Клинико-иммунологические особенности врожденной генерализованной цитомегаловирусной и герпетической инфекции у детей первых трех месяцев жизни

Размещено на http://www.allbest.ru/

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВРОЖДЕННОЙ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОЙ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ И ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ ПЕРВЫХ ТРЕХ МЕСЯЦЕВ ЖИЗНИ

14.01.08 - педиатрия 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

левкович Александр Юрьевич

Ростов - на - Дону 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Афонин Александр Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор Сизякина Людмила Петровна

Официальные оппоненты:

Болотова Нина Викторовна, доктор медицинских наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет им.В.И.Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой пропедевтики детских болезней, детской эндокринологии и диабетологии

Сотникова Наталья Юрьевна, доктор медицинских наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им.В.Н.Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая лабораторией клинической иммунологии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «___» декабря 2013г. в _______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.05. на базе Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан «___»_____________2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доцент Шовкун В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Врожденная инфекционная патология у детей является одной из наиболее сложных и чрезвычайно важных медико-социальных проблем современной педиатрии и неонатологии. Врожденная инфекция выявляется у 27,4-36,6% новорожденных, при этом инфекционная патология занимает ведущее положение в структуре перинатальной смертности, обусловливая от 11% до 45% потерь, мертворождаемость достигает 14-18%, а удельный вес врожденных инфекций в структуре младенческой смертности составляет от 10 до 61% (А.Н. Стрижаков с соавт., 2006; С.В.Сучков с соавт., 2007; И.В.Бахарева, 2009; П.В.Буданов, 2010; Ожегов А.М., 2011; И.С.Сидорова, И.О.Макаров, 2011; М.А.Суслова, 2012; И.Н.Трошина, 2012; C. Johnston et al., 2008; W.J. Muller et al., 2010).

В настоящее время в структуре врожденной инфекционной патологии возросла роль герпесвирусных инфекций, ведущими из которых являются цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) и инфекция, вызванная вирусом простого герпеса 1,2 типа (ВПГИ). Эти заболевания у новорожденных характеризуются склонностью к генерализации, высокой частотой поражения ЦНС, трудностью диагностики, прогнозирования течения, высокой частотой инвалидизации и снижением качества жизни в целом (Н.В.Орджоникидзе с соавт., 2005; А.Я.Сенчук, З.М.Дубоссарская, 2005; И.И. Бочарова с соавт., 2007; Д.Н. Дегтярев с соавт., 2007; Т.И.Долгих, 2008; Э.Н.Симованьян, 2011; З.С.Гаджиева, P.P.Климова, 2009; Ю.В.Казарова, 2009; А. К.Максутова, 2009; О. В. Островская, 2009; Г.В.Яцык, 2009; И.В.Абрамова, 2010; Ю.В.Лобзин с соавт., 2010; М. Ю.Новиков, 2011;О.Picone et al., 2005; M.Abdel-Latif, E.Sugo, 2010; D.W.Dye, G.T.Simmons, 2010; С.А.Gleason, S.U.Devaskar, 2012).

Учитывая, что в реализации инфекционного процесса ведущая роль отводится состоянию защитных сил организма, изучению иммунного статуса новорожденных при ЦМВИ и ВПГИ посвящено большое количество исследований, касающихся преимущественно адаптивного иммунитета (Кравченко Л.В.,2009; Сидорова И.С., Макаров И.О., 2011; Ожегов А.М., 2011; Суслова, М.А., 2012; Трошина И. Н., 2012; Л.В. Ковальчук с соавт., 2010; B.Morein et al., 2007; S. Koyama et al., 2008). В последние годы в работах К.А. Лебедева и соавт. (2009), С.А.Пономарева (2011), А.Iwasaki et al. (2004), B. A. Beutler (2009), H.Kumar et al. (2009), T.R.Kollmann,О.Levy (2012), C.C. Lee et al. (2012) показана важная роль врожденной иммунной системы как в борьбе с патогенными микроорганизмами, так и в активации и регуляции системы приобретенного иммунитета.

В системе врожденного иммунитета большое значение отводится Toll - подобным рецепторам (TLR), связывание которых микробными продуктами приводит к воспалительному ответу, опосредованному продукцией цитокинов, что в дальнейшем определяет характер, направление и интенсивность адаптивного иммунного ответа (П.Г.Назаров, 2005; И.Г.Козлов, 2010; F.Sandor, M.Buc, 2005; T.Kawai, S.Akira, 2007; S.Koyama et al., 2008; L.A. O'Neill, 2008; J.M.Thompson, A.Iwasaki, 2008; D.E.Zak, A.Aderem, 2009; R.Barbalat et al., 2009; N.Dietrich et al., 2010; L.Oliveira-Nascimento et al., 2012). В последние годы накапливаются сведения, свидетельствующие о том, что дефекты в системе TLR - снижение их экспрессии и функции в силу мутаций/полиморфизмов или эпигенетических нарушений регуляции TLR лежит в основе развития иммунодефицитных состояний, реализации и генерализации инфекции (О.А.Ганковская, 2007; Р.М.Хаитов, 2010; S.C.Corr, L.A.J.O'Neill, 2009; J.J. Khoo et al., 2011).

В этой связи актуальным является изучение ключевых механизмов иммунопатогенеза врожденной ЦМВИ и ВПГИ, обусловливающих супрессию иммунного ответа и, следовательно, приводящих к генерализации и неблагоприятному исходу этих заболеваний.

