Перспективы практического использования ПЦР-диагностики

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

1

Саратовский государственный аграрный университет имени Н. И. Вавилова

Перспективы практического использования ПЦР-диагностики

Китаева Анна Геннадьевна

Введение

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе).

Полимеразная цепная реакция позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации любого организма. Метод полимеразной цепной реакции имитирует в пробирке естественное самовоспроизведение ДНК, повторяющееся с огромной скоростью, сколько это необходимо исследователю (Калмыкова М.С. и др., 2009).

Открытию полимеразной цепной реакции предшествовало развитие молекулярно-биологических технологий.

Массовое применение метода ПЦР - диагностики началось в 1985 году.

В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест - систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки различных применений метода.

Таким образом, открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень (Зорина В.В., 2012).

Перспективы практического использования ПЦР-диагностики.

В настоящее время метод ПЦР широко применяется в следующих отраслях: диагностика инфекционных заболеваний, в генетических исследованиях, для определения ГМО в продуктах питания, в ветеринарии, растениеводстве и судебно - медицинской экспертизе.

Диагностика инфекционных заболеваний

На данный момент отмечается значительный рост заболеваемости туберкулезом во всем мире: каждый год регистрируют около 8 млн. новых случаев этого тяжелого заболевания, около 3 млн. человек каждый год умирает от туберкулеза. ПЦР в настоящее время является одним из наиболее важных диагностических инструментов исследования нуклеиновых кислот. ПЦР, по сравнению с рутинными методами, обладает более высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет проводить прямое определение микроорганизмов непосредственно в клиническом материале без получения чистой культуры возбудителя. Такой подход является наиболее информативным при диагностике внутриклеточных паразитов и медленнорастущих микроорганизмов, требующих сложных условий культивирования, например, Mycobacterium tuberculosis. Рутинная диагностика и типирование микобактерий туберкулеза микробиологическими методами занимают от 3 недель до 3 месяцев, что негативно сказывается на эффективности терапии. Кроме того, изменился характер течения болезни: с каждым годом наблюдается рост случаев первичного туберкулеза, вызванного штаммами, устойчивыми к одному или нескольким антимикобактериальным препаратам. Лечение таких больных невозможно по обычным схемам антибиотикотерапии, инфекционный процесс часто протекает тяжело и скоротечно. В связи с этим существует острая необходимость выявления резистентных штаммов. Исследования лекарственной устойчивости к основным антимикобактериальным препаратам - изониазиду и рифампицину - выявили, что резистентность к изониазиду обусловлена мутацией в гене katG фермента каталазыпероксидазы, способствующей переходу действующего вещества в активную форму. Развитие лекарственной устойчивости микобаткерий к рифампицину в 97% случаев связано с мутацией гена гроВ бета-cубъединицы РНК-полимеразы. Известно, что рифампицин связывается ДНК-зависимой РНК-полимеразой, блокируя процесс транскрипции и тормозя жизнедеятельность микобактерий. При назначении больным с первичной устойчивостью к изониазиду и рифампицину стандартного режима химиотерапии к концу курса лечения у них может возникнуть резистентность и к пиразинамиду, и к этамбутолу. У 60% штаммов МБТ, резистентных к этамбутолу, наблюдается изменение в аминокислотном составе в положении 306 гена embB, который кодирует фермент арабинозилтрансферазу. Известно о молекулярных основах лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам второй линии - этионамиду и фторхинолонам. Этионамид и изониазид обладают кросс-резистентностью - состоянием, при котором наблюдается генетически обусловленная лекарственная устойчивость к нескольким препаратам одновременно. Резистентность к этионамиду может встречаться у больных туберкулезом, никогда не получавших этионамид, если МБТ, выделенные у этих больных, устойчивы к изониазиду. Фторхинолоны угнетают синтез ДНК в результате связывания с бактериальной топоизомеразой II. У штаммовМБТ, устойчивых к фторхинолонам, были выявлены мутации в gyrA-гене, кодирующего второй тип ДНК топоизомеразы - ДНК-гиразу. Представленные данные явились основой для разработки тест-систем для выявления антибио- тикорезистентности МБТ методом ПЦР. Данный подход внедряется в рутинную практику лабораторий, что позволяет существенно сократить сроки проведения анализа и своевременно определить тактику терапии.

Подобный подход оправдывает себя и при определении антибиотикорезистентности целого ряда микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций (S.aureus и коагулазонегативные стафилококки, Enterococcus spp., Семейство Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp.).

