Протекторное и нейротоксическое действие оксида азота в моделях зрительных патологий

Размещено на http://www.allbest.ru/

Протекторное и нейротоксическое действие оксида азота в моделях зрительных патологий

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Научный руководитель:доктор биологических наук

Каламкаров Григорий Рафаэлевич

Официальные оппоненты:доктор биологических наук, профессор Петренко Юрий Михайлович

доктор биологических наук

Дудник Людмила Борисовна

Ведущая организация:ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи

Защита состоится «01» июля 2009г. в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.039.01 в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 117977, Москва, ул. Косыгина, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН

Автореферат разослан«__»________2009г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 002.039.01

кандидат химических наук М.А. Смотряева

Общая характеристика работы

Актуальность работы.

Оксид азота играет ключевую роль в регуляции самых разных биологических функций. Известно также, что оксид азота играет важную роль в развитии патологий сетчатки и зрительного нерва. В сетчатке глаза относительно высокая концентрация оксида азота обнаруживается в двух слоях - во внутренних сегментах фоторецепторного слоя и слое ганглиозных клеток. Оксид азота является регулятором синаптической передачи, одним из медиаторов которой является глутамат.

Сетчатка глаза находится в тесном контакте с ретинальными сосудами, которые проходят через все внутренние слои сетчатки и снабжают их кислородом и необходимыми метаболитами. Оксид азота, являясь сосудорасслабляющим фактором, регулирует состояние сосудов как в норме, так и при патологиях и, следовательно, оказывает значительное влияние на работу всех элементов сетчатки. Это особенно важно в условиях гипоксии, когда недостаток кислорода приводит к развитию ишемии сетчатки - причины многочисленных офтальмологических заболеваний.

С другой стороны, известно, что оксид азота может играть и нейротоксическую роль, приводя к апоптозу нервных клеток. Предполагаемой причиной такого действия является взаимодействие оксида азота с супероксид-анион радикалом с образованием пероксинитрита. Пероксинитрит может разлагаться с образованием гидроксильного радикала - сильного токсического агента, приводящего, среди прочего, к апоптотической гибели клеток.

В данной работе нами исследованы оба механизма действия оксида азота - как нейропротекторного фактора, защищающего сетчатку глаза от ишемии, так и нейротоксического фактора, вызывающего апоптотическую гибель клеток.

Для изучения защитных и нейротоксических свойств оксида азота нами была разработана модель ишемии сетчатки глаза на экспериментальных животных. Изучение ишемии сетчатки важно для понимания патогенеза таких связанных с сосудистой недостаточностью заболеваний, как окклюзия ретинальной артерии, глаукома, макулярная дегенерация и др. (Osborne N.N. et al., 2004). Мы создавали ишемию сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов. Такое воздействие, с одной стороны, позволяет резко снизить концентрацию кислорода непосредственно в сосудах и наблюдать за изменением их диаметра при действии нитритов в условиях недостатка кислорода in vivo, с другой стороны, как следствие, вызывать развитие ишемии сетчатки и по состоянию сетчатки оценить степень ее кровоснабжения. Кроме того, такая модель не затрагивает прямо нервные элементы сетчатки.

Оксид азота продуцируется в клетке ферментом NO-синтазой, основным субстратом которой является аргинин. До последнего времени аргинин считался, по существу, единственным источником оксида азота в организме. В последние годы внимание многочисленных исследователей привлек процесс восстановления нитритов до оксида азота и таким образом нитриты также могли бы оказаться источником оксида азота. Предполагается, что нитриты могут восстанавливаться до оксида азота гемсодержащими белками. Особенно активно этот процесс будет происходить в условиях пониженной концентрации кислорода, когда образующийся оксид азота, во-первых, не окисляется до диоксида, а, во-вторых, может связываться с гемом белка, занимая сайт связывания кислорода.

В данной работе мы показали, что такой процесс может происходить в ретинальных сосудах in vivo, причем, за времена порядка минуты. Продемонстрировано, что восстановленный из нитрита оксид азота действует как фактор расслабления сосудов и защищает сетчатку глаза от ишемии.

Целью настоящей работы являлось установить роль и химические механизмы действия оксида азота как нейропротекторного и нейротоксического факторов при развитии патологий в сетчатке глаза.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Создать адекватные модели зрительных патологий на экспериментальных животных (ретинальная ишемия и глутаматная интоксикация сетчатки глаза).

2. Выяснить, участвует ли оксид азота в развитии нейродегенерации при ишемии сетчатки глаза и является ли он проапоптотическим фактором.

3. Создать модель, позволяющую наблюдать изменения отдельного сосуда сетчатки при гипоксии на экспериментальных животных.

4. Выяснить возможность восстановления нитритов до оксида азота в ретинальных сосудах при ишемии сетчатки.

5. Выяснить, может ли введение нитритов вызывать расширение сосудов и таким образом защищать сетчатку от ишемии в условиях гипоксии в разработанной нами модели ретинальной ишемии.

6. Исследовать нейротоксическое действие избытка оксида азота на клетки сетчатки глаза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модель ишемии сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов.

2. Введение нитритов в условиях гипоксии приводит к быстрому расширению сосудов, защищает сетчатку от ишемии и вызванной ею апоптотической гибели клеток.

3. Ингибирование NO-синтазы предотвращает развитие апоптоза при ишемии и глутаматной интоксикации сетчатки глаза.

Диссертационная работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН в соответствии с планами научно-исследовательских работ Института в рамках программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине». зрительный патология оксид азот

Научно-практическая значимость. Результаты проведенных исследований имеют важное теоретическое и практическое значение для понимания роли оксида азота при развитии нейродегенеративного процесса, вызванного ишемией. Данные об участии оксида азота в развитии патологических заболеваний сетчатки глаза ставят вопрос о новых стратегиях лечения таких ишемических заболеваний сетчатки глаза, как глаукома, диабетическая ретинопатия и др. Нами разработана модель, позволяющая отличить патологическое действие гипоксии от патологического действия повышения внутриглазного давления, вызывающего дегенерацию нервных клеток. На этой модели показано, что оксид азота является необходимым элементом в развития апоптоза, вызванного исключительно ишемическим повреждением. Это принципиально важно для разработки лекарственных средств и понимания механизмов возникновения ряда зрительных патологий. Обнаруженный нами защитный эффект нитритов при развитии ишемии вследствие гипоксии имеет важное значение для разработки антиишемических средств лечения глазных патологий.

Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследований - от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.

Апробация диссертации и публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 8 печатных работах, из них 3 - статьи в отечественных журналах и 5 тезисов докладов. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах: «Фундаментальные науки - медицине», Москва. Международная молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика», Москва. «Актуальные вопросы нейроофтальмологии», Москва.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 90 стр., включая 21 рисунок, 1 таблицу и список литературы. Диссертация состоит из введения, описания объектов, материалов и методов исследования, глав «Обзор литературы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов исследования», выводов, списка аббревиатур и библиографического указателя (102 источника).

Содержание диссертации

1. Объекты, материалы и методы исследования

Основным предметом исследования являлись NO-синтаза, оксид азота, сетчатка глаза, ишемия сетчатки глаз экспериментальных животных.

Биофизические и гистохимические методы.

Для гистологического исследования сетчатки крыс глаза фиксировали в 10% нейтральном формалине 12 часов и использовали для приготовления парафиновых срезов согласно стандартному протоколу (Sennlaub F. et al., 2002). Срезы толщиной 5 мкм приклеивали на стёкла с адгезивным покрытием (Silane-Prep Slides, Sigma) и после депарафинирования окрашивали гематоксилином и эозином.

Для иммуногистохимического исследования депарафинированные срезы обрабатывали методом TUNEL (Terminal desoxynucleotidyl transferase - mediated desoxyuridine triphosphate (UTP) - nick end - labeling) для выявления апоптотичесих клеток (набор реактивов «Apoptag» («Chemicon», США)). Метод основан на выявлении свободных 3'-ОН концевых групп ДНК путем их химического мечения модифицированными нуклеотидами, которые выявляются иммунопероксидазным методом. В качестве субстрата для пероксидазы использовали диаминобензидин (DAB). После реакции для дополнительной прокраски ядер срезы обрабатывали 0,5% метиловым зеленым.

Электроретинограмму (ЭРГ) регистрировали с помощью установки EYE Handheld ERG Unit Mjolner (Ephios, Швеция). Выполняли регистрацию ганцфельд ЭРГ в ответ на одиночную стимуляцию и ритмическую (РЭРГ), стимуляцию с частотой 12 и 32 Гц стандартными вспышками.

Принцип метода заключается в регистрации потенциалов клеток сетчатки в ответ на освещение. Оценку электрической активности сетчатки проводили по амплитуде а- и b- волн ЭРГ. a-волна - негативная волна, отражающая функциональную активность фоторецепторов, b-волна - позитивная волна, отражающая электрическую активность биполяров и мюллеровских клеток с возможным вкладом горизонтальных и амакриновых клеток.

Работа с животными. В работе использовали кроликов породы Шиншилла и крыс линии Wistar, содержавшихся в виварии при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище.

Крыс наркотизировали хлоралгидратом (250 мг/кг).

Ишемию создавали путём лазерной коагуляции сосудов сетчатки глаз крыс, для этого использовали лазер Visuals Kombi II фотокоагуляционного типа (аргоновый лазер), позволяющий создавать обтурацию сосудов под офтальмоскопическим контролем. Параметры воздействия составляли: средняя мощность излучения 200-300 мВт, диаметр пятна 100-200 мкм, длительность импульса 0,1 - 0,2 сек. Проводилась коагуляция сосудов I порядка на всем их протяжении в зоне диаметром 1/2 размера диска зрительного нерва.

Для создания ишемии сетчатки глаза кроликов проводилась лазерная коагуляция сосудов первого и второго порядка с окружающей сетчаткой. Энергия воздействия 0,4-1 Вт.

Нитрит натрия вводили внутрибрюшинно в физиологическом растворе (20 мг/кг массы) крысам и кроликам за 15 минут до лазерного воздействия на сосуды сетчатки или через 15 мин сразу после него.

L-NAME (N-щ-nitro-L-arginine methyl ester) вводили внутрибрюшинно в натрий-фосфатном буфере (20 мг/кг) за 15 минут до лазерной коагуляции сетчатки глаза крыс.

NMDA (N-methyl-D-aspartate) (200 нмоль/глаз) и L-NAME (0,1 мг/глаз) в натрий-фосфатном буфере вводили в стекловидное тело глаза крысы (интравитреально) раздельно или в комбинации.

ДНК-Ж (динитрозильный комплекс железа) в натрий-фосфатном буфере вводили в стекловидное тело глаза крысы (10^-7-10^-4моль/глаз).

Контролем при интравитреальных инъекциях служили парные глаза, в которые вводили натрий-фосфатный буфер.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и Origin Pro 6.1 методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при P0,05. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения.

2. Исследование действия нитритов в сетчатке на модели ишемии сетчатки глаза кроликов

Лазерная коагуляция ретинальных сосудов приводит к ишемии сетчатки глаза (Zhang Y. et al., 2005).

При офтальмоскопическом исследовании глазного дна интактного кролика сосуды сетчатки в области диска зрительного нерва не извиты и соответствуют средней норме (рис. 1а).

Лазерная коагуляция ретинальных сосудов приводит к значительным изменениям в кровенаполнении сосудов. При офтальмоскопическом исследовании того же глазного дна сразу после лазерного воздействия видно, что сосуды запустели и резко уменьшились в диаметре (рис. 1б).

Для выяснения возможного действия нитритов на сетчатку глаза и ретинальные сосуды нитрит натрия вводили животным как до, так и после проведения лазерной коагуляции.

