Нарушение функции иммунной системы при острой алкогольной интоксикации и алкоголизме

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

14.01.27 - наркология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени

доктора биологических

наук

НАРУШЕНИЕ ФУНКЦИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ОСТРОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ И АЛКОГОЛИЗМЕ

УЛЬЯНОВА

Людмила Ивановна

Москва 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Национальный научный центр наркологии” Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Гамалея Наталья Борисовна

Официальные оппоненты:

Морозов Сергей Георгиевич - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора института по научной работе, заведующий лабораторией нейроиммунопатологии ФГБУ “НИИ общей патологии и патофизиологии” РАМН

Когана Борис Михайлович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой клинической и специальной психологии ГБУ ВПО “Московский городской педагогический университет”

Орадовская Ида Васильевна - доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник ФГБУ “Государственный научный центр Институт иммунологии” ФМБА России

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение “Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии имени В.П. Сербского” Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится “26” ноября 2013 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д 208.051.01 при ФГБУ “Национальный научный центр наркологии” Минздрава России, по адресу: 119002, Москва, Малый Могильцевский переулок, дом 3

Автореферат разослан “___”_____2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Львова Ольга Фёдоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Алкогольная зависимость представляет собой серьезнейшую медицинскую и социальную проблему [Кошкина Е.А., Киржанова В.В., 2011]. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире алкоголизмом страдает более пяти миллионов человек. В России на сегодняшний день зарегистрировано более 2,5 миллионов человек, страдающих алкогольной зависимостью, а с 2000 года по темпам роста алкоголизма Россия обогнала большинство развитых стран мира [Кошкина Е.А., Киржанова В.В., 2008]. Алкогольная зависимость всё чаще поражает людей в расцвете физических, творческих и духовных сил, лиц разного возраста и разных социальных групп. Злоупотребление алкоголем часто является причиной нетрудоспособности молодых и деятельных слоев населения, приводит к росту смертности, увеличению травматизма и количества преступлений на бытовой и профессиональной почве [Альтшулер В.Б., 2011; Кошкина Е.А. и др., 2011].

Злоупотребление алкоголем в целом негативно сказывается на функционировании практически всех органов и систем организма в результате токсического действия этанола. Стержневым в клинической картине алкоголизма является синдром зависимости, вызванный воздействием чрезмерного употребления алкоголя на определенные системы и структуры мозга [Анохина И.П., 2011].

Хроническая алкогольная интоксикация приводит к возникновению органной и системной патологии. Чаще всего при этом поражаются такие важнейшие органы как печень [Огурцов П.П. и др., 2011; Donohue TM Jr., 2009]; почки [Тарасова Н.С., 2001; Frank J. et al., 2004]; сердце [Кошкин И.В., Букач Т.А., 2001; Огурцов П.П. и др., 2011; Imhof A., Koenig W., 2003]; легкие поджелудочная железа [Огурцов П.П. и др., 2011; Thomson G. S., 2001]; периферическая и центральная нервная система [Анохина И.П., 2011; Мартынов М.Ю. и др., 2011]. Лица, злоупотребляющие алкоголем, входят в группу повышенного риска возникновения туберкулеза [Mason C.M. et al., 2004] и онкологических заболеваний [Dossow V. et al., 2004], а также вирусных гепатитов B и C [Должанская Н.А., Бузина Т.С., 2011; Zhang T., 2006] и ВИЧ-инфекции [Должанская Н.А., Бузина Т.С., 2011; Aloma C. et al., 2007]. Наконец, они чаще чем, кто-либо, страдают острыми респираторными инфекциями [Boyadjieva N.I. et al., 2004].

Иммунная система, как и другие системы организма, подвергается пагубному воздействию алкогольной интоксикации. Однако до сих пор не определено место иммунной системы в патогенетических механизмах алкогольной интоксикации, особенно у лиц без сопутствующей патологии органов и систем, не страдающих аллергическими, аутоиммунными, онкологическими заболеваниями, туберкулёзом и другими инфекциями.

Несмотря на значительный интерес исследователей к проблеме алкогольной интоксикации, остаются спорными вопросы механизмов влияния этанола на иммунокомпетентные клетки организма человека и роли их в патогенезе органной и системной патологии. И, наконец, практически отсутствуют данные о влиянии алкогольной интоксикации на основные показатели клеточного и гуморального иммунитета как у здоровых без синдрома зависимости от алкоголя, так и у больных алкоголизмом до назначения медикаментозного лечения. Исходя из вышесказанного, проблема влияния алкогольной интоксикации на иммунную систему и её роли в патогенетических механизмах развития органной патологии чрезвычайно актуальна.

Цель работы: исследовать влияние алкогольной интоксикации на показатели клеточного и гуморального иммунитета у здоровых лиц и у больных алкогольной зависимостью без выраженной сопутствующей патологии органов и систем до назначения медикаментозного лечения.

Задачи работы:

1. Исследовать in vitro в культуре клеток крови влияние различных доз этанола на пролиферативную активность лимфоцитов, цитолитическую активность NK-клеток, кислородзависимую активность фагоцитов и экспрессию на клеточных мембранах CD25-, CD38-, HLA-DR-молекул и молекул HLA I класса.

2. Изучить особенности влияния алкогольной интоксикации на показатели клеточного и гуморального иммунитета у здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя.

3. Изучить особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом I стадии до назначения медикаментозного лечения.

4. Изучить особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом II стадии до назначения медикаментозного лечения.

5. Изучить особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом II стадии в фазе продолжительной ремиссии.

Научная новизна исследования

Впервые на модели острой алкогольной интоксикации по исследованию влияния разных доз этанола, вносимого в культуры клеток крови in vitro, установлено его угнетающее влияние на CD4⁺ Т-лимфоциты, NK-клетки киллеры и функциональную активность фагоцитирующих клеток. Показано, что этанол обладает тропностью к CD8⁺ цитолитическим Т-лимфоцитам, а именно: усиливает пролиферативную активность этих Т-лимфоцитов, индуцированную митогенным лектином Con A, и экспрессию на них активационных молекул ? CD25, HLA-DR и CD38. Кроме того, этанол обладает способностью усиления экспрессии молекул HLA I класса на клетках крови иммунной системы.