Инфекции, передающиеся половым путем включают T. pallidum, N.gоnorrhoeae, C.trachomatis, M.genitallium, M.hominis, U. urealyticum, U.parvum, HSV2, HPV, T.vaginalis, Candida и.тд. Большинство вышеперечисленных инфекций протекает со схожей симптоматикой, либо (в случае M. genitallium) вообще не имеет патогномичных симптомов, возможно затяжное, хроническое течение, что приводит к развитию осложнений (воспалительные заболевания органов малого таза, нарушение репродуктивной функции, осложнения в процессе беременности и др.). Метод ПЦР позволяет определить этиологию инфекционного процесса, определить количество возбудителя, что актуально для условно-патогенных микроорганизмов, которые вызывают патологию только при определенных условиях (например, при повышении концентрации на фоне снижения количества нормофлоры), осуществить контроль за течением инфекционного процесса и оценить эффективность лечения. Благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании. Особенно это актуально при бессимптомном течении инфекционного процесса, вызванного безусловно-патогенными микроорганизмами (гонорея, трихомониаз, хламидийная инфекция) (Новожилов А.С., 2013).

Особо опасные инфекции - согласно Международным медико-санитарным правилам (ММСП) ООИ - это «инфекционные заболевания, которые вошли в перечень событий, что могут являть собой чрезвычайную ситуацию в системе охраны здоровья в международном масштабе». Такие инфекции разделены на две группы. Первая - «болезни, которые являются необычными и могут оказать серьёзное влияние на здоровье населения»: оспа, полиомиелит, вызванный диким полиовирусом, человеческий грипп. Вторая группа - это «болезни, любое событие с которыми всегда оценивается как опасное, поскольку эти инфекции обнаружили способность оказывать серьёзное влияние на здоровье населения и быстро распространяться в международных масштабах»: холера, легочная форма чумы, желтая лихорадка, геморрагические лихорадки лихорадка Западного Нила. На данный момент складывается достаточно неблагоприятная эпидемическая ситуация по инфекциям, которые ранее имели эндемический характер. В связи с этим для своевременного принятия противоэпидемических мер, наиболее актуальным является использование экспресс-методов, которые должны удовлетворять следующим характеристикам: получение результатов анализа в максимально короткие сроки; возможность проведения и завершения анализа без выделения искомого микроорганизма в чистой культуре при использовании только нативного материала; бесспорно высокие специфичность и высокая чувствительность, как предпосылки надлежащей достоверности анализа; высокая производительность, простота, доступность и воспроизводимость анализов. Метод ПЦР полностью удовлетворяет перечисленным требованиям, в связи с чем, согласно Приказам Роспотребнадзора, он был признан обязательным методом ускоренной диагностики для индикации и лабораторной диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы в клиническом материале и пробах из объектов окружающей среды (Павлов К.В. и др., 2011).

Применительно к диагностике гемотрансмиссивных инфекций, метод ПЦР приобрел свою значимость в первую очередь в службах крови. На данный момент, метод ПЦР решает следующие задачи службы крови:

- обеспечение инфекционной безопасности в период «серонегативного окна»;

- обеспечение информацией об отсутствии инфекционных агентов в крови или ее компонентах при неопределенных результатах обычных иммуноферментных анализов;

- обеспечение выявления истинных вирусоносителей среди серопозитивных лиц;

- генотипирование - определение на уровне генома антигенов лейкоцитов и тромбоцитов (HLA, HPA).

Рассматривается целесообразность перехода к генетическому определению группы крови и резус - принадлежности. Использования ПЦР с точки зрения определения вирусной нагрузки рассматривалась ранее (Зорина В.В., 2012). инфекция полимеразный цепной реакция

Оппортунистические инфекции (ОПИ) - заболевания, вызываемые патогенами, которые обычно не приводят к болезни у здоровых людей (с нормальной иммунной системой). Наиболее распространенными возбудителями являются: вирусы (ЦМВ, вирус Эпштейна - Барр), бактерии (S. aureus, S. pyogenes, P. aeruginosa, A. baumanni, C.difficile), грибы (C. albicans, Aspergillus sp., Pneumocystis jirovecii, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum), простейшие (T. gondii, Cryptosporidium).

Клинические особенности оппортунистических инфекций:

- протекают с опасной для жизни пациента остротой;

- имеют тенденцию к диссеминации возбудителя с обнаружением его в эктопических очагах;

- слабо поддаются специфической терапии, имеют тенденцию к множественным рецидивам;

- к этим инфекциям развивается слабый специфический иммунный ответ.

