Размещено на http://www.allbest.ru/

137

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

розробка складу, технології та дослідження апіпрепарату для ін'єкцій

15.00.01 - технологія ліків, організація

фармацевтичної справи та судова фармація

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

ЄМЕЛЬЯНОВ АНДРІЙ ВІКТОРОВИЧ

Харків-2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі аптечної технології ліків ім. Д. П. Сала

Національного фармацевтичного університету, Міністерства охорони здоров'я України (м. Харків).

мед бджолиний препарат лікарський

Науковий керівник:	заслужений діяч науки і техніки України, академік Української академії наук, доктор фармацевтичних наук, професор ТИХОНОВ ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ, Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри аптечної технології ліків ім. Д. П. Сала.
Офіційні опоненти:	доктор фармацевтичних наук, професор ЗАЙЦЕВ ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ, Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри процесів та апаратів хіміко-фармацевтичного виробництва;
	кандидат фармацевтичних наук, доцент СОКОЛОВА ЛЮДМИЛА ВОЛОДИМИРІВНА, Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я. Горбачевського, завідувач курсом технології ліків.

Захист відбудеться «_____» _________________ 2012 р. о ______ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.02 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий «_____» ________________ 2012 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор фармацевтичних наук, професор Д.І. Дмитрієвський

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Послаблений імунітет організму людини, на сьогоднішній день, одна з найбільш розповсюджених проблем у світі, яка потребує серйозного вирішення.

Хронічна слабкість імунітету виникає у результаті нездорового харчування, обмеження фізичного руху, стресу, великої кількості побічних реакцій лікарських препаратів на основі синтетичних субстанцій (звикання організму, алергічні реакції, тощо). Значну роль також відіграє забруднення оточуючого середовища, яке негативно впливає на організм людини та блокує імунну систему.

Виходячи з вищенаведеного, розробка лікарських препаратів для поліпшення стану імунної системи на основі нових та ефективних, а головне нешкідливих для здоров'я людей субстанцій є актуальним завданням сучасної фармації.

У цьому аспекті особливу увагу заслуговують лікарські субстанції з продуктів бджільництва. Однією з них є мед натуральний порошкоподібний (МНП), отриманий на кафедрі аптечної технології ліків

ім. Д.П. Сала Національного фармацевтичного університету під керівництвом академіка Української АН, професора Тихонова О. І.

Сучасні експериментальні дослідження свідчать, що мед є загальнозміцнюючим засобом, який підвищує загальну стійкість організму до дії шкідливих факторів зовнішнього середовища, проявляє багатосторонню регулюючу дію на організм людини. Чисельні компоненти меду стимулюють та укріплюють організм в цілому, а разом з тим і його захисні та відновні властивості. Тривале вживання цієї природної сировини підвищує опірність організму, стимулює роботу імунної системи.

Тому, створення нового вітчизняного препарату імуностимулюючої дії на основі бджолиного меду є актуальним рішенням проблеми лікування послабленого імунітету.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету (НФаУ) «Створення складу і технології одержання біологічно активних речовин та лікарських засобів природного походження (крім рослинних)», № держреєстрації 0103U000477 та проблемної комісії «Фармація» МОЗ та АМН України.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є наукове обґрунтування складу та розробка раціональної технології апіпрепарату для ін'єкцій з медом натуральним порошкоподібним імуностимулюючої та загальнозміцнюючої дії.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

· вивчити фармацевтичний ринок лікарських засобів імуностимулюючої дії в Україні, проаналізувати та узагальнити сучасні дані літератури стосовно хімічного складу бджолиного меду та його застосування в медицині, а також визначити технологічні аспекти створення ін'єкційних лікарських препаратів;

· теоретично та експериментально обґрунтувати оптимальний склад розчину для ін'єкцій з медом натуральним порошкоподібним;

· експериментально розробити та обґрунтувати раціональну технологію отримання препарату «Апімел»;

· дослідити фізичні, фізико-хімічні та фармако-технологічні показники якості одержаного препарату;

· визначити термін придатності та умови зберігання препарату «Апімел»;

· розробити проекти методів контролю якості (МКЯ) та технологічного промислового регламенту (ТПР) на розчин для ін'єкцій «Апімел»;

· узагальнити результати мікробіологічних та фармакологічних досліджень розробленого препарату.

Об'єкти дослідження. Мед натуральний порошкоподібний, допоміжні речовини для створення стабільного розчину для ін'єкцій, розчин для ін'єкцій «Апімел».

Предмет дослідження. Розробка та обґрунтування складу, а також раціональної технології виробництва ін'єкційного лікарського засобу на основі меду натурального порошкоподібного. Дослідження фізичних, фізико-хімічних, фармако-технологічних та мікробіологічних властивостей отриманого препарату, обґрунтування методик якісного та кількісного визначення основних діючих речовин розчину для ін'єкцій. Встановлення умов та терміну придатності препарату «Апімел». Фармакологічні дослідження препарату. Розробка проектів МКЯ та ТПР на розчин для ін'єкцій «Апімел».

Методи дослідження. Для вирішення поставлених у роботі завдань були використані загальноприйняті методи досліджень: фізичні та фізико-хімічні (визначення прозорості та ступеня забарвлення, рН, густини, якісного складу та кількісного вмісту діючих речовин), фармако-технологічні (визначення об'єму, що витягається, видимих та невидимих механічних включень), мікробіологічні (визначення стерильності, випробування на пірогени, аномальна токсичність), фармакологічні, математичні (статистична обробка результатів), які, на підставі експериментально одержаних результатів, дозволяють об'єктивно та у повній мірі оцінити якісні та кількісні показники якості отриманого препарату.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше запропоновано науково-методичний підхід до створення ін'єкційних лікарських засобів імуностимулюючої дії на основі меду натурального порошкоподібного.

