).

Об относительности стабилизации и патогенетической незавершенности травматического процесса свидетельствуют и показатели соотношения оппозитных цитокинов (рис.1). Если соотношение уровня ИЛ-1/ИЛ-10 на фоне их активной продукции не меняется, то соотношение продукции ИЛ-8 к ИЛ-4 прогрессивно растет, что еще больше усугубляет цитокиновый дисбаланс в период развернутой клиники уже развившийся в более раннем посттравматическом периоде. При этом нарушения цитокиновой сети касаются преимущественно ее хемокинового звена, а именно снижение продукции ИЛ-4, как регулятора (ингибитора) избыточной продукции хемокинов, на фоне активной секреции ИЛ-8.

Примечание: * - достоверные различия с нормой при уровне значимости р0,05

Рисунок 1. Динамика соотношения оппозитных цитокинов в норме и при травматической болезни.

Уровень ИНФ- в раннем посттравматическом периоде достоверно уменьшался почти в 2,5 раза в сравнении с нормой и продолжал прогрессивно падать в период развернутой клинической картины болезни.

Особенности функционирования цитокиновой сети, как в норме, так и при патологических состояниях наиболее ярко проявляются в условиях активации иммунокомпетентных клеток. Нами установлено, что в раннем посттравматическом периоде ЛПС инициировал разнонаправленные эффекты цитокин-продуктивной активности клеток периферической крови. Эндотоксин и ФГА лишь умеренно стимулировали продукцию ИЛ-1. Индекс стимуляции (ИС) был в 15 раз ниже для ЛПС и в 3 раза - для ФГА. Динамика секреции ИЛ-10 в присутствии бактериального митогена была противоположной. Клетки периферической крови травмированных детей отвечали на ЛПС не усилением продукции ИЛ-10, а наоборот, ее угнетением, при этом индекс стимуляции был более чем в 70 раз ниже, чем у здоровых детей. ФГА, напротив, вызывал стимуляцию продукции ИЛ-10. В период развернутой клиники бактериальный митоген реализовывал свой стимулирующий эффект в большей степени, увеличивая секрецию ИЛ-1 в 3 раза и ИЛ-10 в 1,8 раза, что может свидетельствовать о частичном восстановлении регуляторного потенциала цитокиновой системы.

Уровни секреции оппозитных цитокинов ИЛ-1 и ИЛ-10, как и уровни ИЛ-8 и ИЛ-4, продуцируемых ex vivo, в ответ на стимуляцию эндотоксином и ФГА отличались и в раннем посттравматическом, и в более позднем, периодах болезни. Их профиль не имел такого феноменологического сходства, как у здоровых детей и характеризовался асинхронностью ответа на индуктор.

Таким образом, патологическая активация фагоцитов и других иммуноцитов, проявляющаяся, в частности, в повышенной продукции острофазовых цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-8, наиболее выраженной в ранний период посттравматической деструкции, направлена скорее на эффекторное обеспечение повреждающих, нежели репарирующих механизмов иммунного ответа. По нашему мнению, именно высокие уровни продукции цитокинов, в частности, ИЛ-8 определяют развитие мобилизационной блокады фагоцитов, подвижных продуцентов и носителей регуляторов воспаления. Поскольку эти клетки приходят в очаг воспаления или повреждения главным образом из других мест и являются необходимыми элементами процесса, то наряду с вопросами о природе медиаторов, их секреции и механизмах активации, возникает вопрос о том, как изменяется и регулируется их миграционная активность?

Локомоторная функция Нф и Мн исследовалась у 235 детей с переломами костей скелета. Контрольную группу составил 41 здоровый ребенок. В качестве хемоаттрактантов нами были использованы известные регуляторы иммунного воспаления (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-8, ГМ-КСФ, смесь ИНФ-б2 (с) б2 (d), лейкинферон (естественный цитокиновый комплекс), А5-пептидосодержащее вещество, выделенное из супернатантов активированных нейтрофилов). Контролем служил стандартный хемоаттрактант - С5а-фрагмент комплемента.

Установлено, что изучаемые регуляторы иммунного воспаления обладают выраженными хемокинетикотропными свойствами как по отношению к нейтрофилам, так и к моноцитам здоровых детей (рис.2).

После травмы происходит снижение целенаправленного движения нейтрофилов и моноцитов ко всем изучаемым хемоаттрактантам (рис.2). Такая "функциональная рефрактерность" к хемоаттрактантам развивается после контакта с раздражителем и носит системный характер, не связанный с локализацией очага воспаления. В её основе лежит сокращение числа рецепторов, доступных для взаимодействия с новыми порциями лиганда. Негативный эффект потенцируется, если за связыванием следует эндоцитоз, ведущий к структурной изоляции рецептора (Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993).

Рисунок 2. Хемотаксис фагоцитов периферической крови здоровых детей (n=41) и пациентов с ТБ (n=109) в острый период к биологически активным веществам различной природы.

Примечание * - достоверность различий с нормой при р0,01.

Рисунок 3. Спонтанная миграция и хемокинез нейтрофилов периферической крови здоровых детей (n=41) и пациентов с ТБ (n=211) под действием биологически активных веществ различной природы.