Несмотря на то, что в последние годы настороженность к ОПИ повысилась у врачей всех специальностей, их своевременная диагностика составляет не более 30% от реальных показателей заболеваемости. В этих условиях для выбора тактики ведения пациента принципиально важными стали: ранняя диагностика процесса; определение наличия микстинфекции; смены возбудителя в процессе течения заболевания; выделение ведущего этиологического фактора в формировании патологии на конкретном этапе; назначение адекватной терапии и оценка её эффективность. На данный момент, метод ПЦР позволяет решить поставленные задачи, главным образом, благодаря высокой чувствительности и специфичности, возможности дифференцировать возбудителей микстинфекций, а также высокой скорости проведения анализа: в течение 3-5 часов с момента получения лабораторией образца до выдачи результатов врачу-клиницисту(Павлов К.В. и др., 2011).

TORCH - инфекции - комплекс включает в себя следующие инфекции: токсоплазмоз (Toxoplasmosis); другие инфекции, из которых считаются абсолютно доказанными: хламидиоз, сифилис, гепатиты А и В, гонококковая инфекция, листериоз (Others); краснуху (Rubella); цитомегаловирусную инфекцию (Citomegalia); простой герпес (Herpes Symplex). Важной особен- ностью инфекций этой группы является то, что симптомов может не быть или они могут быть мало выражены. В это время инфекция будет пагубно влиять на состояние плода и на течение беременности. Для того чтобы оценить насколько благоприятно будет протекать беременность, важно установить не столько наличие или отсутствие инфекции, сколько стадию, на которой она находится. Основным методом является серологическая диагностика (ИФА), где индикаторами первичной инфекции являются специфические антитела IgM, тогда как IgG могут свидетельствовать только об уже произошедшем контакте человека с инфекцией. Тем не менее, в случае первичного заражения во время беременности оценка риска развития внутриутробной инфекции в перинатальный период возможна только методом ПЦР. Серодиагностика малоэффективна для определения инфекций, поскольку основана на выявлении антител, а в этот период организм ребенка может или вообще не вырабатывать антитела, или «принимать» материнские антитела класса IgG, проникающие к ребенку через плаценту (Зорина В.В., 2012).

Полимеразная цепная реакция в генетике

Одним из наиболее перспективных направлений ПЦР-диагностики являются генетические исследования, а именно:

- мутации, обусловливающие наследственные заболевания;

- полиморфизмы, ассоциированные с предрасположенностью к мультифакторным заболеваниям;

- онкогенетика;

- фармакогенетика;

- HLA-типирование;

- иммуногенетика;

- нарушения метаболизма и т.д.

Согласно классификации, основанной на характере изменения структуры отдельных генов, хромосом и генома в целом различают следующие виды мутаций: геномные, хромосомные, генные. С точки зрения возможностей ПЦР, наибольший интерес представляют генные мутации, связанные с заменой одного или нескольких нуклеотидов. В том случае, когда под действием мутации изменяется лишь один нуклеотид, говорят о точечных мутациях (Сазанов А.А., 2012).

Особую актуальность ПЦР - исследования приобретают в свете возможности использования молекулярно-генетических методов для профилактики и борьбы с неинфекционными заболеваниями (НИЗ), в первую очередь, раком, сердечно-сосудистыми, респираторными заболеваниями, сахарным диабетом. На их долю приходится около 80% всех случаев смерти в группе НИЗ и более чем 60% летальных случаев (36 млн.человек в год) во всем мире. ВОЗ прогнозирует, что при бездействии уже в 2030 году от НИЗ умрут 52 млн. человек, при этом экономические потери составят в среднем 47 триллионов долларов. На данный момент активно разрабатываются и вводятся в практику наборы реагентов, направленные на выявление точечных мутаций и полиморфизмов в генах супрессоров клеточной пролиферации и системы апоптоза, инактивация которых приводит к неконтролируемому делению клеток и возникновению злокачественной опухоли. Подобный анализ позволяет определить группу риска, особенно в случае отягощенного семейного анамнеза, порядок наблюдения носителей указанных полиморфизмов и скорректировать тактику ведения пациента в случае выявленного онкологического процесса. Применительно к мультифакторным заболеваниям генетическое тестирование уже сегодня позволяет отнести человека к группе риска той или иной хронической патологии (тромбофилии, паркинсонизму, сердечно-сосудистым заболеваниям, остеопорозу, бронхиальной астме, эндометриозу и т.д.) (Щелкунов С.Н., 2004).

