Размещено на http://www.allbest.ru/

Исследование химического состава препарата АСД-2Ф

Абдрахманов Валерий Ильдусович / Abdrahmanov Valery Ildusovich - директор по развитию;

Сахипов Валерий Ринатович / Sahipov Valery Rinatovich - начальник лаборатории ОТК, ООО «Гамма-Хим НН»;

Краснов Владимир Львович / Krasnov Vladimir Lvovich - кандидат химических наук, доцент, кафедра «Химическая технология», Дзержинский политехнический институт (филиал), Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева, г. Дзержинск, Нижегородская область

Аннотация: приведена количественная информация о химическом составе препарата АСД-2Ф, полученная методами спектроскопии протонного магнитного резонанса, высокоэффективной жидкостной хроматографии, хромато-масс-спектрометрии и ацидиметрическим титрованием, которая позволила найти органические соединения, определяющие его лечебно-профилактическое действие и показатели качества препарата.

Abstract: presented quantitative information on the chemical composition of a preparation ASD-2F obtained by proton magnetic resonance spectroscopy, high performance liquid chromatography, gas chromatographymass spectrometry and acidimetric titration, which allowed to find organic compounds that determine its therapeutic and preventive action and indicators of the quality of the drug.

Ключевые слова: химический состав, антисептик-стимулятор Дорогова, препарат АСД-2Ф, спектроскопия протонного магнитного резонанса, высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия.

Keywords:chemical composition, Dorogov's antiseptic-stimulant, preparation ASD-2F, proton magnetic resonance spectroscopy, high performance liquid chromatography, gas chromatography-mass spectrometry.

Препарат АСД-2Ф является водной фракцией конденсированных веществ, получаемых в процессе пиролиза мясокостной муки с содержанием животных белков не менее 50 % в диапазоне температур 100-500єC [1]. Препарат АСД-2Ф широко и успешно применяется в ветеринарии уже более шестидесяти лет, однако, до сих пор не существует однозначного признанного мнения о химическом составе этой фракции, что в значительной мере ограничивает возможные сферы его применения и затрудняет достоверное определение показателей качества [2-6].

Для обоснования требований к препарату АСД-2Ф сначала [2] было установлено содержание воды (70-75 %) и аммонийных солей (10-15 %) в этой фракции. Предполагалось присутствие в препарате различных неорганических и органических азотистых соединений: аммиака, карбоната аммония, карбамината аммония, бикарбоната аммония, сульфида аммония, цианида аммония, роданида аммония. Среди органических веществ, которые были идентифицированы в водной фракции, присутствовали амины, амиды жирных кислот и отсутствовали ароматические соединения. Применение спектроскопии ядерного магнитного резонанса [3-5] позволило предложить использовать ПМР - спектр в качестве «дактилоскопического паспорта» препарата АСД-2Ф. Данные спектроскопии протонного магнитного резонанса (ПМР) свидетельствуют [3-5] о наличии в препаратеалифатических органических соединений, а именно aмидов карбоновых кислот, xoлина и xoлинoвых эфиpов, алициклических производных карбамида, метилcульфидов.

По мнению авторов [6], проводивших исследование АСД-2Ф методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в препарате содержится до 18 г/л аминокислот в свободном и связанном виде.

Использование метода хромато-масс-спектрометрии [8] позволило получить наиболее полное, на сегодняшний день, описание химического состава «органической части» АСД-2Ф, включающей 121 вещество.

В настоящей статье представлены результаты обобщения исследований в данной области. В качестве объектов исследований использовали образцы готовой формы препарата АСД-2Ф, произведенные совместно ООО «АРЕАЛ МЕДИКАЛ» и ООО «НВЦ Агроветзащита», различных серий, выпущенные в период с ноября 2014 г. по май 2015 г.

Подлинность субстанции определяли органолептически по внешнему виду и запаху и проверяли методом спектроскопии ПМР в соответствии с рекомендациями [3-5].