Впервые установлено, что этанол, вносимый in vitro в культуры клеток крови здоровых лиц (модель острой алкогольной интоксикации) в дозах, вызывающих сильное и слабое опьянение, приводит к нарушениям клеточного иммунитета. лимфоцит фагоцит этанол иммунитет

Впервые с помощью широкого спектра иммунологических методов при исследовании репрезентативной выборки образцов периферической крови здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя и больных алкогольной зависимостью, без выраженной соматической и системной патологии, проведено комплексное исследование основных параметров иммунного статуса. Получены принципиально новые данные о механизмах влияния алкогольной интоксикации на иммунную систему, что согласуется с результатами исследования прямого влияния этанола на клетки крови in vitro. Показана доминирующая роль CD8⁺-лимфоцитов в иммунном ответе при алкогольной интоксикации, указывающая на их возможную роль в развитии воспалительных процессов на уровне тканей и органов у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

Впервые обнаружены сходные нарушения иммунитета после алкогольной интоксикации, спустя 17-19 часов после последнего употребления алкоголя, у лиц без синдрома зависимости от алкоголя и у больных алкогольной зависимостью.

Впервые показано, что алкогольная интоксикация приводит к нарушению пролиферативной активности T- и В-лимфоцитов и NK-клеток (натуральных клеток киллеров) и нарушению популяционного, субпопуляционного и активационного состава клеток крови как у здоровых лиц после нагрузки крепким алкоголем (в количестве 0,2 л и более), так и у больных с алкогольной зависимостью.

Впервые выявлено, что алкогольная интоксикация приводит к повышению кислородзависимой активности фагоцитов и снижению их поглотительной способности как у здоровых лиц после нагрузки крепким алкоголем (0,2 л и более), так и у больных алкоголизмом.

Впервые обнаружено, что после алкогольной интоксикации, спустя 17-19 часов после последнего употребления алкоголя, в периферической крови повышается содержание иммуноглобулинов классов A и E и снижается содержание иммуноглобулинов классов M и G, а также нарушается гемолитическая активность комплемента, изменяется содержание С1, С3 и С4 компонентов системы комплемента, а также повышается уровень циркулирующих иммунных комплексов как у здоровых лиц после нагрузки крепким алкоголем (0,2 л и более), так и у больных алкоголизмом.

Впервые установлено, что алкогольная интоксикация ведёт к изменению типа иммунного ответа, о чём свидетельствуют сдвиги в содержании цитокинов - IL-4, IL-2 и IFN-г - в образцах периферической крови здоровых лиц после нагрузки крепким алкоголем и больных с алкогольной зависимостью.

Научно-практическое значение результатов работы

Впервые получены принципиально новые данные о негативном влиянии алкогольной интоксикации на клеточные и гуморальные составляющие иммунной системы, приводящем к транзиторному иммунодефициту, активации цитолитических и аутоагрессивных реакций. Как следствие этих процессов возможно развитие системной и органной патологии, в частности, ослабление резистентности организма в борьбе с различными инфекциями и патологические изменения в органах и тканях, что было продемонстрировано ранее в имеющейся литературе.

Получены принципиально новые данные в исследованиях показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом в фазе (3?5 летней) ремиссии, указывающие на то, что именно алкогольная интоксикация является патогенным фактором для иммунной системы. Впервые показано также, что при прекращении употребления алкоголя больными на II стадии алкоголизма в фазе ремиссии восстанавливаются все параметры иммунной системы и исчезает иммунодефицит, что свидетельствует о временном, транзиторном, характере иммунодефицитного состояния у больных с алкогольной зависимостью.

Выявленные нарушения иммунного статуса у больных алкогольной зависимостью диктуют необходимость включения в терапевтическую программу лечения иммуномодулирующих препаратов при условии продолжающегося употребления алкоголя.

Обнаруженные изменения параметров иммунной системы в результате действия алкогольной интоксикации следует учитывать в научно-практических и лечебно-профилактических учреждениях и центрах при исследовании иммунного статуса и проведении клинических анализов крови, поскольку предшествующая алкогольная интоксикация может привести к постановке, во-первых, ошибочного диагноза воспалительного процесса, а, во-вторых, ошибочного диагноза иммунодефицитного состояния.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Этанол in vitro в культурах клеток крови человека в диапазоне доз 6Ч10^-5-6Ч10^-1 мг/мл не влияет на спонтанную пролиферацию лимфоцитов, однако статистически значимо усиливает последующую индукцию делений Т-лимфоцитов митогенным лектином Con A; приводит к значимому повышению экспрессии активационных молекул CD25, CD38, HLA?DR на CD8⁺-лимфоцитах и молекул HLA I класса на клетках крови, а также приводит к статистически значимому снижению кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток, индуцированной зимозаном и форбол-меристат-ацетатом (ФМА).

2. Алкогольная интоксикация приводит к статистически значимым нарушениям клеточного иммунитета у обследованных лиц, а именно:

? изменениям гемограммы; пролиферативной активности T- и В-лимфоцитов; цитолитической активности NK-клеток; фагоцитарного звена иммунной системы;

? изменению популяционного состава клеток крови, которое выражается снижением в периферической крови процента CD4⁺ Т-лимфоцитов, отношения CD4⁺/CD8⁺ Т-лимфоцитов и увеличением процента CD19⁺ B-лимфоцитов.

? увеличению в периферической крови процента активированных CD8⁺DR⁺ Т-лимфоцитов, изменению процента активированных CD4⁺ Т-хелперов и NK-клеток, экспрессирующих DR-молекулы.

3. Алкогольная интоксикация приводит к статистически значимым нарушениям гуморального иммунитета, а именно:

? изменению иммуноглобулинового профиля;

? изменению содержания комплемента и его компонентов;

? изменению содержания циркулирующих иммунных комплексов;

? изменению содержания цитокинов - IL-4, IL-2 и IFN-г в периферической крови.