Определение ГМО в пищевых продуктах

Генетически модифицированный (или трансгенный) организм (ГМО) - это организм, в генетический аппарат (геном) которого искусственно вставлен ген/гены другого организма. За десятилетний период мирового промышленного производства ГМО растительного происхождения в России прошли полный цикл испытаний, зарегистрированы и разрешены для использования в пищевой промышленности и реализации населению 14 видов ГМО растительного происхождения и 5 видов генетически модифицированных микроорганизмов. Среди них 3 сорта сои, 7 сортов кукурузы, 4 сорта картофеля, 1 сорт сахарной свеклы и 1 сорт риса. Наиболее часто генетически модифицированные источники встречаются в мясных продуктах - 6,6%, в соевых продуктах - 3,9% и в птицеводческих - 3,8%. В связи с таким широким распространением генетически модифицированной сои получить абсолютно чистый продукт ее переработки невозможно. Именно поэтому в ряде стран введено так называемое пороговое значение содержания ГМО в продукте (Горлов И.Ф., 2009).

Нормативная база по контролю за ГМО на территории России включает Федеральный закон «Об охране окружающей среды» от 10.01.2002 N 7-ФЗ, в котором (Статья 50), регламентирована охрана окружающей среды от негативного биологического воздействия, а именно: запрещаются производство, разведение и использование растений, животных и других организмов, не свойственных естественным экологическим системам, а также созданных искусственным путем, без разработки эффективных мер по предотвращению их неконтролируемого размножения, положительного заключения государственной экологической экспертизы, разрешения федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих государственное управление в области охраны окружающей среды, иных федеральных органов исполнительной власти в соответствии с их компетенцией и законодательством РФ.

На основании данного закона 25 декабря 2008 г. утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии ГОСТ Р 53244-2008 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот».

Действующий стандарт описывает количественные методы определения ГМО в пищевых продуктаха также в кормах и растительных образцах, отобранных из окружающей среды, с использованием полимеразной цепной реакции, и общие требования к специфической амплификации целевых последовательностей дезоксирибуноклеиновой кислоты (ДНК) для количественного определения содержания ДНК из ГМО, а также для подтверждения идентичности амплифицированной последовательности ДНК.

Система контроля ГМО в России находится в стадии становления. И именно аккредитованные и имеющие необходимое оборудование, а также высококвалифицированных специалистов, лаборатории могут помочь в решении практических вопросов определения ГМО, возникающих как у производителей, так и у обычных потребителей (Зорина В.В., 2012).

Полимеразная цепная реакция в ветеринарии

ПЦР - диагностика дает возможность постановки точного диагноза при инфекционных заболеваниях, определения их этиологии, корректировки проводимого лечения. В наше время ветеринары разработали тест-системы для диагностики методом ПЦР таких заболеваний, как: туберкулёз, сибирская язва, лейкоз, чума крупного рогатого скота, бешенство, ящур, бруцеллез, кампилобактериоз, листериоз, хламидиоз животных, классическая чума свиней, респираторно-репродуктивный синдром свиней, парвовирусная инфекция свиней, энцефаломиокардит свиней, сальмонеллёз, стафилококкоз, микоплазмоз, болезнь Марека, реовирусная инфекция, болезнь Гамборо, инфекционный бронхит птиц, ньюкаслская болезнь, чума плотоядных, вирусный энтерит норок, вирусный гепатит утят и др. Основным массовым и доступным в ветеринарной практике методом прижизненной диагностики туберкулёза является внутрикожная туберкулиновая проба с применением ППД - туберкулина для млекопитающих. Однако данный тест имеет существенный недостаток: длительный срок выявления заболевания (колонии микобактерий туберкулёза бычьего вида появляются только через 20-60 дней, а птичьего - через 15-30 дней посева). При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных результатов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяйствах. Кровь всех животных анализируют при введении туберкулина. Также полимеразную цепную реакцию целесообразно применять при изучении патматериала от убитых животных для диагностики и идентификации культур М. bovis и М. tuberculosis с другими видами микобактерий и при диагностике хламидийной инфекции (Зотова М.А. и др., 2013).

Эффективно метод ПЦР используется и при диагностике вирусных заболеваний. Например, инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИРТ КРС) - контагиозное заболевание, вызываемое герпесвирусом КРС 1-го типа, проявляется в виде поражений респираторного тракта, вульвовагинитов, маститов и абортов у коров, баланопоститов у быков, конъюнктивитов, менингоэнцефалитов, а также, в отдельных случаях, артритов, диарей и генерализованной инфекции у телят.

Инфекции собак и кошек составляют несколько групп: системные, кровопаразитарные, офтальмологические, респираторные, дерматофитозные, половые, желудочно-кишечные и другие. В клинической практике ПЦР получила наибольшее распространение при диагностике системных заболе- ваний и заболеваний, вызванных инфекциями с выраженным тропизмом к клеткам цилиндрического эпителия (респираторные, глазные и половые инфекции). Достаточно давно ПЦР-диагностика введена в практику ветеринарных врачей с точки зрения выявления зооантропонозных инфекций, группа инфекционных и инвазионных болезней, общих живот- ным и человеку. К зооантропонозам относится такие заболевания, как: сибирская язва, сап, бруцеллёз, туберкулёз, бешенство, ящур, лептоспироз, трипаносомоз, эхинококкоз, дифиллоботриоз и др. (Зорина В.В., 2012).