За допомогою фізичних, фізико-хімічних, фармако-технологічних, мікробіологічних та фармакологічних досліджень експериментально розроблено та науково обґрунтовано оптимальний склад та раціональну технологію розчину для ін'єкцій «Апімел».

Розроблено методики визначення якісного складу та кількісного вмісту основних речовин отриманого препарату, які включено до проекту МКЯ на розчин для ін'єкцій «Апімел».

Досліджено стабільність препарату у процесі зберігання, а також узагальнені дані визначення його фармакологічної активності.

За результатами досліджень отримано патент України на корисну модель «Ін'єкційний лікарський засіб з імуностимулюючими та загальнозміцнюючими властивостями» № 61039 від 11.07.2011 р.

Практичне значення одержаних результатів. Створено та запропоновано для практичної медицини новий вітчизняний препарат під умовною назвою «Апімел» у формі розчину для ін'єкцій з імуностимулюючими та загальнозміцнюючими властивостями.

Розроблено та впроваджено на АТ «Лекхім-Харків» специфікацію СПФ М-4.1/О «Мед натуральний порошкоподібний» (дата введення 1.02.2011 р.). Розроблені проекти МКЯ та ТПР на виробництво розчину для ін'єкцій «Апімел», які апробовано в умовах промислового виробництва на АТ «Лекхім-Харків» (акт апробації від 11.02.2011 р.). Препарат «Апімел» включено до перспективного плану розвитку виробництва АТ «Лекхім-Харків» на 2012 р.

Окремі фрагменти роботи впроваджено до навчального процесу вищих медичних та фармацевтичних закладів України: Луганського державного медичного університету (кафедра технології ліків, організації та економіки фармації, акт впровадження від 19.10.2010 р.), Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова (кафедра фармації, акт впровадження від 23.12.2010 р.), Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгіївського (кафедра фармації, акт впровадження від 01.02.2011 р.), Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського (кафедра фармацевтичних дисциплін, акт впровадження від 31.03.2011 р.), Національного фармацевтичного університету (кафедра промислової фармації, акт впровадження від 27.05.2011 р.).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто досліджено фармацевтичний ринок імуностимулюючих лікарських препаратів в Україні, проаналізовано та узагальнено дані літератури стосовно хімічного складу бджолиного меду, а також його застосування у сучасній медицині. Вивчено технологічні аспекти створення ін'єкційних лікарських засобів. Розроблено та обґрунтовано оптимальний склад та раціональну технологію виготовлення розчину для ін'єкцій «Апімел». Досліджені фізичні, фізико-хімічні, фармако-технологічні показники якості отриманого препарату. Розроблено методики якісного та кількісного аналізу основних діючих речовин, які увійшли до проекту МКЯ на препарат. Узагальнено результати мікробіологічних та фармакологічних досліджень препарату «Апімел». Розроблено проект ТПР на виробництво розчину для ін'єкцій «Апімел». Статистично оброблено та систематизовано результати експериментальних досліджень.

Наукові праці опубліковані у співавторстві з Тихоновим О.І., Ковальовою О.О. Особистий внесок автора вказується за текстом дисертації, а також в авторефераті у списку фахових публікацій.

Апробація результатів дисертації. Фрагменти дисертаційної роботи викладено та обговорено на: Українській науково-практичній конференції, присвяченій пам'яті д. фарм. н., проф. Павла Олексійовича Петюніна (до 95-річчя з дня народження) «Проблеми синтезу біологічно активних речовин та створення на їх основі лікарських субстанцій» (Харків, 2009); Ювілейній науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій пам'яті к. фарм. н., доц. Борисова Михайла Івановича (до 80-річчя з дня народження) «Фармакогнозія ХХІ століття. Досягнення та перспективи» (Харків, 2009); VII Національному з'їзді фармацевтів України «Фармація України. Погляд у майбутнє» (Харків, 2010); IV З'їзді апітерапевтів України «Апітерапія: сьогодення та майбутнє фармації» (Київ, 2011); LV Підсумковій науково-практичній конференції «Здобутки клінічної та експериментальної медицини» (Тернопіль, 2011), 4-й Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів» (Тернопіль, 2011); ІІ Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Сучасні досягнення фармацевтичної технології» (Харків, 2011).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 12 наукових робіт, у тому числі 5 статей (4 - у наукових фахових виданнях), 6 тез доповідей в матеріалах конференцій, 1 патент України.

Об'єм та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 166 сторінках друкованого тексту (обсяг основного тексту 134 сторінки), складається зі вступу, огляду літератури, 4 розділів експериментальної частини, висновків, списку використаних джерел, додатків. Робота ілюстрована 48 таблицями та 9 рисунками. Бібліографія включає 147 джерел літератури, з них 54 іноземні.

Основний зміст роботи

У вступі наведено актуальність теми, сформульовано мету та основні завдання дослідження, визначено наукову новизну та практичне значення отриманих результатів.