Цель исследования: выявление патогенетических механизмов развития врожденной генерализованной цитомегаловирусной и герпетической инфекции у новорожденных детей и разработка иммунологических критериев формирования и прогноза течения заболевания.

Задачи исследования:

1.Выявить особенности клинического течения врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ у детей первых трёх месяцев жизни.

2.Определить уровень экспрессии TLR-2, TLR-4, TLR-6 мононуклеарами периферической крови и частоту встречаемости полиморфизма их генов у наблюдаемых новорожденных.

3.Оценить параметры иммунного статуса, содержание Т-регуляторных клеток и характер нарушений процессов апоптоза на основании определения CD95+, AnnexinV+, PI+ у данного контингента детей.

4.Определить содержание в сыворотке крови моноцитарного хемо-аттрактантного протеина- 1 (MCP-1), интерлейкинов - 4, 6, 8, 12, интерферонов б и г у детей с генерализованной ЦМВИ и ВПГИ в динамике первых трех месяцев жизни.

5.Установить корреляционные взаимосвязи между параметрами врожденного и адаптивного иммунитета у наблюдаемых детей.

6.Разработать иммунологические критерии формирования и прогноза течения врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ у новорожденных детей. цитомегаловирусный инфекция герпес новорожденный

Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые:

- проведено комплексное клинико-иммунологическое исследование в аспекте изучения взаимодействия врожденного и адаптивного иммунитета у детей первых 3-х месяцев жизни с генерализованной ЦМВИ и ВПГИ, позволившее установить новые патогенетические механизмы формирования данной патологии;

- выявлены значимые маркеры развития врожденной генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой у новорожденных в виде снижения экспрессии TLR-2 и TLR-6 на моноцитах, полиморфизма Ser249Pro гена TLR-6, снижения уровня NK-клеток с усилением маркеров поздней активации CD95+ на их поверхности, снижения IFN-б, IFN-г, повышения маркеров апоптоза лимфоцитов AnnexinV+PI+, количества Т-регуляторных клеток, повышения уровня IL-4, IL-6, IL-8, MCP-1, приводящие к редукции противовирусного иммунного ответа; при ЦМВИ с неполной клинической симптоматикой отмечается только снижение IFN-б и повышение IL-6;

- показано, что наиболее значимыми причинами развития врожденной генерализованной ВПГИ является снижение экспрессии TLR-2 на моноцитах, наличие полиморфизма Arg753 Gln гена TLR-2, снижение относительного количества CD3+, снижение CD25+ на поверхности NK-клеток, снижение продукции IFN-г, IFN -б, IL-12 в сочетании с повышением маркеров апоптоза лимфоцитов AnnexinV+PI+ и повышением уровня IL-4, IL-6, MCP-1;

- выявленное повышение синтеза МСР-1 при ЦМВИ приводит к усилению вирусной репликации и сдвигу дифференцировки Т-хелперов в направлении Th2, не обеспечивающих формирование эффективного противовирусного иммунного ответа;

- установлено, что повышение количества Т-регуляторных клеток и IL-4 способствует формированию супрессивного иммунофенотипа при врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ;

- выявлены корреляционные взаимосвязи между показателями врожденного и адаптивного иммунитета, отражающие угнетение ранних этапов иммунного ответа, нарушение эффекторной функции иммунокомпетентных клеток, нарушение режима иммунорегуляции при герпесвирусной инфекции;

- разработаны иммунологические критерии формирования и прогноза течения врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ у новорожденных детей.

Практическая значимость

1. Разработаны иммунологические критерии формирования врожденной генерализованной цитомегаловирусной инфекции с полной клинической симптоматикой: повышение содержания CD16+CD95+, AnnexinV+PI+,T-регуляторных клеток, IL-8.

2. Разработаны иммунологические критерии формирования врожденной генерализованной герпетической инфекции: снижение экспрессии TLR-2, снижение CD16+CD25+, повышение уровня IL-6.

3. Выявлены ранние маркеры стойкого сохранения клинической симптоматики к концу острого периода врожденной генерализованной инфекции:

* ЦМВИ - снижение уровня IFN-г;

* ВПГИ - повышение содержания Т-регуляторных клеток.

Положения, выносимые на защиту:

1. Особенности клинического течения врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ ассоциированы с различными вариантами иммунного реагирования.

2. У детей с врожденной генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой ведущим в формировании врожденного и адаптивного иммунного ответа является снижение экспрессии TLR-2 и TLR-6 на моноцитах, наличие полиморфизма Ser249Pro гена TLR-6, снижение уровня NK-клеток с усилением маркеров поздней активации CD95+ на их поверхности, снижение IFN-б, IFN-г, повышение маркеров апоптоза лимфоцитов AnnexinV+PI+, количества Т-регуляторных клеток, повышение уровня IL-4, IL-6, IL-8, MCP-1, а при ЦМВИ с неполной клинической симптоматикой - снижение уровня IFN-б, повышение маркеров ранней активации CD25+ на поверхности СD16+, повышение уровня уровня IL-6 и IgM.

3. Врожденная генерализованная ВПГИ формируется у детей на фоне нарушения ранних этапов врожденного иммунного ответа (снижение экспрессии TLR-2 на моноцитах, наличие полиморфизма Arg753Gln гена TLR-2), снижения продукции IFN-б, IFN-г и IL-12, дисбаланса в клеточном и гуморальном звене иммунной системы (снижение относительного количества CD3+ и активационных маркеров CD25+ на поверхности NK -клеток, в сочетании с повышением маркеров апоптоза лимфоцитов AnnexinV+PI+, количества Т-регуляторных клеток, уровня I -4, IL-6, MCP- 1).