4. Статистически значимое повышение кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток, увеличение цитолитической активности NK-клеток, повышение экспрессии молекул HLA I класса и экспрессии активационных молекул на CD8⁺-лимфоцитах, а также увеличение в периферической крови процента активированных CD8⁺-лимфоцитов могут явиться предпосылкой для развития соматической патологии у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

5. Тяжесть нарушений клеточного и гуморального иммунитета возрастает по мере увеличения количества потребляемого алкоголя и длительности его потребления.

Публикации

Основное содержание диссертации изложено в 39 публикациях, в том числе 24 публикациях в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 публикациях в периодической научной печати, главе в монографии, 12 публикациях в материалах научных конгрессов и конференций.

Апробация результатов диссертации

Результаты исследования доложены на 2-ом Национальном конгрессе РААКИ (Москва, 1998 г.); на XIV съезде психиатров России (Москва, 15 - 18 ноября 2005 г.); конференции - Современные достижения наркологии, посвящённой 20-летию Национального научного центра наркологии (Москва, 21 - 22 ноября 2005 г.); на Международном конгрессе “Иммунитет и болезни: от теории к терапии” (Москва, 3 - 7 октября 2005 г.); на ХI Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе (Санкт-Петербург, 28 - 31 мая 2007 г.); на VIII конгрессе “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии” (Москва, 27 - 29 июня 2007 г.); на I Российском национальном конгрессе по наркологии с международным участием (Москва, 24 - 27 ноября 2009 г.); на ХIV Всероссийском научном Форуме с международным участием им. Академика В.И. Иоффе “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2011” (Санкт-Петербург, 23 - 26 мая 2011 г.); на VII Российской конференции, посвящённой 90-летию со дня рождения академика РАМН Г.Н. Крыжановского “Нейроиммунопатология” (Москва, 13-14 ноября 2012 г.); на Третьей Всероссийской конференции с международным участием “Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии” (Томск, 5-6 марта 2013 г.).

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 254 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: “Введение”, “Цели и задачи исследования”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы исследования”, “Результаты собственных исследований и обсуждение”, “Заключение”, “Выводы” и “Библиография”. Список литературы представлен 229 библиографическими источниками, в том числе 89 отечественных и 140 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 61 таблицами и 38 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro.

Биологическим материалом для проведения исследований служила венозная кровь здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя, взятая в пробирки “Vacutainer” с гепарином. В работе использовали цельную кровь и мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной крови, в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографин “Gibco” d=1,077 г/см³ по общепринятой методике [Boym A., 1968]. Клетки культивировали при 37^о C в атмосфере с 5% СО₂ в полной питательной среде (ППС), в состав которой входила среда RPMI (“Sigma Chemical Co”, USA), дополненная 10% фетальной телячьей сывороткой (“Sigma Chemical Co”, USA), 2 mM L-глутамина (“Gibco”, USA), 20 mM HEPES-буфера (“Gibco”, USA) pH 7,4 и 10 мкг/мл гентамицина (“Gibco”, USA).

Изучалось влияние этанола in vitro на способность Т-лимфоцитов усиливать синтез ДНК, цитолитический эффект NK клеток, экспрессию на лимфоцитах активационных молекул ? CD25, CD38, HLA-DR и экспрессию молекулы HLA I класса на клетках крови; функциональную активность фагоцитирующих клеток. Для выполнения этих задач был выбран широкий диапазон доз этанола, включающий: критические дозы (6 мг/мл); дозы, вызывающие сильное (0,6Ч10^-1 мг/мл) или слабое (6Ч10^-2 мг/мл) опьянение, и дозы, практически не влияющие на организм человека (6Ч10^-3 мг/мл и ниже). Выбор исследованных концентраций этанола соответствует дозам, охарактеризованным в России и США для здоровых лиц, не страдающих алкогольной зависимостью, употребивших алкоголь в различных количествах [Прозоровский В.И. и др., 1967].

Методы изучения влияния этанола на пролиферативную активность T -лимфоцитов на модели реакции бластной трансформации in vitro. Биологическим материалом для исследований служила цельная периферическая кровь здоровых лиц, взятая в пробирки с гепарином. Влияние этанола на пролиферативную активность T-лимфоцитов определяли на модели реакции бластной трансформации (РБТЛ) без или с применением митогенных лектинов PHA (“Sigma”, USA) в концентрации 5 мкг/мл и Con A (“Sigma”, USA) в концентрации 5 мкг/мл. Контролем служили клетки из той же цельной крови без внесения этанола и культуры без этанола, но с добавлением митогенных лектинов. Интенсивность пролиферативной реакции иммунокомпетентных клеток оценивали по активности синтеза ДНК, измеренной по скорости включения метил-³Н₁-тимидина во вновь синтезируемую ДНК. Радиоактивность образцов измеряли на в-счётчике (“Wallac 1409 DSA”, Finland). Результаты измерения выражали имп/мин (CPM) и рассчитывали для каждой культуры. Каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты исследований выражали средними арифметическими значениями имп/мин (CPM).

Метод изучения влияния этанола на цитолитическую активность NK-клеток на модели естественной цитолитической активности in vitro. Биологическим материалом для исследования служили мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной периферической крови, как указано выше. Влияние этанола на цитолитическую активность натуральных (естественных) киллеров (NK-клеток) периферической крови человека определяли на модели естественной цитолитической активности in vitro. Метод основан на способности NK-клеток in vitro лизировать клетки-мишени эритромиелоидной линии К-562, меченные ³Н₁-уридином. В культуры вносили этанол в концентрациях (6Ч10^-5-6Ч10^-1 мг/мл), контролем служила смесь мононуклеаров и культур К-562, меченых ³Н₁-уридином без этанола. Радиоактивность образцов измеряли на в-счётчике “Wallac 1409 DSA” (Finland). Результаты измерения выражались в имп/мин (CPM) в расчете на каждую культуру. Каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты выражали индексом цитотоксичности, который вычисляли по формуле: ИЦ=(1 - средние значения CPM в опытных культурах : средние значения CPM в контрольных культурах) Ч 100%.