Такие характеристики субстанции, как плотность и рН определялись общепринятыми методами. Было установлено, что неорганическая часть препарата практически полностью состоит из карбоната аммония, который был выделен из субстанции АСД-2Ф высаливанием изопропиловым спиртом, а также нагреванием субстанции в диапазоне температур 50-100єC с последующей конденсацией карбоната, и идентифицирован общеизвестными реакциями.

Количественное определение содержания карбоната аммония проводили ацидиметрическим титрованием субстанции АСД-2Ф по схеме, предложенной нами и опубликованной в данном журнале [7].

Кривые титрования разбавленной субстанции АСД-2Ф рабочим раствором соляной кислоты, полученные методом рН-метрии, содержали две точки эквивалентности в области рН1=7.65 и рН2=4.07, соответствующие двум ступеням титрования карбоната аммония, превращающегося сначала в гидрокарбонат аммония, согласно реакции I, и затем в хлорид аммония и угольную кислоту, согласно реакции II:

(NH4)2CO3 + HCl = NH4Cl + NH4HCO3 (I)

NH4HCO3 + HCl = NH4Cl + H2CO3 (II)

Для расчета с помощью формулы (1) содержания карбоната аммония (m((NH4)2CO3), г/л), достаточно определить объем 0,1н соляной кислоты, затрачиваемый на титрование разбавленной субстанции АСД-2Ф от 1-ой до 2-ой точки эквивалентностиТ Т . m((NH4) (1)

химический препарат спектроскопия

Здесь Vк - объем мерной колбы , VАСД - объем пробы, Vп - объем пипетки.

Например, если согласно результатам титрования 10 мл АСД-2Ф, приведенным в работе [7], принятьТ Т мл, Vк/Vп = 25, то содержание карбоната аммония m((NH4)2CO3)составляет 300 г/л. В таблице представлены результаты определения содержания карбоната аммония в трех образцах препарата АСД-2Ф, изменяющегося в диапазоне 286-319 г/л при плотности субстанции 10801100 г/л.

Приведенные в таблице результаты вместе с данными по содержанию воды служат рамкой для информационной картины, отражающей химический состав фракции. Особенность этой картины в том, что неорганическая «рамка», представляющая собой водный раствор карбоната аммония, занимает 9395 % всей субстанции, в то время как на многочисленные органические вещества, часть которых, несомненно, ответственна за уникальное лечебно-профилактическое действие препарата, приходится лишь 5-7 % массы субстанции АСД-2Ф.

Для правильной интерпретации приведенных в таблице данных следует учитывать, что экспериментальные результаты определения содержания воды в субстанции (m(H2O)эксп.), изменяющиеся в диапазоне 780-796 г/л, получали путем азеотропной дистилляции образца препарата объемом 10 мл по методу [10]. В круглодонную колбу заливали 10 мл препарата АСД-2Ф, добавляли концентрированную серную кислоты для нейтрализации образца и 60 мл бензола. Вода образует с бензолом азеотропную смесь и при кипячении с помощью насадки Дина-Старка собирается в водоотделителе, а бензол возвращается обратно в колбу. Содержание воды рассчитывается по формуле: m(H2O)эксп. = 100 V(H2O), где V(H2O) - объем воды в мл. При этом вместе с водой, имеющейся в препарате до нейтрализации, определялась вода, выделяющаяся при взаимодействии карбоната аммония с серной кислотой по реакции III:

(NH4)2CO3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 + H2O (III)

Количество воды, выделившейся при нейтрализации карбоната аммония и получившей, соответственно, наименование «связанной», определяли расчётным путём: m(H2O)связ. = 0,1875 m((NH4)2CO3). Соответственно, если термином «свободная» вода обозначить содержание воды в препарате до нейтрализации, то оно может быть рассчитано как разность между экспериментально определяемым количество воды и «связанной» водой: m(H2O)свободн. = m(H2O)эксп. - m(H2O)связ.

Для расчета массы органических веществ, содержащихся в препарате АСД-2Ф, из массы препарата вычитали массу раствора карбоната аммония: mорг.в-в. (расч.) = 1000с - m(H2O)свободн. - m((NH4)2CO3).