Полимеразная цепная реакция в растениеводстве. Вирусные инфекции культурных растений вызывают ощутимые потери урожая, заметно ухудшают качество сельскохозяйственной продукции и все чаще рассматриваются как серьезная угроза продовольственной безопасности. Важнейшую роль в предупреждении распространения вирусных инфекций играет карантинный контроль продукции растениеводства, особенно импортируемого семенного и посадочного материала. В современной фитопатологии ПЦР применяют не только для диагностики патогенов растений, но также в таксономии и филогении вироидов, вирусов, фитоплазм, бактерий, грибов, оомицетов и нематод. Эта техника широко используется для мониторинга болезней растений, а также для детекции возбудителей болезней в органах вегетирующих растений, семенах, фруктах и другой хранящейся продукции растениеводства. Она была применена для обнаружения вирусов многих экономически важных сельскохозяйственных культур и других культивируемых растений. На данный момент разработаны диагностические наборы для ПЦР анализа ряда наиболее распространенных патогенных микроорганизмов защищенного грунта, особенно важных при выращивании овощных культур, в первую очередь огурцов и томатов. Применение таких диагностических наборов позволяет получить в течение нескольких часов быстрые и достоверные (со специфичностью анализа более 95%) результаты, позволяющие сделать своевременную выбраковку семенного материала, а также при необходимости подобрать оптимальные состав и дозы реагентов для химической обработки растений, уменьшая тем самым потери урожая (agro-portal.su).

ПЦР в судебно-медицинской экспертизе

Первый опыт использования полимеразной цепной реакции для исследования судебно-медицинских объектов описан в 1987-1988 годах в работах по типированию локуса HLA-DQA1.

Разработки ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России в области использования ПЦР в судебной медицине позволили выделить основные направления судебномедицинской методики анализа ДНК методом ПЦР:

- исследования малого количества ДНК и ее деградации, актуальные для экспертной практики;

- исследование биологических объектов разного происхождения (установление половой принадлежность объекта);

- работа с образцами спермы со сниженным содержанием сперматозоидов (олигозооспермия);

- исследование образцов, содержащих смесь женской и мужской ДНК;

-исследование следов разной давности образования;

- исследование следов, расположенных на различных предметахносителях;

- исследование образцов с микробным загрязнением (Лесовая Н.Н., 2010).

Список литературы

1. Горлов И.Ф. Идентификация и мониторинговые исследования мясных продуктов на содержание ГМО и соответствие требованиям нормативно-технической документации./ Горлов И.Ф., Шалимова Д.А., Зубарева К.Ю., Козлова Т.А., Дементьев С.В.// Вестник ОрелГАУ № 4, 2009.

2. Зотова М.А. Определение Chlamydia trachomatis в клиническом материале методом ПЦР в режиме реального времени./ М.А. Зотова, К.В. Багаев, А.И. Лебедева, С.С. Тихонова// Вестник Челябинского государственного университета № 7, 2013.

3. Лесовая Н.Н. Основные направления судебно-медицинской методики анализа ДНК./ Н.Н. Лесовая// Человек: преступление и наказание № 3, 2010; 4. Новожилов А.С. Статистика здоровья населения и здравоохранения /А.С. Новожилов/ М.: Лань 2013. 480 с.

4. Основы полимеразной цепной реакции: методическое пособие (Зорина В.В. Москва, «ДНК - диагностика», 2012. 80 с.

5. Основы полимеразной цепной реакции с разными формами детекции: учебное пособие (Калмыкова М.С., Калмыков М.В., Белоусова Р.В. Санкт - Петербург, «Лань», 2009. 80 с.

6. Павлов К.В. Комплекс целевых программ как форма регулирования развития системы здравоохранения./ К.В. Павлов, Т.М. Пинкус, М.А. Степчук, С.В. Абрамова, Д.Л. Боженко// Региональная экономика: Теория и практика № 37, 2011.

7. Сазанов А.А. Основы генетики./А.А.Сазанов/ СПб.: Колос, 2012. 240 с.

8. Федеральный закон об охране окружающей среды от 10.01.2012 г. (Статья 50).

9. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия./С.Н. Щелкунов/ Новосибирск, 2004, 490 с.

10. agro - portal.su.

Размещено на Allbest.ru