Апробация работы. Основные положения работы представлены на V Ежегодном Конгрессе специалистов перинатальной медицины, Москва, 2010; IX Российском Конгрессе "Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии", Москва, 2010; XV Международном Конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Дубай, ОАЭ, 2010; Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», Новосибирск, 2010; I Международном Конгрессе по перинатальной медицине, посвященный 85-летию академика РАМН В.А.Таболина, и VI Ежегодном Конгрессе специалистов перинатальной медицины, Москва, 2011; IV Всероссийском образовательном Конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и и респираторной аллергии, Москва, 2011; Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология практическому здравоохранению», Москва, 2012; VII научно-практической конференции Юга России «Актуальные проблемы клинической иммунологии и аллергологии», Пятигорск, 2012; XII Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии», Москва, 2013; Региональной научно-практической конференции «Приоритетные задачи охраны репродуктивного здоровья и пути их решения», г.Ростов-на-Дону, 2013; V Конгрессе Федерации педиатров стран СНГ и VI Конгрессе педиатров и неонатологов Республики Молдова,Кишинев,2013; XI Всемирном Конгрессе по перинатальной медицине, Москва, 2013.

Внедрение результатов. Результаты работы внедрены в учебный процесс педиатрического отдела, а также в практику отделения патологии новорожденных и недоношенных детей ФГБУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России.

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 17 работ в отечественной и зарубежной печати, в том числе 7 - в журналах из перечня ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 183 страницах компьютерного текста (Time New Roman 14), содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 3 главы с результатами собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список цитируемой литературы, включающей 198 отечественных и 149 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 49 таблицами, 16 рисунками.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Исследование проведено на базе ФГБУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России. Исследования выполнялись в течение 2010-2012г.г. Под наблюдением находилось 95 новорожденных (рис.1).

Наблюдаемые дети были распределены на три группы (I группа - дети с врожденной генерализованной ЦМВИ, которые согласно классификации К.В.Орехова (2002) были разделены на две подгруппы: подгруппу I.I. - с типичной генерализованной формой с полной клинической симптоматикой и подгруппу I.2. - с типичной генерализованной формой с неполной клинической симптоматикой; II группа - дети с врожденной генерализованной ВПГИ; контрольная группа - здоровые новорожденные, родившиеся у женщин с физиологическим течением беременности и родов. Оценка физического развития новорожденных проводилась комплексно с применением метода центильных таблиц (Г.М.Дементьева,2000). При оценке поражения ЦНС использовалась классификация перинатальных поражений нервной системы, утвержденной МЗ РФ (М., 2007).

Диагноз ЦМВИ и ВПГИ ставился при выявлении ДНК вирусов в крови и в моче методом ПЦР в режиме реального времени с использованием программируемого амплификатора с флуоресцентной системой детекции «Rotor-Gene» 6000 («Corbet Researc», Австралия) и наборов «АмплиСенс» для флуоресцентной детекции, а также при выявлении специфических антител класса IgM в сыворотке крови у ребенка к ЦМВ и ВПГ 1,2 типа и при нарастании титров IgG в динамике, определяемых методом ИФА с использованием стандартных наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Определение популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов и моноцитов периферической крови: FITC (изотиоцианат флуоресцеина) - меченые CD3+,CD4+, CD8+, CD 16+, СД19+, СD282+, СD284+, CD286+ и PE (фикоэритрин ) - меченые CD 95+, CD25+, CD69+, НLA-DR+, CD14+ проводили методом одно- и двухпараметрического фенотипирования с использованием реагентов фирмы Immunotex (Франция), Caltag (США), HyCultbiotechnology (Нидерланды); количества лимфоцитов, вступивших в апоптоз, - с использованием диагностического набора, включающего Аннексин-V, меченый FITC и пропидий йодид (PI), (Caltag, США) по прилагаемому протоколу. Концентрацию IL- 4, IL-6, IFN-г, IFN-б в сыворотке крови определяли методом ИФА с помощью набора реагентов «Протеиновый контур» (г. Санкт-Петербург), IL-8 - с использованием тест-систем «Bender Medsistems» (Австрия), IL-12 - с помощью тест-систем «Biosource» (США). Определение содержания MCP-1 - с использованием тест-систем «Bender Medsistems» (Австрия).

Определение аллельных вариантов генов TLR проводили методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом тест-системами ГосНИИгенетика (Москва) по программе, рекомендованной производителем набора.