У розділі 1 «Сучасні аспекти створення ін'єкційних лікарських препаратів імуностимулюючої дії на основі бджолиного меду» проаналізовано стан фармацевтичного ринку України імуностимулюючих препаратів. Встановлено, що лікарські препарати (ЛП) імуностимулюючої дії представлені здебільшого у вигляді лікарських засобів (ЛЗ) для парентарального застосування, із значним домінуванням продукції іноземного виробництва. Визначено, що саме ЛЗ на основі природних субстанцій є найбільш прийнятними для організму людини. Наведено узагальнені сучасні дані літератури стосовно хімічного складу бджолиного меду та його застосування в медичній практиці. Встановлено перспективність застосування цієї сировини в якості діючої субстанції при розробці нових ЛП широкого спектру дії. Розглянуто особливості технології ін'єкційних ЛЗ, визначено основні вимоги при створенні даної лікарської форми. Обґрунтовано раціональність створення нового ін'єкційного засобу імуностимулюючої дії на основі бджолиного меду.

У розділі 2 «Обґрунтування загальної концепції та методів досліджень» представлено загальну концепцію досліджень, яка враховує особливості підходу до розробки та обґрунтування складу та технології ін'єкційних лікарських засобів у вигляді розчинів для ін'єкцій. Наведено характеристику діючої речовини - меду натурального порошкоподібного (МНП), а також використаних допоміжних речовин.

Представлено основні методи та методики фізичних, фізико-хімічних, фармако-технологічних, мікробіологічних та фармакологічних досліджень, умови їх проведення та статистичну обробку результатів.

У розділі 3 «Розробка складу та технології апіпрепарату для ін'єкцій» наведено результати експериментальних досліджень з обґрунтування оптимального складу і раціональної технології виготовлення розчину для ін'єкцій з МНП імуностимулюючої дії.

З метою отримання субстанції на основі натурального бджолиного меду з оптимальними фізико-хімічними властивостями та збереженням максимальної кількості його біологічно активних речовин на кафедрі аптечної технології ліків ім. Д.П. Сала НФаУ під керівництвом академіка Української АН, професора Тихонова О.І. було розроблено технологію одержання субстанції меду натурального порошкоподібного. Проте, ця технологія є дуже складною, а технологічний процес отримання субстанції є довготривалим.

Тому, експериментальним шляхом, нами було удосконалено технологію отримання субстанції МНП за рахунок зміни параметрів процесу сублімаційної сушки бджолиного меду, що дозволило скоротити загальний час сублімації на 23 години. Це суттєво знизило собівартість одиниці субстанції МНП.

Крім того, для зниження ризику мікробної контамінації готового препарату, була застосована стерилізуюча фільтрація при приготуванні розчину меду для сублімації.

За удосконаленою технологією було отримано 4 зразки субстанції з різних видів натурального бджолиного меду:

№ 1 - зразок, отриманий з незакристалізованого білоакацієвого меду;

№ 2 - зразок, отриманий з закристалізованого білоакацієвого меду;

№ 3 - зразок, отриманий з закристалізованого гречаного меду;

№ 4 - зразок, отриманий з закристалізованого поліфлерного меду.

Наступним етапом наших досліджень стало вивчення фізичних та фізико-хімічних показників якості зразків субстанції МНП, одержаних за удосконаленою технологією.

Експериментальні дані проведених досліджень наведені у табл. 1.

З табл. 1 видно, що усі 4 зразки субстанції МНП, отримані за удосконаленою технологією відповідають вимогам ТУ У 01.2-02010936-001:2007 «Мед натуральний порошкоподібний».

Стерильність одержаних зразків субстанції підтверджено мікробіологічними дослідженнями, проведеними на базі Державної установи (ДУ) «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова» (м. Харків).

Таким чином, наступним етапом наших досліджень стало обґрунтування складу розчину для ін'єкцій на основі МНП. Першочергово було визначено раціональну концентрацію діючої речовини МНП у готовому препараті.

Таблиця 1

Порівняльна характеристика фізико-хімічних властивостей 4-х зразків субстанції МНП, отриманих за удосконаленою технологією (n = 5, P = 0,95)

Параметр	Норма згідно ТУ У 01.2-02010936-001:2007	Зразок № 1	Зразок № 2	Зразок № 3	Зразок № 4
Масова частка води та летких сполук, %	не більше 8	7,15 ± 0,03	6,87 ± 0,19	6,45 ± 0,26	7,76 ± 0,18
Масова частка відновлювальних цукрів до інверсії у безводній речовині, %	не менше 70	70,49 ± 0,35	72,93 ± 0,71	71,63 ± 1,11	72,78 ± 1,21
Масова частка сахарози у безводній речовині, %	не більше 6	5,32	4,85	4,83	4,73
Діастазне число в перерахунку на 1 г безводної речовини, од. Готе	не менше 7	8,30 ± 0,26	8,12 ± 0,27	9,09 ± 0,18	8,14 ± 0,24
Вміст гідроксиметилфурфуролу, мг/кг	не більше 25	22,53 ± 0,38	23,17 ± 0,37	23,90 ± 0,33	24,45 ± 0,28
Кислотність, міліеквівалентів натрію гідроксиду на 1 кг	не більше 50	45,88 ± 0,26	47,33 ± 0,44	46,14 ± 0,46	47,65 ± 0,31
Вміст проліну, мг/кг	не менше 300	340,42 ± 7,50	320,00 ± 4,92	325,82 ± 4,94	313,74 ± 5,19

Експериментальними дослідженнями визначено оптимальний діапазон концентрацій діючої субстанції у розчині для ін'єкцій за допомогою вивчення параметрів фільтрації розчинів МНП у діапазоні концентрацій від 5 % до 20 % крізь фільтруючу мембрану діаметром 150 мм з розміром пор 0,2 мкм за допомогою фільтрувальної установки «Millipore» (США) (табл. 2).