Поскольку известно, что карбонат аммония полностью разлагается на аммиак и углекислый газ при нагревании, оказалось возможным экспериментально определить содержание органических веществ в субстанции. Для обеспечения максимальной сохранности органических веществ упаривание раствора карбоната аммония проводили следующим образом: предварительно препарат наносили на подложку из аэросила (оксид кремния) марки А-300, после чего полученные образцы нагревали при температуре не выше 65єC до прекращения выделения аммиака. Далее в образцах проверяли наличие карбоната аммония, и при его отсутствии определяли содержание воды по методу [10] (без использования серной кислоты).

После этого массу органических веществ на подложке определяли экспериментально, прокаливая образцы в муфельной печи. В полученных образцах определяли также содержание «общего» азота по Кьельдалю согласно методике [11]. Полученные результаты представлены в таблице.

Химический состав органической части препарата изучали по результатам работы [8], в которой приведены экспериментальные данные, полученные методом хромато-масс-спектрометрии.

Вещества, найденные этим методом в препарате АСД-2Ф, объединяли в группы по родственным признакам, касающихся особенностей их химического строения и состава, изучали литературные данные по биологической активности, что позволило выявить вещества, определяющие, на наш взгляд, лечебно-профилактическое действие препарата.

Таблица 1. Показатели препарата АСД-2Ф

Как видно из данных таблицы 1, для диапазона плотностей серийных образцов 1,08-1,1 г/ см3, основную часть препарата составляет вода, содержание которой находится в диапазоне (для «свободной» воды) 720-742 г/л, или 65,5-68,7 % соответственно. Также незначительно изменяется и содержание основного неорганического компонента препарата - карбоната аммония - от 286 до 319 г/л или 26,5-29 % соответственно. Полагая, что карбонат аммония не обладает заметным собственным лечебным эффектом, можно считать, что действие препарата обеспечивается органическими веществами, количество которых находится, согласно двум предпринятым способам оценки, в диапазоне концентраций 52-83 г/л или 4,8-7,5 %.

При формировании групп из 121 органических веществ, обнаруженных при хроматографировании препарата АСД-2Ф, принимали во внимание вещества, сходные по составу, суммарное содержание которых составляло не менее 1 % относительно массы органических соединений. В результате обработки сформированы 7 основных групп из 79 веществ и выделены 5 индивидуальных веществ, суммарное содержание которых составляло 95 % от всех органических веществ.

Результаты обобщения данных хромато-масс-спектрометрии препарата АСД-2Ф представлены на рисунке:

Рис. 1. Химический состав органической части препарата АСД-2Ф

Первая группа соединений с суммарной долей 18,8 % массы органических веществ может быть составлена из 16 амидов низших насыщенных карбоновых кислот, являющихся прямыми продуктами термического распада белков в температурном диапазоне производства АСД-2Ф.

Пять групп веществ могут быть сформированы из азотсодержащих гетероциклических соединений с одним или двумя атомами азота. Суммарная доля азотсодержащих гетероциклических соединений среди органических веществ иной структуры составляет 38,4 %.

Известно, что данные соединения широчайшим образом представлены в качестве структурных фрагментов биологически активных веществ, витаминов, антибактериальных веществ, некоторые из них обладают собственной биологической активностью.

Следует отметить, что среди веществ, отнесённых к группам гетероциклических соединений, некоторые вполне могут претендовать и на отдельное рассмотрение из-за их высоких концентраций, составляющих иногда от 30 до 95 % от суммарной концентрации всей группы.

Например, в группе шестичленных гетероциклических соединений с одним атомом азота в цикле, составленной из 23 аминопиридинов и пиридинов (11 %), максимальную концентрацию имели такие вещества, как 2-аминопиридин (3,4 %), 3-метил-2-аминопиридин (2,2 %), пиколинамид (1,8 %), всего 7,4 %.