Для формирования базы данных и при проведении статистического исследования эмпирических данных использовались возможности табличного процессора Excel 2003 и пакетов прикладных программ («Мегастат» и Statistica 6.0). При определении статистической обоснованности различия исследуемых групп применялся критерий Манна-Уитни для независимых групп и критерий Вилкоксона для зависимых групп. Показатели описательной статистики представлены в виде выборочной средней и стандартного отклонения. Для анализа различия частот в двух независимых группах применялся точный критерий Фишера-Ирвина. Для оценки тесноты связи отдельных показателей использовался коэффициент корреляции по Спирмену (Реброва О.Ю., 2002). Для выявления значимых признаков соответствующих клиническим группам был применен метод «деревьев решений», позволяющий выявить следственную связь между признаками и получить точки раздела клинических групп (CutOff). Для формирования диагностических правил проводился расчет точек.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ клинических данных выявил, что большинство наблюдаемых детей родились доношенными (I группа - 63%, II группа - 86,4%), недоношенными при сроке гестации 35-37 недель в родились 37% новорожденных в I группе и 13,6% - во II группе. У всех матерей наблюдаемых детей с врожденной генерализованной цитомегаловирусной и герпетической инфекцией отмечался отягощенный акушерстко-гинекологический анамнез с одинаковой частотой во всех группах: у 78,3% матерей выявлялись гинекологические заболевания (преимущественно эндоцервицит, аднексит), у 71% женщин имели место неблагоприятные исходы предыдущих беременностей: преждевременные роды, самопроизвольные аборты в ранние сроки, неразвивающаяся беременность, у 94,2% матерей наблюдаемых детей отмечалось отягощенное течение беременности (угроза прерывания беременности, внутриутробная гипоксия плода).

Оценка клинических данных в раннем неонатальном периоде показала, что у новорожденных детей с генерализованной ЦМВИ, протекающей с полной клинической симптоматикой чаще по сравнению с детьми с неполной клинической симптоматикой выявлялся гепатит, пневмония, геморрагический синдром, патологическая убыль массы тела (р<0,05); менингоэнцефалит и миокардит диагностировались только у новорожденных с полной клинической симптоматикой (6,9% и 10,3% соответственно). С высокой частотой встречались синдром дыхательных расстройств (62,1% и 22,2% соответственно) и геморрагический синдром (44,8% и 11,1% соответственно) При ВПГИ выявлялись пневмония (31,8%), миокардит (18,2%), гепатит (13,6%), менингоэнцефалит (4,6%). У всех новорожденных с ЦМВИ и ВПГИ отмечались перинатальные поражения ЦНС.

Наблюдение в динамике позволило установить, что к концу острого периода заболевания (к трём месяцам жизни) клиническая симптоматика сохранялась у 23,4% детей с ЦМВИ, преимущественно у больных с полной клинической симптоматикой, и у 27,3% детей с ВПГИ.

При изучении механизмов врожденного иммунитета, представляющих первую линию защиты организма от различных патогенов, установлено, что у новорожденных с генерализованной ЦМВИ в подгруппе I.I в раннем неонатальном периоде имело место достоверное снижение экспрессии TLR - 2 (CD282+) на моноцитах периферической крови по сравнению с контрольной группой и подгруппой 1.2 (45,4±8,9%, 76,2±5,6% и 65,1±6,1%, соответственно). Выявлена обратная корреляционная зависимость с уровнем вирусной нагрузки (r=0,81, p<0,05). Аналогичные изменения были характерны и для TLR - 6 (CD14+CD286+) (44,6±5,9%, 61,1±1,4% и 57,8±2,2%, соответственно), что объясняет высокую чувствительность TLR - 2 и TLR - 6 к цитомегаловирусу. Во II группе у новорожденных с ВПГИ также выявлено достоверное снижение экспрессии TLR - 2 (CD282+) по сравнению с контрольной группой (43,8±8,3% и 76,2±5,6% соответственно), что согласуется с данными X.D.Yao, K.L.Rosenthal (2011) об ингибировании ВПГ 1,2 TLR-2 и снижении противовирусного иммунного ответа. Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем экспрессии ТLR-2 и продукцией IL-12 (r=0,60, p<0,05) и обратная с CD16+CD95+(r=-0,71, p<0,05), а также с IFN-г (r=-0,60, p<0,05).

Общее количество Т - лимфоцитов в раннем неонатальном периоде в подгруппе I.I было достоверно ниже показателей контрольной группы и подгруппы 1.2 (45,9±7,1%, 69,3±7,5% и 64,6±10,7 соответственно) (р< 0,05). Аналогичные сдвиги были выявлены и у новорожденных II группы относительно контрольной группы (52,4±2,1% и 69,3±7,5% соответственно). Выявленное в подгруппе I.I. по сравнению с контрольной группой и подгруппой 1.2 снижение количества CD4+ сопровождалось редукцией иммунорегуляторного коэффициента (p <0,05).

Сравнение средних значений натуральных киллеров CD16+ у новорожденных с ЦМВИ в подгруппе I.I. обнаружило достоверное снижение их количества по сравнению с контрольной группой и подгруппой 1.2 (1,9±0,3%, 3,4±0,8% и 4,4±0,3% соответственно, p <0,05). При этом выявлена прямая корреляция между количеством СD16+ и экспрессией TLR-2 (r=0,88, p<0,05) и обратная корреляционная зависимость с уровнем вирусной нагрузки (r=-0,63, p<0,05), что связано со снижением синтеза IFN-б и прямым повреждающее действие вируса на клетки иммунной системы (T.I.Arnon, 2005). При изучении функциональной активности лимфоцитов периферической крови у новорожденных II группы с ВПГИ отмечено достоверное снижение СD16+СD25+ по сравнению с контрольной группой (0,1±0,06% и 0,4±0,07% соответственно, р<0,05), что приводит к редукции цитотоксической активности натуральных киллеров и снижению синтеза IFN-г и IFN-б. Для подгруппы с неполной клинической симптоматикой ЦМВИ было характерно повышение CD25+ на поверхности СD16+ относительно контроля (1,1±0,4% и 0,4±0,07 %, соответственно, p<0,05), что подтверждает мнение S.Suvas (2011) о том, что тяжесть заболевания связана с выраженностью иммунного ответа.