Таблиця 2

Результати визначення оптимального діапазону концентрації МНП у розчині для ін'єкцій (n = 5, P = 0,95)

Концентрація субстанції у розчині, %	Об'єм фільтрату, л
	10 хв.	20 хв.	30 хв.	40 хв.
5	1,90±0,05	3,31±0,06	3,75±0,06	3,94±0,03
10	1,50±0,03	3,00±0,06	3,50±0,06	3,73±0,03
15	1,00±0,03	1,64±0,04	2,13±0,03	2,36±0,05
20	0,50±0,02	1,09±0,03	1,42±0,05	1,60±0,03

На підставі отриманих даних побудовано графік залежності об'єму фільтрату від концентрації МНП у розчині, який наведено на рис. 1.

Рис. 1. Графік залежності об'єму фільтрату від концентрації МНП у розчині

З рис. 1 видно, що при концентрації МНП у розчині для ін'єкцій 5 % та 10 % об'єм фільтрату після закінчення процесу фільтрації (40 хв.) складав 3,94 л і 3,73 л відповідно, у той час як при концентраціях 15 % та 20 % об'єм фільтрату складав 2,36 л та 1,60 л відповідно, що свідчить про утруднення процесу фільтрації внаслідок закупорювання пор фільтру.

Таким чином, з наведених вище експериментальних даних видно, що для забезпечення ефективного процесу фільтрації розчину для ін'єкцій концентрація МНП у готовому препараті повинна бути не більше 10 %.

Для уточнення концентрації субстанції МНП у готовому препараті були проведені фармакологічні дослідження розчинів субстанції у визначеному діапазоні концентрацій.

Дослідження проводили in vitro на базі ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова» на препаратах крові 27 чоловіків та жінок віком від 18 до 47 років з різними вихідними значеннями показників стану імунітету, які проходили обстеження імунного статусу в Міському центрі клінічної імунології м. Харкова. При цьому препарати крові були розподілені на дві основні групи. До препаратів крові першої групи додавали досліджувані субстанції меду натурального порошкоподібного в різних концентраціях. Кров другої групи залишалась інтактною та використовувалась для порівняння.

У результаті дослідження впливу розчинів субстанції МНП у різних розведеннях на фагоцитарні здібності нейтрофілів периферичної крові за показниками фагоцитарного числа та індексу отримані наступні дані, які наведено у табл. 3.

З даних табл. 3 видно, що найбільше посилення фагоцитарної активності було виявлено при додаванні до препаратів крові зразків субстанції № 1 та № 3 у концентрації 0,0251 г/мл. Виходячи з цього, можна зробити висновок, що раціональна концентрація МНП у розчині для ін'єкцій - 2,5 %.

Таблиця 3

Результати впливу розчинів субстанції МНП у різних розведеннях на фагоцитарну активність нейтрофілів (n = 5, P = 0,95)

Розведення, г/мл	Фагоцитарний індекс / Фагоцитарне число, %
	Зразок № 1	Зразок № 2	Зразок № 3	Зразок № 4	Контрольна група,
0,1	3,91±0,39 74,10±3,78	3,88±0,42 73,88±4,04	3,96±0,62 74,71±3,98	3,84±0,52 73,29±4,17	3,84±0,43 73,15±3,55
0,05	4,08±0,47 79,53±3,46	3,99±0,43 74,24±3,49	4,10±0,49 79,87±3,45	4,02±0,49 78,77±4,29
0,0251	6,43±0,52 86,37±3,87	4,32±0,39 76,19±3,75	7,01±0,84 85,26±4,49	4,85±0,60 79,03±4,34
0,0125	6,03±0,52 80,13±3,67	4,30±0,61 76,03±4,18	6,10±0,63 83,67±4,19	4,64±0,61 77,12±4,18
0,00625	4,72±0,49 79,89±3,82	4,08±0,39 75,84±4,42	5,03±0,58 81,19±3,76	4,18±0,58 76,03±3,94
0,0031	4,22±0,61 79,34±4,03	3,97±0,58 75,63±3,98	4,52±0,49 79,97±4,29	3,94±0,43 75,98±4,39
0,0015	3,99±0,39 79,11±4,11	3,91±0,55 75,40±4,14	4,08±0,65 79,64±4,07	3,90±0,63 75,87±4,15
0,00078	3,92±0,57 76,52±3,94	3,87±0,49 74,74±4,37	3,98±0,54 77,13±3,89	3,88±0,39 75,43±3,97
0,00039	3,87±0,63 75,36±3,96	3,86±0,61 74,13±3,98	3,93±0,37 76,58±4,17	3,87±0,45 75,39±3,42
0,0002	3,85±0,48 74,61±4,13	3,84±0,56 73,69±4,23	3,87±0,66 74,87±4,09	3,85±0,37 73,72±3,73

Наступним етапом нашої роботи стало обґрунтування вибору та кількісного вмісту допоміжних речовин у складі готового препарату.

Загальновідомо, що одним з найвідповідальніших етапів розробки складу ЛП у вигляді парентеральних розчинів є вибір розчинника. Найбільш розповсюдженим розчинником для ін'єкційних ЛЗ у вигляді розчинів є вода для ін'єкцій.

Оскільки субстанція МНП добре розчинна у воді, то в якості розчинника нами було обрано саме воду для ін'єкцій.

Для обґрунтування доцільності введення до складу препарату інших допоміжних речовин нами спочатку було виготовлено модельний зразок розчину, який був розлитий і запаяний в ампули, та містив тільки МНП (2,5 г) і воду для ін'єкцій (до 100 мл).