В том случае, когда нитрит натрия вводили кролику в течение 15 минут после лазерной коагуляции в количестве 20 мг/кг массы, наблюдается восстановление кровенаполнения сосудов непосредственно за зоной лазерного воздействия (рис. 1в). В самих поврежденных сосудах начинается восстановление кровообращения. Таким образом, введение нитрита натрия на фоне гипоксии приводит к быстрому расслаблению сосудов, что свидетельствует о том, что в условиях ишемии нитрит быстро восстанавливается до оксида азота.

Рис. 1. Действие нитрита натрия на сосуды глазного дна после лазерной коагуляции. а - фотография глазного дна кролика до лазерной коагуляции (стрелка указывает место последующего лазерного воздействия); б - то же сразу после лазерной коагуляции, в - то же, что «б» через 15 минут после введения нитрита натрия.

В контрольных экспериментах было показано, что введение нитрита животному без лазерного воздействия не приводит к значительному расширению сосудов, что свидетельствует о том, что восстановление нитрита до оксида азота может происходить, как и предполагалось, только в условиях недостатка кислорода.

В следующей серии экспериментов мы попытались выяснить, насколько предварительное введение нитритов может предотвращать сужение сосудов. В этих экспериментах животному сначала вводили нитрит натрия (20 мг/кг), а затем, через 15 минут, производили лазерную коагуляцию и наблюдали за изменением сосудов глазного дна (рис. 2).

Рис. 2. Введение нитрита натрия предотвращает развитие ишемии сетчатки при лазерной коагуляции сосудов. а - фотография глазного дна кролика после введения нитрита (до лазерной ишемии), (стрелка указывает место последующего лазерного воздействия); б - то же сразу после лазерного воздействия на фоне предварительного введения препарата.

В этом случае лазерное воздействие создавало не стойкий, а лишь кратковременный спазм сосуда с быстрым последующим восстановлением кровенаполнения и проводимости сосуда.

Таким образом, можно заключить, что нитрит натрия в условиях острой гипоксии приводит к почти мгновенному расширению сосудов, что и делает лазерную коагуляцию неэффективной. Можно предполагать, что в условиях гипоксии, когда нитриты могут связываться с гемом гемсодержащих белков, может происходить их восстановление до оксида азота в концентрациях, достаточных для быстрого и полного расслабления сосудов.

Регистрация электроретинограммы при ишемии сетчатки глаза кроликов

Известно, что ишемия сетчатки, вызванная недостаточным кровоснабжением через ретинальные сосуды, сопровождается характерными изменениями в картине фотоэлектрической активности сетчатки - электроретинограмме. Использование ЭРГ позволило оценить действие нитритов на ретинальные сосуды по изменению электрической реакции сетчатки глаза, то есть независимым методом. Измерение выполнялось сразу после лазерной коагуляции, после введения препарата на фоне лазерного воздействия и после лазерного воздействия на фоне предварительного введения нитрита натрия.

Лазерная коагуляция сосудов сетчатки приводила к резкому снижению амплитуд а- и b- волн ЭРГ (рис.3). Введение нитрита натрия в количестве 20 мг/кг массы через 15 минут после лазерной коагуляции приводило к более быстрому восстановлению а- и b- волн ЭРГ. Наибольший положительный эффект препарата был выявлен при его введении до создания лазерной ишемии сетчатки, где не наблюдалось угнетения биопотенциалов.

Глиальный индекс К_Г, рассчитываемый по отношению амплитуд b-волны ЭРГ и РЭРГ (12 Гц), равнялся 1,8 при норме 2,3-2,5 относительных единиц. Известно, что возрастание глиального индекса, отражающее активизацию метаболизма клеток Мюллера, является характерным признаком ретинальной ишемии. Однако, при острых нарушениях кровообращения в бассейне центральной артерии сетчатки, b-волна ЭРГ быстрее реагирует на гипоксию сетчатки, связанную с сосудистой катастрофой, чем низкочастотная РЭРГ. Поэтому опережающее снижение амплитуды b-волны ЭРГ сразу после лазерной коагуляции сосудов приводит к снижению К_Г, отражая значительные нарушения в сетчатке. Действительно, клинические наблюдения свидетельствуют о развитии обтурации, кровотечения и запустения сосудов после лазерного воздействия и последующей острой ишемии сетчатки.

Рис. 3. Динамика изменения амплитуд волн ЭРГ при действии нитритов.

а - амплитуда a- волны ЭРГ, б - амплитуда b-волны ЭРГ.

- амплитуды а- и b- волн ЭРГ до проведения операции. - то же через 15 мин после проведения лазерной коагуляции. - амплитуды а- и b- волн в том случае, когда через 15 мин после проведения лазерной коагуляции животному вводилcя нитрит натрия. - амплитуда волны в том случае, когда лазерная коагуляция проводилась через 15 мин после введения нитрита натрия.

Таким образом, полученные двумя независимыми методами (ЭРГ и офтальмоскопия) результаты показывают, что введение нитритов экспериментальным животным защищает сетчатку от острой ишемии. Такое действие, по-видимому, обусловлено тем, что при недостатке кислорода in vivo нитрит натрия может восстанавливаться до оксида азота в концентрациях, достаточных для полного расслабления сосудов.

Модель ишемии сетчатки глаза на крысах

Модель ишемии сетчатки глаза на кроликах в некоторых экспериментах очень удобна, т.к. сосуды глаза хорошо видны, и для регистрации ЭРГ эти животные не требуют адаптации к темноте. Однако кровоснабжение сетчатки кролика отличается от кровоснабжения сетчатки человека. У кроликов 2/3 сетчатки питается от хориоидальных сосудов, которые снабжают наружные слои сетчатки. И всего 1/3 сетчатки питается от ретинальных сосудов, которые распадаются на капилляры в пределах ганглиозного слоя и слоя нервных волокон.