Метод изучения влияния этанола на экспрессию на лимфоцитах молекул CD25, CD38, HLA-DR и HLA I класса на клетках крови человека in vitro. Биологическим материалом для исследования служила цельная кровь здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя, взятая в пробирки “Vacutainer” с гепарином. Экспрессию молекул активации ? CD25, CD38 и HLA-DR - определяли по интенсивности флуоресценции, которую выражали в условных единицах, у.е. ? MFI (mean fluorescence unit), всех позитивных CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺ Т-лимфоцитов, CD19⁺ В-лимфоцитов и CD3^-56⁺ NK-клеток. Экспрессию молекул HLA I класса определяли по интенсивности флуоресценции (у.е.) всех позитивных клеток крови (моноцитов, T- и В-лимфоцитов, нейтрофилов и NK-клеток).

Метод изучения влияния этанола на экспрессию молекул CD25, CD38 и HLA-DR на лимфоцитах крови in vitro. Постановку реакции проводили в 24-луночных планшетах (“Nunc”, Denmark). В лунки вносили 500 мкл ППС и 500 мкл цельной крови, после чего вносили этанол в конечных концентрациях (6Ч10^-5-6 мг/мл). Контролем служила кровь без этанола. Культуры инкубировали в течение 18 часов при 37° C в атмосфере влажности с 5% СО₂. Обработку биологического материала проводили согласно протоколу фирмы “Becton Dickinson” (USA). Анализ образцов осуществляли с помощью проточного лазерного цитофлуориметра FACS Calibur фирмы “Becton Dickinson” (USA) с использованием двухцветных моноклональных антител фирмы “Becton Dickinson” (USA) [Loken M.R., 1990].

Метод изучения влияния этанола на экспрессию молекулы HLA класса I на клетках крови in vitro. Постановку реакции проводили в 96-луночных круглодонных планшетах (“Nunc”), в которые вносили 100 мкл ППС c конечными концентрациями этанола 6Ч10^-5-6Ч10^-1 мг/мл и 100 мкл выделенных мононуклеаров (2Ч10⁶ в 1 мл ППС), контролем служила клеточная суспензия в ППС без этанола. Культуры инкубировали 18 часов при 37°C в атмосфере влажности с 5% СО₂, после чего планшеты центрифугировали 5 минут при 300g, надосадок убирали стряхиванием планшета, добавляли 240 мкл раствора Хенкса. В пластиковые пробирки для проточной цитофлюориметрии (“Falcon”) вносили по 10 мкл суспензии клеток, добавляли по 50 мкл немеченого антитела к антигену HLA I класса (“Сорбент”, Филатов А.В.), встряхивали и инкубировали при комнатной температуре 30 минут. Отмывали центрифугированием 5 минут при 300g, надосадок удаляли и добавляли 150 мкл раствора Хенкса, еще раз отмывали 5 минут при 300g, надосадок убирали. Добавляли 50 мкл вторичных антител (меченных ФИТЦ), инкубировали при комнатной температуре 30 минут. Центрифугировали 5 минут при 300g, осадок фиксировали раствором Сell Fix. Клетки анализировали не позднее 24 часов после фиксации. Анализ образцов осуществляли с помощью проточного лазерного цитофлуориметра FACS Calibur фирмы “Becton Dickinson” (USA). Экспрессию молекул HLA I класса определяли по интенсивности флуоресценции всех позитивных клеток крови (моноцитов, T- и В-лимфоцитов, нейтрофилов и NK-клеток).

Метод изучения влияния этанола на функциональную активность фагоцитирующих клеток in vitro. В качестве источника фагоцитирующих клеток использовали венозную кровь, взятую в пробирки “Vacutainer” с ЭДТА. Постановку проводили в стерильных пробирках (“Nunc”) объемом 15 мл, в которые вносили по 500 мкл цельной крови. Затем вносили этанол в конечных концентрациях 6Ч10^-5 - 6 мг/мл в эксперименте. Контролем служила кровь без этанола. Культуры инкубировали в течение 18 часов при 37°C в атмосфере влажности с 5% СО₂. Интенсивность реакции оценивалась количественно по числу импульсов за 1 минуту (имп/мин) в расчете на каждую исследуемую пробу. Для активации хемилюминесцентной реакции фагоцитирующих клеток использовали зимозан (“Sigma Chemical Co”, USA), опсонизированный по [Зыкин В.Ю., Годков М.А., 2004], или раствор форбол-меристат-ацетата (ФМА). В пробирки (по 3 на пробу) добавляли по 15 мкл зимозана (10 мг/мл) или ФМА (0,2 мг/мл) и регистрировали уровень хемилюминесценции в течение 30 минут. Интенсивность хемилюминесцентного ответа оценивали по максимальному значению на кинетической кривой хемилюминометра Люцифер Б (“Диалог”, Москва). Среднее значение интенсивности хемилюминесценции определяли по данным трех идентичных измерений. Результаты выражали в виде средних арифметических значений хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови) и индексом стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения хемилюминесценции фагоцитов с зимозаном, либо с ФМА (имп/мин на 100 мкл крови) : средние значения спонтанной хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови).

Методы иммунологического обследования

Материалы для исследования. В качестве биологического материала для иммунологических исследований использовали репрезентативную выборку образцов периферической крови здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя и больных алкогольной зависимостью спустя 17-19 часов после употребления последней дозы крепкого алкоголя.

Часть работы выполнена на базе ФГБУ “ГНЦ Института иммунологии” ФМБА России. В работе представлены результаты иммунологического обследования 220 больных алкогольной зависимостью, проходивших стационарное или амбулаторное лечение в наркологических клиниках и диспансерах города Москвы в период с 1994 по 2009 годы, а также от 180 здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя

Распределение обследованных лиц по полу и возрасту представлено в табл. 1.