Анализ количества Т-регуляторных клеток обнаружил их достоверное повышение у новорожденных детей с генерализованной ЦМВИ в подгруппе I.I по сравнению с контрольной группой и подгруппой I.2 (3,4±0,6%, 1,9±0,3% и 2,2±0,1% соответственно, p<0,05). У детей с генерализованной ВПГИ (II группа) также обнаружено их достоверное повышение по сравнению с контрольной группой в (3,3±0,4% и 1,9±0,3% соответственно). Выявлена обратная корреляционная зависимость содержания Т-регуляторных клеток и СD4+ лимфоцитов (r=-0,82, p<0,05). Эти данные подтверждают мнение S.Suvas (2004) о подавлении иммунного ответа на ВПГ 1,2 и ЦМВ у новорожденных Т-регуляторными клетками.

Изучение процессов поздней активации лимфоцитов в раннем неонатальном периоде выявило, что при ЦМВИ в подгруппе I.1 по сравнению с контрольной группой и подгруппой I.2 отмечены статистически значимые различия экспрессии CD95+ на поверхности CD16+ (4,8±0,4%, 3,0±0,4% и 3,2±0,3% соответственно, p<0,05). Кроме того, в подгруппе I.I по сравнению с контрольной группой и подгруппой 1.2 выявлено усиление ранних (9,6±1,4%, 5,8±0,9% и 5,2±0,6% соответственно, p<0,05) и поздних маркеров апоптоза (1,0±0,2%, 0,1±0,03% и 0,1±0,03 соответственно, p<0,05). У новорожденных при ВПГИ (II группа) также выявлено достоверное повышение относительно контроля ранних (8,4±1,3% и 5,8±0,9% соответственно) и поздних маркеров апоптоза (0,9±0,5% и 0,1±0,03% соответственно), (p<0,05). Наши результаты подтверждают данные A.Iannello (2011) о стимулирующем влиянии герпесвирусов на процессы апоптоза иммунокомпетентных клеток.

Средние значения содержания про- и противовоспалительных цитокинов в раннем неонатальном периоде представлены в таблице 1.

Таблица 1

Средние значения содержания про- и противовоспалительных цитокинов в раннем неонатальном периоде

пг/ мл	I группа	II группа	Контроль
	1.I.	I.2
IFN -б	8,3±0,9*	10,7±1,1*	9,1±6,2*	15,9±2,1
IL-12	1,5±0,9	2,0±0,8	0,7±0,01*	1,1±0,3
MCP-1	1083,2±258,4*	783,5±223,1	1187,2±342,4*	600,5±53,9
IL -6	25,8±5,2*	18,3±4,2*	33,6±10,8*	9,0±1,6
IL -8	71,3±5,8*^	40,7±11,3	30,1±8,2	26,3±7,7
IFN -г	42,1±9,7*^	86,5±21,9	44,9±9,5*	100,8±27,4
IL -4	264,9±24,2*^	138,9±41,1	298,4±51,8*	74,1±24,8

*-достоверность различий по сравнению с контролем (p<0,05)

^- достоверность различий по сравнению с группой I.2(p<0,05)

Анализ результатов исследования уровня IFN - б в сыворотке крови показал, что в раннем неонатальном периоде у детей с ЦМВИ в подгруппе 1.1 и 1.2 отмечено достоверное снижение его уровня по сравнению с контрольной группой (p<0,05). У детей с ВПГИ уровень IFN - б был в 1,7 раз ниже по сравнению с контрольной группой (р<0,05), что может быть следствием установленного нами значительно более низкого уровня экспрессии TLR-2.

Анализ уровня IFN-г показал, что у детей с ЦМВИ подгруппы 1.1 его концентрация в раннем неонатальном периоде была в 2,4 раза ниже по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Выявлена прямая корреляционная зависимость содержания IFN-г и CD16+ (r=0,80, p<0,05), что подтверждает снижение функциональной активности натуральных киллеров. У детей II группы с генерализованной ВПГИ уровень IFN- г был в 2,2 раза ниже по сравнению с контрольной группой (р<0,01).

В нашем исследовании как при ЦМВИ в подгруппе 1.1 и 1.2, так и при ВПГ во II группе содержание IL-6 достоверно превысило показатели контрольной группы (p<0,05). Данные изменения могут приводить к сдвигу дифференцировки Т-хелперов в направлении Th2, не обеспечивающих формирование эффективного противовирусного иммунного ответа.

У детей подгруппы 1.1 уровень IL-8 был в 2,7 раз выше по сравнению с контрольной группой (р <0,05) и в 1,8 раз выше чем в подгруппе 1.2 (р <0,05). Выявлена прямая корреляционная зависимость содержания IL-8 и уровнем вирусной нагрузки (r=0,81, p<0,05). Наши данные согласуются с исследованиями N.Saederup (2002) об усилении синтеза IL-8 под воздействием ццитомегаловируса.

Содержание МСР-1 в сыворотке крови у новорожденных подгруппы 1.1 достоверно превысило показатели контрольной группы (p<0,05). Во II группе его содержание также было достоверно выше показателей контрольной группы, что согласуется с данными C.Papadopoulou (2008) о том, что ЦМВ и ВПГ могут использовать хемокиновые рецепторы для контроля репликации вирусов.