В то время как у человека, наоборот, только 1/3 сетчатки питается от хориоидальных сосудов и 2/3 - от ретинальных. Важно отметить, что основной причиной патологий человека является ишемия, вызванная нарушениями именно в ретинальных сосудах. Наиболее близким объектом является крыса, у которой кровоснабжение сетчатки осуществляется, как и у человека. Кроме того, сетчатка крысы является хорошо изученным гистологическим объектом, что позволяет использовать эту модель для применения гистологических и иммуногистохимических методов выявления апоптоза на ранних стадиях. Поэтому перед нами стояла задача разработать новую модель ишемии сетчатки глаза на крысах. Ишемию создавали при помощи лазерного воздействия именно на ретинальные сосуды, так же, как и в предыдущих экспериментах.

Исследование глазного дна крыс после лазерной коагуляции.

При офтальмоскопии сразу после лазерной коагуляции отмечалось резкое сужение магистральных сосудов с полной или почти полной остановкой кровотока, сохраняющейся на протяжении нескольких минут, после чего кровоток частично восстанавливался, но просвет сосуда оставался значительно суженным.

На следующий день после коагуляции на глазном дне у некоторых крыс наблюдалась стушеванность границ диска зрительного нерва из-за отека окружающей сетчатки, суженные артерии, местами до полной их непроходимости, кровоток в них становился прерывистым. Некоторое расширение вен, по-видимому, было обусловлено одновременным нарушением венозной гемодинамики в результате распространения коагулирующего действия лазерного излучения на стенку расположенного рядом магистрального венозного сосуда.

Рис. 4. Фотография глазного дна экспериментальной крысы.

а - до лазерного воздействия. Глазное дно - в норме: сосуды - нормального калибра, центральные отделы глазного дна - без изменений; б - сразу после лазерного воздействия: лазерные коагуляты почти полностью перекрыли 2 магистральных сосуда (стрелка 1), что привело к развитию периваскулярного отека сетчатки; в - через сутки после лазерного воздействия: в зоне воздействия отек сетчатки сохраняется, наблюдается сужение сосудов (стрелка 2) и компенсаторное расширение расположенных рядом ретинальных сосудов (стрелка 3).

Через сутки после лазерной коагуляции в результате тромбоза магистральных ретинальных сосудов отмечались достаточно выраженные гемодинамические нарушения в ретинальной системе микроциркуляции, приводящие к ишемии внутренних слоев сетчатки.

Регистрация электроретинограмы при ишемии сетчатки глаза крыс

Стойкие гемодинамические нарушения в системе ретинального кровотока через сутки приводили к электрофизиологическим изменениям в сетчатке, характерным для ишемии. Для оценки степени развития ишемии сетчатки широко используется соотношение амплитуд b- и а- волн ЭРГ - индекс b/a (Нероев В.В. и др., 2004). а-волна ЭРГ характеризует функциональную активность фоторецепторных клеток, b-волна - внутренних слоев сетчатки, прежде всего, биполярных клеток. На следующий день после лазерной коагуляции сосудов амплитуда b-волны ЭРГ снижалась на 40-70% от исходных значений (рис. 5). Угнетение a-волны ЭРГ отмечалось через сутки не у всех животных. В тех случаях, когда амплитуда a-волны снижалась, угнетение b-волны было более значительным. Изменения b-волны развиваются, как правило, раньше угнетения а-волны и являются более выраженными из-за ухудшения трофики нейронов внутреннего ядерного слоя сетчатки при нарушениях ретинальной циркуляции. В нашем исследовании при развитии острой ишемии сетчатки коэффициент b/a резко снижался - до 1,0-2,0 отн. единиц при его нормальных значениях у крыс 3,3-4,8 ед.

Рис. 5. Запись электроретинограммы крысы. а - ЭРГ интактного животного, б - ЭРГ того же глаза через 1 сутки после лазерной коагуляции ретинальных сосудов.

Гистологические и иммуногистохимические исследования сетчатки глаз крыс после лазерного воздействия

Данные электроретинографических исследований подтверждаются гистологическими результатами. Нарушение кровотока в ретинальных сосудах вследствие их тромбирования уже через сутки приводили к ишемическим повреждениям во внутренних слоях сетчатки глаза (рис. 6). Типичными проявлениями ишемического повреждения были кровоизлияния, микрокистовидные изменения в слое нервных волокон, отек ганглиозных клеток, локальное уменьшение плотности нейронов в слое биполярных клеток. Следствием периваскулярного отека явилось истончение и микроразрывы внутренней пограничной мембраны, через которые происходила миграция мононуклеарных клеток крови из просвета сосуда в корковые отделы прилежащего стекловидного тела.

Рис. 6. Гистологическое исследование сетчатки крысы.

а - контроль; б - через сутки после лазерной коагуляции сосудов. НЯС - наружный ядерный слой, НСС - наружный синаптический слой, ВЯС - внутренний ядерный слой, ВСС - внутренний синаптический слой, ГС - ганглиозный слой. Стрелками на рисунке указаны: 1 - тромбоз ретинальной артериолы, 2 - уменьшение плотности нейронов в слое биполярных клеток, 3 - отек ганглиозных клеток. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.х400.

Таким образом, результаты наших электрофизиологических и гистологических исследований позволяют заключить, что лазерная коагуляция ретинальных сосудов приводит к развитию характерных ишемических изменений в сетчатке.

Для подтверждения того, что гибель клеток идёт по апоптотическому пути, был применён метод TUNEL. Данным методом были выявлены TUNEL-положительные ядра в ганглиозном слое уже через 6 часов после лазерного воздействия на сосуды (рис. 7). Также наблюдался апоптоз амакриновых и ганглиозных клеток через 18 и 24 часа после лазерной коагуляции.

Рис. 7. Выявление апоптотических клеток в сетчатке при ишемии: а - контроль; б - 6 часов после лазерной коагуляции; в - 9 часов после лазерной коагуляции; г - 24 часа после лазерной коагуляции. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра сетчатки.

При лазерной коагуляции ретинальных сосудов наибольшее количество апоптотических ядер в ганглиозном слое выявлено через 24 часа после тромбирования сосудов (60 % от общего числа клеток) (рис. 8). Максимальное количество TUNEL-положительных ядер во внутреннем ядерном слое (ВЯС) было обнаружено уже через 9 часов после лазерного воздействия.

