Анализ необычной морфологии хромосомы 21 хориона при неразвивающейся беременности

Размещено на http://www.allbest.ru/

2

Анализ необычной морфологии хромосомы 21 хориона при неразвивающейся беременности

Исследование причин «замершей» беременности является достаточно актуальной проблемой врачей-репродуктологов и пациентов. Согласно данным российской статистики, неразвивающаяся беременность составляет 45-88% от числа самопроизвольных абортов, 11% первых беременностей заканчиваются хирургическим абортом, а частота невынашивания беременности достигает 20%. Одной из самых частых причин, вызывающих преждевременное прерывание беременности, является наличие хромомсомных аномалий у плода.

Трисомия хромосомы 21 (Синдром Дауна)- одно из самых распространенных заболеваний (частота- 1-2 случая на 800-1000 живорожденных детей).

Описаны три формы данного синдрома: регулярная трисомия (93% всех случаев), транслокационная (5%) и мозаичная (2%). Очень редко в результате хромосомной перестройки могут быть удвоены отдельные участки хромосомы 21. Критическим сегментом, ответственным за формирование основных признаков синдрома, является область 21q22. Чаще всего наблюдается транслокация, когда в наборе имеются две нормальные хромосомы 21, одна нормальная хромосома группы D и крупная аномальная непарная хромосома, представляющая собой соединение q-плечей одной из трех 21-й и второй, например 15-й хромосомы. Другой формой транслокации при болезни Дауна может быть соединение между собой двух хромосом 21 из трех имеющихся в хромосомном наборе (21/21). В данной работе описан удивительный феномен необычной морфологии одного из гомологов хромосомы 21, выявленной в хорионе при «замершей» беременности.

Целью данного исследования является анализ кариотипа хориона при «замершей» беременности стандартными цитогенетическими и современными молекулярно-цитогенетическими методами.

Методы GTG-Дифференциальное окрашивание

Проанализирован хорион абортного материала от женщины в возрасте 29 лет с подтвержденным диагнозом неразвивающаяся беременность. Операционный материал, представленный элементами хориона, был доставлен в течение часа после операции в цитогенетическую лабораторию. Препараты метафазных хромосом получили из клеток цитотрофобласта ворсинчатого хориона, «прямым» методом по общепринятой методике. По окончании гипотонической обработки клетки фиксировали смесью этилового спирта и уксусной кислоты в соотношении 3:1. Размягчение клеток проводили в 70%-ном растворе уксусной кислоты. GTG- дифференциальное окрашивание хромосом проводили стандартным методом. После предварительной обработки, с применением трипсина, хромосомы окрашивали раствором красителя Гимза, приготовленном на фосфатном буфере. Цитологические препараты анализировали на световом микроскопе .

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

FISH хросомоспецифичной ДНК-пробы с метафазными хромосомами проводили на препаратах, полученных из клеток цитотрофобласта ворсинчатого хориона при неразвивающейся беременности, окрашенных ранее методом GTG-дифференциального окрашивания. Для этого препараты отмывали от иммерсионного масла в трех сменах ксилола по 5 минут. Высушивали при комнатной температуре в течение 10 минут и отмывали от красителя Гимзы дважды , погружая препараты в стаканы с фиксатором. Далее проводили флоуресцентую гибридизацию in situ согласно стандартному протоколу , без обработки пепсином.

После гибридизации in situ хромосомы окрашивали красителем DAPI. Хромосомы и хромосомные районы идентифицировали, анализируя GTGокрашивание и инвертированный DAPI-бэндинг. Для описания хромосом и хромосомных районов использовали стандартную номенклатуру хромосом человека.

Результаты

Цитогенетические исследование метафазных хромосом ворсин хориона методом GTG- дифференциальной окраски выявило во всех исследованных клетках наличие хромосомы 21 необычной морфологии. Этот гомолог по размеру был значительно крупнее своего гомогола как по длине, так и по ширине.

Супрессионная флуоресцентная гибридизация in situ микродиссекционной ДНК-пробы специфичной хромосоме 21 полностью окрасила q-плечи обоих гомологов 21-й хромосомы хориона. Отсутствие сигнала на спутниках хромосом обусловлено супрессией гибридизации повторенных последовательности 100-кратным избытком Cotl ДНК,использованных при проведении FISH.

FISH с использованием ДНК пробы, специфичной теломерным районам , дала сигнал в теломерных районах обоих гомологов 21-хромосомы.

Заключение

беременность преждевременный прерывание

При пренатальной диагностике выявление аномальных кариотипов, обусловленных структурными и численными вариациями хромосомы 21, имеют огромное значение . Трисомия по 21-й хромосоме или даже по ее небольшому району приводит к множественноым аномалиям развития, описанным как синдром Дауна. Выявленная в данном проведенном исследовании необычная морфология одного из гомоголов 21-й хромосомы в клетках хориона, не связана с дупликацией его длинного плеча, так как паттерн бэндов при GTG-дифференциальной окраске соотвествует паттерну бэндов нормальной хромосомы.

Результаты FISH с использованием полнохромосомной ДНК-пробы не выявили каких-либо структурных перестроек: длинные плечи обоих гомологов хромосомы 21 были полностью окрашены, и никаких сигналов не было выявлено на других хромосомах. При приготовлении препаратов метафазных происходит их распластывание на предметном стекле. Условия распластывания хромосом различаются даже в пределах одной клетки, что может приводить к возникновению различий по морфологии отдельных гомологичных хромосом и значительным вариациям их размера. Так, на переферии метафазной пластинки в результате большего растяжения хромосомы часто имеют больший продольный и поперечный размер. В данной работе гомологи 21-й хромосомы значительно отличались во всех метафазных пластинках, полученных из ворсинок хориона.

В качестве одной из гипотез, объясняющих возникновение «увеличенного» гомолога 21-й хромосомы можно предположить амплификацию и расселение по нему некого мобильного элемента, что может не только нарушить нормальное протекание процесса конденсации хромосом, но и привести к реальному увеличению размера этой конкретной хромосомы.

Исходя из полученного в данном исследовании опыта можно сделать вывод, что описанный «увеличенный» гомолог 21-й хромосомы не является техническим свидетельством.

Список литературы

1.Милованов АП, Серопа АФ. Причины и дифференциованное лечение раннего невынашивания беременности (руководство для врачей).- М.:Изд-во Студия МДВ , 2011.- 216 с.

2.Баранов ВС, Кузнецова ТВ, Иващенко ТЭ и др. Современные алгоритмы пренатальной диагностики наследственных болезней :методические рекомендации -Спб.:Изд-во Н-Л. 2009.- 80 с.

3.Ворсанова СГ, Юров ЮБ, Чернышов ВН. Медицинская цитогенетика.- М.:Изд- во Медпрактика-М, 2006.- 300 с.

4.Рубцов НБ. Методы работы с хромосомами млекопитающих.- Новосибирск: ИЗД-во Новосиб. Гос. Ун-т. 2006.- 107 с.

5.Наследственные болезни : национальное руководство. Под ред.Бочков НП, Гинтер ЕК, Пузыревой ВП. - М: Изд-во ГЭОТАР - Медиа, 2012.-936с.

6.Козлов ВА. Метилирование ДНК клетки и патология организма. Медцинская иммунология. 2008; 10(4-5).

Размещено на Allbest.ru