Таблица 1.

Распределение обследованных лиц по полу и возрасту, n=400

Гендерный состав	Средний возраст пациентов	% обследованных
Мужчины, n=321	24-60 лет (45,5±8,8 лет)	81 %
Женщины, n=79	25-60 лет (40,9±9,8 лет)	19%

В табл. 2 представлена возрастная и гендерная характеристика обследованных групп больных алкоголизмом и здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя.

Таблица 2. Характеристика групп обследованных больных с алкогольной зависимостью и здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя (M±у)

Группы обследованных	мужчины	женщины	Средний возраст (лет)	Рост (см)	Вес (кг)
1. Больные алкоголизмом I стадии n=79	58 (73%)	21 (27%)	43±10	165-190	64-110
2. Больные алкоголизмом II стадии n=72	60 (83%)	12 (17%)	43,3±9,6	167-189	63-105
3. Больные алкоголизмом II стадии, фаза ремиссии, n=69	60 (87%)	9 (13%)	44,9±9,6	165-192	63-105
4. Здоровые лица (контроль), n=90	73 (81%)	17 (19%)	44±10	163-195	60-128
5. Здоровые добровольцы, получавшие нагрузку алкоголем, n=90	70 (78%)	20 (22%)	44,2±9,2	164-198	60-135

У больных алкоголизмом I стадии, вошедших в группу 1, злоупотребление алкоголем варьировало от 1 года до 3,5 лет, средняя длительность хронической алкогольной интоксикации (ХАИ) составляла 2,3±0,8 лет. Значимых различий длительности заболеваний у мужчин и женщин не было выявлено. Состояние алкогольного абстинентного синдрома ни у одного из больных группы 1 не было отмечено. Толерантность к алкоголю варьировала у мужчин от 0,4 л до 0,8 л (в среднем 0,6±0,2 л) и у женщин от 0,3 л до 0,6 л (в среднем 0,43±0,1 л) крепких алкогольных напитков в сутки (табл.3). Больные употребляли крепкий алкоголь в течение 2?3 дней до исследования в количестве 0,3-0,45 литра, забор крови проводили спустя 17-19 часов после употребления больными последней дозы алкоголя до назначения медикаментозного лечения.

Таблица 3.

Характеристика обследованных пациентов по длительности злоупотребления алкоголем, толерантности к алкоголю и частоте запоев, M±у.

Группы пациентов	Длительность хронической интоксикации	Толерантность к крепкому алкоголю (в литрах)	Продолжитель-ность запоев (дни)	Частота запоев в год
		мужчин	женщин
1. Больные алкоголизмом I стадии, n=79	2,3±0,8	0,6±0,2	0,43±0,1	0	0
2. Больные алкоголизмом II стадии, n=72	7,5±2,6	0,9±0,2	0,68±0,22	10 ? 20	4 ? 7
3. Больные алкоголизмом II стадии, фаза ремиссии, n=69	В анамнезе	0	0
	8,1±2,0	0,5 - 1,2	0,4 - 1,1

У больных алкоголизмом группы 2 длительность ХАИ варьировала от 6 до 10 лет (в среднем 7,5±2,6 лет). Алкогольный абстинентный синдром появился 4-6 лет назад. Частота появления ААС варьировала от 4 до 7 раз в год (табл. 3). Продолжительность запоев составляла 10-20 дней, толерантность к алкоголю варьировала у мужчин от 0,6 до 1,2 л (в среднем 0,9±0,2 л) и у женщин от 0,4 до 1 л (в среднем 0,68±0,22 л) крепких алкогольных напитков в сутки. Больные употребляли алкоголь в течение 1?2 дней до исследования в количестве 0,45-0,6 литра крепкого алкоголя, забор крови проводили спустя 17-19 часов после употребления больными последней дозы алкоголя до назначения медикаментозного лечения.

В группу 3 вошли больные алкоголизмом II стадии в фазе ремиссии длительностью от 3 до 5 лет, в среднем 4,1±1,1 лет (табл. 2, 3).

В контрольную, четвертую, группу сравнения (норма) вошли здоровые лица без синдрома зависимости от алкоголя. В группу 5 вошли здоровые добровольцы также без синдрома зависимости от алкоголя. В зависимости от дозы принимаемого алкоголя 5 группа добровольцев была разбита на 3 подгруппы (табл. 4). В подгруппу 1 вошли 27 практически не пьющих добровольцев, которые употребляли 50 мл водки или 150 мл красного вина за 17-19 часов до забора крови. В подгруппу 2 вошли 35 добровольцев, употреблявших раз в неделю по 0,2?0,3 л крепкого алкоголя. В течение дня они употребили 0,2?0,3 литра водки, последний был за 17?19 часов до забора крови. В подгруппу 3 вошли 28 добровольцев, эпизодически (раз в 1-2 месяца) употреблявших крепкий алкоголь, в течение 2-3 дней до исследования они употребили 0,6-1 литр крепкого алкоголя, последний приём был за 17-19 часов до забора крови. Перед данным исследованием добровольцы подгруппы 3 не употребляли никакого алкоголя в течение 1,5?2 месяцев.

Таблица 4.

Характеристика подгрупп обследованных здоровых добровольцев из группы 5, без синдрома зависимости от алкоголя

Подгруппы добровольцев	мужчины	женщины	Возраст	Рост	Вес
1. 50мл водки или 150мл вина, n=27	20 (74%)	7 (26%)	24?60 лет	164-188 см	60-105 кг
2. 0,2-0,3 л водки, n=35	30 (86%)	5 (14%)	25?60 лет	170-190 см	68-105 кг
3. 0,6-1 л крепкого алкоголя в течение 2-3 дней, n=28	24 (86%)	4 (14%)	28?60 лет	170-190 см	70-135 кг

Все обследованные (100%) - люди трудоспособного возраста с одинаковым социальным статусом (высшее образование, хорошая среда обитания и материальный достаток, проживание в полноценных семьях), жители города Москвы и ближнего Подмосковья. Из числа обследованных были исключены лица с отягощённой наследственностью по соматическим, аллергическим, аутоиммунным и онкологическим заболеваниям, а также страдающие туберкулезом, рецидивирующими герпетическими, цитомегаловирусными, хламидийными инфекциями, гепатитами B и C и ВИЧ-инфекцией.