При спостереженні за зовнішнім виглядом, а також дослідженні показника рН отриманого розчину для ін'єкцій з МНП протягом 5 днів було виявлено, що вже після 3-х днів зберігання у розчині з'явилась завись, після 5-ти днів зберігання розчин став каламутним та утворився нерозчинний осад, що є неприпустимим для ін'єкційних ЛЗ. Також знизився показник рН з 4,20 ± 0,02 до 3,03 ± 0,07.

Таким чином, нами було встановлено, що розчин МНП є нестабільним. Тому, для отримання стабільного готового препарату необхідно додавання спеціальних допоміжних речовин - стабілізаторів.

Проаналізувавши дані літератури нами були виготовлені модельні зразки розчинів для ін'єкцій з додаванням різних типів стабілізаторів, склад яких наведено у табл. 4.

Таблиця 4

Склад модельних зразків розчинів для ін'єкцій з МНП

Компонент	Склад
	Зразок № 1	Зразок № 2	Зразок № 3	Зразок № 4	Зразок № 5	Зразок № 6
МНП	2,5 г
Пропіленгліколь	20 г	40 г	-	-	20 г	-
Спирт бензиловий	-	-	1,0 г	-	-
Ніпагін	-	-	-	0,08 г	0,08 г	-
Ніпазол	-	-	-	0,009 г	0,009 г	-
Натрію метабісульфіт	-	-	-	-	-	0,1 г
Вода для ін'єкцій	до 100 мл

З табл. 4 видно, що в якості допоміжних речовин нами були використані різни типи стабілізаторів та консервантів, які найчастіше застосовуються при виробництві ін'єкційних розчинів.

Проте в результаті спостережень визначено, що отримати стабільний розчин для ін'єкцій так і не вдалося оскільки, у кожному з виготовлених модельних зразків вже протягом 5 днів спостереження було виявлено помутніння розчину та випадіння осаду, що не припустимо для ін'єкційних ЛП. Також спостерігалась зміна показника рН у кислу сторону (табл. 5).

Таблиця 5

Зміна показника рН отриманих модельних зразків розчину для ін'єкцій

Термін зберіган-ня, дні	Значення показника рН розчину
	Зразок № 1	Зразок № 2	Зразок № 3	Зразок № 4	Зразок № 5	Зразок № 6
1	4,21±0,06	4,39±0,05	4,30±0,05	4,24±0,05	4,25±0,04	4,34±0,04
3	3,52±0,06	3,49±0,03	3,50±0,04	3,48±0,03	3,55±0,04	3,60±0,03
5	3,04±0,06	3,06±0,06	3,01±0,05	3,02±0,03	3,04±0,03	3,04±0,04

Як видно з даних табл. 5 значення показника рН середовища усіх модельних зразків постійно знижується, тобто є нестабільним.

З даних літератури відомо, що основним фактором, який забезпечує стійкість глюкози (одного з основних компонентів бджолиного меду) у розчині є рН середовища. Так, у лужному середовищі відбувається окиснення, карамелізація та полімеризація глюкози. У сильно кислому середовищі (рН = 1,0 - 3,0) у розчині глюкози утворюється кислота D-глюконова. При подальшому її окисненні вона перетворюється у 5-оксиметилфурфурол, який викликає забарвлення розчину у жовтий колір. При рН = 3,5 - 5,0 реакція уповільнюється, а при рН вище 5,0 - знову зростає.

Проведені нами попередні дослідження свідчать, що розчин МНП має кислу реакцію середовища (рН 2,5 % розчину 4,20 ± 0,02).

Тому, виходячи з вище наведеного, нами були виготовлені модельні зразки розчину для ін'єкцій МНП з додаванням цитратних буферних систем, оскільки саме вони здатні забезпечити необхідний рівень рН розчину, а також є найбільш фізіологічними для організму людини .

Склад виготовлених зразків наведено у таблиці 6.

Таблиця 6

Склад модельних зразків розчину для ін'єкцій МНП з додаванням цитратних буферних систем

Компонент / рН отриманого розчину	Кількісний вміст, г
	Зразок № 7	Зразок № 8	Зразок № 9	Зразок № 10
МНП	2,5
Кислота лимонна безводна	0,065	0,045	0,020	0,005
Натрію цитрат	0,010	0,030	0,060	0,030
Вода для ін'єкцій	до 100 мл
рН	3,02±0,04	4,0±0,02	5,01±0,02	6,01±0,03

З даних табл. 6 видно, що нами було виготовлено 4 зразки розчину для ін'єкцій з використанням цитратних буферних систем з різними значеннями рН середовища.

Проте вже на 3 день зберігання у виготовлених зразках розчину для ін'єкцій № 7, № 9 та № 10 було виявлено опалесценцію, а протягом 5 днів зберігання утворилася завись і відбулася незначна зміна показника рН середовища до 2,95 ± 0,05 у зразку № 7, до 4,91 ± 0,04 у зразку № 9, і до 5,98 ± 0,05 у зразку № 10.

У зразку розчину для ін'єкцій № 8 не спостерігалась зміна зовнішнього вигляду, але також було відмічено незначне змінення показника рН середовища до 3,75 ± 0,03, яке не призводить до погіршення якості розчину.

Тому, виходячи з аналізу вище наведеного, можна зробити висновок, що найбільш оптимальним із досліджених є склад модельного зразку № 8 розчину для ін'єкцій з використанням цитратного буферу з рН середовищем - 4,0.