Рис. 8. Зависимость образования апоптотических ядер в сетчатке глаза крысы при ишемии от времени.

Действие нитритов на клетки сетчатки глаза крысы при ишемии

Понимание молекулярного механизма гибели клеток при патологии особенно важно при попытках фармакологически предотвратить их гибель. Известно, что гибель нервных клеток при развитии ишемии может идти апоптотическим путем. Можно предполагать, что поскольку повышенная концентрация нитритов в сосудах защищала сетчатку от появления признаков ишемии, то этот механизм должен предотвращать и развитие апоптоза клеток сетчатки.

Нитрит натрия вводили крысам внутрибрюшинно за 15 минут до лазерного воздействия в количестве 20 мг/кг массы. При этом лазерное воздействие создавало нестойкий эффект: через сутки после лазерного воздействия на сосуды происходило их полное восстановление.

Иммуногистохимическим методом TUNEL было показано, что предварительное введение нитрита натрия животным приводило к значительному снижению количества TUNEL-положительных ядер в ганглиозном слое и защищало от апоптоза клетки внутреннего ядерного слоя (рис. 9).

Рис. 9. Защитный эффект нитритов при ишемии сетчатки: а - контроль; б - апоптоз клеток при ишемии; в - сетчатка после лазерной коагуляции на фоне предварительного введения нитрита натрия. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра сетчатки.

При предварительном введении нитрита натрия до лазерной коагуляции сосудов сетчатки количество апоптотических клеток в ганглиозном слое сетчатки снижалось на 66%, а во внутреннем ядерном слое - на 50% (рис. 10).

Рис. 10. Количество апоптотических ядер в сетчатке при ишемии и введении нитрита натрия.

Важно отметить, что изменения затрагивали, главным образом, внутренние отделы сетчатки (до внутреннего ядерного слоя), которые кровоснабжаются ретинальными сосудами. В наружных отделах, которые питаются из слоя хориокапилляров (слой наружных сегментов фоторецепторов, наружный ядерный слой), видимых морфологических изменений не обнаружено.

Роль оксида азота в механизме развития апоптоза при ишемии сетчатки

Известно, что гибель нервных клеток мозга и сетчатки при некоторых патологиях происходит апоптотическим путем при участии оксида азота. Естественно предполагать, что и при развитии ишемии оксид азота может быть индуктором развития апоптоза. Ранее было установлено, что введение животным конкурентного ингибитора NO-синтазы L-NAME приводит к существенному снижению концентрации оксида азота в клеточных слоях сетчатки и таким образом можно предполагать, что введение этого ингибитора будет влиять на развитие апоптоза.

Для подтверждения этого экспериментальным животным вводили ингибитор NO-синтазы L-NAME. Внутрибрюшинное введение этого препарата в количестве 20 мг/кг массы снижало концентрацию оксида азота в клетках сетчатки, и пероксинитрит не образовывался. При предварительном введении L-NAME за 15 минут до лазерного воздействия на ретинальные сосуды апоптотические клетки во внутренних слоях сетчатки не выявлялись (рис. 11).

Рис. 11. Защитный эффект L-NAME при ишемии сетчатки: а - контроль, б - апоптоз клеток сетчатки при ишемии, в - сетчатка после лазерной коагуляции на фоне предварительного введения L-NAME. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра сетчатки.

Лазерная коагуляция сосудов сетчатки глаза приводит к гибели 50% клеток ганглиозного слоя и 30% клеток внутреннего ядерного слоя (ВЯС) сетчатки. При предварительном введении препарата L-NAME крысам лазерное воздействие на ретинальные сосуды приводит к гибели всего 20% ганглиозных клеток и 15% клеток ВЯС от общего числа клеток (рис. 12).



Рис. 12. Количество апоптотических ядер в сетчатке крысы при ишемии и при введении ингибитора NO-синтазы L-NAME.

Можно сделать вывод, что ингибитор NO-синтазы L-NAME защищает клетки сетчатки от апоптоза при ишемии. Таким образом, оксид азота является необходимым элементом развития апоптоза в клеточных слоях сетчатки.

Повреждение сетчатки глаза крыс при глутаматной интоксикации

Глутаматная интоксикация может являться одной из ступеней длинной цепи ишемического повреждения (Louzada-Junior et al., 1992), но может происходить и независимо от ишемии при различных дегенеративных нарушениях. В работе нами исследовалось влияние повышения концентрации глутамата на возникновение нейродегенеративных нарушений в сетчатке и роль оксида азота в этих процессах.

NMDA (агонист глутамата) вводили непосредственно в глаз экспериментальным животным в количестве 200 нмоль/глаз. И уже через сутки методом TUNEL можно было выявить апоптотические ядра во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток сетчатки (рис. 13). Введение NMDA приводит к апоптотической гибели 60% ганглиозных клеток от общего числа клеток ганглиозного слоя и 50% клеток внутреннего ядерного слоя от общего числа клеток этого слоя.



Рис. 13. Структурные изменения клеток сетчатки после введения NMDA: а - контроль, б - через 24 часа после введение NMDA. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра.

ЭРГ также ясно свидетельствует о снижении функциональной активности во внутренних слоях сетчатки: наблюдается уменьшение амплитуды b-волны на 50% от нормы (рис. 14). Известно, что передача сенсорного сигнала от фоторецепторов к последующим слоям сетчатки осуществляется посредством глутамата. Введение агониста глутамата NMDA приводит к блокированию этой передачи и увеличению концентрации глутумата в синаптической щели. Это приводит к тому, что ответы фоторецепторных клеток сохраняются, а ответы более глубоких слоев сетчатки значительно уменьшаются. Именно такая картина наблюдается и при электроретинографических исследованиях. Как видно, а-волна ЭРГ, которая обусловлена электрической активностью фоторецепторов, практически не изменяется, а b-волна, основной вклад в которую вносят ответы биполярных клеток, существенно уменьшена



Рис. 14. Запись электроретинограммы крысы.