Для всех больных и здоровых, принимавших участие в исследовании показателей иммунного статуса (400 человек), проводилось комплексное клиническое и лабораторно-инструментальное обследование, направленное на выявление сопутствующих патологий.

Исследование проводилось в соответствии с требованиями Основ законодательства “Об охране здоровья граждан”. Врачами психиатрами-наркологами у больных и у здоровых добровольцев было получено информированное согласие на проведение обследования.

Всем добровольцам после нагрузки алкоголем и больным алкоголизмом проводили определение показателей иммунного статуса: клеточного и гуморального иммунитета.

Забор крови у здоровых проводили рано утром, а у больных в момент поступления в клинику или в наркологический диспансер в пробирки с гепарином, ЭДТА и сухие без антикоагулянта с помощью системы “Vacutainer” (“Becton Dickinson”, USA). Для оценки иммунного статуса кровь использовали не позднее 6-и часов после забора.

Методы определения клеточного иммунитета

Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в пробирки “Vacutainer” с гепарином. В работе использовали мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной крови как указано выше [Boym A., 1968]. Клетки культивировали в полной питательной среде (ППС), как указано выше (методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro).

Всем обследованным проводили клинический анализ крови с обязательным определением лейкоцитарной формулы.

Метод определения пролиферативной активности T- и B- лимфоцитов. Пролиферативную активность T- и B- лимфоцитов определяли на модели реакции бластной трансформации (РБТЛ) с применением митогенных лектинов PHA (“Sigma”, USA), Con A (“Sigma”, USA), PWM (“Sigma”, USA) и LPS (“Sigma”, USA), которая рассматривается как экспериментальная модель пролиферативной экспансии клеток, происходящей под влиянием антигенов in vivo. Контролем служили культуры без добавления митогенных стимуляторов. Интенсивность пролиферативной реакции иммунокомпетентных клеток оценивали по активности синтеза ДНК, измеренной по скорости включения метил-³Н₁-тимидина во вновь синтезируемую ДНК. Радиоактивность образцов измеряли на в-счётчике “Wallac 1409 DSA” (Finland). Результаты измерения выражали имп/мин (CPM) в расчете на каждую культуру клеток, каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты исследований выражали в виде средних арифметических значений и индекса стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения CPM опытных культур : средние значения CPM контрольных культур [Петров Р.В. и др., 1984].

Метод определения цитолитической активности NK-клеток. Цитолитическую активность натуральных (естественных) киллеров (NK-клеток) периферической крови человека определяли на модели естественной цитолитической активности in vitro как описано выше (методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro). Результаты выражали индексом цитотоксичности, который вычисляли по формуле: ИЦ=(1 - средние значения CPM в опытных : средние значения CPM в контрольных культурах) Ч 100% [Алексеев Л.П. и др., 1985].

Метод определения популяционного состава лимфоцитов. Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в пробирки “Vacutainer” с ЭДТА. Обработку крови проводили согласно протоколу фирмы “Becton Dickinson” (USA). Популяционный и субпопуляционный состав периферической крови изучали методом проточной лазерной цитофлюориметрии на приборе FACS Calibur фирмы “Becton Dickinson” (USA) с использованием двух- и трёхцветных моноклональных антител фирмы “Becton Dickinson” (USA) [Loken M.R., 1990].

Методы определения функциональной активности фагоцитов. В качестве источника фагоцитирующих клеток использовали венозную кровь, взятую в пробирки “Vacutainer” с ЭДТА. Кислородзависимую активность фагоцитирующих клеток оценивали методом хемилюминесценции как описано выше. Результаты выражали в виде средних арифметических значений хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови) и индексом стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения хемилюминесценции фагоцитов с зимозаном, либо с ФМА (имп/мин на 100 мкл крови) : средние значения спонтанной хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови). Поглотительную активность фагоцитов оценивали на модели дрожжевых грибов, меченных ФИТЦ. Метод основан на способности фагоцитирующих клеток in vitro поглощать Candida albiсans, меченные ФИТЦ. Интенсивность фагоцитоза оценивали на проточном цитофлюориметре FACS Calibur фирмы “Becton Dickinson” (USA). Фагоцитарный индекс вычисляли как число грибов Candida albicans, поглощённых одним нейтрофилом [Пинегин Б.В. и др., 2001; Saresella M., Spesiale D. et al., 1999].

Методы определения гуморального иммунитета

Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в сухие пробирки “Vacutainer” без антикоагулянта. Кровь оставляли для свёртывания на 1 час при комнатной температуре, затем центрифугировали 10 мин при 400g (+4^о С). Сыворотку аликвотировали в пробирки “Eppendorf” и хранили до анализа при -20^о C не более месяца.

Метод определения содержания в сыворотке крови иммуноглобулинов классов A, M, G и E). Количественное определение содержания IgA, IgM, IgG и общего IgE в сыворотке крови человека проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест систем фирмы “Sigma” (USA). Постановку проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра - ридера “Titertek Multiskan MCC/340” (“Labsystems”, Finland) при длине волны 492 nm [Фримель Г., 1987].