Сравнение результатов исследования влияния регуляторов цитокиновой сети на хемокинетическую функцию фагоцитов здоровых и травмированных детей, показало, что характер изменений хемокинеза Нф и Мн, наблюдаемый после травмы и у здоровых детей, индуцируемых исследуемымицитокинами, почти полностью совпадает (рис.3). По сути дела при непосредственном воздействии данными веществами на фагоциты здоровых детей in vitro мы фактически моделировали состояние этих клеток, схожее с тем, которое развивается после тканевой деструкции.

Далее предстояло выяснить, насколько изменения локомоторной функции Нф и Мн у детей с травматической болезнью играют отрицательную роль в плане развития гнойно-воспалительных осложнении. Для этого нами были обследованы 27 детей, у которых в посттравматическом периоде развились гнойно-воспалительные осложнения.

Осложненное течение травматической болезни характеризовалось еще более выраженным угнетением целенаправленной подвижности фагоцитов уже в остром периоде. Почти ко всем изучаемым регуляторным факторам отмечалось снижение направленной миграции как Нф, так и Мн. При этом Нф становились наиболее рефрактерны к ИЛ-1 и еще менее чувствительны к ИЛ-8 и ГМ-КСФ. Повышением чувствительности Нф отвечали только на смесь ИНФ б2 (с) б2 (d).

Таким образом, развитие гнойно-воспалительных осложнений у травмированных детей сопровождается еще более выраженным угнетением как хемокинетической, так и хемотаксической функции фагоцитов. Запоздалая миграция фагоцитов в очаг тканевой деструкции не позволяет данным клеткам эффективно реализовать элиминационный потенциал, а также участвовать в процессах репаративной регенерации костной ткани.

Далее необходимо было выяснить, как изменяется соотношение процессов формирования и резорбции костной ткани в условиях мобилизационной блокады нейтрофилов и моноцитов.

Индикаторами костного метаболизма являются маркеры костного ремоделирования - продукты костного матрикса и клеток кости.

Нами были исследованы три маркера метаболизма костной ткани кальцитонин (специфический гормональный ингибитор паратгормона), остеокальцин (костный глутаминовый белок - BGP - биохимический маркер формирования кости, характеризующий функцию остеобластов) и С-телопептиды коллагена I типа (CrossLaps) (маркер костной резорбции, характеризующий функцию остеокластов).

Содержание сывороточного кальцитонина у здоровых детей, составило 2,13±0,03 пг/мл. В раннем посттравматическом периоде отмечалась лишь тенденция к его повышению в сыворотке (3,06±0,18 пг/мл) в пределах возрастной нормы (рис.4). В катаболическую фазу второго периода нами было зафиксировано достоверное повышение сывороточной концентрации кальцитонина более чем в 35 раз в сравнении со здоровыми детьми.

Примечание * - достоверность различий с нормой при р0,001.

Рисунок 4. Уровень кальцитонина в сыворотке крови здоровых детей (n=15) и пациентов с травматической болезнью в острый период (n=15) и катаболическую фазу (n=15) периода развернутой клинической картины.

У здоровых детей содержание остеокальцина составило 95,97±4,87 пг/мл, а С-телопептидов коллагена I типа (CrossLaps) - 0,59±0,01 нг/мл (рис.5). При травматическом повреждении костной ткани в острый период уровень остеокальцина колебался в пределах возрастной нормы. В то время как концентрация маркера остеогенной деструкции достоверно увеличивалась почти в 2,5 раза, что свидетельствует об усилении в первые часы после травмы только резорбтивных процессов.

Примечание * - достоверность различий с нормой при р0,01.

Рисунок 5. Уровни остеокальцина и С-телопептидов коллагена I типа (CrossLaps) в сыворотке крови здоровых детей (n=15) и пациентов с травматической болезнью в острый период (n=15) и катаболическую фазу (n=15) периода развернутой клинической картины.

Концентрация остеокальцина сыворотки крови в катаболическую фазу снижалась как по отношению к норме более чем в 3 раза и в сравнении с острым периодом - на 60%. Концентрация же маркера остеогенной резорбции продолжала увеличиваться и в катаболическую стадию процесса.

Итак, механическое повреждение костной ткани уже в первые часы после травмы индуцирует резорбтивные процессы, приводя к дисбалансу остеогенеза и резорбции, интенсивность которой коррелирует со степенью нарушения локомоторной активности фагоцитов.

Учитывая, что риск перехода "физиологического" воспаления в инфекционный процесс во многом будет зависеть от функционального кинетического резерва фагоцитов важно было установить насколько эти клетки способны в условиях посттравматического воспаления отвечать на дополнительную хемотаксическую нагрузку бактериями и их дериватами.

С этой целью мы исследовали локомоторную функцию Нф у 134 детей с неосложненной и у 27 пациентов с осложненной механической травмой скелета. Контрольную группу составил 41 здоровый ребенок. В качестве хемоаттрактантов использовали вещества как бактериального, так и небактериального происхождения. Живые суточные бактериальные культуры Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, а также супернатанты нейтрофилов, полученные после инкубации с данными микроорганизмами (САН).

Изучаемые суточные культуры живых бактерий обладали выраженной хемотаксической активностью. Индекс хемотаксиса нейтрофилов здоровых детей к бактериям достоверно превышал уровень их спонтанного радиального движения. Аналогичные изменения хемотаксиса нейтрофилов здоровых детей нами зарегистрированы и к САН (рис.6).

Примечание * - достоверность различий с контролем при р0,01.