Снижение уровеня IL-12 у новорожденных во II группе относительно контроля (p<0,05) приводит к нарушению формирования связи между механизмами неспецифической защиты и специфического иммунитета.

Уровень IL-4 у детей подгруппы 1.1 и II группы был выше по сравнению с контрольной группой. в 3,6 и 4,0 раз соответственно (р<0,05), что отражает доминирование противовоспалительных цитокинов и ведет к снижению противоинфекционной защиты.

В динамике заболевания у детей с ЦМВИ в подгруппе 1.1 к 1 месяцу жизни по сравнению с ранним неонатальным периодом произошло достоверное повышение Т - лимфоцитов и HLA-DR (p<0,05), снижение IL-8 (p<0,05). Только к 3 месяцам жизни повысился уровень CD4+, CD16+, ТLR-2, IFN- б, (p<0,05). Произошло снижение уровня IL-4, IL-6, Т-регуляторных клеток, CD95+CD16+, AnnexinV+, AnnexinV+ PI+, (p<0,05). В подгруппе I.2 уже к 1 мес. показатели IFN- б достоверно превышали его уровень по сравнению с ранним неонатальным периодом (p<0,05), произошло снижение продукции IL-8, IL-6. Показатели IFN-г прогрессивно нарастали к 3 месяцам.

У детей с ВПГИ во II группе к 1 мес. жизни по сравнению с ранним неонатальным периодом отмечено достоверное снижение CD16+CD95+, усиление экспрессии TLR-2 (p<0,05). К 3 мес. жизни произошло повышение CD3, IFN -б, IL-12, (p<0,05), снижение Т-регуляторных клеток, снижение AnnexinV+PI+, IL -6, IL -4 (p<0,05).

При анализе частот полиморфизмов генов TLR (рис.2) при генерализованной ЦМВИ в зависимости от тяжести состояния была обнаружено, что в подгруппе детей с полной клинической симптоматикой ЦМВИ (подгруппа I.I) по сравнению с подгруппой детей с неполной клиникой (подгруппа I.2) частота генотипа Ser/ Pro гена TLR-6 встречалась достоверно чаще (68,4% и 12,5% соответственно, р <0,05), а генотипа Pro/Pro гена TLR-6 достоверно реже (26,3% и 81,3% соответственно, р<0,05). Таким образом, у носителей аллеля Ser гена TLR-6 риск развития более тяжелого течения ЦМВИ выше, а генотип Pro/Pro является протективным в отношении тяжести протекания ЦМВИ.

^- достоверность различий по сравнению с группой I.2 (p<0,05)

Рис. 2 Распределение частот генотипов гена TLR-6 среди пациентов 1 группы в зависимости от тяжести заболевания

В группе детей с ВПГИ (II группа) получено достоверное различие в распределении генотипа Arg753Gln гена TLR-2 по с равнению с контрольной группой (26,3% и 3,8%, соответственно), (р <0,05), (рис.3). Таким образом, аллельные варианты гена TLR-2 в точках полиморфизма Arg753Gln могут являться генетическими маркерами риска развития тяжелой генерализованной формы ВПГИ у новорожденных детей.

*-достоверность различий по сравнению с контролем (p<0,05)

Рис. 3 Распределение частот генотипов гена TLR-2 у пациентов 2 группы

С учетом выявленных патогенетических механизмов развития генерализованной ЦМВИ и ВПГИ на основании анализа диагностической и прогностической значимости тестов нами разработаны критерии формирования генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой (повышение уровней CD16+CD95+, AnnexinV+PI+, T-регуляторных клеток, IL-8) и развития генерализованной ВПГИ (снижение экспрессии TLR-2, снижение CD16+CD25+, повышение уровня IL-6) (рис.4,5), а также разработаны прогностические маркеры стойкого сохранения клинической симптоматики к концу острого периода заболевания при ЦМВИ (снижение уровня IFN-г) и при ВПГИ (повышение содержания Т-регуляторных клеток) (рис.6,7).

Рис. 4 Иммунологические критерии формирования врожденной генерализованной цитомегаловирусной инфекции с полной клинической симптоматикой

Рис. 5 Иммунологические критерии формирования врожденной генерализованной герпетической инфекции



Рис. 6 Иммунологические критерии прогноза течения врожденной генерализованной цитомегаловирусной инфекции

Рис. 7 Иммунологические критерии прогноза течения герпетической инфекции

Итогом данной работы явились новые данные о роли Toll-подобных рецепторов и полиморфизма их генов, клеточных и цитокин-опосредованных механизмов в формирования врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ у новорожденных детей, дополнительные объективные иммунологические критерии развития и прогноза течения заболевания, что открывает перспективу оптимизации не только диагностики, но и лечения детей с данной патологией.

Выводы

1. Врожденная генерализованная цитомегаловирусная и герпетическая инфекция характеризуется неспецифичностью клинической картины заболевания и полиморфностью поражения органов и систем.

У новорожденных детей с генерализованной ЦМВИ, протекающей с полной клинической симптоматикой (выраженными клиническими проявлениями) достоверно чаще по сравнению с детьми с неполной клинической симптоматикой (умеренно выраженными признаками заболевания) выявляется гепатит, пневмония, геморрагический синдром, патологическая убыль массы тела; менингоэнцефалит и миокардит диагностируется только у новорожденных с полной клинической симптоматикой (6,9% и 10,3%, соответственно). При ВПГИ ведущими в клинике заболевания являются пневмония (31,8%), миокардит (18,2%), гепатит (13,6%), менингоэнцефалит (4,6%). У всех новорожденных с ЦМВИ и ВПГИ отмечается перинатальное, преимущественно гипоксически-ишемическое поражение ЦНС.