Методы определения в сыворотке крови активности комплемента CH50, содержания компонентов комплемента C1, C3 и C4. Гемолитическую активность комплемента (CH50) в сыворотке крови определяли методом 50% гемолиза эритроцитов барана (ЭБ). Постановку реакции осуществляли в триплетах. Контролем служила стандартная пулированная (более 30 образцов) сыворотка здоровых доноров. Качество гемолитической системы контролировали по установленному стандартному значению оптической плотности суспензии сенсибилизированных эритроцитов, инкубированных в лунках без добавления сыворотки. Учёт реакции проводили с помощью спектрофотометра - ридера “Titertek Multiskan MCC/340” (“Labsystems”, Finland) при длине волны 690 nm. Активность комплемента выражали в условных единицах - CH50, рассчитанных с помощью специальной программы. За единицу активности принимали количество комплемента, выраженное в мл, вызывающее 50% гемолиз сенсибилизированных ЭБ [Кондратьева И.А. и др., 2001]. Количественное определение содержания в сыворотке крови C1, C3 и C4 компонентов комплемента проводили методом твердофазного ИФА с применением тест систем (“Beckman Culture”, USA). Для определения были использованы наборы “IFA-С1”, “IFA-С3” и “IFA-С4”, основанные на “сэндвич” - варианте твердофазного ИФА. Постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учёт реакции проводили с помощью спектрофотометра - ридера “Titertek Multiskan MCC/340” (“Labsystems”, Finland) при длине волны 630 nm [Walport M.J., 2001].

Методы определения содержания в сыворотке крови С-реактивного белка (CRP), антистрептолизина-О (ASO), ревматоидного фактора (RF) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Количественное определение содержания в сыворотке крови CRP, ASO и RF. Тест основан на взаимодействии исследуемых сывороток или контрольной сыворотки со специфическими моноклональными антителами к CRP, или ASO, или RF, иммобилизованными на латексных частицах. Появление отчетливо видимой агглютинации латекса в ячейках стеклянного слайда указывает на положительный результат теста. В работе были использованы наборы HUMATEX CRP, ASO и RF (“HUMAN”, Deutschland). Постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Количественное определение содержания в сыворотке крови ЦИК. Определение основано на снижении растворимости иммунных комплексов при наличии в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000. Увеличение мутности раствора при осаждении циркулирующих иммунных комплексов ПЭГ определяли турбодиметрически, оценивая скорость нарастания оптической плотности. При 3% концентрации ПЭГ происходит осаждение крупных иммунных комплексов, при 4% концентрации ПЭГ - средних и мелких. Измерение проводили с помощью спектрофотометра - ридера “MRX Microplate Reader” (“Dinex Technology Ins.”, USA) при длине волны 340 nm. Конечный результат выражали как среднее арифметическое трех значений оптической плотности (OD) в минуту [Digeon M. et al., 1977].

Метод определения содержания цитокинов - IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-б и IFN-г Количественное определение содержания в сыворотке крови цитокинов - IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-б и IFN-г проводили методом твердофазного ИФА с применением тест систем “Cytimmune” (USA). Постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра - ридера “MRX Microplate Reader” (“Dinex Technology Ins.”, USA) при длине волны 490 nm. Метод определения продукции лейкоцитами IFN-г при индукции клеток крови митогеном PHA in vitro. Биологическим материалом для исследования служили мононуклеары, выделенные из гепаринизированной крови, как указано выше [Boym A., 1968]. Для индукции IFN-г использовали фитогемагглютинин (PHA) “Sigma” (USA) 5 мкг/мл ППС (мононуклеары культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в полной питательной среде при 37^о C в атмосфере с 5% СО₂, время культивирования 48 часов). По завершении инкубации планшеты центрифугировали, затем собирали супернатанты в стерильные пробирки “Eppendorf”, которые хранили до анализа при -20^о С. Содержание IFN-г в культуральной среде определяли с помощью твердофазного ИФА с применением тест систем “Cytimmune” (USA), постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра - ридера “MRX Microplate Reader” (“Dinex Technology Ins.”, USA) при длине волны 490 nm.

Методы статистической обработки результатов исследований

Статистическую обработку полученных результатов проводили методом вариационной статистики на персональном IBM-совместимом компьютере с применением пакетов прикладных программ “Microsoft Excel 2007” и “Biostatistics”.

Результаты представлены в виде средней (М) ± стандартное отклонение (у). Сравнение групп здоровых добровольцев после нагрузки алкоголем и больных алкоголизмом с группой здоровых (норма) проведено с использованием t-критерия Стьюдента при условии нормального распределения признаков. Различия считались достоверными при p<0,05 [Реброва, О.Ю., 2003; Glantz, 1999].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.Влияние этанола на иммунокомпетентные клетки крови здоровых лиц в культурах in vitro

Для выяснения механизмов влияния этанола на клетки крови нами было проведено исследование действия различных концентраций этанола in vitro на иммунокомпетентные клетки периферической крови здоровых лиц. Биологическим материалом для исследования служили образцы периферической крови здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя. Нами был выбран широкий диапазон концентраций этанола - от критических (6 мг/мл) до нейтральных (6Ч10^-5 мг/мл). Выбор исследованных концентраций этанола соответствует дозам, охарактеризованным в России и США для здоровых лиц, не страдающих алкогольной зависимостью, и употребивших различные количества алкоголя (Прозоровский В.И. и др., 1967). В соответствии с этим исследованы in vitro дозы этанола, не влияющие на человека (6Ч10^-5 -6Ч10^-3 мг/мл); дозы, вызывающие слабое (6Ч10^-2 мг/мл) и сильное (6Ч10^-1 мг/мл) опьянение, и критические дозы, приводящие к смертельному исходу (6 г/кг массы тела).

1.1. Влияние этанола на синтез ДНК лимфоцитами крови человека

Исследовали влияние различных концентраций этанола на способность лимфоцитов цельной крови спонтанно инициировать клеточное деление in vitro. В одном варианте экспериментов на весь период культивирования лимфоцитов цельной крови от 10 здоровых лиц (72 часа при 37^оC в атмосфере влажности с 5% CO₂) этанол вносили в отсутствии митогенных лектинов PHA и Con A. Во втором варианте этанол вносили вместе с митогенными лектинами (кровь от 10 здоровых лиц), а в третьем варианте лимфоциты цельной крови (от 10 здоровых лиц) инкубировали 3 часа в тех же условиях в присутствии митогенных лектинов, после чего вносили этанол (оценка влияния этанола на индуцибельную фазу иммунного ответа).