а - ЭРГ контрольного животного, б - ЭРГ того же глаза через 1 сутки после введения NMDA.

Введение NMDA приводило к развитию апоптоза в клеточных слоях сетчатки. Так, через 24 часа после введения апоптотические ядра обнаруживались во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток, то есть именно в тех слоях, где медиаторная роль глутамата установлена.

Для того чтобы выяснить, по какому пути идёт гибель клеток, в стекловидное тело глаза вместе с NMDA вводили ингибитор NO-синтазы L-NAME (0,1 мг/глаз). При этом количество апоптотических ядер в сетчатке резко снижалось (рис. 15).

Рис. 15. Защитный эффект L-NAME при глутаматной интоксикации сетчатки: а - контроль, б - 24 часа после введения NMDA, в - 24 часа после введения NMDA и L-NAME. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра сетчатки.

Введение L-NAME вместе с NMDA в стекловидное тело глаза приводило к снижению количества апоптотических ядер во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток на 50% и 70%, соответственно (рис. 16).

Рис. 16. Количество апоптотических ядер в сетчатке глаза крысы при введении NMDA и ингибитора NO-синтазы L-NAME.

Повреждение сетчатки крысы при повышении концентрации оксида азота

(Эксперименты проводились совместно с А.Ф. Ваниным)

Для подтверждения предположения, что в разработанных нами экспериментальных моделях глазных патологий именно высокая концентрация NO является токсическим фактором, нам требовалось создать 20-кратный избыток NO в сетчатке. Для этого мы вводили в глаз донор оксида азота динитрозильный комплекс железа с глутатионом (ДНК-Ж). Динитрозильные комплексы железа в тканях животных и человека продуцируют свободные молекулы оксида азота и могут функционировать в качестве эндогенных универсальных регуляторов биохимических и физиологических процессов. ДНК-Ж обеспечивают стабилизацию и перенос NO в биосистемах. Так как компоненты этого комплекса уже содержатся в системе, то его введение не является токсичным для клеток сетчатки. Ниже приведена структурная формула ДНК-Ж с глутатионом и распад этого соединения на составляющие компоненты с образованием оксида азота.

GSH-S^- NO⁺…..RS^-

Fe⁺ - Fe²⁺ + NO + RS-NO

GSH-S^- NO⁺…..RS^-

Введение в стекловидное тело глаза крыс динитрозильного комплекса железа с глутатионом (10^-5-10^-8 моль/глаз) через сутки приводило к появлению апоптотических ядер в сетчатке. Методом TUNEL было выявлено, что апоптозу подверглись клетки внутреннего ядерного и ганглиозного слоев сетчатки (рис. 17). При этом апоптоз был выявлен только при введении ДНК-Ж в дозах 10^-7 и 10^-8 моль/глаз. А при введении большего количества препарата (10^-6 и 10^-5 моль/глаз) TUNEL-положительные ядра в сетчатке выявить не удалось.

Рис. 17. Введение ДНК-Ж в стекловидное тело глаза крысы: а - контроль, б - ДНК-Ж, 10^-5 моль/глаз, в - ДНК-Ж, 10^-6 моль/глаз, г - ДНК-Ж, 10^-7 моль/глаз, д - ДНК-Ж, 10^-8 моль/ глаз. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра сетчатки.

При введении ДНК-Ж в количестве 10^-7 моль/глаз количество апоптотических клеток в ганглиозном слое сетчатки увеличилось на 30% от нормы (рис. 18). При введении препарата в количестве 10^-8 моль/глаз апоптозу подверглось до 70% клеток ганглиозного слоя сетчатки от общего количества клеток. При этом клетки внутреннего ядерного слоя подвергались апоптозу в незначительной степени и составили всего 15% от нормы.

Рис. 18. Количество апоптотических ядер в сетчатке глаза крысы при введении ДНК-Ж.

Таким образом, введение донора оксида азота ДНК-Ж в низких дозах приводит к апоптозу клеток сетчатки экспериментальных животных, так как избыток NO в ткани ведёт к образованию пероксинитрита, а, следовательно, и к гибели клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Действие оксида азота двояко: с одной стороны, он защищает сосуды от ишемии, так как он является сосудорасслабляющим фактором, с другой стороны, при дегенеративных нарушениях сетчатки он взаимодействует с активными формами кислорода, что приводит к образованию пероксинитрита - сильнейшего токсического фактора, который действует на митохондрии и индуцирует развитие апоптоза клеток. Поэтому нас интересовало, во-первых, участие NO в патологии, так как он играет нейротоксическую роль, во-вторых, - защитное действие оксида азота при патологии.

Для изучения обоих свойств оксида азота нами были разработаны модели ишемии и глутаматной интоксикации сетчатки глаза на экспериментальных животных.

Существует несколько методик создания экспериментальной ишемии, из которых наиболее распространенными являются искусственное повышение внутриглазного давления (Buchi E.R. et al., 1991) или наложение лигатуры на сосуды в районе зрительного нерва (Otori Y. et al., 1997). Каждый из этих подходов имеет свои недостатки. Так, для повышения внутриглазного давления требуется жесткая фиксация иглы, через которую создается повышенное давление на длительное время (до 1 часа). Этот метод очень чувствителен к любым механическим воздействиям, что делает результаты нестабильными. Кроме того, повышение внутриглазного давления неизбежно ведет к дегенерации ганглиозных клеток, которая может быть обусловлена и не ишемией. Во втором случае, при наложении лигатуры, неизбежно повреждаются не только сосуды, но и зрительный нерв, что приводит к независимым от ишемии дополнительным патологическим изменениям в сетчатке (Masurawa K. et al., 2006). Таким образом, имеющиеся модели не могут дифференцировать гибель клеток сетчатки, вызванную ишемией, от гибели клеток, обусловленной независимой от ишемии дегенерацией клеток сетчатки. Понимание отличий этих механизмов патогенеза принципиально важно как для поиска перспективных лекарственных средств, так и для выбора правильной стратегии лечения. Так, антиишемические средства могут и не предотвращать гибель нейронов, вызванную другими причинами.