Таким чином, нами було експериментально розроблено оптимальний склад розчину для ін'єкцій з МНП під умовною назвою «Апімел»:

Склад препарату «Апімел» на одну ампулу:

Діюча речовина:
Мед натуральний порошкоподібний (у перерахунку на безводну речовину)	50,0 мг
Допоміжні речовини:
Кислота лимонна безводна	0,9 мг
Натрію цитрат	0,6 мг
Вода для ін'єкцій	до 2 мл

Як відомо, однією з найважливіших вимог, які висуваються до парентеральних ЛЗ є стерильність. Тому першочерговим завданням при розробці технології виготовлення препарату «Апімел» став вибір раціонального методу його стерилізації.

У Настанові 42-3.1:2004 «Фармацевтична розробка» наведена схема вибору методу стерилізації (рис. 2).



	Чи можна лікарський засіб стерилізувати вологим жаром при температурі 121 єС протягом 15 хв.
Ні	Так
Чи можна лікарський засіб стерилізувати вологим жаром протягом ? 8 хв., досягаючи СНС ? 10-6		Використовувати автоклавування при температурі 121 єС протягом 15 хв.
Ні	Так
Чи можна даний склад фільтрувати крізь фільтр, що затримує мікроорганізми		Використовувати вологий жар протягом ? 8 хв.
Ні	Так
Використовувати попередньо простерилізовані окремі компоненти; приготування та наповнення в асептичних умовах		Використовувати комбінацію стерилізуючої фільтрації та ведення процесу в асептичних умовах

Рис. 2. Схема рішень для вибору методу стерилізації лікарських засобів, що являють собою водні розчини

Посилаючись на схему, яка наведена на рис. 2, а також враховуючи те, що мед є термолабільною речовиною можна зробити висновок, що раціональним рішенням для вибору методу стерилізації препарату «Апімел» буде використання комбінації стерилізуючої фільтрації та проведення технологічного процесу в асептичних умовах.

Тому, наступним етапом досліджень був вибір оптимального фільтруючого матеріалу для фільтрації препарату «Апімел» на основі проведення статичного та динамічного методів визначення впливу фільтруючих матеріалів на досліджуваний розчин для ін'єкцій, застосовуючи для цього такі типи фільтрів: «Ultipor N 66» фірми «Pall» з фільтруючою мембраною з нейлону (Німеччина), «МF-Millipore» фірми «Millipore» з фільтруючою мембраною з суміші нітрату й ацетату целюлози (США), «Propor Pes» фірми «Domnick hunter» з фільтруючою мембраною з поліефірсульфону (Англія).

В результаті виконання досліду було встановлено, що всі наведені типи фільтрів не чинили негативного впливу на якість розчину «Апімел» та можуть бути використані для його фільтрації в промислових умовах.

Для запобігання окиснення препарату в процесі зберігання під дією кисню, який міститься у достатній кількості в розчині та у повітряному просторі в запаяній ампулі нами було вивчено вплив різних методів ампулювання на якість препарату «Апімел».

Отримані експериментальні дані наведені у табл. 7.

Таблиця 7

Результати дослідження впливу різних методів ампулювання

на показники якості розчину «Апімел»

Показник	Зразки препарату «Апімел»
	Звичайне ампулювання	Ампулювання у струмені інертного газу
Прозорість	прозорий	прозорий
Кольоровість	світло-жовтий	світло-жовтий
Механічні частки	відсутні	відсутні
рН	3,77±0,06	4,11±0,03

Виходячи з даних табл. 7 видно, що за показником рН найбільш прийнятним є метод ампулювання у струмені інертного газу - азоту. Тому вибір саме цього методу ампулювання препарату «Апімел», на наш погляд, є найбільш раціональним у промисловому виробництві.

Проведені нами експериментальні дослідження дозволили розробити раціональну технологію виготовлення розчину для ін'єкцій «Апімел». Критичні параметри технологічного процесу були опрацьовані у промислових умовах АТ «Лекхім-Харків», необхідні контрольні точки внесені до технологічної документації. На препарат «Апімел» розроблено проект ТПР, який апробовано в промислових умовах АТ «Лекхім-Харків» (акт апробації від 11.02.2011 р.). Технологічна блок-схема виробництва препарату «Апімел» наведена на рис. 3.

У розділі 4 «Розробка методик контролю якості та стандартизації розчину для ін'єкцій «Апімел». Вивчення стабільності препарату» наведено результати фізичних, фізико-хімічних, фармако-технологічних та мікробіологічних досліджень препарату, які покладені в основу проекту МКЯ. Встановлено термін придатності та умови зберігання розчину для ін'єкцій.

Одержаний препарат «Апімел» у формі розчину для ін'єкцій оцінювали за такими показниками: прозорість, ступінь забарвлення, рН, густина, об'єм, що витягається, механічні включення (видимі та невидимі частки).

Встановлено, що препарат «Апімел» є прозорим розчином для ін'єкцій, зі ступенем забарвлення не інтенсивніше еталона Y₅. Показник рН середовища розчину становить 3,98 ± 0,04, густина - 1,0069 ± 0,0003 г/см³. При визначенні об'єму, що витягається було встановлено, що показник вкладається у допустимі межі, (ДФУ 1-е вид., доп. 2, С. 149). Видимих механічних часток у розчині для ін'єкцій не виявлено, а кількість невидимих часток вкладається у допустимі норми згідно ДФУ 1-е вид., доп. 2, С. 164.

З метою стандартизації препарату «Апімел» також були проведені дослідження з вивчення якісного та кількісного вмісту його діючих речовин та специфічних домішок: відновлювальні цукри, сахароза, діастазна активність, гідроксиметилфурфурол та пролін.