Результаты исследования влияния in vitro широкого диапазона концентраций этанола на лимфоциты цельной крови представлены на рис. 1. Из рисунка видно, что этанол в концентрации 6 мг/мл полностью подавляет спонтанный пролиферативный ответ лимфоцитов (их способность к делению). Концентрация этанола 6Ч10^-1 мг/мл статистически значимо подавляет спонтанный пролиферативный ответ лимфоцитов, дозы этанола от 6Ч10^-2 мг/мл и ниже не влияют на спонтанную пролиферацию лимфоцитов in vitro, в сравнении с клеточными культурами без внесения этанола. Полученные результаты свидетельствуют о том, что этанол при внесении его в культуры клеток крови in vitro не индуцирует пролиферацию лимфоцитов, а в высокой концентрации (6 мг/мл), напротив, подавляет её. Причём, этанол в концентрации 6 мг/мл вызывает гибель клеток крови, что было подтверждено подсчётом клеток в камере Горяева, т.е. обладает выраженным цитостатическим эффектом.

Рис. 1. Уровень спонтанной пролиферации (СП) лимфоцитов (имп/мин) периферической крови здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя в присутствии этанола в сравнении с контрольными культурами в отсутствии этанола; *** - p<0,0001 - статистически значимое отличие от контроля; t-критерий Стьюдента

Таким образом, можно сделать заключение, что этанол не влияет на пролиферацию (деление) лимфоцитов крови человека (в диапазоне доз не подавляющих жизнеспособность) и не способен инициировать иммунный ответ.

Далее мы установили, что этанол в конечных концентрациях 6Ч10^-1-6 мг/мл, вносимый в культуры лимфоцитов крови человека вместе с митогенными лектинами PHA или Con A, подавляет пролиферативный ответ лимфоцитов на эти митогенные стимуляторы по абсолютным значениям CPM (имп/мин) в сравнении с контрольными культурами без этанола (рис.2).



Рис. 2. Уровень пролиферативной активности лимфоцитов, индуцированной митогенными лектинами PHA и Con A; ** - p<0,001; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия показателей культур с внесением митогенных лектинов PHA или ConA в присутствии этанола от показателей контрольных культур в отсутствии этанола; ^ ? тенденция к увеличению показателя; t-критерий Стьюдента

Дозы этанола 6Ч10^-5-6Ч10^-2 мг/мл не влияют на пролиферацию Т-лимфоцитов, индуцированную митогенным лектином PHA, в то же время усиливают пролиферацию Т-лимфоцитов, индуцированную Con A (рис. 2). Результаты, полученные в этом варианте исследований, свидетельствуют о том, что этанол обладает способностью усиливать пролиферацию CD8⁺ Т-лимфоцитов, поскольку известно, что Т-клеточный митоген Con A в культурах лимфоцитов in vitro стимулирует к пролиферации в основном популяцию CD8⁺-лимфоцитов [Дейл М.М., Формен Д.К., 1998].

Таким образом, установлено, что этанол обладает способностью усиливать in vitro индуцированную митогенным лектином Con A пролиферацию CD8⁺ T-лимфоцитов, что говорит о тропности этанола к этим клеткам.

В экспериментах с предварительным культивированием лимфоцитов цельной крови здоровых лиц (в течение 3 часов при 37°С в атмосфере влажности с 5% СО₂) в присутствии митогенов PHA или Con A и без них с последующим внесением этанола в конечных концентрациях 6Ч10^-5-6Ч10^-2 мг/мл (время культивирования 72 часа при тех же условиях), обнаружено, что этанол не оказывал влияния на фазу индуцибельного периода иммунного ответа и не усиливал последующую индукцию митогенными лектинами PHA или Con A деления Т-лимфоцитов (табл. 5).

Таблица 5.

Влияние этанола in vitro на фазу индуцибельного периода иммунного ответа лимфоцитов крови здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя (M±у)

Концентрация этанола мг/мл	Пролиферативный ответ лимфоцитов, (имп/мин) n=10
	СП	PHA (5мг/мл)	Con A (5мг/мл)
контроль (без этанола)	544±77	24593±4380	18483±4503
6Ч10-5	544±76,9	24508±4351	18457±4398
6Ч10-4	539±80,0	24393±4303	18450±4474
6Ч10-3	538±75,6	24829±4488	18275±4658
6Ч10-2	529±70,1	23726±4333	18647±4352

Таким образом, установлено, что этанол не влияет на индуцибельную фазу иммунного ответа.

1.2.Влияние этанола на активность NK-клеток

Исследовали in vitro влияние этанола на цитолитическую активность NK-клеток крови человека. Биологическим материалом для исследования служили лимфоциты, выделенные из венозной крови от 10 здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя. На весь период культивирования (18 часов при 37°С в атмосфере влажности с 5% СО₂) клеток-мишеней (клеточная линия К-562, меченая H³-уридином) и выделенных лимфоцитов в инкубационную среду вносили этанол в конечных концентрациях от 6Ч10^-5-6 мг/мл Контролем служили соответствующие культуры клеток без этанола (рис. 3).



Рис. 3. Индекс цитолитической активности NK-клеток крови in vitro; * - p<0,05; ** - p<0,001; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия показателя в присутствии этанола от показателя контрольных культур в отсутствии этанола; v ? тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента

Установлено, что этанол в концентрациях от 6Ч10^-5 до 6 мг/мл снижает цитолитическую активность NK-клеток. Наиболее выраженный эффект снижения наблюдается при дозах, которые вызывают слабое (6Ч10^-2) и сильное (6Ч10^-1 мг/мл) опьянение. Как видно из рисунка 3, при этих концентрациях отмечается высоко значимое снижение цитолитической активности NK-клеток по сравнению с контролем. Эффект полного подавления цитолитической активности NK-клеток этанолом наблюдается при концентрации 6 мг/мл, которая приводит к гибели человека.

...