Избежать этих недостатков в модели можно путем непосредственного локального воздействия лазерного излучения на магистральные ретинальные сосуды, что вполне выполнимо, поскольку они хорошо видны и доступны для лазерной коагуляции.

Эта модель является удобной, так как, с одной стороны, позволяет избежать указанных выше недостатков. С другой стороны, избирательное тромбирование сосудов, создаваемое лазерной коагуляцией, дает возможность, выбирая различные отделы магистральных ретинальных сосудов или их ветвей и изменяя параметры лазерного излучения, создавать как локальную, так и обширную ишемию сетчатки. Предлагаемая нами модель имеет ряд преимуществ. Во-первых, изменение скорости кровотока происходит не в результате длительного (1-2 часа) воздействия, а в доли секунды (время экспозиции лазерного излучения). Это позволяет изучать ишемические нарушения в остром периоде. Во-вторых, модель быстро и легко реализуема при наличии лазерного оборудования и, в-третьих, лазерная коагуляция моделирует такое офтальмологическое заболевание, как тромбоз ретинальных сосудов.

Защитное действие оксида азота от ишемических повреждений клеток сетчатки продемонстрировано нами на описанной выше модели. Показано, что введение нитрита натрия экспериментальным животным до и после лазерного воздействия на сосуды сетчатки приводит к восстановлению диаметра сосудов, и поэтому характерные ишемические повреждения в сетчатке не наблюдаются. Это можно объяснить тем, что нитриты в условиях гипоксии могут восстанавливаться гемсодержащими белками до оксида азота, что приводит к расширению сосудов.

Как уже отмечалось, восстановление нитритов рассматривается рядом авторов как альтернативный источник оксида азота в организме в условиях гипоксии. Предполагается, что восстановление неорганических нитритов до оксида азота происходит на геме гемсодержащих белков, прежде всего, гемоглобина и ксантиноксидазы, которые в условиях гипоксии могут работать как редуктазы. Наиболее убедительно это подтверждается в экспериментах in vitro на выделенных ферментах и культурах клеток. (Rifkind, J.M. 2003, Millar et al., 1998). Следует отметить, что при обсуждении механизма восстановления нитритов гемсодержащими белками основным возражением служит то, что при закислении среды восстановление нитритов до NO in vivo может происходить в результате неферментативной окислительно-восстановительной реакции. Создание гипоксии в любых органах неизбежно приводит к ацидозу. Причиной этого является переход клетки от окислительного фосфорилирования к гликолизу, что сопровождается закислением. Однако этот процесс требует времени. Так, в мозге - структуре наиболее близкой к сетчатке, закисление происходит лишь через 15 минут после создания экспериментальной ишемии (Shimizu et al., 1993).

Очевидно, что в наших экспериментах ацидоз никак не может быть причиной восстановления нитрита до NO, которое, судя по быстрой реакции сосуда, происходит за времена менее минуты. Так, проведение коагуляции сосудов после введения животному нитрита натрия не приводило к стойкому тромбированию сосудов, наблюдалось лишь кратковременное сужение сосуда, а затем немедленное восстановление его диаметра. Можно предположить, что при этом возникает кратковременная гипоксия, которая и является условием для быстрого восстановления присутствующего в сосуде нитрита натрия до NO.

На той же модели ишемии сетчатки глаза мы продемонстрировали нейротоксические свойства оксида азота в нервной ткани. В данном случае наиболее адекватными являются модели ишемии сетчатки на крысах, так как у них соотношение ретинального и хориоидального кровоснабжения сетчатки близко к таковому у человека. В нашей работе показано, что апоптоз клеток при ишемических повреждениях сетчатки происходит именно во внутренних слоях сетчатки, которые кровоснабжаются ретинальными сосудами. Отсутствие апоптотических клеток в фоторецепторном слое объясняется тем, что фоторецепторы в значительной степени снабжаются кислородом через хориоидальные сосуды и не страдают от ишемии ретинальных сосудов.

Ранее нами было показано, что предварительное введение экспериментальным животным ингибитора NO-синтазы L-NAME значительно снижает концентрацию эндогенного NO в клетках сетчатки. При лазерной коагуляции ретинальных сосудов введение L-NAME предотвращает развитие апоптоза клеток во внутренних слоях сетчатки. Важно отметить, что апоптоз в этом случае индуцирован исключительно ишемией, тогда как в других моделях дегенерация может быть обусловлена прямым воздействием на нервные клетки сетчатки.

На второй использованной нами модели нейродегенерации сетчатки глаза, вызванной глутаматной интоксикацией, мы показали, что апоптотическая гибель клеток также происходит во внутренних слоях сетчатки. Это объясняется тем, что передача сенсорного сигнала посредством глутамата осуществляется в синаптических слоях, таким образом, избыток глутамата приводит к гибели клеток всех слоёв сетчатки, исключая фоторецеторный.

Каков механизм развития апоптоза в обоих случаях? К настоящему времени накоплено немало доказательств того, что оксид азота является необходимым фактором развития апоптоза при дегенеративных нарушениях нервных клеток. Развитие ишемии, как известно, приводит к развитию окислительного стресса в клетках сетчатки и повышению содержания активных форм кислорода (Cuzzocrea et al., 2001). Именно это является, как считается, причиной развития апоптоза. Однако сам по себе супероксид анион-радикал в отсутствие NO не приводит к развитию апоптоза. Интересно отметить, что ингибирование NO-синтазы не только не уменьшает генерацию супероксид-анион радикала, а напротив, увеличивает ее. Так, при работе NO-синтазы электрон с НАДФ-Н последовательно переносится на кислород, затем на аргинин с последующим образованием NO. В присутствии в системе аргинина NO-синтаза работает как синтаза, образуя NO, в отсутствие аргинина - как оксидаза, образуя О₂^-.