В группе пиразины и пиримидины (3 %) наибольшее содержание имели: метилпиразин (0,8 %, Т. кип. = 135 є С), 2, 3-диметилпиразин (0,9 %, Т. кип.= 156єС), триметилпиразин (0,5 %, Т. кип.= 171-172є С), всего 2,2 %.

Вещества группы пиразинов и пиримидинов входят в составнуклеиновых оснований, нуклеозидов, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, играют важную биологическую роль.

Группа пиперидиноны (16,1 %) практически представлена одним соединением: 2-пиперидон, или двалеролактам (15,7 %, Т.кип.=256єС). Производные 2-пиперидона предложены в качестве антагонистов простагландинов. В группе пирролидинонов (6,5 %) наибольшее содержание имеет 2-пирролидон (5 %,Т. кип. = 245єС). Пирролидоновый цикл входит в структуру ноотропных препаратов рацетамовой группы, водорастворимого полимера поливинилпироллидона - носителя различных фармацевтических средств.

Имидазолидиноны включают два вещества: 5,5-диметилгидантоин (6,3 %, Т. пл.=174-178°C) и dl-5этил-5 метил-2,4-имидазолидинон (3,6 %, Т.пл. = 144-150єС). Фенолы (2 %), широко известные, как антисептики, представлены группой из пяти веществ, в том числе 4-гидрокси-фенилфосфониевой кислотой.

Среди индивидуальных органических соединений, содержащихся в препарате АСД-2Ф, привлекает внимание 1, 3, 4, 6, 7, 9a-гексагидро-2H-хинолизидин (3,7 %, Т. кип. = 298°C), имеющий строение бициклического ненасыщенного азотсодержащего гетероцикла. Хинолизидин является структурным фрагментом биологически активных алкалоидов, таких как цитизин, пахикарпин, спартеин. Производные хинолизидина синтезируются в живых организмах из аминокислоты лизина.

При хроматографировании найдены также прямые продукты расщепления белковой цепи: циклические дипептиды, условно обозначенные на рис. 1 как циклодипептид 1 (гексагидро-3-(2-метилпропил)-пирроло-[1, 2-a]-пиразин-1, 4-дион, или Cyclo-Leu-Pro-дикето-пиперазин, Т. пл. =163-165єС) и циклодипептид 2 (5, 10-диэтокси-2, 3, 7, 8-тетрагидро-1Н,6Н-дипирроло [1, 2-a; 1', 2'-d] пиразин или этиловый эфир Cyclo-Pro-Pro-дикето-2,5-пиперазина Т пл. = 180є С) с содержанием в органической части АСД, равным 7,2 % и 9,2 % соответственно.

Известно [9], что дикетопиперазины (циклические дипептиды) ингибируют продукцию афлатоксина и обладают антимикробными свойствами, кроме этого данные соединения могут обладать анксиолитической и антидепрессивной активностью. Обсуждается и их антираковое действие [12].

Такие вещества, как нитрилы и изонитрилы, тиазолы, аминокислота валин также обнаружены в хроматограмме, но имеют весьма незначительные по сравнению с другими соединениями, концентрации. Поэтому в рамках данного исследования они не рассматривались.

Для всех остальных, выделенных нами групп веществ, рассчитана (по формулам среднего статистического) средняя молекулярная масса и молекулярная формула органической части препарата АСД-2Ф. м ср. = Ущi / У(щi/мi) = 112,5 г/моль.

Полученная усредненная формула органической части АСД-2Ф, соответствующая средней молекулярной массе 112,5 г/моль, имеет вид:

Эта формула соответствует элементному анализу органической части препарата: 58,99 % С, 8,22 % Н, 17,75 % N. Поскольку содержание органических веществ является важной характеристикой препарата, то анализ «общего азота» (%Nэксп.) органической части АСД-2Ф (см. строку 4.4 в таблице) может быть использован для расчета этой характеристики: mорг. в-в =10с k (%Nэксп.).

Коэффициент пересчета k, входящий в формулу согласно приведенному элементному анализу k = 100/17,75 = 5,63.