Для якісного визначення основних речовин МНП у розчині для ін'єкцій були застосовані класичні реакції ідентифікації: з реактивом Фелінга, з резорцином у кислоті сірчаній та з 5 % спиртовим розчином тимолу.

Вихідна сировина, проміжна продукція та матеріали		Підготовка сировини та ампул		Контроль у процесі виробництва
Ампули, касети		Стадія 1 Набір ампул у касети Перевантажний пристрій		Зовнішній вигляд ампул, кількість ампул у касеті та загрузочному бункері
Мед натуральний порошкоподібний, кислота лимона безводна, натрію цитрат		Стадія 2 Зважування сировини Ваги		Маркування, кількість компонентів, швидкість ламінарного потоку повітря
		Приготування розчину
Сировина зі стадії 2, вода для ін'єкцій		Стадія 3 Розчинення компонентів Реактор		Температура, кількість речовин, час перемішування, число обертів мішалки, повнота розчинення, рН розчину, кількісний вміст речовин
Азот		Стадія 4 Стерилізуюча фільтрація Фільтри, збірник		Тиск у реакторі та у збірнику
Ампули зі стадії 1, вода для ін'єкцій, стисле повітря		Стадія 5 Миття та стерилізація ампул Автоматична лінія		Час миття, параметри режиму стерилізації, зовнішній вигляд ампул, кількість ампул у загрузочному бункері
Розчин зі стадії 4, азот, природний газ та кисень		Стадія 6 Наповнення та запайка ампул Автоматична лінія		Кількість запаяних ампул, об'єм наповнення, якість запайки, швидкість ламінарного потоку повітря
		Стадія 7 Перевірка ампул на герметичність Автоклав		Тиск, час краш-тесту
Вода очищена		Стадія 8 Миття ампул з розчином Вана для миття ампул		Відсутність негерметичних ампул
		Стадія 9 Контроль на механічні включення Столи для перегляду		Відсутність механічних включень
		Пакування ампул
Ампули зі стадії 9, етикетки, що клеяться		Стадія 10 Маркування ампул Етикетувальний автомат		Правильність маркування, якість наклеювання етикетки
Пачки, перегородки, інструкції, ящики, групові етикетки		Стадія 11 Упаковка у групову тару Пакувальний стіл		Зовнішній вигляд пачки та ящика, правильність маркування пачки та етикетки, ко-мплектність пачки та ящика
		Склад готової продукції		Контроль готової продукції

Рис 3. Технологічна блок-схема процесу виробництва розчину для ін'єкцій «Апімел»

Кількісне визначення діючих речовин МНП у препараті «Апімел» проводили спектрофотометричним методом з подальшою комп'ютерною обробкою результатів дослідження за допомогою програмного забезпечення «Спектр» для «Windows».

Для визначення кількісного вмісту відновлювальних цукрів у препараті «Апімел» до інверсії (у мг) вимірювали оптичну густину розчину досліджуваного зразку препарату на спектрофотометрі СФ-46 в кюветі з товщиною шару 10 мм при довжині хвилі (440,0 ± 2,0) нм, використовуючи як розчин порівняння воду очищену.

Вміст відновлювальних цукрів до інверсії у препараті «Апімел» повинен становити не менше 17,5 мг/мл (у перерахунку на кількісний вміст відновлювальних цукрів до інверсії у субстанції МНП). Результати визначення кількісного вмісту відновлювальних цукрів до інверсії у розчині для ін'єкцій наведено у табл. 8.

Таблиця 8

Результати кількісного визначення відновлювальних цукрів до інверсії в розчині для ін'єкцій «Апімел» (n = 5, P = 0,95)

№ з/п	Кількісний вміст відновлювальних цукрів до інверсії (Хі), мг/мл	Метрологічна характеристика
1	18,2	= 18,4 S = 0,18 S = 0,080 Д = ±0,2 = 1,21%
2	18,5
3	18,2
4	18,6
5	18,4

З табл. 8 видно, що кількісний вміст відновлювальних цукрів до інверсії у розчині для ін'єкцій «Апімел» складає 18,4 ± 0,2 мг/мл.

Для визначення діастазного числа у препараті «Апімел» вимірювали оптичну густину розчину досліджуваного зразку препарату на спектрофотометрі СФ-46 в кюветі з товщиною шару 10 мм при довжині хвилі

(590,0 ± 2,0) нм, використовуючи як розчин порівняння воду очищену.

Діастазне число повинно становити не менше 0,175 од. Готе/мл (у перерахунку на діастазне число у субстанції МНП). Результати визначення діастазного числа у препараті наведено у табл. 9.

Таблиця 9

Результати визначення діастазного числа

для розчину «Апімел» (n = 5, P = 0,95)

№ з/п	Діастазне число (Хі), од. Готе/мл	Метрологічна характеристика
1	0,197	= 0,198 S = 0,0037 S = 0,0017 Д = ±0,005 = 2,34%
2	0,197
3	0,201
4	0,201
5	0,192

З табл. 9 видно, що діастазне число у препараті «Апімел» становить 0,198 ± 0,005 од. Готе/мл.

Для визначення кількісного вмісту проліну в препараті «Апімел» вимірювали оптичну густину розчину досліджуваного зразку препарату на спектрофотометрі СФ-46 в кюветі з товщиною шару 10 мм при довжині хвилі (510,0 ± 2,0) нм. Паралельно виконували контрольний дослід з використанням води очищеної.