Предполагается, что оксид азота связывается с образовавшимся супероксид-анион радикалом, что приводит к появлению пероксинитрита (ONOO^-), который является проапоптотическим фактором и ведёт к гибели клеток. Сам по себе пероксинитрит развития апоптоза не вызывает, а является короткоживущим промежуточным продуктом. Дальнейшее химическое превращение ONOO^- выглядит так:

Мы предполагаем, что при глутаматной интоксикации апоптотическая гибель клеток происходит по-другому. Известно, что действие глутамата приводит к активации входного кальциевого тока в клетку, и внутриклеточная концентрация кальция возрастает. NO-синтаза является кальций-зависимым ферментом, и увеличение концентрации кальция в клетке приводит к увеличению продукции оксида азота в клетке, в результате образуется большее количество пероксинитрита, что ведет к развитию апоптоза по уже описанному механизму. Ключевым фактором в этом случае является не увеличение концентрации супероксида, а увеличение концентрации оксида азота.

Интересно отметить, что повышение активности NO-синтазы, опосредованное глутаматом, может происходить и при развитии ишемии. Как известно, ишемия вследствие энергодефицита приводит к изменению потенциала нервных клеток, что в свою очередь может приводить к изменению работы как метаботропных, так и ионотропных глутаматных рецепторов и увеличению внутриклеточной концентрации кальция. Таким образом, глутаматная интоксикация при развитии ишемии также является одним из повреждающих факторов, которые реализуются через образование пероксинитрита.

В экспериментах, когда содержание оксида азота в сетчатке глаза напрямую повышалось введением донора NO (ДНК-Ж с глутатионом) в низких концентрациях, наблюдалось появление апоптотических клеток в сетчатке через сутки после введения препарата. При ведении ДНК-Ж в высоких концентрациях апоптоз клеток в сетчатке не наблюдался. Это можно объяснить тем, что введённый ДНК-Ж связан с глутатионом, который обладает антиоксидантными свойствами. И при увеличении концентрации препарата соответственно увеличивалась и концентрация глутатиона, когда токсическое действие NO уже находилось в насыщении.

Это подтверждает наше предположение о токсичности высокой концентрации оксида азота в нервной ткани, которая возникает при различных нейродегенеративных заболеваниях сетчатки глаза.

Таким образом, снижение внутриклеточной концентрации NO могло бы предотвратить апоптотическую гибель при развитии ретинальных патологий глаза.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана оригинальная модель ишемии сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов.

2. Установлено, что предварительное введение нитритов в условиях гипоксии приводит к быстрому расширению сосудов, защищает сетчатку от ишемии и вызванной ею апоптотической гибели клеток.

3. Показано, что ингибирование NO-синтазы предовтращает развитие апоптоза при ретинальной ишемии. Предполагается, что ключевую роль в развитии апоптоза в данной зрительной патологии играет образование пероксинитрита.

4. Показано, что ингибирование NO-синтазы предотвращает развитие апоптоза при глутаматной интоксикации сетчатки глаза.

5. Показано, что введение в глаз динитрозильных комплексов железа в количестве 10^-7 - 10^-8 моль/глаз приводит к развитию апоптоза во внутренних слоях сетчатки.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК-Ж - динитрозильный комплекс железа

ЭРГ - электроретинограмма

НС - наружные сегменты

НЯС - наружный ядерный слой

НСС - наружный синаптический слой

ВЯС - внутренний ядерный слой

ВСС - внутренний синаптический слой

ГС - ганглиозный слой

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Г.Р. Каламкаров, И.В. Цапенко, М.В. Зуева, А.Н. Иванов, С.В. Резвых, Т.С. Константинова, Т.Ф. Шевченко. Нитриты способны расширять сосуды при гипоксии и защищать сетчатку от ишемии. Докл. Академии наук, 2007, Т. 417, № 2, С. 1-3.

2. Г.Р. Каламкаров, Т.Ф. Шевченко, Т.С. Константинова, М.А. Островский, А.В. Агеев, С.А. Кочергин, Л.К. Мошетова. Прогнозирование развития офтальмологических патологий с помощью выявления специфических антител сетчатки. Технологии живых систем. 2007, Т. 4, № 5-6, С. 11-19.

3. Г.Р. Каламкаров, И.В. Цапенко, М.В. Зуева, А.Н. Иванов, Т.С. Константинова, А.Е. Бугрова, С.В. Резвых, А.А. Федоров, Т.Ф. Шевченко. Экспериментальная модель острой ишемии сетчатки глаза у крыс. Бюлл. эксп. биологии и медицины. 2008, № 6, С. 634-638.

4. Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский, А.Е. Бугрова, Т.Ф. Шевченко, Т.С. Константинова. Разработка иммунологических методов выявления глазных патологий; роль оксида азота в дегенерации сетчатки глаза. «Фундаментальные науки - медицине», Москва. Декабрь 2007, С. 60.

5. Константинова Т.С., Каламкаров Г.Р., Цапенко И.В., Зуева М.В.,. Иванов А.Н, Шевченко Т.Ф. Нитриты могут быть источником оксида азота в условиях гипоксии и защищать сетчатку глаза от ишемии. Международная молодёжная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика». Сборник статей. Москва. Ноябрь. 2006 г. С. 135-136.

6. Константинова Т.С., Каламкаров Г.Р., Цапенко И.В., Зуева М.В.,. Иванов А.Н, Шевченко Т.Ф. Роль оксида азота в развитии дегенеративных заболеваний сетчатки глаза. Международная молодёжная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика». Сборник статей. Москва. Ноябрь. 2007 г. С 57-58.

7. Константинова Т.С., Цапенко И.В., Зуева М.В., Иванов А.Н., Бугрова А.Е., Шевченко Т.Ф., Каламкаров Г.Р. Участие оксида азота в развитии апоптоза клеток сетчатки при ишемии. Международная молодёжная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика». Сборник статей. Москва. Ноябрь. 2008, С. 109-113.

...