2. К концу острого периода заболевания (к трём месяцам жизни) клиническая симптоматика сохраняется у 23,4% детей с ЦМВИ, преимущественно у больных с полной клинической симптоматикой, и у 27,3% детей с ВПГИ.

3. Снижение экспрессии TLR-2 и TLR-6 на моноцитах, приводящее к редукции синтеза IFN-б и нарушению противовирусного иммунного ответа, имеет место при генерализованной ЦМВИ только у детей с полной клинической симптоматикой. У новорожденных с генерализованной ВПГИ отмечается снижение экспрессии TLR-2, что ассоциируется с уменьшением уровня IL-12, нарушением формирования связи между механизмами врожденного и адаптивного иммунитета.

4. Дефекты в генах TLR выявляются у 68,4 % детей при врожденной генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой в виде полиморфизма Ser249Pro гена TLR-6 и у 26,3% детей с врожденной генерализованной ВПГИ в виде полиморфизма Arg753Gln гена TLR-2.

5. Врожденная генерализованная цитомегаловирусная и герпетическая инфекция характеризуется разнонаправленными изменениями в иммунном статусе: при ЦМВИ с полной клинической симптоматикой имеются выраженные нарушения этапов активации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, что верифицируется снижением CD3+, CD4+, CD16+ и повышением числа Т-регуляторных клеток, тогда как при ЦМВИ с неполной клинической симптоматикой отмечается лишь повышение маркеров ранней активации CD25+ на поверхности СD16+; при ВПГИ имеет место снижение количества CD3+ и маркеров ранней активации CD25+на поверхности CD16+, а также повышение числа Т-регуляторных клеток.

Нарушение процессов апоптоза у пациентов с генерализованной ЦМВИ и ВПГИ характеризуются повышением уровня маркеров раннего и позднего апоптоза AnnexinV+, AnnexinV+PI+, CD95+ на поверхности CD16+.

6. У детей при генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой и генерализосванной ВПГИ отмечается снижение содержания IFN-б и IFN-г, повышение уровня MCP-1, IL-6 и смещение цитокинового баланса в сторону продукции противовоспалительного цитокина IL-4, при ЦМВИ с неполной клинической симптоматикой имеет место только снижение концентрации IFN-б и повышение IL-6.

Характерной особенностью цитокинового статуса у пациентов с полной клинической симптоматикой генерализованной ЦМВИ является повышение уровня IL-8, что приводит к снижению синтеза IFN-б, а для пациентов с ВПГИ - снижение IL-12, приводящее к редукции Th-1 типа иммунного ответа.

7. Выявленные корреляционные зависимости между показателями врожденного и адаптивного иммунитета отражают угнетение ранних этапов иммунного ответа и нарушение иммунной регуляции у детей при генерализованной ЦМВИ и ВПГИ.

8. Иммунологическими критериями формирования врожденной генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой являются: полиморфизм гена TLR-6, повышение уровней CD16+CD95+, AnnexinV+PI+,T-регуляторных клеток, IL-8; при генерализованной ВПГИ - полиморфизм гена TLR-2, снижение экспрессии TLR-2, снижение CD16+CD25+, повышение уровня IL-6.

9. Маркерами стойкого сохранения клинической симптоматики к концу острого периода заболевания (к 3 месяцам жизни) являются: при генерализованной ЦМВИ - снижение уровня IFN-г; при генерализованной ВПГИ - повышение содержания Т-регуляторных клеток.

Практические рекомендации

1. Детям с врожденной генерализованной цитомегаловирусной и герпетической инфекцией необходимо оценивать экспрессию TLR-2, TLR-6, полиморфизм их генов, определять иммунный и цитокиновый статус.

2. Полиморфизм Ser249Pro гена TLR-6, показатели CD16+CD95+ >3,7%, AnnexinV+PI+>2,7%, T-регуляторные клетки >2,5%, IL-8 >51,2пг/мл являются объективными иммунологическими критериями формирования врожденной генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой.

3. Уровень IFN-г < 77,4 является ранним маркером стойкого сохранения клинической симптоматики к концу острого периода генерализованной ЦМВИ.

4. Наличие полиморфизма Arg753Gln гена TLR-2, показатели экспрессии TLR-2<64,3%, CD16+CD25+<3,5%, IL-6>32,6 пг/мл являются объективными иммунологическими критериями формирования генерализованной герпетической инфекции.

5. Уровень Т-регуляторных клеток >2,54% является ранним маркером стойкого сохранения клинической симптоматики к концу острого периода генерализованной ВПГИ.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации

1. Левкович А.Ю., Афонин А.А., Кравченко Л.В., Левкович М.А. Показатели врожденного иммунитета при герпесвирусной инфекции новорожденных детей // Международный журнал по иммунореабилитации. 2010. Том 12, № 2. С. 201.

2. Левкович А.Ю., Афонин А.А. Показатели иммунного статуса у детей раннего возраста из группы высокого инфекционного риска// Современная перинатология: организация, технология качество: Материалы V Ежегодного Конгресса специалистов перинатальной медицины. М., 2010. С. 41.