Вміст проліну повинен становити не менше 0,0075 мг/мл розчину для ін'єкцій «Апімел» (у перерахунку на кількісний вміст проліну в субстанції МНП). Результати визначення кількісного вмісту проліну в препараті «Апімел» наведено в табл. 10.

Таблиця 10

Результати кількісного визначення проліну для розчину «Апімел» (n = 5, P = 0,95)

№ з/п	Кількісний вміст проліну (Хі), мг/мл	Метрологічна характеристика
1	0,00847	= 0,00840 S = 0,000099 S = 0,000044 Д = ±0,00010 = 1,48%
2	0,00840
3	0,00821
4	0,00832
5	0,00840

Як видно з табл. 10, кількісний вміст проліну в препараті «Апімел» становить 0,00840 ± 0,00010 мг/мл.

З метою встановлення терміну придатності та умов зберігання, розроблений нами препарат «Апімел» був закладений на зберігання при двох температурних режимах: у прохолодному місці (+8 єС - +15 єС), та у холодильнику (+2 єС - +8 єС) в ампулах, які були вкладені у пачку з картону типу хром-ерзац.

У процесі зберігання контролювали наступні показники: прозорість, ступінь забарвлення, рН, об'єм, що витягається, механічні включення, стерильність, а також якісне визначення та кількісний вміст відновлювальних цукрів, діастазне число, кількісний вміст ГМФ та проліну.

Результати експериментального обґрунтування температурного режиму зберігання препарату «Апімел» наведено у табл. 11.

З табл. 11 видно, що в процесі зберігання при температурі +2 єС - +8 єС препарат «Апімел» має задовільні фізичні, фізико-хімічні та мікробіологічні показники якості, значення яких вкладається у норми, встановлені за проектом МКЯ.

При зберіганні у температурному режимі +8 єС - +15 єС відбувається зміна прозорості розчину, значення показника рН, а також знижується кількісний вміст основних компонентів препарату.

Таким чином, на підставі проведених експериментальних досліджень, було визначено термін придатності препарату - 2 роки, а також обрано раціональний температурний режим зберігання - це +2 єС - +8 єС.

Таблиця 11

Результати вивчення стабільності препарату «Апімел» в процесі зберігання при температурі +2 єС - +8 єС

Показник (норма згідно проекту МКЯ)	Первинний аналіз	Термін зберігання, міс
		3	6	9	12	15	18	21	24	27
Опис	Злегка забарвлена рідина
Ідентифікація: відновлювальні цукри	З реактивом Фелінга утворюється помаранчевий осад З резорцином у концентрованій сірчаній кислоті утворюється жовте забарвлення та осад рожево-бурого кольору З 5 % спиртовим розчином тимолу утворюється червоне забарвлення
Прозорість (повинен бути прозорим)	Прозорий
Ступінь забарвлення (не інтенсивніше еталона Y5)	Відповідає
рН (від 3,7 до 4,2)	4,11±0,03	4,04± 0,05	4,06± 0,03	3,99± 0,03	3,95± 0,05	3,97± 0,04	3,91± 0,06	3,92± 0,05	3,83± 0,04	3,84± 0,04
Об'єм, що витягається (від 2,0 мл до 2,15 мл)	2,12±0,02	2,11± 0,02	2,12± 0,02	2,11± 0,03	2,10± 0,02	2,12± 0,02	2,12± 0,02	2,12± 0,03	2,12± 0,02	2,12± 0,03
Механічні включення: - невидимі частки ( ? 10 мкм - не більше 6000 ? 25 мкм - не більше 600 в ампулі)	472,0 25,2	446,4 25,2	492,4 25,6	466,8 24,4	448,4 25,6	424,0 24,4	445,7 24,4	470,9 25,2	448,4 25,6	446,4 25,6

Показник (норма згідно проекту МКЯ)	Первинний аналіз	3	6	9	12	15	18	21	24	27
- видимі частки (повинні бути відсутніми)	Відсутні
Стерильність (повинен бути стерильним)	Відповідає
Кількісне визначення: - відновлювальні цукри (не менше 17,5 мг/мл) - діастазне число (не менше 0,175 од. Готе) - вміст ГМФ (не більше 0,000625 мг/мл) - вміст проліну (не менше 0,0075 мг/мл)	18,4±0,3 0,198±0,005 0,00054± 0,00002 0,00836± 0,00012	18,4± 0,2 0,196±0,007 0,00054± 0,00002 0,00831± 0,00011	18,5± 0,2 0,194±0,006 0,00054± 0,00003 0,00830± 0,00010	18,3± 0,3 0,199±0,006 0,00055± 0,00003 0,00831± 0,00012	18,6± 0,2 0,199±0,007 0,00057± 0,00002 0,00832± 0,00014	18,4± 0,2 0,198±0,005 0,00057± 0,00003 0,00831± 0,00013	18,4± 0,2 0,199±0,005 0,00058± 0,00002 0,00827± 0,00016	18,3± 0,3 0,197±0,007 0,00060± 0,00002 0,00823± 0,00011	18,5± 0,3 0,196±0,007 0,00058± 0,00003 0,00834± 0,00015	18,3± 0,3 0,196±0,005 0,00058± 0,00003 0,00827± 0,00011

У розділі 5 «Фармакологічні дослідження розчину для ін'єкцій «Апімел» представлені результати проведених на базі Центральної науково-дослідної лабораторії НФаУ фармакологічних досліджень препарату «Апімел».

За результатами проведених досліджень встановлено, що розчин для ін'єкцій «Апімел» при внутрішньом'язовому введені щурам у дозах 50 мг/кг та 25...