Таким образом, в результате анализа собственных и литературных данных нами обоснован следующий состав препарата АСД-2Ф для плотности субстанции в диапазоне 1,08-1,1г/см3:

- вода «свободная» - 720-742 г/литр (65,5-68,7 %); - карбонат аммония - 286-320 г/литр (26,5-29 %); - органические вещества - 52-83 г/литр (4,8-7,5 %).

В данной работе предложены общедоступные экспериментальные методики определения обобщенных показателей химического состава препарата АСД-2Ф, позволяющие оперативно и достоверно определять показатели качества препарата.

Показано, что органическая часть препарата содержит значительное количество (около 100) веществ, являющихся структурными фрагментами биологически активных веществ, витаминов, антибактериальных веществ, а также обладающих собственным лечебным действием. Не менее 50 % органических веществ составляют гетероциклические азотосодержащие вещества с одним или двумя атомами азота: аминопиридины и пиридины; пиразины и пиримидины, пиперидиноны, пирролидиноны, имидазолидиноны. Среди гетероциклических соединений наибольший интерес могут представлять: хинолизидин (1, 3, 4, 6, 7, 9a-гексагидро-2H-хинолизидин) с содержанием в органической части 3,7 % и циклические дипептиды Cyclo-Leu-Pro-дикетопиперазин (7,2 %) и этиловый эфир Cyclo-Pro-Pro-дикето-2,5-пиперазина (9,2%), обладающие, предположительно, антираковым действием.

Литература

1. Николаев A. B. О химическом составе и новых фракциях препарата АСД. // Труды ВИЭВ. 1959. Т. 22. C. 317-326.

2. Дерябина З. И. Химико-фармакологическая характеристика препарата АСД. // Труды ВИЭВ. 1963. Т.

25. C. 326-339.

3. Абдрахманов В. И., Кирюткин Г. В., Жукова В. В., Краснов В. Л. Утилизация отходов переработки белкового сырья. // Труды НГТУ. Химическая и пищевая промышленность: современные задачи техники, технологии, автоматизации, экономики. 2004. Т. 45. С. 67-68.

4. Абрамов В. Е., Абдрахманов В. И., Дорогова О. А., Кирюткин Г. В., Краснов В. Л. Определение показателей качества препарата АСД-2. // Ветеринария. 2004. № 9, С. 13-15.

5. Абдрахманов В. И., Дорогова О. А., Кирюткин Г. В., Краснов В. Л. Сравнение показателей качества препарата АСД-2Ф, производимого ООО «Ареал-Медикал» и ФГУП «Армавирская биофабрика». // Зооиндустрия. 2005. № 1.С. 5.

6. Абрамов В. Е., Кугелева Т. И., Сироткина В. П., Касперович В. П. Показатели качества субстанции АСД-2Ф. // Ветеринария. 2010. № 2. С. 42-44.

7. Абдрахманов В. И., Сахипов В. Р., Краснов В. Л., Сулимов А. В. Титрование препарата АСД-2Ф. // Проблемы современной науки и образования. - 2015. № 4 (34). С. 38-45.

8. Пат. РФ № 2494750 от 10.10.2013. Способ получения стабилизированной формы антисептикастимулятора Дорогова - фракции 2 (АСД-2).

9. Лапинская Е. С. Аминокислоты и циклические дипептиды в настойках гомеопатических матричных URTRICA DIOCA L. и URTRICA URENS L. // Химико-фармацевтический журнал. Т. 42. 2008. №11. с. 49-52.

10. ГОСТ32055-2013. Нефтепродукты и материалы битумные. Определение содержания воды с помощью перегонки.

11. ГОСТ 13496.4-93. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения азота и содержания сырого протеина.

12. Sai Lakshman Mithun. C. S. V. Ramachandra Rao. Isolation and Molecular Characterization of AntiCancerous Compounds Produsing Marine Bacteria by Using 16S rRNA Sequencing and GC-MS Techniques. // International Jornal of Modern Engineering Research (IJMER). 2012. V. 2. № 6. Р. 45102515.

Размещено на Allbest.ru