3. Левкович А.Ю., Афонин А.А. Клинико-иммунологические варианты внутриутробной инфекции у новорожденных//Цитокины и воспаление. 2010. Том 9, N3. С. 67-68.

4. Левкович А.Ю., Афонин А.А., Шокарев А.В., Кравченко Л.В., Левкович М.А.Диагностика реализации внутриутробного инфицирования у детей от матерей сурогенитальной инфекцией// Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии: Материалы IX Российского конгресса. М.,2010. С. 196-197.

5. Левкович А.Ю., Афонин А.А., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Демидова М.В. Клинико-иммунологический статус новорожденных с цитомегаловирусной инфекцией// Материалы I Международного Конгресса по перинатальной медицине, посвященного 85-летию академика РАМН В.А.Таболина и VI Ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины. М., 2011. С. 102-103.

6. Кравченко Л.В., Левкович М.А., Левкович А.Ю., Демидова М.В, Уровень интеферонов в сыворотке крови у новорожденных с цитомегаловирусной инфекцией//Материалы I Международного Конгресса по перинатальной медицине, посвященного 85-летию академика РАМН В.А.Таболина и VI Ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины.М., 2011. С. 98.

7. Левкович А.Ю., Афонин А.А., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Демидова М.В., Павленко Г.В. Показатели врожденного иммунитета у детей с внутриутробной герпесвирусной инфекцией// Аллергология и иммунология. 2011. Том 12, N2-3. С. 311.

8. Афонин А.А, Левкович А.Ю., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Демидова М.В. Механизмы риска манифестации цитомегаловирусной инфекции// Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии: Сборник материалов IV Всероссийского образовательного конгресса. М., 2011. С. 128-129.

9. Афонин А.А., Линде В.А., Левкович А.Ю., Левкович М.А. Современное состояние проблемы внутриутробных герпесвирусных инфекций у новорожденных детей// Журнал Фундаментальной медицины и биологии. Ростов-на-Дону, 2012. №3. С. 19-22.

10. Левкович А.Ю., Афонин А.А., Левкович М.А., Андреева В.О., Кравченко Л.В., Демидова М.В., Плахотя Т.Г. Дисфункция показателей врожденного и адаптивного иммунитета при манифестации герпесвирусной инфекции у новорожденных детей//Российский аллергологический журнал.2012. N.1, Вып. 1. С. 186-187.

11. Левкович А.Ю., Афонин А.А., Сизякина Л.П., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Андреева В.О., Плахотя Т.Г., Демидова М.В. Особенности иммунного реагирования новорожденных при внутриутробной герпесвирусной инфекции// Цитокины и воспаление. 2012. Т.11, № 3.-3. С. 111-112.

12. Левкович М.А., Афонин А.А., Кравченко Л.В., Левкович А.Ю., Демидова М.В., Заурова Л.М. Показатели иммунного статуса и функциональной активности лимфоцитов у новорожденных детей с герпесвирусной инфекцией// Российский аллергологический журнал. 2013. N2. С. 174-176.

13. Левкович А.Ю., Афонин А.А., Кравченко Л.В., Левкович М.А., Демидова М.В. Особенности иммунного ответа новорожденных с инфекцией, вызванной вирусами герпеса 1,2 типа, в раннем неонатальном периоде//Приоритетные задачи охраны репродуктивного здоровья и пути их решения: Материалы региональной научно-практической конференции г.Ростов-на-Дону, 2013. С. 7-8.

14. Афонин А.А., Левкович А.Ю., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Демидова М.В., Заурова Л.М. Особенности иммунного реагирования новорожденных с герпесвирусной инфекцией// Материалы V Конгресса Федерации педиатров стран СНГ и VI Конгресса педиатров и неонатологов Республики Молдова. Кишинев, 23-24 мая 2013. С. 231.

15. Афонин А.А., Левкович А.Ю., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Андреева В.О. Нарушение иммунного гомеостаза при герпесвирусной инфекции у новорожденных детей//Журнал Фундаментальной медицины и биологии. Ростов-на-Дону,2013. №1. С. 33-35.

16. Левкович А.Ю., Афонин А.А. Особенности врожденного и адаптивного иммунитета у новорожденных с генерализованной цитомегаловирусной инфекцией// Современные проблемы науки и образования. 2013. №3. URL: www.science-education.ru/109-9217.

17. Levkovich A., Afonin A., Levkovich M., Kravchenko L. Condition of system of innate immunity in infants with cytomegalovirus infection // J. Perinat. Med. 2013. Vol.41. P. 316.

Список сокращений

CD-	кластер дифференцировки
IFN-	интерферон
Ig-	иммуноглобулины
IL-	интерлейкин
NK-	натуральные киллерные клетки
Th-	Т-хелперы
TLR-	Toll-подобные рецепторы
TNF-б-	фактор некроза опухоли альфа
T-рег.-	Т-регуляторные клетки
ВПГИ-	инфекция, вызванная вирусом простого герпеса
ВУИ -	внутриутробная инфекция
ИФА -	иммуноферментный анализ
ЛПС -	липополисахарид
МСР-1-	моноцитарный хемотаксический протеин-1
ОАГА-	отягощенный акушерско-гинекологический анамнез
ПЦР -	полимеразная цепная реакция
ЦМВ -	цитомегаловирус
ЦНС-	центральная нервная система
ООО -	открытое овальное окно

Размещено на Allbest.ru

...